一種與人類胎兒生長受限發生相關的血清微小核糖核酸標誌物及其應用的製作方法
2023-07-06 04:33:01
一種與人類胎兒生長受限發生相關的血清微小核糖核酸標誌物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程及生殖醫學領域，公開了一種與人類胎兒生長受限發生相關的血清微小核糖核酸標誌物及其應用。該標誌物為hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-675-5p中的多種。該標誌物對胎兒生長受限具有特異性和敏感性，可用於製備胎兒生長受限診斷或監測的試劑，可反覆檢測，且易於動態監測胎兒生長受限的程度。
【專利說明】一種與人類胎兒生長受限發生相關的血清微小核糖核酸標誌物及其應用
發明領域
[0001]本發明屬於基因工程及臨床醫學領域，涉及與人類胎兒生長受限發生相關的血清微小核糖核酸(microRNA, miRNA)標誌物及其應用。
【背景技術】
[0002]胎兒生長受限(fetal growth restriction, FGR)是指胎兒出生體重低於同孕齡平均體重的兩個標準差，或低於同齡正常體重的第10百分位數。FGR是圍生期的重要併發症，居圍生兒死亡原因第2位，其圍生兒死亡率為正常兒的6-10倍，在死亡中約佔圍生兒的30%，產時宮內缺氧圍生兒中50%為FGR，據統計我國的發病率平均為6.39%。FGR會引起新生兒呼吸困難、紅細胞增多症、低血糖、腦室出血、低溫等併發症。FGR不僅直接影響胎兒的發育，遠期也影響兒童期及青春期的體能與智能發育，以及增加成人對冠心病、2型糖尿病、高血壓等心血管疾病和代謝性疾病的易感性。
[0003]FGR的病因迄今尚未完全闡明，其發生與孕婦、胎兒因素、胎盤、環境等多方面的因素密切相關。明確FGR的病因對早期診斷和治療有重要的作用。30%~40%的FGR發生於孕母有各種疾患及妊娠合併症者，如子癇前期、妊娠合併高血壓或高血壓合併妊娠、妊娠期糖尿病等，此外母體血管疾病和血栓形成會導致子宮胎盤灌注不足而引起胎兒生長受限。10%由於多胎，多胎加重了子宮胎盤動脈的壓力。10%由於胎兒問題一感染或畸形，約有40%發生於正常妊娠，其發病原因迄今仍未闡明，稱為「特發性胎兒生長受限」。
[0004]有時即便孕婦和胎兒均無異常因素，胎盤及其附屬物的變化亦可導致FGR。胎盤滋養細胞參與激活代謝、產生激素、吸收營養和排除代謝廢物等，廣泛的證據表明在FGR的發生中胎盤功能不足。導致胎兒生長受限的最主`要最直接的原因是胎盤發育異常及循環功能障礙，造成胎兒營養物質供給和利用障礙。研究發現不同的胎盤因素參與疾病的發生，如解剖、血管、染色體和/或形態異常等。FGR組與正常對照組相比，胎盤絨毛數目、絨毛血管數目、胎盤體重和胎兒-胎盤重量比均明顯下降。增厚的絨毛滋養細胞基底膜、絨毛梗死的發病率、血栓形成和血腫的存在和發生在FGR組中較常見。子宮-胎盤血管、胎兒-胎盤血管重構異常也發生於FGR。絨毛血管的生成障礙導致胎兒與母體間血運減少、營養物質的輸送能力下降。同時絨毛間隙纖維素沉積可導致絨毛間血流減少，合體滋養細胞微絨毛膜表面的Na(+)/K(+)ATPase活性明顯降低，導致Na(+)_偶聯的轉運功能削弱，母胎間的交換面積和效率均降低。已知許多生長因子，包括血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PIGF)、轉化生長因子P (TGF P )、成纖維細胞生長因子(FGF)等在絨毛細胞內產生，經其受體在局部起作用，控制胎盤血管的生成、遷移、入侵等能力。此外，MMP-9是滋養層細胞分泌的有效水解酶，選擇性水解子宮內膜成分及基底膜，在胎盤的植入中發揮重要作用，其分泌的減少使滋養細胞對子宮肌層的浸潤和螺旋動脈的形成發生變化，限制胎盤血供，使絨毛間隙含氧量減少，造成絨毛細胞缺氧。但是FGR的病因迄今尚未完全闡明。
[0005]微小核糖核酸(microRNA,即miRNA)是近年剛剛興起的研究熱點，它是一類長約19-25個核苷酸組成的內源性非編碼小分子單鏈RNA，多位於基因組非編碼區。它在生物進化過程中高度保守，在細胞中具有時空特異性表達模式，可在轉錄後水平對基因表達進行調節，並與動物的許多正常生理活動，同時也與許多疾病的發生及發展存在著緊密的聯繫。這些小分子RNA是從60~200nt的具有髮夾狀結構的前體中被切割出來而成熟，在動物細胞中，miRNA的轉錄初產物(pr1-miRNA)很快被一種核糖核酸酶III Drosha加工成miRNA前體(pre-miRNA)，然後由細胞核轉運至細胞質中，經另一種核糖核酸酶III Dicer識別剪切為成熟miRNA。隨後，這個單鏈與輔酶因子TRBP及PACT形成RNA誘導沉默複合物，再與mRNA的3』端非編碼區(3』UTR)結合，從而發揮其調控mRNA轉錄與蛋白翻譯的總開關作用。miRNA誘發的基因沉默現象是通過直接切割或阻礙基因的轉錄。多數的miRNA與一個特定的mRNA不是完全互補的，因此相同的mi RNA可以同時調控多個基因。另外，不同的mi RNAs也可以靶向調控相同的mRNA，並且有相似的生物學功能。大約30%的人類基因表達可能受miRNAs調控。第一個ncRNA於1965年在麵包酵母中被發現，但是它的生理功能直到1993年才被認識，在線蟲體內時序性調控生長發育，所以叫做「小時空RNA」。直到20世紀初,才被稱為miRNA，它在細胞內的RNA幹擾機制開始被認識。最近的十幾年，在人類中已發現了1000多種miRNAs，作為21世紀生命科學的重大發現，越來越多的研究顯示，其參與的細胞轉錄後調控，在個體發育、細胞胞增殖、分化、代謝和凋亡等多種生物學過程中發揮著重要的調節作用。目前，已發現血清miRNA可作為多種腫瘤發生與預後的良好生物標誌物。
[0006]最新的研究成果發現血清中存在數百種的miRNA，性質穩定、含量豐富、易於定量檢測，且存在顯著的疾病特異性，在肺癌、乳腺癌中已經證實血清miRNA的表達譜可作為早期診斷的潛在生物標誌物。這一發現令人振奮，血清miRNA作為一類非編碼調節性的小分子RNA有可能取代傳統的特異蛋白為代表的生物標誌物，開拓了生物標誌物的新境界。該研究迅速引起國際媒體的廣泛關注，路透社、合眾社、《科學的美國人》、美國《技術評論》等都對該研究成果進行了專門報導，《Nature》雜誌也在其網站首頁的「最新研究進展」專欄中展示了這一最新研究進展。然而孕婦血清中miRNA在胎兒生長受限早期診斷監測中的應用還未得到相應的關注，若能發現與胎兒生長受限發病相關的特異且穩定的血清miRNA作為生物標誌物，並研發相應疾病的`診斷、監測試劑盒，不僅能創造令人矚目的經濟效益，對我國胎兒生長受限的防治也將是一次強有力的推動。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供與人類胎兒生長受限發生相關的血清microRNA標誌物。
[0008]本發明的另一個目的是提供上述血清microRNA標誌物的引物。
[0009]本發明還有一個目的是提供含有上述血清microRNA標誌物或其引物的應用。
[0010]本發明再有一個目的是提供含有上述血清microRNA標誌物的引物的用於人類胎兒生長受限診斷或監測的試劑盒。
[0011]本發明的目的是通過下列技術措施實現的:
[0012]與人類胎兒生長受限相關的血清microRNA標誌物，選自hsaniR-lOa、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p、hsa-miR-675_5p 中的多種。
[0013]所述的血清microRNA 標誌物由 hsa-miR-lOa、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p 構成。所述的血清 microRNA標誌物，其中 hsa-miR-lOa 的序列為 uacccuguagauccgaauuugug (SEQ ID N0.1),hsa_miR-320b 的序列為 aaaagcuggguugagagggcaa (SEQ ID N0.2), hsa-miR-409_3p的序列為 gaauguugcucggugaaccccu (SEQ ID N0.3), hsa-miR-483_3p 的序列為 ucacuccucuccucccgucuu (SEQ ID N0.4), hsa-miR-675_5p 的序列為uggugcggagagggcccacagug (SEQ ID N0.5)。
[0014]所述的血清microRNA標誌物的引物，其中序列為SEQ ID N0.1的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.6，下遊引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.2的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.8，下遊引物為SEQ ID N0.9 ;序列為SEQ ID N0.3的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.10，下遊引物為SEQ ID N0.11 ;序列為SEQ ID N0.4的標誌物的上遊引物為SEQID N0.12，下遊引物為SEQ ID N0.13 ;序列為SEQ ID N0.5的標誌物的上遊引物為SEQ IDN0.14，下遊引物為 SEQ ID N0.15。
[0015]所述的血清microRNA標誌物或其引物在製備胎兒生長受限診斷或監測試劑中的應用。所述試劑是能夠測定這些血清microRNA標誌物在血清中表達量的試劑。
[0016]一種人類胎兒生長受限診斷或監測試劑盒，該試劑盒含有上述血清microRNA標誌物(hsa-miR-10a、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p中的多種)的引物。
[0017]所述的診斷或監測試劑盒，該試劑盒含有上述引物(SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.1,SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQ IDN0.13，SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15)中的多對。
[0018]所述的診斷或監測試劑盒，該試劑盒含有下列5對引物SEQ ID N0.6和SEQ IDN0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQID N0.13，SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15。
[0019]試劑盒中除引物外的其他試劑可採用現有技術中相應檢測技術的常用試劑。
[0020]本發明詳細描述如下:
[0021]本發明人以標準操作程序(SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人群基礎信息和臨床資料，並採用了 RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array,Real-time PCRCTaqMan探針和染料法)方法的一種或幾種進行檢測。
[0022]具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:
[0023]一、研究對象選擇和分組依據
[0024]A組:健康對照組(n=80，10人晶片篩選，30人一期驗證，40人獨立人群驗證)，無其
他全身性重大疾病。
[0025]B組:胎兒生長受限組(n=80，10人晶片篩選，30人一期驗證，40人獨立人群驗證)，無其他全身性重大疾病。
[0026]二、血液血清分離及miRNA提取
[0027](I)新鮮肝素抗凝血5ml於離心機3000g離心5min,取上清每100 V-1分裝至潔淨1.5ml EP 管中；
[0028](2)加入60iU裂解液，漩渦震蕩5s，室溫靜置3min ；
[0029](3)加入20 u I蛋白液，漩渦震蕩5s，室溫靜置lmin，IlOOOg離心3min ；
[0030](4)取上清至新的2ml收集管，加入270 U I異丙醇，漩渦震蕩5s ；[0031](5)將microRNA離心柱放在收集管中，將步驟4的液體加入離心柱中，室溫靜置2min, IlOOOg離心30s，倒掉收集管中液體，將離心柱放回收集管；
[0032](6)加入IOOii I洗脫液I至microRNA離心柱，IlOOOg離心30s，倒掉收集管中液體，將離心柱放回收集管；
[0033](7)加入700 ii I洗脫液2至microRNA離心柱，IlOOOg離心30s，倒掉收集管中液體，將離心柱放回收集管；
[0034](8)加入 250 V-1 洗脫液 2 至 microRNA 離心柱，IlOOOg 離心 2min ；
[0035](9)將microRNA離心柱放置在新的1.5ml收集管中，加入25 U I去核糖核酸酶水至microRNA離心柱膜上,室溫靜置lmin, IlOOOg離心Imin ；
[0036](10)重複步驟9 一次，_70°C保存收集管中的樣本。
[0037]本發明實驗中使用的離心柱和配套試劑(裂解液、蛋白液、洗脫液I和洗脫液2)均來自 Exiqon mi RCURY RNA isolation kit (貨號 300112)試劑盒,下同。
[0038]三、Real-time PCR方法測量血清miRNAs表達量
[0039]1.取經前處理的血清，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品。
[0040]按下表所示配製反轉錄體系:
[0041]
【權利要求】
1.人類胎兒生長受限相關的血清microRNA標誌物,選自hsa-miR-10a、hsa-miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p、hsa-miR-675_5p 中的多種。
2.根據權利要求1所述的血清microRNA標誌物，其特徵在於由hsa_miR-10a、hsa_miR-320b、hsa-miR-409_3p、hsa-miR-483_3p 和 hsa-miR-675_5p 構成。
3.根據權利要求1或2所述的血清microRNA標誌物,其特徵在於hsa_miR-10a的序列為 SEQ ID N0.1，hsa-miR-320b 的序列為 SEQ ID N0.2，hsa-miR-409_3p 的序列為 SEQ IDN0.3，hsa-miR-483-3p 的序列為 SEQ ID N0.4，hsa-miR-675_5p 的序列為 SEQ ID N0.5。
4.權利要求3所述的血清microRNA標誌物的引物，其特徵在於序列為SEQID N0.1的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.6，下遊引物為SEQ ID N0.7 ;序列為SEQ ID N0.2的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.8，下遊引物為SEQ ID N0.9 ;序列為SEQ ID N0.3的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.10，下遊引物為SEQ ID N0.11 ;序列為SEQ ID N0.4的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.12，下遊引物為SEQ ID N0.13 ;序列為SEQ ID N0.5的標誌物的上遊引物為SEQ ID N0.14，下遊引物為SEQ ID N0.15。
5.權利要求1或2所述的血清microRNA標誌物在製備人類胎兒生長受限輔助診斷或監測試劑中的應用。
6.權利要求4所述的引物在製備人類胎兒生長受限輔助診斷或監測試劑中的應用。
7.一種人類胎兒生長受限輔助診斷或監測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有權利要求1或2所述的血清microRNA標誌物的引物。
8.根據權利要求7所述的輔助診斷或監測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有權利要求4所述引物中的多對。
9.根據權利要求8所述的輔助診斷或監測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有引物SEQID N0.6 和 SEQ ID N0.7，SEQ ID N0.8 和 SEQ ID N0.9，SEQ ID N0.10 和 SEQ ID N0.11，SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.1`3，以及 SEQ ID N0.14 和 SEQ ID N0.15。
【文檔編號】C12N15/11GK103757017SQ201410028086
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月21日 優先權日:2014年1月21日
【發明者】吳煒, 湯秋勤, 丁虹娟, 陳敏, 夏彥愷, 陸春城, 王心如 申請人:南京醫科大學