一種野生稻抗稻瘟病抗性相關基因、蛋白及其用途的製作方法

2023-07-05 14:18:51

專利名稱：一種野生稻抗稻瘟病抗性相關基因、蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明為生物技術領域，尤其涉及一種野生稻抗稻瘟病抗性相關基因、蛋白及其用途。
背景技術：
稻瘟病是水稻三大病害之一，分布廣、危害大。目前國內外的研究重點主要集中在抗病相關基因的鑑定和克隆上，迄今已定位的稻瘟病抗性基因(Pi系列)達20多個，現已克隆了Pi-ta(Bryan G T.et al.2000)。與此同時，通過傳統的育種手段和現代轉基因技術也培育出了一些抗瘟性水稻新品種。由於抗瘟品種的單一化和稻瘟病菌生理小種的複雜性和較快的變異性，一般應用3-5年後就會產生能侵染該品種的優勢小種，造成水稻品種抗性的喪失。培育高效廣譜的水稻抗瘟新品種是亟待解決的問題，關鍵之一在於對水稻和病原菌互作機制的深入了解和對抗瘟性基因的功能進一步研究。植物與病原互作過程一般涉及病原菌與宿主的相互識別、信號傳導、植物抗性基因激活等一系列的生理生化反應，從水稻基因群體的角度進行研究可以對水稻抗瘟機制的整個過程得以了解。基因晶片技術的出現為從群體水平探索基因表達差異提供了良好的實驗平臺。通過分析基因表達譜可以檢測整個基因組範圍的眾多基因表達水平的變化，獲得基因的差異表達信息，同時還可以用聚類分析算法研究在功能或表達調控上具有相關性的基因，最終為研究基因功能和基因遺傳網絡提供有力手段。
如何解析特異基因的時空性表達及其基因網絡的調控機制，是生物學中的核心問題。在該表達調控過程中，轉錄因子起非常主要的作用。這些轉錄因子的蛋白結構是模塊式的，通常是根據DNA結合結構域的結構對其進行分類。鋅指模塊是DNA結合結構域的一種類型(Albagli，O.，P.，et al 1995)。其中C2H2鋅指是DNA結合結構域最典型的代表之一。人類基因組中編碼C2H2模塊的基因約有600-700個(Bellefroid，E.J.，et al.1991，Venter，J.C.，et al.2001)。鋅指轉錄因子的C2H2類中，鋅指元件常伴隨著各種結構模塊。這些結構模塊通過控制轉錄因子與其它細胞組分進行選擇性的結合，進而調節亞細胞定位、DNA結合和基因表達。在C2H2類鋅指轉錄因子中，這些結構模塊包括痘病毒鋅指結構域(poxvirus and zinc fingerdomain，(POZ))(Bardwell，V.J.，et al. 1994)，如已知的BTB結構域(Broad-Complex，Tramtrack，and Bric-a-brac)，Kruppel關聯盒(Kruppel-associated box(KRAB))(Bellefroid，E.J.，et al.1991)和SCAN結構域(Williams，A.J.，et al.1995)。
BTB/POZ結構域是一個進化保守的蛋白—蛋白相互作用結構域，在許多轉錄因子的N末端區域。這些結構域表現出能與其它蛋白互作並產生同源或異源二聚體的能力(Bardwell andTreisman，1994；Igarashi et al.，1998)。而且，絕大多數含有BTB/POZ結構域的蛋白通常還包括其它的結構域，如鋅指結構域、b-ZIP結構域、kelch重複、MATH結構域或錨蛋白重複序列(ankyrin repeats)(Aravind and Koonin，1999)。這些結構域通過相互協同作用，從而達到行使生物學功能的目的。BTB/POZ結構域的例子從酵母到人類的有機體中得到了證實。
擁有BTB/POZ結構域的蛋白其功能涉及到轉錄調節、細胞骨架組織、染色質的改變和人類癌症、發育和鉀離子通道的四聚化結構域等(Albagli et al.，1995；Aravind and Koonin，1999，Sophie Deltour，et al.2001，Patrick M.et al.2000)。
目前，植物中發現的含有BTB/POZ結構域的已知功能的蛋白數量相當少，如NPR-1基因、RPT2/NPH3基因家族，且都是在擬南芥中發現的。RPT2基因是一個光誘導的、編碼蛋白，有593個胺基酸殘基，分子量為65.8kD，有四個外顯子。該蛋白擁有推測的磷酸化位點，一個核定位信號、一個BTB/POZ結構域和一個捲曲螺旋結構域(coiled-coil domain)，屬於一個大基因家族。該家族還包括NPH3基因。RPT2/NPH3擁有一個BTB/POZ結構域和一個捲曲螺旋結構域，都參與了調節擬南芥的向光性反應(Tatsuya S.et al，2000)，但目前尚未弄清RPT2相互作用機制。
在植物中，擬南芥的NPR-1是目前發現的唯一一個擁有BTB/POZ結構域且參與植物抗病的基因，該基因包含一個BTB/POZ結構域和錨蛋白重複序列，是對病原反應的主要調節子(Caoet al.，1997)。另外，NPR-1還能與含有b-ZIP結構域的轉錄調節子(Zhang et al.，1999)和核蛋白SNI進行蛋白—蛋白互作(Li et al.，1999)，這表明是一個轉錄調節子誘導了系統獲得抗性(SAR)。NPR-1基因定位於核中(Després C，et al.2000，Kinkema M，et al.2000)，NPR-1通過與轉錄因子的物理相互作用進而調節PR基因的表達。NPR-1含有蛋白—蛋白互作結構域。用酵母雙雜交掃描發現，NPR-1結合了TGA轉錄因子家族(Després C，et al.2000，Zhang YL，et al.1999，Zhou JM，et al.2000)。TGA轉錄因子在早期的轉錄研究中就證實能調控SA誘導的基因表達(Jupin I，et al.1996，Lebel E，et al.1998)。一個TGA結合到啟動子元件as-1呈現出SA誘導的PR-1基因表達，說明TGAs可能是轉錄激活子。NPR-1增強了TGA-因子結合到as-1元件上(Després C，et al.2000，Xinnian Dong，2001)。因此，對水稻中含有BTB結構域的基因進行研究，有助於了解水稻的抗病網路以及機制，同時也對作物育種提供了理論和實踐指導。
以稻瘟病菌(M.grisea)處理水稻近等基因系抗病品種(H7R)和感病品種(H7S)的葉片抽提的mRNA為探針，與含有1106條獨立的cDNA晶片雜交(來自稻瘟病菌誘導的水稻葉cDNA文庫、莖cDNA文庫和胚乳cDNA文庫)，獲得一批明顯上調的基因，並選出十個功能未知的基因進行生物信息學分析，發現一個基因含有BTB結構域，Northern印跡雜交實驗證實該基因的表達受稻瘟病菌的誘導；Southern印跡雜交實驗證實該基因來源於野生稻基因組且以單拷貝形式存在。應用M-EST陣列、cDNA末端快速擴增(RACE)和RT-PCR等方法最終獲得了OsBTB基因的全長序列並命名，且確定了該基因的完整開放讀碼框架(ORF)。運用中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46的F8重組自交系群體的親本為材料，對OsBTB基因進行RFLP進行多態性分析，發現OsBTB基因在親本中以1～2拷貝存在，位於第2號染色體，且在兩個重組自交系群體的一個公共標記RZ324附近。
如上所述的OsBTB基因經Northern印跡雜交驗證在抗性水稻品系中的誘導表達明顯強於感病品系中的表達，說明cDNA片段與水稻抗稻瘟病病緊密相關；在水稻基因組中以單拷貝的形式存在。OsBTB基因的獲得對研究確定OsBTB基因的作用機理、信號轉導、抗病性等方面提供了基礎，因此分離該基因具有非常重要的意義。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種野生稻抗稻瘟病抗性相關基因；本發明的另一個目的是提供OsBTB基因編碼的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因多肽——OsBTB基因多肽以及其生物活性片段、或其活性類似物、或其活性衍生物。
本發明的另一個目的是提供含有編碼OsBTB基因的用途。
本發明的另一個目的是提供含有編碼OSBTB基因的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供含有編碼OSBTB基因的多核苷酸的重組載體。
本發明的另一個目的是提供了一種探針分子。
一種分離出的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因是運用重組載體和基因工程化宿主細胞，通過應用模塊表達序列標籤陣列、互補脫氧核糖核酸末端快速擴增、聚合酶鏈式反應和反轉錄聚合酶鏈式反應、分子雜交方法獲得的、存在交替剪接現象的、且已於染色體上定位的具有SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。
所說的已於染色體上定位，是野生稻抗稻瘟病抗性相關基因定位於第2號染色體，且定位在中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46的F8重組自交系群體親本的一個公共標記RZ324附近。
一種分離的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因的多肽具有SEQ ID No.3胺基酸序列的多肽、其保守性變體、或其生物活性片段，或其活性類似物、或其活性衍生物。
一種重組載體含有權利要求1所述的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因，它包括細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒。
一種基因工程化宿主細胞是用權利要求5所述的重組載體轉化的基因工程化宿主細胞，它包括原核細胞、低等真核細胞、高等真核細胞。
一種探針分子，它含有權利要求1或2所述的水稻抗白葉枯抗性相關基因的多核苷酸序列分子中8～100個連續核苷酸的序列。
所說的多核苷酸序列包括SEQ ID No.1～7所示的序列、其互補序列、多核苷酸序列變體、抑制水稻抗白葉枯抗性相關基因信使核糖核酸的寡核苷酸以及核酶。
多核苷酸序列變體是指一種或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。
一種分離出的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因的用途是用於水稻抵禦稻瘟病菌的侵染。
本發明的優點是1)利用本發明分離的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因而培育出的水稻可以抵禦稻瘟病菌的侵染，從而在農業領域加以推廣，進而減少過度使用農藥而造成對環境的危害。2)利用本發明分離的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因多肽、或其保守性變體、或其生物活性片段、或其衍生物，進行單克隆抗體或多克隆抗體的製備，可以廣泛運用於分子生物學領域。例如，運用免疫組織化學對目的基因進行細胞定位，運用western blot對目的基因進行確認，另外，還可以運用所獲得的抗體進行蛋白晶片的製備，也可以用獲得的抗體作為抗原進行二級免疫，獲得二級抗體。3)本發明的多核苷酸和/或多肽可作為探針分子，用於診斷抗病和/或感病或其他由於OsBTB表達異常所引起的抗病性或感病性。


圖1.pCAMBIA-OsBTB正義和反義植物表達載體的構建圖譜；圖2.轉化農桿菌後pCAMBIA-OsBTB正義和反義質粒的EcoR I酶切鑑定圖譜，圖中左起第一泳道為標記分子，第二和第四泳道分別為未酶切的正義和反義的pCAMBIA-OsBTB表達載體，第三和第五泳道分別為EcoR I酶切的正義和反義的pCAMBIA-OsBTB表達載體；圖3.轉OsBTB基因後所得到的分化的抗性愈傷組織圖譜；圖4.轉化農桿菌後pCAMBIA-OsBTB正義和反義植株的EcoR I酶切鑑定圖譜，圖中左起第一泳道為標記分子，第二和第三泳道分別為EcoR I酶切的正義的pCAMBIA-OsBTB表達載體，第四和第五泳道分別為EcoR I酶切的反義的pCAMBIA-OsBTB表達載體；圖5.獲得的OsBTB基因蛋白電泳圖譜，第一泳道為空載體pET28a的陰性對照；第二泳道為連接有OsBTB的pET28a載體的樣品；第三泳道為中等分子量的蛋白標記分子；圖6.獲得的轉OsBTB基因的植株的抗病性鑑定圖譜。圖中，左一為高抗植株，左二為中抗植株，右二為低抗植株，右一為對照植株。
具體實施例方式
本發明涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)具有SEQ ID NO.1的1～1974位的序列；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸序列；(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％同源性的多核苷酸；(d)與(a)或(b)的多核苷酸序列中8～100個連續核苷酸為探針的序列。
本發明還涉及分離的多肽，該多肽是水稻源的，它包含具有SEQ ID NO.3胺基酸序列的多肽、或其保守性變體、或其生物活性片段、或其衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ IDNO.3胺基酸序列的多肽。
本發明另外涉及一種含有本發明多核苷酸的載體，特別是表達載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細胞，包括轉化、轉導或轉染的宿主細胞；一種包括培養所述宿主細胞和回收表達產物的製備本發明多肽的方法。
本說明書和權利要求書中使用的下列術語除非特別說明具有如下的含義「核酸序列」是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術語「胺基酸序列」是指寡肽、肽、多肽或蛋白質序列及其片段或部分。當本發明中的「胺基酸序列」涉及一種天然存在的蛋白質分子的胺基酸序列時，這種「多肽」或「蛋白質」不意味著將胺基酸序列限制為與所述蛋白質分子相關的完整的天然胺基酸。
蛋白質或多核苷酸「變體」是指一種或多個核苷酸改變的胺基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括胺基酸序列或核苷酸序列中胺基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有「保守性」改變，其中替換的胺基酸具有與原胺基酸相類似的結構或化學性質，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
「缺失」是指在胺基酸或核苷酸序列中一個或多個胺基酸或核苷酸的缺失。
「插入」或「添加」是指在胺基酸序列或核苷酸序列中的改變導致與天然存在的分子相比，一個或多個胺基酸或核苷酸的增加。「替換」是指由不同的胺基酸或核苷酸替換一個或多個胺基酸或核苷酸。
「生物活性」是指具有天然分子的結構、調控或生物化學功能的蛋白質。
「調節」是指OsBTB具有的功能發生改變，包括蛋白質活性的升高或降低、結合特性的改變及OsBTB編碼蛋白的任何其他生物學性質、功能的改變。
「基本上純」是指基本上不含天然與其相關的其他蛋白、脂類、糖類或其他物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化OsBTB基因編碼的多肽。基本上純的OsBTB基因編碼的多肽在非還原性聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。OsBTB基因編碼的多肽的純度可用胺基酸序列分析。
「同源性」是指互補的程度，可以是部分同源或完全同源。「部分同源」是指一種部分互補的序列，其至少可部分抑制完全互補的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴格性程度降低的條件下進行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測。基本上同源的序列或雜交探針可競爭和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴格性程度降低的條件下的結合。這並不意味嚴格性程度降低的條件允許非特異性結合，因為嚴格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結合為特異性或選擇性相互作用。
「相同性百分率」是指在兩種或多種核酸序列比較中序列相同或相似的百分率。可用電子方法測定相同性百分率。
「相似性」是指胺基酸序列之間排列對比時相應位置胺基酸殘基的相同或保護性取代的程度。
「反義」是指與特定的DNA或RNA序列互補的核苷酸序列。「反義鏈」是指與「有義鏈」互補的核酸鏈。
「衍生物」是指HFP或編碼其的核酸的化學修飾物。這種化學修飾物可以是用烷基、醯基或氨基替換氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學特性。
「分離的」一詞指將物質從它原來的環境(例如，若是自然產生的就指其天然環境)之中移出。如本發明所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸如從天然狀態中同存在的其他物質分開，則為分離純化的。
「分離的OsBTB基因編碼的多肽」是指OsBTB基因編碼的多肽基本上不含天然與其相關的其他蛋白、脂類、糖類或其他物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化OsBTB基因編碼的多肽。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺上能產生單一的主帶。OsBTB基因編碼的多肽的純度能用胺基酸序列分析。
本發明提供了一種新的多肽——OsBTB基因編碼的多肽，基本上是由SEQ ID NO.3所示的胺基酸序列組成的。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可以包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括OsBTB基因編碼的多肽的生物活性片段、或其活性類似物、或其活性衍生物。如本發明所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的OsBTB基因編碼的多肽相同的生物學功能或活性多肽。本發明多肽的生物活性片段、或其衍生物或其活性類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸參加(優選的是保守胺基酸殘基)取代，並且取代的胺基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基的某個基團或其他基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的胺基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)。通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員的知識範圍之內。
本發明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有SEQ ID NO.3胺基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本發明的多核苷酸是從野生稻的cDNA文庫中發現的。它包含的多核苷酸序列全長為1974個鹼基，其開放讀碼框為1674個鹼基，通過Southern雜交證實抗性水稻品系中的誘導表達明顯強於感病品系中的表達，推測這些cDNA片段與水稻抗稻瘟病緊密相關，具有抗稻瘟病菌的功能。OsBTB基因的全長DNA序列如SEQ ID NO.4所示，包含6個外顯子和5個內含子。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO.1所示的編碼區序列相同或是簡併的變異體。如本發明所用，「簡併的變異體」在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO.3的蛋白質或多肽，但與SEQ ID NO.1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO.3的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語「編碼多肽的多核苷酸」是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位病原體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實際上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優選具有70％的相同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC、0.1％SDS、60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(V/V)甲醯胺、0.1％小牛血清/0.1％Ficoll、42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好在97％以上時才發生雜交。並且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO.3所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與以上所述的序列雜交的核酸片段。如本發明所用，「核酸片段」的長度至少含8個核苷酸，較好是至少20～30個核苷酸，更好是至少50～60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼OsBTB基因的多核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的編碼OsBTB基因的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術但不局限於(1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和(2)表達文庫的抗體篩選出具有共同結構特徵的克隆的多核苷酸片段。
本發明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限於)(1)DNA-RNA或DNA-DNA雜交；(2)標誌基因功能的出現或喪失；(3)測定OsBTB的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或直接用OsBTB基因的編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
本發明中，編碼OsBTB基因的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發明所述多核苷酸的重組載體。術語「載體」指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限於在細菌中表達的基於T7啟動子的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源於杆狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都可以用於構建重組表達載體。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含編碼OsBTB基因的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列強會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個鹼基對，作用於啟動子以增強基因的轉錄。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用地二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌地四環素或氨苄青黴素抗性等。
本領域技術人員都清楚如何選擇適當的載體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發明中，編碼OsBTB基因的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語「宿主細胞」指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS、Bowes黑素瘤細胞等。
通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的OsBTB多肽(Science，1984；2241431)。一般來說有以下步驟(1)用本發明的OsBTB的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)在合適的培養基中培養宿主細胞；(3)從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明OsBTB基因產生的轉錄本及其編碼的多肽可直接用於研究在生物體內的作用機制、編碼蛋白對生物生理生化的影響、寄主與宿主的互作和抗病性的研究等本發明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，並進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質譜分析。
編碼OsBTB基因的多核苷酸可用於植物的疾病診斷。編碼OsBTB基因的多核苷酸可用於OsBTB基因的表達與否。如編碼OsBTB基因的DNA序列可用於雜交以判斷OsBTB基因的表達情況。雜交技術包括Southern印跡法和Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA晶片(又稱為「基因晶片」)上，用於分析組織中基因的差異表達和基因克隆。用OsBTB基因特異引物進行RNA-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測OsBTB基因的轉錄產物。
檢測OsBTB基因的突變也可用於研究OsBTB基因異常功能相關的疾病。OsBTB基因突變形式包括與正常野生型OsBTB基因DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其他任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、Northern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外。突變有可能影響蛋白的表達，因此用Southern印跡法和Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑑定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條水稻染色體具體位置且並可以與其雜交。目前，需要鑑定染色體上的各基因的具體位點。現在，只有很少的基於實際序列數據(重複多態性)的染色體標記物可用於標記染色體位置。根據本發明，為了將這些序列與抗稻瘟病病以及植物的生殖發育過程相關聯，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位於染色體上。本發明的研究發現運用中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46的F8重組自交系群體的親本為材料，對OsBTB基因進行RFLP進行多態性分析，OsBTB基因在親本中以1～2拷貝存在，位於第2號染色體，且在兩個重組自交系群體的一個公共標記RZ324附近。
本發明的編碼OsBTB基因的多核苷酸序列的染色體定位可以有多種方法，例如體細胞雜合細胞的PCR定位法、原位雜交、RFLP法和螢光原位雜交(FISH)法等。
簡而言之，根據cDNA製備PCR引物(優選15～35bp)，可以將序列定位於染色體上。然後，將這些引物用於PCR篩選含各條水稻染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應於引物的水稻基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現亞定位。可用於染色體定位的其他類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA文庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行螢光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human ChromosomesManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
比較抗病與感病個體間的cDNA和基因組序列的差異，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基於cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據目前的物理圖譜和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與抗病有關的染色體區域的cDNA，可以是50至500個潛在抗病基因間之一種(假定1兆鹼基作圖分辨能力和每20kb對應於一個基因)。
下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所介定的本發明範圍。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 OsBTB基因的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取水稻總RNA。用Quick mRNA Isolation Kit(Qiagene)從總RNA種分離poly(A+)mRNA。2μg poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(Clontech)將cDNA片段定向插入到pBS SK(+)載體(Clontech)的多克隆位點上，轉化DH-5α感受態細胞，形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reaction sequencingkit(promega，U.S.A.)和Megabase1000測序儀測定所有克隆的5』和3』末端的序列。將測定的cDNA序列與Genbank資料庫比較，結果發現其中一個克隆的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，該克隆所含的全長cDNA為1991bp(SEQ ID NO.1)。經進一步的研究發現，該全長DNA序列為2661bp(SEQ IDNO.3)，包含7個外顯子和6個內含子(附圖)。
實施例2用RT-PCR方法克隆編碼OsBTB多肽的OsBTB基因用稻瘟病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)處理水稻抗病品種(IR26)和感病品種(金剛30)愈傷組織，分別提取總RNA(嚴格按照Trizol試劑盒說明書要求操作)作為逆轉錄反應的模板，按照下列體系進行逆轉錄反應合成cDNA引物分別為Primer15』-ATGGCCGGGAGCGAGGCGGCGTTTTTTTTTTTTTTT-3′(3′(反轉錄用))；Primer25′-GGCCTCGAGTCAGACAGTGGGTTGCTTTAT-3′(5′(反轉錄用))Primer35′-GGCCTCGAGTCAGACAGTGGGTTGCTTTAT-3′(3′(擴增用))Primer45′-CTAGCTAGCATGGCCGGGAGCGAGGCGGCG-3′(5′(擴增用))流程為100ng/μl的3′5′2.5μl，RNA 5μl(約200ng)，5μl DEPC-H2O混合後70℃水浴5min，冰浴5min；加入5×RT緩衝液6μl，0.1 mol/L DTT 3μl，20nmol/LdNTPs 3μl，2μl MMLV(200U/μl)，RNasin 1μl，總體積50μl。42℃溫浴2小時。65℃滅活。稀釋50倍後取5μl作模板進行PCR擴增。
擴增反應的條件50μl的反應體系中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Tag DNA聚合酶(Clontech)。在HybaidPCR儀上按照下列程序進行反應94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；36cycles。
在RT-PCR時同時設定-actin為陽性對照和模板為陰性對照。擴增產物用試劑盒純化(Qiagene，Germany)，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrongen，U.S.A.)。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與SEQ ID NO.2所示的1~1674完全相同。
實施例3 Northern印跡法分析OsBTB基因的表達用一步法提取總RNA(Anal.Biochem.1987，162.156-159)。該法包括酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合後離心。吸取水相，加入異丙醇(0.8體積)並將混合物離心得到RNA沉澱，將得到的RNA沉澱用70％乙醇洗滌，乾燥並溶於水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然後轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法製備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為PCR擴增的OsBTB編碼區序列。將32P-標記的探針與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中於42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲醯胺-25mM KH2PO4(Ph7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之後，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中於55℃洗30min。然後，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實施例4 OsBTB多肽的體外表達、分離和純化根據SEQ ID NO.3所示的編碼區序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer5 5』-CTA GCT AGC ATG GAT GAG GAA ATT TCC GTA-3』Primer6 5』-GGC CTC GAG TCA AGC AAC TGA ATG GTC AAA-3』此兩段引物的5』端分別含有Nhe I和Xho I酶切位點，其後分別為目的基因的5』和3』的編碼序列，Nhe I和Xho I酶切位點相應於載體質粒pET-28b(+)(Novagen)上的選擇性內切酶位點。以含有全長OsBTB基因的質粒克隆為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含有質粒模板10pg、引物分別為10pmol、Advantage polymerase mix(Clontech)1μl。94℃，4min；94℃，20sec；60℃，30sec；72℃，2min；36cycles。
用Nhe I和Xho I分別對擴增產物和質粒pET-28b(+)進行雙酶切，分別回收大片段，並用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿菌DH-5α，在含卡那黴素(終濃度100μg/ml)的LB平板培養過夜後，用菌落PCR法篩選陽性克隆，並進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(OsBTB基因的質粒克隆)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen)。在含卡那黴素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養中，宿主菌BL21(OSBTB基因的質粒克隆)在37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續培養5小時。離心收集菌體，經超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind QuickCartridge(Novagen)進行層析，得到了純化的目的OsBTB多肽。經SDS-PAGE電泳，得到一條單一的條帶。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端胺基酸序列分析，結果N-端15個胺基酸與SEQ ID NO.3所示的N-端15個胺基酸完全相同(圖5)。
實施例5本發明的多核苷酸片段用作雜交探針的應用從本發明的多核苷酸中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針有多方面的用途，如用該探針可與不同來源的正常組織或病理組織的基因組或cDNA文庫雜交以鑑定其是否含有本發明的多核苷酸序列和檢出同源的多核苷酸序列，進一步還可用該探針檢測本發明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常組織或病理組織細胞中的表達是否異常。
本實施例的目的是從本發明的多核苷酸SEQ ID NO.1中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針，並用濾膜雜交方法鑑定一些組織中是否含有本發明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。濾膜雜交方法包括斑點印跡法、Southern印跡法、Northern印跡法和複印方法等，它們都是將待測的多核苷酸樣品固定在濾膜上後使用基本相同的步驟雜交。這些相同的步驟是固定了樣品的濾膜首先用不含探針的雜交緩衝液進行預雜交，以使濾膜上樣品的非特異性的結合部位被載體和合成的多聚物所飽和。然後預雜交液被含有標記探針的雜交緩衝液替換，並保溫使探針與靶核酸雜交。雜交步驟之後，未雜交上的探針被一系列洗膜步驟除掉。本實施例利用較高強度的洗膜條件(如較低鹽濃度和較高的溫度)，以使雜交背景降低且只保留特異性強的信號。本實施例選用的探針包括兩類第一類探針是完全與本發明的核苷酸SEQID NO.1相同或互補的寡核苷酸片段；第二類探針是部分與本發明的核苷酸SEQ ID NO.1相同或互補的寡核苷酸片段。本實施例選用斑點印跡法將樣品固定在濾膜上，在較高強度的洗膜條件下，第一類探針與樣品的雜交特異性較強而得以保留。
一、探針的選用從本發明的多核苷酸SEQ ID NO.1中選擇寡核苷酸片段用作雜交探針，應遵循以下原則和需要考慮的幾個方面1.探針大小優選範圍為18-50個核苷酸；2.GC含量為30-70％，超過則非特異性雜交增加；3.探針內部應無互補區域；4.符合以上條件的可作為初選探針，然後進一步作計算機序列分析，包括將該初選探針分別與其來源序列區域(即SEQ ID NO.1)和其它已知的基因組序列及其互補區進行同源性比較，若與非靶分子區域的同源性大於85％或者超過15個連續鹼基完全相同，則該初選探針一般就不應該使用；5.初選探針是否最終選定為有實際應用價值的探針還應進一步由實驗確定。完成以上各方面的分析後挑選併合成兩種探針探針1，與SEQ ID NO.1的基因片段完全同源或互補；探針2，與SEQ ID NO.1的基因片段或其互補片段的替換突變序列。
與以下具體實驗步驟有關的其他未列出的常用試劑及其配製方法請參考文獻DNA PROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實驗手冊書籍如《分子克隆實驗指南》(1989年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學出版社。
植物基因組DNA的提取在50ml離心管中加入20ml提取緩衝液I，60℃水浴預熱。水稻幼苗或葉子5~10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀後立即倒入預熱的離心管中，劇烈搖動混勻，60℃水浴保溫30~60min(時間長，DNA產量高)，不時搖動。加20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫靜置5~10min，使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。室溫5000rpm離心5min。仔細移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現絮狀DNA沉澱。在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻棒撈出DNA絮團，乾淨吸水紙上吸乾，轉入含TE的離心管中，DNA很快溶解於TE。若DNA未形成絮狀沉澱，則可用5000rpm離心5min，再將沉澱移入TE管中。這樣收集的沉澱，往往難溶於TE，可在60℃水浴置15min以上，以助溶。將DNA溶液3000rpm離心5min，將上清倒入乾淨的5ml離心管。加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對DNA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃置20min左右，DNA形成絮狀沉澱。用玻棒撈出DNA沉澱，70％乙醇漂洗，吸水紙吸乾。將DNA重溶於1ml TE，-20貯存。取2μl DNA樣品在0.7％Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時取15μl稀釋20倍，測定OD260/OD280，檢測DNA含量及質量。分裝後存放於-20℃。
樣膜的製備1)取4×2張適當大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，用鉛筆在其上輕輕標出點樣位置及樣號，每一探針需兩張NC膜，以便在後面的實驗步驟中分別用高強度條件和低強度條件洗膜。2)吸取樣品及對照各15μl，點於樣膜上，在室溫中晾乾。3)置於浸潤有0.1mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl的濾紙上5min(2次)，晾乾置於浸潤0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/L NaCl的濾紙上5min(2次)，晾乾。4)夾於乾淨濾紙中，以鋁箔包好，60-80℃真空乾燥2小時。探針的標記1)3μl Probe(0.1OD/10μl)，加入2μl Kinase緩衝液，8-10μCi-32P-dATP+2UKinase，以補加至終體積20μl。2)37℃保溫2小時。3)加1/5體積的溴酚藍指示劑(BPB)。4)過Sephadex G-50柱。5)至少32P-Probe洗出前開始收集第一峰(可用Monitor檢測)。6)5滴/管，收集10-15管。7)用液體閃爍儀監測同位素量。8)合併第一峰的收集液後即為所需製備的32P-Probe(第二峰為游離γ-32P-dATP)。
預雜交將樣膜置於塑膠袋中，加入3-10mg預雜交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/ml CTDNA(小牛胸腺DNA))，封好袋口後，68℃水浴搖2小時。
雜交將塑膠袋剪去一角，加入製備好的探針，封好袋口後，42℃水浴搖過夜。洗膜一、高強度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。2)2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)。3)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)。4)0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30min(2次)，室溫晾乾。
二、低強度洗膜1)取出已雜交好的樣膜。2)2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15min(2次)。3)0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15min(2次)。4)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)，室溫晾乾。
實驗結果採用低強度洗膜條件所進行的雜交實驗，以上兩個探針雜交斑放射性強弱沒有明顯區別；而採用高強度洗膜條件所進行的雜交實驗，探針1的雜交斑放射性強度明顯強於另一個探針雜交斑的放射性強度。因而可用探針1定量和定性地分析本發明的多核苷酸在不同組織中的存在和差異表達。
實施例6 DNA Microarray基因晶片或基因微陣列(DNA Microarray)是目前許多國家實驗室和大製藥公司都在著手研製和開發的新技術，它是指將大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻片、矽片、硝酸纖維素膜等載體上，然後用螢光或同位素檢測和計算機軟體進行數據的比較和分析，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的、本發明的多核苷酸可作為靶DNA用於基因晶片技術用於高通量研究新基因功能；尋找和篩選組織特異性新基因特別是疾病相關基因；疾病的診斷，如遺傳性疾病、其具體方法步驟在文獻中已有多種報導，如可參閱文獻Derisi，J.L.，Lyer，V.and Brown，P.O.(1997)Science 278，680-686.及文獻Helle，R.A.，Schema，M.，Chai，A.，Shalom，D.，(1997)PNAS 942150-2155.
(一)點樣各種不同的全長cDNA共計4000條多核苷酸序列作為靶DNA，其中包括本發明的多核苷酸、將它們分別通過PCR進行擴增，純化所得擴增產物後將其濃度調到500ng/μl左右，用GAC Solution點樣儀(購自美國)點於尼龍膜上。將點樣後的玻片進行水合、乾燥、置於紫外交聯儀中交聯，洗脫後乾燥使DNA固定在尼龍膜上製備成晶片。其具體方法步驟在文獻中已有多種報導，本實施例的點樣後處理步驟是1)潮溼環境中水合4分鐘；2)0.2％SDS洗滌1分鐘；3)ddH2O洗滌兩次，每次1分鐘；4)NaBH4封閉5分鐘；5)95℃水中2分鐘；6)0.2％SDS洗滌1分鐘；7)ddH2O洗滌兩次；8)晾乾，25℃儲存於暗處備用。
(二)探針標記用一步法分別從水稻特定的愈傷組織(用稻瘟病菌處理水稻抗病品種(IR26)和感病品種(金剛30))中抽提總mRNA，並用Oligotex mRNA Midi Kit(購自QiaGen公司)純化mRNA，運用隨機引物通過反轉錄分別將同位素α-33p-CTP(購自Amersham PhamaciaBiotech公司)標記水稻抗病品種(IR26)mRNA和感病品種(金剛30)mRNA，經純化後製備出探針。具體步驟參照及方法見Schena，M.，Shalon，D.，Heller，R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.9310614-10619.Schena，M.，Shalon，D.，Davis，R.W.(1995)Science.270.(20)467-480.
(三)雜交分別將來自以上兩種組織的探針與晶片一起在UniHybTM HybridizationSolution(購自TeleChem公司)雜交液中進行雜交16小時，室溫用洗滌液(1×SSC，0.2％SDS)洗滌後用Scanarray3000掃描儀(購自美國General Scanning公司)進行掃描，掃描的圖象用Imagene軟體(美國Biodiscovery公司)進行數據分析處理，算出每個點的Ratio比值。
實施例7.OsBTB基因的染色體定位為了進一步了解OsBTB基因在染色體上位置及其在水稻基因組中存在的拷貝數，我們篩選了該基因在三個重組自交系群體親本間的RFLP多態性，並對該基因在篩選到的重組自交系群體中進行了定位。
材料和方法選用由中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46；協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的F8重組自交系群體的親本為材料，用於OsBTB基因的RFLP多態性鑑定。由247個株系組成的珍汕97B/密陽46重組自交系群體和210個株系組成的協青早B/密陽46重組自交系群體分別應用於基因定位研究。
RFLP定位
一、DNA提取、酶解、southern轉膜參照《分子克隆實驗方法》(薩姆布魯克J，1989)方法。以BamH I、Dra I、EcoR I、EcoR V和Hind III五種限制性內切酶分別對三個重組自交系珍汕97B/密陽46、協青早B/密陽46和中156/谷梅2號的5個親本進行酶解。
二、探針標記與分子雜交及信號檢測用ECL檢測系統(Amersham pharmacia Biotech)，參照莊傑雲(浙江大學博士論文2001)優化方法。(一)預雜交將濾膜放入預熱到41℃的含有0.5mol/L NaCl和5％封閉試劑的雜交液中，預雜交1h。所有雜交液的用量為每一張10cm×20cm濾膜一般用量為10-15ml。(二)探針標記用雙蒸水稀釋探針為10ng/μl，沸水中變性5min，冰浴5min；加入與探針等體積的標記試劑(辣根過氧化物酶)，緩慢混勻；再加入等體積的化學膠聯試劑戊二醛溶液，緩慢混勻；37℃保溫15min，置於冰上，馬上進行雜交。(三)雜交標記好的探針加入預雜交液中混勻，在41℃下緩慢震蕩，雜交過夜。(四)洗膜將濾膜從雜交液中取出，DNA面朝上，逐張放入洗滌液I(5M尿素、0.5×SSC、0.4％SDS)，於41℃下洗滌2×15min，再用洗滌液II(2×SSC)在室溫下洗滌2×5min。(五)信號檢測在一個空盒中混合等體積的檢測試劑I和檢測試劑II，馬上將濾膜放入，DNA面朝上，使檢測試劑蓋住濾膜；取出濾膜，略微滴幹後置於吸水紙上，DNA面朝上；移到保鮮膜上，DNA面朝下包好；放入裝有增感屏的X光片夾中，DNA面朝上。在暗紅燈下壓上X光片；暴光0.5-2h，常規衝片。
三、數據分析及連鎖圖構建應用MAPMAKER/EXP3.0(Lancoln et al，1992a)構建連鎖圖，以LOD＝3.0將各標記歸入連鎖群，以LOD＝2.0確定連鎖群內標記的順序，部分區間含有多個緊密連鎖的標記，標記間順序無法達到LOD＝2.0的置信度，暫以計算結果提供的最佳順序排列。採用Kosambi函數(1944)將重組值轉換成遺傳圖距，根據前人發表的圖譜確定各連鎖群的染色體號(Causse et al，1994)OSBTB基因的圖譜定位選用珍汕97B/密陽46重組自交系群體的247個株系DNA，經EcoR I進行酶解轉膜，以OsBTB克隆為探針，進行雜交；經MAPMAKER/EXP3.0連鎖分析，在97B/密陽46重組自交系群體中將其定位於水稻第2染色體上RG108和RM210B之間，距離分別為6.5cM和3.5cM；以我們所定位的OsBTB基因緊密連鎖G104標記與NCBI公布的水稻基因組第8號染色體圖譜(www.ncbi.nlm.nih.gov/cig-bin/Entrez/maps.cgi？org＝rice8chr＝8)比較，發現該基因位於水稻第8號染色體著絲粒附近(表1)。
表1 OsBTB基因在珍汕97B/密陽 實施例8.OsBTB基因的功能研究46重組自交系群體的染色體定位通過構建OsBTB基因cDNA全長序列正義表達與反義表Markers Distance 達的植物轉化載體，用農桿菌侵染法對水稻進行轉化，RG555 3.7cM 希望從該基因在水稻中超表達與阻斷表達後水稻表型RZ915 1.4cM 對比，進一步了解該基因的生理功能。
RZ957 4.6cM 供試水稻品種秈稻品種(O.sativa L.sub.indica)H7SRG634 1.5cM 實驗方法RZ512 0.9cM 一、正義與反義表達的植物轉化載體構建，以下載體構RM71 4.2cM 建方法參照《重組DNA的原理與方法》(李德葆等，OSB 0.4cM 1994)。1)pGEM-T-OsBTB質粒的EcoR I酶切；2)酶切RZ324 1.8cM 片段OsBTB/E的回收(嚴格按Concert TM Rapid GelRZ288 7.5cM Extraction Systerm要求操作)；3)pBluescript SK(pBS)RG171 2.4cM 載體的EcoR I酶切及抽提；4)回收片段OsBTB/E與pBSRG120 0.7cM 載體的連接；5)連接產物的轉化感受態細胞及蘭白斑篩RZ717 3.9cM 選；6)鹼法小量製備重組質粒DNA；7)pBS-OsBTB質粒RZ668 2.6cM EcoR I酶切鑑定；8)pBS-OsBTB質粒的BamH I酶切及RG252 0cM OsBTB/B片段回收；9)pCAMBIA 1301質粒BamH I酶切RG905 1cM 及抽提；10)pCAMBIA1301與OsBTB/B片段的連接；RZ401 3.3cM 11)pCAMBIA1301-OsBTB(pCAM-OsBTB)轉化感受態細胞RZ318 5.6cM 及鹼法小量製備重組質粒DNA；12)BamH I酶切鑑定RZ123 7cM pCAMBIA1301與OsBTB/B片段連接情況；13)pCAM-OsBTB質粒的EcoR I酶切鑑定片段連接方向；14)轉化載體的PCR驗證。運用下列引物對對所得質粒進行PCR擴增，擴增條件94℃30sec、60℃45sec、72℃80sec、40循環。
Primer75』-GGATCCACCAAGTGACAATATGGATGAGGAA-3』Primer85』-TATAAGAATCCATTGTTCAGGCC-3』二、水稻轉化用於本研究的細菌培養基及水稻組織培養培養基見表2、3表2細菌培養基培 養 組分 參考文獻基16g/L蛋白腖，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl， Sambrook J，20012YTpH7.0YEB 5g/L蛋白腖，1g/L酵母提取物，5g/L牛肉浸膏，Vervliet等，
5g/L蔗糖，2mmol/LMgSO4，pH7.019753g/LK2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/LNH4Cl，300mg/L Chilton等，1974ABMgSO4，150mg/L KCl，10mg/L CaCl，2.5mg/LFeSO4.7H2O，5g/L葡萄糖，pH7.0表3水稻組織培養培養基培養基 組份愈傷組織誘導及培養用培養基N6(Chu 1978)鹽份和維生素，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，N6D24-D，2.5g/L phytegal，pH5.8懸浮細胞培養用培養基AA(Toriyama等1985)鹽份和胺基酸，MS(Murashige等，1962)維生素，AA0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，0.2mg/L KT，pH5.8共培養培養基AA鹽份和胺基酸，MS維生素，0.5g/L水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/LAAM蔗糖，100μmol/L乙醯丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2，10g/L葡萄糖，100μmol/L乙醯丁香酮，pH5.2N6鹽份和維生素，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2.5g/L phytagel，N6C100μmol/L乙醯丁香酮，pH5.8篩選培養基N6D2，0.25g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/LN6D2S1 玉米素(zeatin)，0.5mg/LKT，2.0g/L phytagel，25mg/L潮黴素，250mg/L頭孢黴素，pH5.8N6D2，0.25g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/LN6D2S2 玉米素(zeatin)，0.5mg/LKT，2.0g/L phytagel，50mg/L潮黴素，250mg/L頭孢黴素，pH5.8分化培養基MS鹽份，MS維生素、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/L玉MSBK米素(zeatin)、0.2mg/L NAA、50mg/L潮黴素、2.0/L phytagel，pH5.8生根培養基1/2MS鹽份，MS維生素，30g/l蔗糖，0.2mg/L NAA，50 mg/L潮黴素，1-2mg/L1/2MSOEMH多效唑(劉明華等1995)，2.0g/L phytagel，pH5.8
三、雙元載體導入農桿菌及酶切鑑定參考Hofgen等(1998)的凍融法直接將雙元載體pCAMBIA 1301導入根癌農桿菌菌株EHA105，具體步驟如下1)根癌農桿菌生長於YEB(無抗生素)固體平板上，任挑一單菌落接入5mL YEB液體培養基中28℃、200rpm培養過夜；2)按1％接種量將上述菌液接種於50mL新鮮的YEB液體培養基中，28℃、200rpm培養至對數生長期；3)4000g、4℃、8min離心收集農桿菌菌體，用5mL預冷的TE(pH7.5)(10mmol/L Tris-Cl，pH7.5，1mmol/L EDTA)洗滌一次，加入5mL新鮮YEB培養基重新懸浮；4)取200μl菌液分裝於1.5mL eppendorf管中，液氮速凍後於-70℃保存備用；5)直接取步驟3中200μl菌液(或取一管凍存細胞冰上化凍)加入1μg質粒DNA混勻，然後依次於冰上、液氮上、和37℃水浴中放置5min；6)用新鮮的YEB液體培養基稀釋至1mL，於28℃振蕩培養2-4小時；7)取200μl塗布於含Km 50mg/L的YEB平板上，28℃培養2-3天；8)生長的菌落在含Km 50mg/L的YEB平板上劃分單菌，重複3次；9)隨機挑選2個單菌落，用鹼法小量製備質粒DNA；10)用氯化鈣法將質粒DNA轉化入E.coli DH5α感受態細胞中；11)再隨機挑選2個單菌落，用鹼法小量製備質粒DNA，進行酶切鑑定(圖2)。
四、轉化農桿菌後質粒鑑定導入農桿菌後質粒的酶切鑑定操作參照《重組DNA原理和方法》(李德葆等，1994)的方法。用鹼法小量製備質粒DNA，用EcoR I酶切。質粒DNA經氯化鈣法轉化E.coli DH-5α。
五、水稻幼胚愈傷組織的誘導授粉後12-15天的水稻未成熟種子經70％乙醇浸泡1分鐘後於2％的NaClO溶液中(加入2-3滴土溫20)消毒60分鐘以上，用無菌水衝洗4-5次，用解剖刀和鑷子挑出幼胚並培養於N6D2培養基上誘導愈傷組織(圖3)。
六、根癌農桿菌的培養及水稻的轉化(一)根癌農桿菌培養農桿菌菌種自YEB平板上接種到3mL含Km 50mg/L的YEB液體培養基中於28℃、200rpm培養過夜，第二天按1％接種量接入含Km 50mg/L的AB液體培養基中，28℃、200rpm繼續培養至分光光度計上600nm讀數0.8左右，將新鮮的培養液於5000g、4℃離心5min，收集並重新懸浮於1/3體積的AAM液體培養基中，用於水稻幼胚愈傷組織的轉化。(二)水稻幼胚愈傷組織與根癌農桿菌的共培養轉化轉化前製備N6D2C固體培養基時，在製備好的培養基上鋪一層無菌濾紙，並用少量新鮮的AAM液體培養基潤溼。在6mL培養皿中將預培養後的愈傷組織浸泡於新鮮的AAM農桿菌菌液並不時搖動，20min後將水稻材料取出，在無菌濾紙上吸去多餘的農桿菌菌液，隨即轉移到上述N6D2C培養基上於28℃共培養3天。共培養時，在共培養培養基AAM、N6D2C中添加100μmol/L的乙醯丁香酮(AS)作為農桿菌Vir基因的活化誘導物。共培養三天後，從培養基上取出轉化水稻材料，用無菌水洗一次並於無菌濾紙上吸乾菌液和水份。(三)轉化後愈傷組織的篩選、分化及生根(1)愈傷組織的處理、篩選及分化將愈傷組織從N6D2C固體培養基中取出，無菌條件下用鑷子和解剖刀將芽切除。去除芽的愈傷組織接種於N6D2S1培養基，12-14天後轉接於N6D2S2培養基繼續篩選。兩周後，將抗性愈傷組織接種於MSBK分化培養基誘導分化。轉接時挑選分化狀態良好的愈傷組織，並注意同一愈傷組織所增殖的新愈傷在轉接時不要分開接種，以便準確統計抗性愈傷轉化效率。(2)轉化植株的再生將分化的小苗栽入1/2MSOEMH生根培養基。生根後，將再生植株從生根管取出，自來水將根部培養基衝洗乾淨後，經練苗移栽溫室。(四)植株再生與轉化頻率的計算轉化效率為抗性愈傷分化後產生的總株系(含白化苗)數與轉入第一輪選擇的愈傷組織數的比值，即轉化效率＝分化的總苗株(系)數/進入第一輪選擇的愈傷組織數×(100％)。其中一個株係指由一個抗性愈傷分化而來的一棵或幾棵苗。計算愈傷組織轉化頻率的公式為(劉巧泉等，1998)穩定轉化率＝能夠產生HYGr水稻植株的幼胚數/與農桿菌共培養的幼胚總數×(100％)七、轉基因株的鑑定(一)轉基因水稻植株總DNA提取，參照《重組DNA的原理與方法》(李德葆等，1994)的方法。(二)轉基因植株的PCR分析用以下引物對正義轉基因株DNA及反義轉基因株DNA進行PCR鑑定。Primer35S15′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′；Primer35S25′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3』；PrimerNos15′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′；PrimerNos25′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′；Primer BBRG35′-ACATCCACCGCTGCTTGAGGCAG-3′；PrimerBBRG65′-TGCCTGAGATCCCTCGATTCT-3′。引物組合為35S1×35S2；35S1×BBRG3；35S1×BBRG6；Nos1×Nos2。反應體系為模板DNA 100ng；10×緩衝液5μl；20mM dNTP 0.5μl；100ng/μl引物各0.5μl；Taq酶2U；加水至體積50μl。反應條件35S與Nos檢測用94℃30sec、54℃45sec、40循環；35S1×BBRG或BBRG6用94℃30sec、56℃45sec、72℃80sec、40循環。轉基因株的PCR鑑定結果(圖4)八、OsBTB基因抗病性鑑定對獲得的OsBTB基因抗病植株進行抗病性檢測。用稻瘟病菌噴灑水稻3～4葉期的幼苗，三個星期後觀察葉片發病情況。其結果如圖6所示。
序列表(1)SEQ ID No.1的信息(a)序列特徵長度1974個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.1SEQ ID No.1cgcccttgtcgtccaaccctcctctcctcccctcctcgtcgcggggctagggttacgccccctcctcctcctcctcctcctcgtcgtgtgggggcatggccgggagcgaggcggcggcggcgcaggaggcggagatggacccggacttctcgggcgggggcggtgggggccccagcttcgagttcgccttcaactcggtcaacttctccgaccgggtgctccggatcgaggtcgtcgcgggggacgacgacgacgacgacgaccacgcgcccggctccagccgggacggcggggccggctcgctttcggattgggcgcgccaccgcaagcgccgccgtgaggagctcctcaaggagaaagagtctgaagcagtcatgccagaccagataaattgcaaagtagaaccagaagaatgtgatgcatatgaagaaaatcaagaagaacctgtagcaatgatggacgactctccacccagtgttggccctgatggtgatgatggaccaagtatggactcaccttggagtggtggggtgagcacaccagttctaagagtaaagaacatttatatcagttcagcgattcttgcagcaaaaagtcctttctttttcaagcttttctcaaatggcatgaaagaatctgatgagaggcaggcaacccttagaattactgattcagaggaaaatgcccttatggagcttttaagctttatgtacagtggaaagttgacatcaactgaccctactcttctactggatattctgatggctgctgacaagtttgaggttgtttcgtgcatgaggtactgcagtcagttgctcacaagcttgactatgactacagaatctgcactactctacctagatcttccatgctccatttcgatggctgctgcagttcaacctctgacagatgcagccaaggaatatctttccaacaaatacaaggatttgactaagttccaagatgaagtgatgaacatccctcttgctggaatcgaagccatcttgtcaagtaatgacctccaggtggcatctgaagatgctatctacgatttcttgatcaggtgggctcgcgcacaataccctaaatcagaggaaaggcgtgagatcttgagttctcgtttgcttccgctcgtgcgattcagtcacatgacctgtaggaagctgcggaaggtcctaatatgcaccgatctggaccatgagcaagcaaccaagtgtgtcactgaggcacttctatataaagctgatgctccacacaggcaacgtgctctcgcagcagacgtaacaacctgtcggaaatttgcagagcgggcttacaagtacagacctttgaaagttgttgagtttgaccgaccctacccacagtgtatagcatacttggatctaaagcgcgaagagtgctcccggctcttcccgtcaggtcggatgtactctcaagccttccatcttgcagggcagggcttcttcctctcagcacactgtaacatggaacagcagagtacgttctactgcttcggtctcttcttagggatgcaagagaagggctcaatgagcgtgacagtagattatgagtttgctgcaaggacaagaccgtcaggagagtttgtgagcaagtacaagggtaactacacgttcaccggtgggaaggcggttggttacaggaatctctttgcgataccatggtcgacgttcatggctgacgacagcctcttcttccttgacggcgtgttgcatctgagagctgaattgacgataaagcaacccactgtctaatgtactgctgccaaactcaagttggctttgcgctcgagtgggtgatagtgcgaaacatcacatgctgcagatatcgtattgttttttttccccttcttctatgcttaaacccttttgttgatagaaactttgcaaatgacaagtggaaaaaaaaagaactaaaaccggtctcttttactggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特徵長度1674個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型cDNA
(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID NO.2SEQ ID NO.2 atggccgggagcgaggcggcggcggcgcaggaggcggagatggacccggacttctcgggcgggggcggtgggggccccagcttcgagttcgccttcaactcggtcaacttctccgaccgggtgctccggatcgaggtcgtcgcgggggacgacgacgacgacgacgaccacgcgcccggctccagccgggacggcggggccggctcgctttcggattgggcgcgccaccgcaagcgccgccgtgaggagctcctcaaggagaaagagtctgaagcagtcatgccagaccagataaattgcaaagtagaaccagaagaatgtgatgcatatgaagaaaatcaagaagaacctgtagcaatgatggacgactctccacccagtgttggccctgatggtgatgatggaccaagtatggactcaccttggagtggtggggtgagcacaccagttctaagagtaaagaacatttatatcagttcagcgattcttgcagcaaaaagtcctttctttttcaagcttttctcaaatggcatgaaagaatctgatgagaggcaggcaacccttagaattactgattcagaggaaaatgcccttatggagcttttaagctttatgtacagtggaaagttgacatcaactgaccctactcttctactggatattctgatggctgctgacaagtttgaggttgtttcgtgcatgaggtactgcagtcagttgctcacaagcttgactatgactacagaatctgcactactctacctagatcttccatgctccatttcgatggctgctgcagttcaacctctgacagatgcagccaaggaatatctttccaacaaatacaaggatttgactaagttccaagatgaagtgatgaacatccctcttgctggaatcgaagccatcttgtcaagtaatgacctccaggtggcatctgaagatgctatctacgatttcttgatcaggtgggctcgcgcacaataccctaaatcagaggaaaggcgtgagatcttgagttctcgtttgcttccgctcgtgcgattcagtcacatgacctgtaggaagctgcggaaggtcctaatatgcaccgatctggaccatgagcaagcaaccaagtgtgtcactgaggcacttctatataaagctgatgctccacacaggcaacgtgctctcgcagcagacgtaacaacctgtcggaaatttgcagagcgggcttacaagtacagacctttgaaagttgttgagtttgaccgaccctacccacagtgtatagcatacttggatctaaagcgcgaagagtgctcccggctcttcccgtcaggtcggatgtactctcaagccttccatcttgcagggcagggcttcttcctctcagcacactgtaacatggaacagcagagtacgttctactgcttcggtctcttcttagggatgcaagagaagggctcaatgagcgtgacagtagattatgagtttgctgcaaggacaagaccgtcaggagagtttgtgagcaagtacaagggtaactacacgttcaccggtgggaaggcggttggttacaggaatctctttgcgataccatggtcgacgttcatggctgacgacagcctcttcttccttgacggcgtgttgcatctgagagctgaattgacgataaagcaacccactgtc(3)SEQ ID No.3的信息(a)序列特徵長度558個胺基酸類型胺基酸拓撲結構線性(b)分子類型多肽(c)序列描述SEQ ID No.3SEQ ID NO.3M A G S E A A A A Q E A E M D P D F S G G G G G G P S F E F A F N S V N F S D R V L R I E V V A G DD D D D D D H A P G S S R D G G A G S L S D W A R H R K R R R E E L L K E K E S E A V M P D Q I NC K V E P E E C D A Y E E N Q E E P V A M M D D S P P S V G P D G D D G P S M D S P W S G G V S T PV L R V K N I Y I S S A I L A A K S P F F F K L F S N G M K E S D E R Q A T L R I T D S E E N A L M E LL S F M Y S G K L T S T D P T L L L D I L M A A D K F E V V S C M R Y C S Q L L T S L T M T T E S A LL Y L D L P C S I S M A A A V Q P L T D A A K E Y L S N K Y K D L T K F Q D E V M N I P L A G I E A IL S S N D L Q V A S E D A I Y D F L I R W A R A Q Y P K S E E R R E I L S S R L L P L V R F S H M T CR K L R K V L I C T D L D H E Q A T K C V T E A L L Y K A D A P H R Q R A L A A D V T T C R K F A ER A Y K Y R P L K V V E F D R P Y P Q C I A Y L D L K R E E C S R L F P S G R M Y S Q A F H L A G QG F F L S A H C N M E Q Q S T F Y C F G L F L G M Q E K G S M S V T V D Y E F A A R T R P S G E F VS K Y K G N Y T F T G G K A V G Y R N L F A I P W S T F M A D D S L F F L D G V L H L R A E L T I KQ P T V(4)SEQ ID No.4的信息
(a)序列特徵長度8308個鹼基類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分子類型DNA(c)最初來源水稻(d)序列描述SEQ ID No.4SEQ ID No.4agatccggcatgaagcggcgcggcagcccggcatgcctctcgctcacgatgcgggaaggcggaagtacgctaccgtcaagcagagcggagccccgtgccatggcgccagaggaagagatgattgagagcgagcgtgtgtggcgagggtaaggcgcagcagagaaagagttagggctcaagcagcgaaggcaaggggaataatggcgaaaggaagggagcaaatcctttcctcggtgtttttatacctttgccatcgctgtgcccggctcctcgtttctcgcgcccactatcccgctccctcgtttctcactatctcgctccctcgattctcgtgcccacgcttccactaatcccattcgcccgcttgcggcgcatgaggtggatatgcggttgtggcagtcgagacagatcgtatcgtgcgcgcgttaattacgctcgccgatcgaagcgacgttgccatatctccaggcgaagcaaaatcgactcgcccagattcgtgcgctgcacaagtgatgtggcagtcttgaagagaccgcccattatttgacagctaagattaccataaccgatgtgcatggtttgagaccgttgggtctctacccaaccatggagaccggtcccacctgtcaccaggctttaggagtggcgtcacgcccgaccgcttcccttgagaagggcgatcgccctggcataacgccgggggctactgtcggtgatatgggaccgggagtaccgtgaccagaggcttgaggcagacacaatcgcccacgtggcctggcaccttcggggacgtcgggcccgagggtgaggtgtccgccctcctcctgatttccccgagggggggtcgggtgactcctgccccggccccggggaccgaggcggcccgaccccttgtgaagttagcgctacatgaatgggttaggtgagcacggtaaacctcaccgaaccacatttaatgcggtctggtcgaacgtgtcacactgcatgcagcgtagtgcagcgcgttcctttatccggtctgtgaccagtcacagaccggtcagatcacgggttaggtggcgactggcggtctgacgcacgccttgccccatcccgtcaagacgaaagcctttagggcactcgtctcaagctggagctagtgtgttatctcttagagatggcacgttagccctggttagatttttaccaggcttcatcccaaccgttacaggcaagatgctacatgaagaagggcaaacatgcacgctgctaagctgacgcgtggtggacaaggatgactggtctgtgaccggtctgacacgggttgcgtcatccacagacagccataatcccacgtcgcacctgtttccggtggaagtgggggtaggtatgggctgtcccgtcagaagggcactcggacagcaaccgtaccgatctccgtccatttatgaagagaagaacagtccagtttggaaagggagaggtgcatgtggtatccccttgagatataaaaggaggaccttgcccacttagagaaggatcttggacttttggactggaggccttttccagaaccgatcccagagcgattgggggctggttcatactttgtaacttgtccatacacagatccaccaaaaacacaggagtagggtattacgcttcccagcggcccgaacctgtatacgtctcctgcgtctcgcgtttcttcttggttcgcgatctttccacataccgagagagcttgggatttcaccctaagcctccggccgaaccggcaaaggggggcctgtgcggtctcccggtgaggagccacgagctccgtcacaaccaagtatatatcgattagcatcatgtcatcacaacacagttaatgcacaaattaggcaaccatgcaaattaggttcgaatttgagggagccagcctgctaggcttttttgttgggcttcttttgatcgttgttttctttatttctctgcatacatacgaagtatataccttatatatgtattctttttgtaaaaatcttaggtattttcatttgaatacccttgaattgagttggcccacccctgcccatgaccacgacaaatagagtaaggccctgtttagttcaggggtgaaaagtatttgtgtgttataacggatttacggacacatatttgaagtattaaacgtagactaataacaaaacaaattacagattctgcctgtaaactgcgagaagattttattaagcctaattaatccgtcattcgtaaatgtttactgtagcaccacattatcaaatcatgacgcaatcaggcttaaaagatttgtctcgcaatttacacgtaatctgtgtaattagtttttttttgtctatatttaatactccatacatatgtccaaatattcaatgtgattggggaagctggagtaggtaaaacagtactcatcataaaattaattaacaatattgctaaagctcactgggccgggtgaaaattttttatttaggaactaaatagggcctaattaagctgtgtatagtaagcacaatttccacgccgacgcactgcaattttcacgcaactttcaccgcctatttccttcttttacccccacaaccacgaccacgacgacgaccagagtaaacaagtcttattataaccacccc ttaattttcgaattgtggacgatcgttttacgaaaatttcggtgccttcgatcatatattaggtggtcaatgaaaagcgaccagggtaacggagaatggatgaaaggggattttatttttctccttccaatttttagatgctctcgtgtacttgtaatagataccttttcagaatttgatat
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權利要求
1.一種分離出的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因，其特徵在於運用重組載體和基因工程化宿主細胞，通過應用模塊表達序列標籤陣列、互補脫氧核糖核酸末端快速擴增和反轉錄聚合酶鏈式反應方法獲得的、且已於染色體上定位的具有SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種分離出的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因，其特徵在於所說的已於染色體上定位，是指野生稻抗稻瘟病抗性相關基因定位於第2號染色體，且定位在中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46的F8重組自交系群體親本的一個公共標記RZ324附近。
3.根據權利要求2所述的一種分離出的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因，其特徵在於具有SEQ ID No.2所示的開放讀碼框序列，並且具有SEQ ID No.3所示的開放讀碼框多核苷酸序列。
4.一種分離的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因多肽，其特徵在於，它具有SEQ ID No.3胺基酸序列的多肽、其保守性變體、或其生物活性片段，或其活性類似物、或其活性衍生物。
5.一種重組載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因，它包括細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒。
6.一種基因工程化宿主細胞，其特徵在於，它是用權利要求5所述的重組載體轉化的基因工程化宿主細胞，它包括原核細胞、低等真核細胞、高等真核細胞。
7.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1或2所述的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因的多核苷酸序列分子中8～100個連續核苷酸的序列。
8.根據權利要求7所述的一種探針分子，其特徵在於所說的多核苷酸序列包括SEQ IDNo.1～2所示的序列、其互補序列、多核苷酸序列變體、抑制水稻抗白葉枯抗性相關基因信使核糖核酸的寡核苷酸以及核酶。
9.根據權利要求8所述的一種探針分子，其特徵在於所說的多核苷酸序列變體是指一種或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。
10.一種分離出的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因的用途，其特徵在於它用於水稻抵禦稻瘟病菌的侵染。
全文摘要
本發明公開了一種野生稻抗稻瘟病相關基因、蛋白及其用途。同時公開了OsBTB基因的開放讀碼框序列。這些序列具有SEQ ID NO.1～4所示的多核苷酸序列。這些cDNA片段與水稻抗稻瘟病抗性緊密相關。本發明還提供含有編碼OsBTB基因的多核苷酸的重組載體和基因工程化宿主細胞，提供克隆OsBTB基因的方法，提供OsBTB基因的染色體定位。OsBTB基因在親本中以1～2拷貝存在，位於第2號染色體，且在中國水稻研究所國家水稻改良中心構建的珍汕97B/密陽46的F8重組自交系群體親本的一個公共標記RZ324附近。本發明的多核苷酸和/或蛋白或多肽可作為探針分子，用於診斷抗病和/或感病或其他由於OsBTB基因表達異常所引起的抗病性或感病性。利用本發明分離的野生稻抗稻瘟病抗性相關基因而培育出的水稻新品種可以抵禦稻瘟病菌的侵染。
文檔編號C07K14/415GK1546665SQ20031010914
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月5日 優先權日2003年12月5日
發明者董海濤, 姜玉新 申請人:浙江大學