放射免疫偶聯物和其用途的製作方法

2023-07-19 03:57:11

專利名稱：放射免疫偶聯物和其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及血液癌症的放射免疫療法，該放射免疫療法是利用一種細胞毒性極高的經過放射性標記的單克隆抗體來進行。
背景技術：
針對非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)已採用了一種利用經過放射性標記的抗體進行的療法，並且該療法是一種目前已獲得批准的方法。市場上有兩種產品，即，Zevalin 和Bexxar ，並且這兩種產品都以CD20抗原為目標(Jacene等人，2007)。免疫治療劑利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan /Mabthera )也以⑶20抗原為目標。針對同一目標的治療方法所存在的一個問題是，有可能在病程期間發生免疫表型漂移(immunophenotypic drift) (Ngo等人，2009),當在利妥昔單抗療法中隨時間 重複CD20療法時，或者如果在長期的利妥昔單抗療法後給予基於CD20的放射免疫療法(radio immunotherapy, RIT),該免疫表型漂移會引起0)20療法的作用減弱。很多接受了針對CD20的療法的患者最終將會出現復發(Buchegger等人，2006 ；Gordon等人，2004)。因此，對於一種在NHL患者體內以除⑶20外的另一種抗原為目標的放射免疫療法(RIT)存在。在RIT的早期開發過程中，對⑶37和⑶20兩種抗原作為目標進行了評估(Press等人，2001)。由此得出結論，以⑶20為目標的RIT更為適合，並且因此放棄了針對⑶37的RIT的開發。因而，在所屬領域中已知多種單克隆抗體適用於針對淋巴瘤的RIT中，但以CD20為目標的放射免疫偶聯物(radioimmunoconjugate，RIC)優於以CD37為目標的RIC(Press 等人,2001)。近年來，0)37已引起了一些新的關注(Heider等人，2009 ;Grosmaire, 2007),它主要是作為使用嵌合或人源化抗體構建體的免疫療法的目標。這些研究提出，不要使用常規的鼠類IgG單克隆抗體，因為這些鼠類抗體會誘導患者體內產生人類抗小鼠的抗體(HAMA)，這可能會引起不適，並且降低免疫療法的功效。在RIT中，常規的鼠類單克隆抗體仍被認為是值得關注的，因為所用蛋白質劑量總體而言較低，而且無需如同免疫療法同樣程度地重複進行治療。鼠類IgG的清除總體而言也比鼠類IgG的人源化或嵌合型式略快，這一點至少在某些背景下從RIT的全身輻射暴露來講可能更恰當。應注意的是，Bexxar和Zevalin兩者都是基於鼠類抗體。本發明提供抗CD37的鼠類抗體HHl作為放射性同位素的載體。產生該鼠類抗CD37抗體HHl的首個雜交瘤克隆體是在1980年代開發出來的(Smeland等人，1985)，並且數年來，該HHl抗體一直在進行銷售，在體外用於免疫組織化學技術中。對於HHl在放射免疫療法中的生物分布以及細胞的細胞毒性，先前未作評估。因此，當前的研究是著手對HHl在放射免疫療法中的適用性進行評估。先前利用抗CD37的RIC的臨床和臨床前研究使用了氯胺T/Iodogen法用131I直接對多個酪氨酸殘基進行放射性標記，相比之下，HHl是使用金屬放射性核素代替滷素，通過螯合劑進行放射性標記。使用一種已通過螯合劑-連接子進行標記的金屬放射性核素可為有利的，因為標記有131I的抗體的使用會使得甲狀腺暴露於由RIC釋放的不同量的碘。在先前一項旨在評估HHl是否適於製備放射免疫偶聯物的研究中，曾將CHX-A-DTPA與HHl偶聯，並且用2°5，2°6Bi標記該偶聯物，來達到建立體外模型的目的(Henriksen 等人,1997)。對鉍與HHl或與抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)的偶聯物在細胞系Raji中的攝取情況進行了比較。在鉍與抗生蛋白鏈菌素的偶聯物的情形中，細胞曾用生物素化的HHl預先飽和。已發現，當用212Bi或213Bi進行標記時，確保功能性RIC所需的螯合劑數目是一個限制性因素。因此，提出了使用生物素化的HHl來代替基於HHl的RIC。一旦結合於細胞，該生物素化的HHl因而就可以作為經過放射性標記的抗生蛋白鏈菌素的目標。因此，該項研究提出，由於用發射a -粒子的放射性核素標記的HHl在認為HHl可耐受的螯合劑濃度下的比活性不足以保持足夠的結合能力，故該HHl不太有用。 該論文還指出，與a-發射體相比較，￠-發射體將更不適合構建功能性RIC(Henriksen等人，1997),因為其作者指出，由於交叉放射(cross-fire)對於獲得足夠的效應至關重要，故利用3-發射體的靶向性放射療法彌散性疾病較差。因此，上文列舉的研究提出，在放射免疫療法中不要使用直接螯合的HH1，而且在基於P -發射體的RIC中也不要使用HHl。發明概述本發明涉及一種結合人類⑶37的放射免疫偶聯物，包含鼠類單克隆抗體HH1、一個連接子以及一种放射性核素，該放射性核素選自由以下各項組成的組，即211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、9°Y、186Re、188Re、199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd,77As、67Cu、47Sc 以及 177Lu。在本發明的一個實施方案中，該連接子是一種螯合性連接子，並且該放射性核素是 177Lu。本發明的一個方面涉及一種藥物組合物，包含一種本發明的放射免疫偶聯物和一種藥學上可接受的載體。在本發明的一個實施方案中，本發明的藥物組合物包含一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯物。在本發明的另一個實施方案中，一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯物以CD20為目標。本發明的又一個實施方案涉及一種本發明的藥物組合物，用於對表達⑶37抗原的B細胞惡性細胞進行治療。在本發明的一個實施方案中，該藥物組合物是用於治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。本發明的一個方面涉及本發明的放射免疫偶聯物的用途，用於治療B細胞惡性腫瘤。本發明的一個實施方案涉及本發明的放射免疫偶聯物的使用，該放射免疫偶聯物是組合或連同另一種療法一起給予的。在本發明的一個實施方案中，該療法選自預治療、化學療法、單克隆抗體療法、手術、放射療法和/或光動力療法。在本發明的另一個實施方案中，該療法包含先使用抗CD20和/或抗CD37的單克隆抗體進行預治療，然後用本發明的放射免疫偶聯物進行治療。本發明的一個方面涉及一種用於對選自非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病的一種B細胞惡性腫瘤進行治療的方法，包括給予有效量的一種本發明的藥物組合物。本發明另一方面涉及一種用於製備本發明的放射免疫偶聯物的試劑盒，包含兩個或更多個小瓶，其中一個小瓶含有一種偶聯物，該偶聯物包含與一種鼠類單克隆抗體HHl連接的一種螯合劑；並且一個第二小瓶含有一种放射性核素。本發明的一個實施方案涉及一種本發明的試劑盒，其中這些小瓶中一個或數個的 內含物是經過凍幹的或呈一種溶液的形式。在本發明的另一個實施方案中，該放射免疫偶聯物是通過對該兩個小瓶的內含物進行混合而產生。附圖簡要說明圖I在Raji、Rael以及Daudi 細胞與 111In-HHU111In-利妥昔單抗、125I-HHl 以及 125I-利妥昔單抗一起培養時在洗滌後立即(A)和96小時(B)得到的結合細胞的抗體。圖2在與mLu-HHl或mLu-利妥昔單抗一起培養2小時(A)和18小時(B)後結合於Daudi細胞的活性。阻斷的細胞是用IOOy g/ml未經過標記的抗體阻斷的。圖3在洗滌前與mLu-HHl (A)或mLu-利妥昔單抗(B) —起培養2小時的Daudi細胞的生長情況。圖4在洗滌前與mLu-HHl (A)或mLu-利妥昔單抗(B) —起培養18小時的Daudi細胞的生長情況。圖5在帶有Daudi異種移植物的小鼠中通過螯合劑標記111In的HHl的生物分布。圖6未經過標記的Daudi細胞、僅用二次抗體標記的Daudi細胞、或者用HH1、0N. 108、IP0. 24或6D263標記的Daudi細胞的FITC柱形圖。圖7在帶有Daudi腫瘤的雌性裸小鼠中mLu-的生物分布。圖8對小鼠靜脈內(iv)注射Daudi細胞的療法。利用50和100MBq/kg mLu_HHl、冷的HH1、冷的利妥昔單抗以及NaCl治療的小鼠的存活率。發明詳細說明本發明涉及抗體HHl在放射免疫療法中的使用。一種金屬放射性核素、連接子與抗⑶37的單克隆抗體的組合出人意料地顯示，經過放射性標記的HHl在一個異種移植物/裸小鼠模型中具有一種相關的生物分布和腫瘤攝取。這個重要信息表明了在放射免疫療法中的適用性。放射免疫偶聯物本發明出人意料地顯示，放射免疫偶聯物mLu-HHl對彌散性腫瘤細胞展現出一種顯著的細胞毒性，並且在給定劑量下，mLu-HHl針對這些腫瘤細胞的細胞毒性高於177Lu-利妥昔單抗。這一發現是出乎意料的，因為每一細胞結合更多的放射物，並且結合的放射性核素的保留度類似於或優於mLu-利妥昔單抗。 該傳授內容與本領域中的常識相反，本領域的常識是對於放射免疫療法而言，抗⑶20抗體優於抗⑶37抗體。此外，本研究與先前觀念的不同之處在於，對於￠-發射體，無法在彌散性細胞中獲得的交叉放射對於獲得足夠的作用將至關重要(Henriksen等人，1997)。出現所觀察的效應的原因尚不清楚。由利用不同劑量的未經過標記的HHl和利妥昔單抗進行的實驗得到的數據在所用生長檢驗中並未指示由這些未經過標記的抗體所產生的任何作用。一個可能的解釋可以是，CD37與CD20相比較，具有極低抗原密度的細胞更少，即使平均起來，CD20在所用細胞上具有更為強烈的表達。保留度數據因⑶37的內化而無法呈現更好的保留度，這將是另一個可能的解釋，因為據報導，關於⑶37抗原存在一些內化現象(Press等人，2001)。因此，本發明涉及一種結合人類CD37的放射免疫偶聯物，包含鼠類單克隆抗體HH1、一個連接子以及一种放射性核素，該放射性核素選自由以下各項組成的組，即211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、9°Y、186Re、188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag,109PdJ7As, 67Ciu47Sc 以及 177Lu。在本發明的一個實施方案中，該連接子是一種螯合性連接子。在本發明的另一個實施方案中，該放射性核素是mLu。在又一個實施方案中，該放射性核素是另一種￠-發射體或是一種Ct-發射體。根據體外數據，本發明提出，經過放射性標記的HHl與⑶37抗原的結合比經過放射性標記的利妥昔單抗與CD20抗原的結合更有效，即，該經過放射性標記的HHl用更少的循環抗體就達到與該抗原的最大結合(表2，圖2)。它達到最大結合所需的時間也更少(圖2)。這些也將是重要的體內特徵，因為這意味著腫瘤細胞甚至在較低的循環抗體濃度下也能截留RIC，而循環抗體濃度較低的情形可能在較不易達到的實體腫瘤區域以及位於正常組織的遠端區域中的多個單一腫瘤細胞和微轉移中出現。這一點與先前數據明顯不同，先前的數據曾指出，利用另一種抗CD37抗體使抗原飽和並且獲得有利的生物分布所需的抗體濃度高於HHKBernstein等人，1990)，也高於一種抗CD20抗體(Press等人,1993)。此外，本發明還顯示，與一組三種不同的抗⑶37抗體相比較，HHl具有一些不同的抗原結合特性，不過所有這些抗體實質上都結合於同一表位。阻斷實驗(S卩，使用以未經過標記的抗體預先飽和的細胞進行的實驗)顯示，HHl將阻止活細胞上的⑶37結合於經過放射性標記的HHl，實質上優於其他三種抗⑶37抗體。在對多種經過放射性標記的抗體進行比較的一項細胞檢驗中，HHl顯示的免疫活性分數比其他三種抗體高得多。免疫活性分數是指在存在無限制的過量抗原的情況下能結合抗原的抗體的分數。不同的抗體在經歷標記程序後，可以具有不同的保持免疫活性的能力。實例6實驗IV的表5中的結果顯示，HHl所保持的免疫活性高於三種可商購抗體的免疫活性。另一方面，多項免疫組織化學分析顯示，這三種抗體使由經過石蠟包埋的固定的腫瘤樣品得到的組織切片染色，而HHl未能如此。抗體抗原相互作用的差異無法通過流式細胞術來檢測。HHl與這三種其他抗⑶37抗體的流式細胞術柱形圖是相似的(圖6)。總體來說，這些數據顯示，HHl具有一種重要的個體性抗原相互作用，這一相互作用在幾個方面上無法由利用其他抗CD37抗體的研究預測出來。 這裡描述的具有強細胞毒性特性的新穎抗CD37放射免疫偶聯物由鼠類單克隆抗體HHl、一種螯合性連接子以及P -發射體mLu組成。該放射性核素可以通過以下步驟附接到抗體首先使一種雙官能螯合劑，例如p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Tx, USA),與該抗體反應,隨後進行純化以除去未偶聯的螯合劑，接著使螯合劑抗體偶聯物與該放射性核素反應，隨後進行純化以除去任何未偶聯的放射性核素。作為替代方案，可以先將螯合劑與放射性核素組合，隨後與抗體偶聯。螯合性連接子(例如，如p-SCN-bn-DOTA)可用於使其他金屬放射性核素按與關於177Lu所述類似的方式與HHl偶聯。具有足夠的絡合能力以及允許與一種蛋白質或肽直接或間接偶聯的一個官能團的任何類型的連接子都可以使用。這些連接子的實例描述於文獻中(例如，Brechbiel, 2008 ；Liu, 2008)。一些有用的實例是雙官能的環狀螯合劑，如p-SCN-bn-DOTA、DOTA-NHS-酯；雙官能的線性螯合劑，如p-SCN-Bn-DTPA 和 CHX-A" -DTPA。本發明中的多种放射性核素將優選通過使用雙官能螯合劑與一個目標分子偶聯。這些雙官能螯合劑可以是環狀、線性或分支狀螯合劑。特別應提到的是聚氨基聚酸螯合劑，這些螯合劑包含一個線性、環狀或分支狀聚氮雜烷烴主鏈，其中有多個酸性(例如，羧基烷基)基團附接在該主鏈氮上。適合的螯合劑的實例包括DOTA衍生物，如對異硫氰酸基苯甲基-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-I，4，7，10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)和DTPA衍生物，如對異硫氰酸基苯甲基-二亞乙基三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA)，前者是環狀螯合劑，後者是線性螯合劑。絡合部分的金屬化可以在該絡合部分與目標部分偶聯之前或之後進行。如果螯合劑是在進行放射性標記之前與抗體偶聯，則進行放射性標記的程序在所用時間等方面一般將更適宜。使用與抗體附接的螯合劑來製備經過放射性標記的偶聯物的原理在(例如)Liu, 2008中有更為全面的描述。因此，可以使用HHl來製備多种放射免疫偶聯物，這些放射免疫偶聯物具有不同的輻射特性和有效半衰期。舉例來說，可以製備由鼠類單克隆抗體HH1、一個螯合性連接子以及一種發射3粒子或發射a粒子的放射性核素(包括但不限於177Lu、211At、213Bi、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、90Y^186Re,188Re,199Au,194Ir,166Ho, 159Gd、153Sm、149Pm、142Pr、niAg、1(l9Pd、77AS、67Cu、47SC)組成的抗CD37放射免疫偶聯物，並且使用這种放射免疫偶聯物來製備多種藥物製劑，並用於多種治療應用中。藥物組合物基於HHl的一种放射免疫治療產品典型地將會以一種藥物組合物的形式提供，該藥物組合物是由根據以上描述的一种放射性核素通過一種螯合劑與溶解於一種緩衝溶液中的鼠類單克隆抗體HHl連接而組成，這在很大程度上保持了放射免疫偶聯物的化學完整性，並且將其輸注到患者體內在生理學上是可接受的。
因此，本發明的一個方面涉及一種藥物組合物，包含一種本發明的放射免疫偶聯物以及一種藥學上可接受的載體和/或賦形劑。可接受的藥物載體包括但不限於無毒緩衝劑、填充劑、等滲溶液等。更具體地說，該藥物載體可以是(但不限於)生理鹽水(0. 9%)、二分之一生理鹽水(half-normalsaline)、林格氏乳酸鹽(Ringer，s lactate)、5%右旋糖、3. 3%右旋糖/0. 3%鹽水。生理學上可接受的載體可以含有一种放射分解性穩定劑，例如抗壞血酸，這種穩定劑能在儲存和運輸期間保持放射性藥物的完整性。本發明的一個實施方案包含本發明的藥物組合物和一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯物。抗體包括但不限於利妥昔單抗、依帕珠單抗(Epratuzumab)、L19、F8、F16、加利昔單抗(Galiximab)、託利珠單抗(Toralizumab)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、維妥珠單抗(Veltuzumab)、阿託珠單抗(Afutuzumab)、託西莫單抗(Tositumomab)、利圖斯(Reditux)以及替伊莫單抗(Ibritumomab)。放射免疫偶聯物包括但不限於Zevalin和Bexxar。在本發明的另一個實施方案中，一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯物以CD20為目標。抗體包括但不限於利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、阿託珠單抗、託西莫單抗、利圖斯以及替伊莫單抗。放射免疫偶聯物包括但不限於Zevalin和Bexxar。本發明的又一個實施方案涉及一種本發明的藥物組合物，用於對表達⑶37抗原的B細胞惡性細胞進行治療。在本發明的一個實施方案中，該藥物組合物是用於治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病的。序列一致性與一般定義一樣，「一致性」在這裡定義為分別在核苷酸或胺基酸水平上的多個基因或多種蛋白質之間的序列一致性。因此，在本文中，「序列一致性」是在胺基酸水平上多種蛋白質之間一致性的一種量度，以及在核苷酸水平上多個核酸之間的一致性的一種量度。蛋白質序列一致性可以通過在比對多個序列時比較每一序列中某一指定位置的胺基酸序列來確定。類似地，核酸序列一致性可以通過在比對多個序列時比較每一序列中某一指定位置的核苷酸序列來測定。為了測定兩個核酸序列或兩個胺基酸的一致性百分比，出於進行最佳比較的目的，對這些序列進行比對(例如，可以在第一個胺基酸序列或核酸序列中引入多個空隙，以便與第二個胺基酸或核酸序列達到最佳比對)。接著對多個相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸進行比較。當佔據第一個序列中某一位置的胺基酸殘基或核苷酸與第二個序列中相應位置的胺基酸殘基或核苷酸相同時，則這些分子在該位置是一致的。兩個序列之間的一致性百分比會隨這些序列所共有的一致位置的數目而變化(即，一致性％= —致位置的數目/位置(例如重疊的位置)的總數X 100)。在一個實施方案中，這兩個序列具有相同長度。可以手動比對這些序列，並且計算出一致核酸或胺基酸的數目。作為替代方案，可以使用一種數學算法比對兩個序列，以測定一致性百分比。此種算法被併入NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序進行，總分=100，字長=12，由此獲得 與本發明的核酸分子同源的多個核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程序進行，總分=50，字長=3，由此獲得與本發明的蛋白質分子同源的多個胺基酸序列。為了進行帶空隙的比對以達到比較的目的，可以利用Gapped BLAST。作為替代方案，可以使用PSI-Blast來進行一種迭代檢索法，檢測多個分子之間的遠緣關係。當利用NBLAST、XBLAST以及Gapped BLAST程序時，可以使用相應程序的默認參數。參見http://www. ncbi. nlm. nih. gov。作為替代方案,可以在對多個序列進行比對之後,例如通過BLAST程序在EMBL資料庫中來計算序列一致性(www. ncbi. nlm. gov/cgi-bin/BLAST) 總體來說，可以使用有關(例如)「計分矩陣」和「空隙罰分」的默認設置來進行比對。在本發明的上下文中，BLASTN和PSI BLAST的默認設置可為有益的。兩個序列之間的一致性百分比可以在允許有空隙或不允許有空隙的情況下，使用與上文所述類似的技術測定。在計算一致性百分比時，只對精確匹配計數。本發明的一個實施方案涉及一種分離的核酸，包含與HHl抗體的VH序列(SEQ IDNO: I)和/或VL序列(SEQ ID N0:3)共有80%序列一致性的一個序列。本發明的一個實施方案涉及一種分離的核酸，包含一個序列，該序列帶有HHl抗體的 VH 序列(SEQ ID NO: I)和 / 或 VL 序列(SEQ ID N0:3)。在本發明的另一個實施方案中，該分離的核酸包含與HHl抗體的VH序列(SEQ IDNO: I)和/或VL序列(SEQ ID NO: 3)共有至少90%序列一致性，如90% —致性、91%—致性、92% —致性、93% —致性、94% —致性、95% —致性、96% —致性、97% —致性、98% —致性或99% 一致性的一個序列。本發明的另一個實施方案涉及一種抗體，包含與HHl抗體的VH序列(SEQ IDNO: 2)和/或VL序列(SEQ ID NO:4)共有80%序列一致性的一個多肽序列。本發明的另一個實施方案涉及一種抗體，包含一個多肽序列，該多肽序列帶有HHl抗體的 VH 序列(SEQ ID NO:2)和 / 或 VL 序列(SEQ ID N0:4)。在本發明的另一個實施方案中，該抗體包含與HHl抗體的VH序列(SEQ ID N0:2)和/或VL序列(SEQ ID NO:4)共有至少90%序列一致性，如90% —致性、91% —致性、92% —致性、93% —致性、94% —致性、95% —致性、96% —致性、97% —致性、98% —致性或99% —致性的一個序列。
遺傳變異遺傳變異是由基因中核苷酸的鹼基次序發生變化而引起的。這種變化使這些基因發生突變，隨後使這些基因所編碼的蛋白質發生突變。這些突變可以是有義突變或錯義突變，或者是取代。本發明的一個實施方案涉及HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ ID NO: I)和/或VL鏈(SEQ ID N0:3)的分離的核酸序列，該分離的核酸序列包含至少50個，如20個，如10個，如5個，如4個，如3個，如2個，如I個有義突變。本發明的另一個實施方案涉及HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ ID N0:1)和/或VL鏈(SEQ ID NO:3)的分離的核酸序列，該分離的核酸序列包含0到50個，如I到50個，如0到20個，如I到20個，如0到10個，如I到10個，如0到5個，如I到5個，如3個，如I
·個有義突變。錯義突變(一類非同義突變)是一種點突變，在這種突變中，單一核苷酸發生改變，產生一種編碼不同胺基酸的密碼子(將一種胺基酸變為一個終止密碼子的突變被認為是無義突變，而不是錯義突變)。錯義突變可以使所得到的蛋白質沒有功能性。然而，並非所有的錯義突變都導致可觀的蛋白質變化。一個胺基酸可以用化學特性極為相似的一個胺基酸替代，在這種情況下，蛋白質仍能夠正常起作用；這被稱為中性、「安靜(quiet)」或保守突變。作為替代方案，可以在蛋白質的一個區域中進行胺基酸取代，這種取代不會明顯影響蛋白質的二級結構或功能。當一個胺基酸可能由多於一個密碼子編碼(所謂的「簡併編碼，，)時，密碼子中的突變可能不會在翻譯中產生任何變化；這種突變將是一種同義突變(一種沉默突變形式)，而不是一種錯義突變。本發明的一個實施方案涉及一種抗體，包含HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ IDNO: I)和/或VL鏈(SEQ ID NO: 3)的一個多肽序列，該多肽序列包含至少50個，如20個、如10個、如5個、如4個、如3個、如2個、如I個錯義突變。本發明的一個實施方案涉及一種抗體，包含HHl單克隆抗體的VH鏈(SEQ IDNO: I)和/或VL鏈(SEQ ID NO:3)的一個多肽序列，該多肽序列包含0到50個，如I到50個，如0到20個，如I到20個，如0到10個，如I到10個，如0到5個，如I到5個，如3個，如I個錯義突變。保守取代是用具有大體上類似特性的一個胺基酸取代另一個胺基酸，以致整體功能性很可能不受明顯影響的一種取代。在本發明的另一個實施方案中，是錯義突變、保守突變或取代。本發明的又一個實施方案涉及一種分離的核酸序列或一種多肽序列，與HHl的可變重鏈(SEQ ID N0:2)和/或可變輕鏈(SEQ ID N0:4)序列具有80%序列一致性，其中序列變異是保守取代。在本發明的另一個實施方案中，序列一致性是80% —致性，如90% —致性、91%—致性、92% —致性、93% —致性、94% —致性、95% —致性、96% —致性、97% —致性、98% —致性或99% 一致性，並且序列變異是保守取代。為了對放射性標記的步驟進行改進，宜將額外的賴氨酸引入(例如)HH1的Fe部分中。此舉可以減小將結合賴氨酸的螯合劑附接到該抗體的抗原結合位點中的機率，由此降低在進行放射性標記期間損害免疫活性的風險。用於將賴氨酸引入(例如)HHl的Fe部分中的方法在本領域中是已知的，例如由Hemminki 等人,1995 獲知。本發明的一個實施方案涉及本發明的放射免疫偶聯物，該放射免疫偶聯物已在HHl 的 Fe 部分中用 10 個 Lys(如 8 個 Lys^n 6 個 Lys^n 5 個 Lys^n 4 個 Lys^n 3 個 Lys、如2個Lys^n I個Lys)進行了修飾。治療
根據本發明的藥物溶液的治療應用可以是對表達CD37抗原的惡性細胞進行治療,包括但不限於非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。其他應用可以是治療自體免疫疾病和治療移植相關性反應。該療法可以基於(但不限於)￠-粒子的輻射或a-粒子的輻射，或者這兩者的一個組合。該療法可以作為單藥療法給予，或者與其他療法，優選標準治療方法組合來給予。這些其他療法可以是預治療、手術、化學療法、免疫療法、光動力療法、放射免疫療法，或者這些療法中兩種或多種的一個組合。給予是指靜脈內輸注或靜脈內注射。更具體地說，本發明的放射免疫偶聯物可以通過連接到一個滴注器的一個周邊導管直接給予到一條靜脈中，該滴注器以防止空氣栓塞，並且允許對流入患者體內的速率進行估算。在一個實施方案中，該放射免疫偶聯物可以按一種重複的方式給予。在本發明的另一個實施方案中，該放射免疫偶聯物可以按一種重複的方式，但用多種不同的放射性核素給予，例如，可以在3 -放射免疫療法之後進行a-放射免疫療法，或反之亦然。本發明的一個方面涉及本發明的放射免疫偶聯物的用途，用於治療B細胞惡性腫瘤。本發明的一個實施方案涉及本發明的放射免疫偶聯物的使用，該放射免疫偶聯物是組合或連同其他療法一起給予。在本發明的一個實施方案中，其他療法選自預治療、化學療法、單克隆抗體療法、手術、放射療法和/或光動力療法。在本發明的另一個實施方案中，其他療法是骨髓移植或幹細胞移植和/或療法。本發明的另一個實施方案包含先使用抗CD20和/或抗CD37的單克隆抗體進行治療性預治療，然後用本發明的放射免疫偶聯物進行治療。本發明的一個方面涉及一種用於對選自非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞的一種B細胞惡性腫瘤進行治療的方法，包括給予有效量的本發明的藥物組合物。在本發明的一個實施方案中,抗體劑量是每位患者I到IOOOmg,更優選每位患者5到50mg，並且mLu的量為每公斤體重I到200MBq，更優選為每公斤體重10到lOOMBq。試劑盒本發明的一個方面涉及一種用於製備本發明的放射免疫偶聯物的試劑盒，包含兩個或更多個小瓶，其中一個小瓶含有一種偶聯物，該偶聯物包含與一種鼠類單克隆抗體HHl連接的一種螯合劑；並且一個第二小瓶含有一种放射性核素。一個試劑盒可能需要進行一些程序，例如在輸注前進行放射性標記和/或純化。本發明的一個實施方案涉及一種本發明的試劑盒，其中一個或數個小瓶的內含物是經過凍幹的或是呈一種溶液的形式。通過將兩個小瓶的內含物混合以產生放射免疫偶聯物，將得到最終產物。因此，在本發明的另一個實施方案中，該放射免疫偶聯物是通過將兩個小瓶的內含物混合來產生。此產物可能需要在使用前進行純化。實例 實例I-對HHl進行放射性標記碘化根據製造商的描述，使用預先塗有I0D0GEN的碘化管(Pierce, Rockford, IL),通過間接碘化法,利用125I對抗體進行標記。 用111In和mLu進行標記首先，使抗體與一種螯合劑(p-SCN-Bn-DTPA或p-SCN-Bn-DOTA )反應。將DTPA或DOTA螯合劑按5:1的比率溶解於0.05M HCl中，隨後加入該抗體中，通過用碳酸鹽緩衝液洗滌，將其PH調到約8。接著再次檢查pH，並且在必要時加以調整。在室溫下，將該溶液振蕩60分鐘，隨後通過加入50 u I 200mM甘氨酸溶液(每毫克抗體)來終止反應。為了除去游離的螯合劑，用PBS (PAA)將經過偶聯的抗體洗滌4到5次，接著通過用乙酸銨洗滌，將調到pH 5。然後，將111In或177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma，USA)加到0. 5mg DOTA-Ab中，並在42° C下振蕩I小時。最後,通過在一個凝膠過濾柱(例如SephadexG-25PD10，來自GE health ;或類似凝膠柱)上洗脫來純化產物。總標記產率在17%到63%間變動。使用淋巴瘤細胞和一種經過改進的Lindmo法來測量放射免疫偶聯物的品質。使用每毫升達108個細胞的細胞濃度來補償111In-偶聯物的最適度的比活性。對於125I-偶聯物(具有更高的比活性)，使用每毫升達4X IO7個細胞的細胞濃度就已足夠。這些放射免疫偶聯物的免疫活性和比活性可以參見表I。實例2-結合參數利用一步曲線擬合方法(Dahle等人2007)，測定締合速率常數ka、平衡解離常數Kd以及結合位點的平均數目Bmax。對HHl和利妥昔單抗針對Raji、Rael以及Daudi細胞三種不同的淋巴瘤細胞系的結合參數進行測量(表2)。隨時間和抗體濃度的變化來測量特異性結合，並且使用締合速率常數ka、平衡解離常數Kd以及結合位點的平均數目Bmax作為參數，將描述抗原-抗體絡合物的淨形成速率的差分方程的解與實驗數據點相擬合。使用每毫升五百萬個細胞、4種濃度的標記有125I的抗體(100ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml以及10000ng/ml)以及7個培養時間點(5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、I小時、I. 5小時以及2小時)。培養後，用PBS將細胞洗滌兩次，隨後在一個Y計數器中進行計數。實例3-結合細胞的抗體的保留度在將Raji、Rael 和 Daudi 細胞與 111In-HHU111In-利妥昔單抗、125I-HHl 和 125I-利妥昔單抗一起孵育後，對洗滌後立即和洗滌後96小時的時候與細胞結合的抗體的保留度進行測量(圖I)。 在含有10%胎牛血清、1%L-穀氨醯胺和1%青黴素/鏈黴素的I mlRPMI 1640培養基中，將一百萬個細胞與I y g/ml標記有125I或標記有111In的HHl或利妥昔單抗一起孵育I小時，用培養基洗滌兩次，並且再孵育4天。在洗滌後立即(

圖1A)以及在培養4天後(圖1B)對結合細胞的活性進行測定，該測定是通過測量細胞數目(Vi細胞活力分析儀(Vi CellViability Analyzer), Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA),並且利用一種經過校準的Y 檢測器(Cobra II 自動 Y 檢測器，Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA)測量放射物的量來進行。實例4-在體外用mLu-HHl或mLu-利妥昔單抗治療淋巴瘤細胞實驗I : mLu-HHl結合於Daudi細胞將Iml的Daudi細胞懸浮液(一百萬個細胞/ml)播種於24個管中，並且用IOOii g/ml的HHl或利妥昔單抗阻斷半數的管，並在37° C下孵育30分鐘。隨後，向每一個管中加A 177Lu-HHl或mLu-利妥昔單抗，達到0、1、2. 5、5、10或20 y g/ml的最終濃度，並且再在37° C下進行孵育。mLu-HHl的比活性為91. ekBq/yg，並且mLu-利妥昔單抗的比活性為 136.6kBq/U g。在孵育期間，利用一種Y檢測器(Cobra II自動、檢測器,Packard InstrumentCompany)測量增加的活性量。2小時後，對半數的細胞進行洗滌，並且對結合細胞的活性進行測量(圖2A)，同時將另外一半的細胞孵育過夜(18小時)，之後進行洗滌以及結合細胞的活性的測量。在2小時的孵育後，與HHl —起孵育的細胞和與利妥昔單抗一起孵育的細胞之間沒有差異，而在18小時的孵育後，與利妥昔單抗一起孵育的細胞的結合細胞的活性是與HHl 一起孵育的細胞的兩倍(圖2)。表3和表4指出，與利妥昔單抗相比較，經過放射性標記的HHl使抗原飽和更快並且抗體濃度更低。這兩种放射免疫偶聯物(RIC)的非特異性結合看起來類似，並且該非特異性結合隨著培養基中RIC濃度的增加而增加。利妥昔單抗特異性結合mLu的最大數目是HHl的大約兩倍。然而，在lug/ml劑量下，特異性結合的放射性原子的數目幾乎沒有差異。實驗II :與177Lu-IgG 一起孵育2小時細胞生長數據如同實驗I，將Daudi細胞與放射免疫偶聯物一起孵育(圖2A)。通過將來自每一個管的50，000個細胞播種於六個12孔板中的三個孔中，來測量在與177Lu-HHl或177Lu-利妥昔單抗一起孵育2小時後Daudi細胞的生長情況。使用自動成像系統(Clone Select Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK)測量在接下來 14 天中數個時間點的細胞量。未經過標記的抗體單獨對細胞生長沒有影響。然而，用mLu-抗體處理過的阻斷的細胞的生長明顯不如未處理過的對照細胞快，這表明未結合的mLu-抗體或未特異性結合的mLu-抗體對細胞具有影響(圖3)。用mLu-抗體處理未被阻斷的細胞使得用10 u g/ml 177Lu-HHl處理的細胞的生長延遲出現44%的增加(圖3A)，並且使得用10 u g/ml mLu-利妥昔單抗處理的細胞的生長延遲出現31%的增加(圖3B)。
對於用20y g/ml進行處理，這兩種抗體之間的差異甚至更大，因為用mLu-HHl處理過的細胞不存在再生長。這一結果是出乎意料的，因為這些細胞都是用相同量的抗體進行標記的(圖2A)。實驗III :與mLu-IgG —起孵育18小時細胞生長數據如同實驗I，將Daudi細胞與放射免疫偶聯物一起孵育(圖2B)。通過將來自每一個管的50，000個細胞播種於六個12孔板中的三個孔中，來測量在與177Lu-HHl或177Lu-利妥昔單抗一起孵育18小時後Daudi細胞的生長情況。使用自動成像系統(CloneSelect Imager, Gentix Ltd, Hampshire, UK),測量在接下來14天中的數個時間點的細胞量。未經過標記的抗體單獨對細胞生長沒有影響。由於與放射免疫偶聯物在培養基中孵育的時間增加了16小時，本實驗(圖4)中對用177Lu-抗體處理過的阻斷的細胞的細胞生長抑制作用大於實驗II中的情形(圖3)。用mLu-抗體處理未阻斷的細胞使得用2. 5 u g/ml 177Lu-HHl處理過的細胞的生長延遲出現了 107%的增加(圖4A)，並且使得用2. 5 u g/ml mLu-利妥昔單抗處理過的細胞的生長延遲出現了 52%的增加(圖4B)。這一結果是出乎意料的，因為在18小時的孵育後，標記有mLu-利妥昔單抗的細胞的結合細胞的活性是標記有mLu-HHl的細胞的兩倍(圖2B)。 實例5-HH1的生物分布用在研究開始時帶有32-256mm3尺寸的Daudi異種移植物的BALB/c-裸(nu/nu)小鼠來研究經過mIn標記的HHl的生物分布。使用pSCN-Bz-DOTA作為一種雙官能螯合劑，與放射性核素絡合，並且將該放射性核素附接到抗體，由此進行放射性標記(參見實例I)。通過對每隻動物的尾靜脈注射100 u I溶液來給予這些製劑。在每隻動物中注射120kBq的活性物。每一時間點使用五隻動物。在注射後的不同時間點，在實施頸椎脫白法後進行屍體解剖。測定各組織樣品的重量，並且藉助一個經過校準的 Y 檢測器(Cobra II 自動 Y 檢測器，Packard Instrument Company,Meriden, CT, USA)來測量mIn。在這些測量程序中，使用注射物的樣品作為參照物。帶有Daudi異種移植物的小鼠在注射後24小時的111In-HHl攝取情況以及在正常組織中的生物分布提供於圖5中。經過放射性標記的抗體具有一種相關的腫瘤靶向性和生物分布。螯合劑-偶聯物111In-HHl在體內顯示出良好的穩定性。實例6-HH1與三種其他抗⑶37的抗體的比較實驗I :抗⑶37的抗體針對經過放射性標記的HHl的抗原阻斷能力為了測試HHl抗原相互作用是否能被其他抗⑶37的抗體阻斷，通過將Daudi細胞與HH1、0. N. 108、IP0-24或6D263抗體一起預孵育來進行阻斷。將Daudi細胞(二百萬個/毫升)與HH1、0.N. 108、IP0-24或6D263 (20 y g/ml) —起孵育15分鐘，並且加入經過125I標記的HHl抗體，並且孵育I小時。之後，對這些細胞進行離心，並且洗滌3次，並使用一個X射線/ Y計數器對上清液中的活性物以及對細胞團進行計數。與被HHl阻斷的細胞相比較，標記有125I的HHl的結合分數分別比被0. N. 108、IP0-24或6D263阻斷的細胞高48%、44%和51%。因此，用HHl實現的125I-HHl對抗原結合的阻斷作用優於這三種其他抗體，這表明抗原相互作用存在某些差異。總之，與一組三種其他抗⑶37的單克隆抗體相比較，HHl具有明顯不同的抗原結合特性。實驗II :抗體結合於用石蠟包埋的淋巴瘤組織樣品為了對HHl與三種可商購的⑶37抗體結合於經過固定的淋巴瘤樣品的能力進行比較，將來自多位淋巴瘤患者的活體檢查樣品固定於福馬林(formalin)中，用石蠟包埋，並且切割成多個IOiim的切片，安放到物鏡上。用抗體HHl、IP0. 24、0N. 108和6D263對這些樣品進行標記，並且使用兔抗小鼠多克隆抗體和過氧化物酶染色來檢測所進行的標記的程度。抗體IP0. 24和0N. 108對這些淋巴瘤樣品進行的標記最強。6D263抗體標記的樣品略弱。HHl抗體對這些切片的標記不明顯。因此，可以得出結論，由於HHl不結合，而三種其他抗⑶37的抗體進行結合，故HHl具有一種明顯不同的抗原相互作用。 實驗III :用HH1、IP0. 24、0N. 108和6D263抗體進行的流式細胞術為了調查通過不同⑶37抗體對比通過HHl檢測的抗原表達的差異，用含有5%胎牛血清的RPMI 1640培養基洗滌Daudi細胞兩次，並且在冰上，在含有10% FCS的0. 2ml培養基中用10 u g/ml的一次抗體HH1、IP0. 24,0N. 108以及6D363進行標記，持續0. 5小時。隨後，用含0. 25%FCS的PBS將這些細胞洗滌兩次，並且在冰上，用標記有FITC的多克隆兔抗小鼠IgG Fab'2 (按1:20稀釋)進行標記(圖6)，持續0. 5小時。通過在流式細胞儀中用488nm雷射激發，來檢測FITC標記發出的螢光。使用前向散射、側向散射和碘化丙啶信號排除死亡的細胞和雙聯體(doublet)。各種⑶37抗體的不同FITC柱形圖間沒有明顯變化(圖6)。總之，HHl與三種其他抗CD37的抗體IP0. 24,0N. 108以及6D363產生相似的流式細胞術柱形圖。實驗IV =HHl以及三種可商購抗⑶37的抗體的結合分數為了對HHl的結合分數與O.N. 108、IP0-24或6D263抗體的結合分數進行比較(Santa Cruz,生物技術(Biotechnology)),使用 Daudi 細胞。用 HH1、0. N. 108、IP0-24 或6D263抗體(500ii g/ml)阻斷細胞懸浮液(表明抗原大量過量)，持續15分鐘，以引起抗體的非特異性結合，這些細胞懸浮液是由六千萬個Daudi細胞於含有5%胎牛血清的0. 2ml RPMI1640培養基中組成的。其他平行實驗未被阻斷。隨後，加入經過125I 標記的 HH1、0.N. 108、IP0-24 或 6D263 抗體(5-10 ng/ml)，並且在輕微振蕩下，在4° C下將這些細胞孵育2小時。之後，對這些細胞進行離心，並且用含1%FCS的PBS洗滌2次。將細胞團轉移到多個潔淨的管中，並且使用一個Y計數器進行計數。測定的結合分數是未被阻斷的小瓶和阻斷的小瓶的活性與增加的活性的差異。HHl顯示出的結合分數比其他CD37抗體的結合分數高得多(表5)。總之，當按類似方式對抗體進行放射性標記時，HHl所顯示的針對活細胞的免疫活性比IP0. 24,0N. 108以及6D363高得多。這一結果表明，HHl具有與這三種其他抗體不同的抗原相互作用。實例7 -低鏈和重鏈可變區的DNA和胺基酸序列HHl抗⑶37抗體的可變區的基因和蛋白質序列如下VHa CD37的基因序列對應於SEQ ID NO: I並且VHa CD37的蛋白質序列對應於SEQID N0:2。VH a CD37gagatccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaaggtaEIQLQQSGPELVKPGASVKV
tcctgcaaggcttctggttactcattcactgactacaacatgtactgggtgaagcagagcSCKASGYSFTDYNMYffV KQ ScatggaaagagccttgagtggattggatatattgatccttacaatggtgatactacctacHGKSLEffIGYIDPYNGD TT YaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgttgacaagtcctccagcacagccttcNQKFKGKATLTVDKSSSTAFatccatctcaacagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcccct
IHLNSLTSEDSAVYYCARSPtatggtcactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaYGHYAMDYffGQGTSVT VS SVLa CD37的基因序列對應於SEQ ID NO: 3，並且VL a CD37的蛋白質序列對應於SEQ ID NO:4。VLaCD37gacattgtgatgacccagtctcacaaactcttgtccacatcagtaggagacagggtcagcDIVMTQSHKLLSTSVGDRVSatcacctgcaaggccagtcaggatgtgagtactgctgtagactggtatcaacagaaaccaITCKASQDVSTAVDffYQ QK PggacaatctcctaaactactgattaactgggcatccacccggcacactggagtccctgatGQSPKLLINffASTRHTG VP DcgcttcacaggcagtggatctgggacagattatactctcaccatcagcagtatgcaggctRFTGSGSGTDYTLTISSMQAgaagacctggcactttattactgtcgacaacattatagcactccattcacgttcggctcgEDLALYYCRQHYSTPFTFGSgggacaaagttggaaataaaaGTKLEIK該胺基酸序列明顯不同於結合⑶37的抗體AO的胺基酸序列(Heider等人，2009)。HHl的與AO的可變輕鏈之間的重疊部分達到56%，而可變重鏈之間的重疊部分是 82%。實例8-將經過放射性標記的HHl結合到用⑶20抗體利妥昔單抗飽和的細胞上。背景非霍奇金淋巴瘤患者常常接受利妥昔單抗作為一種標準療法。如果能夠對這些患者使用經過放射性標記的HH1，那麼即使他們正在經歷利妥昔單抗療法，也將是有益的。表達⑶20和⑶37兩種抗原的Daudi淋巴瘤細胞被用作一種模型。方法用過量(100 U g/ml)的利妥昔單抗對Daudi淋巴瘤細胞(3，300, 000個/0. 5ml)進行預處理和共同處理，持續五分鐘，之後加入Iu g標記有125I的HHl，或在未進行利妥昔單抗預處理情況下加入給定的標記有125I的HH1。為了測定125I-HHl的非特異性結合，使用與上文相同的配置，但利用未經過標記的HH1(使用了 IOy g/ml)進行預處理。室溫下，在PBS中將這些細胞孵育兩小時，並且在一個Y計數器中進行計數，在ImlPBS中洗滌三次，之後離心，最後對細胞所結合的放射物進行再計數。結果在用利妥昔單抗進行預處理/共同處理的情況下，加入的125I-HHl中有26. 0% (總結合27. 4%-非特異性結合I. 4%)特異性結合於細胞。在不用利妥昔單抗進行預處理/共同處理的情況下，25. 5% (26. 9-I. 4)特異性結合(所有數字都表示三次平行實驗的平均值)。也就是說，由於存在利妥昔單抗，使得125I-HHl的結合無明顯差異。結論用過量的利妥昔單抗進行預處理和共同處理不會改變經過放射性標記的HHl的細胞結合能力，並且因此，不會阻止與CD37抗原的接近。 這表明，用經過放射性標記的HHl進行的放射免疫療法可以適合於接受了或正在接受用抗CD20的抗體進行的免疫療法的患者以及未用利妥昔單抗治療過的患者。實例9-使用mLu-HHl治療經靜脈內接種了 Daudi淋巴瘤細胞的SCID小鼠。背景用當前針對CD20的放射免疫療法來治療淋巴瘤患者可能會因抗原漂移以及可能發生的⑶抗原阻斷而為先前曾用利妥昔單抗治療過的患者帶來問題。因此，以其他抗原為目標的放射免疫療法可能更有效。通過對重度聯合免疫缺陷(severe combined immunedefCient，SCID)小鼠靜脈內注射人類淋巴瘤細胞，建立一個靜脈內腫瘤模型。當對SCID小鼠靜脈內接種Daudi淋巴瘤細胞時，這些小鼠將會因Daudi腫瘤細胞的生長而發生後肢癱瘓。實驗在給予50 或 100MBq/kg 177Lu-HHl、50 ii g HHl、50 ii g 利妥昔單抗或 NaCl 的前一周，對SCID小鼠靜脈內注射一千萬個Daudi細胞。每隔一周監測小鼠的後肢癱瘓情況和體重損失，以及WBS計數。使用無症狀存活期中斷作為終點。為了製備經過放射性標記的抗體，首先用p-SCN-Bn-DOTA對HHl進行標記，並且將其純化。更換緩衝液後，將mLu(PerkinElmer, Boston, Ma, USA)加入D0TA-HH1中，並且在40° C下振蕩40分鐘。終產物的比活性為約3200MBq/mkg。將每一製劑溶解於等滲鹽水中，達到每隻動物IOOiU的總注射體積。結果中值無症狀存活期對於鹽水為26天(在21到33天的範圍內)，對於HHl為40天(在23到44天的範圍內)，並且對於利妥昔單抗為40天(在33到44天的範圍內)(圖8)。對於50kBq/kg mLu-HHl,在79天後有80%的動物仍存活。在100kBq/g組中有兩隻小鼠死亡於鹽水組中任一動物之前,並且血細胞計數指示存在放射毒性。該100kBq/g組中三分之一的動物在第49天時死亡。其他動物(70%)在第79天時仍存活。用mLu-HHl治療的小鼠的存活率明顯高於用NaCl、HHl或利妥昔單抗治療的小鼠的存活率(p〈0. 005, Mann Whitney時序測試)。結論數據顯示，接受每克體重(b.w) 50或IOOkBq劑量mLu-HHl的各組的存活率明顯優於接受鹽水或者用HHl或利妥昔單抗進行的免疫療法的組的存活率。毒性數據表明，活性應該保持每克體重小於100kBq。這些數據表明，177Lu-HHl具有相關的體內放射免疫療法的特性。實例IO-mLu-HHl在帶有表達⑶37的腫瘤異種移植物的裸小鼠中的生物分布。背景對經過鑥-177標記的HHl抗體的體內組織分布和腫瘤靶向性進行評估。實驗程序用放射性核素對抗體進行標記
首先用螯合劑p-SCN-Bn-DOTA對抗體進行標記。將DOTA溶解於0. 05M HCl中，將其按5 I的比率加入該抗體中，並且通過使用30kDa截留分子量的Amicon離心過濾管(Millipore, USA)，用碳酸鹽緩衝液洗滌，將pH調到8_9。隨後再次檢查pH，並且在必要時加以調整。室溫下，將該溶液振蕩60分鐘，隨後通過加入50iU 200mM甘氨酸溶液(每毫克抗體)終止反應。為了除去游離的螯合劑，用PBS(PAA)(使用Amicon和離心法)將偶聯的抗體洗滌4到5次，隨後通過用乙酸銨洗滌調到PH5。接著，將 177Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, USA)與 0. 5mg DOTA-HHl 合併於一個 2ml 的聚丙烯管(Eppendorf, Germany)中，並且在40° C下振蕩I小時。mLu-偶聯物的比活性通常為 25_120MBq/kg。免疫活性使用淋巴瘤細胞和一種經過改進的Lindmo法來測量放射免疫偶聯物的品質。所用細胞濃度為每毫升最多108個細胞。這些實驗中使用的偶聯物的免疫活性高於50%。放射免疫偶聯物的生物分布對三周前植入了 I I Imm Daudi腫瘤異種移植物的雄性BALB/c裸(nu/nu)小鼠中177Lu-HHl的生物分布進行測定。通過對每隻動物的尾靜脈注射IOOiU溶液來給予這些製劑。對於mLu-HHl,每隻小鼠的平均活性為500kBq。每一時間點使用四到五隻動物。在注射後各個時間點，在實施頸椎脫白法後進行屍體解剖。測定每一組織樣品的重量，並且利用一種經過校準的Y檢測器(Cobra II自動Y檢測器,Packard Instrument Company,Meriden, CT, USA)測量mLu。在這些測量程序中，使用注射物樣品作為參照物。結果與討論在帶有Daudi異種移植物的BALB/c_裸(nu/nu)雌性小鼠的正常組織中標記有177Lu的HHl的攝取和保留度於圖7中呈現。在放射免疫偶聯物的初始攝取之後來自任何器官/加到任何器官的核素沒有發生再分布的跡象，這表明這些放射免疫偶聯物是穩定的。在帶有腫瘤的裸小鼠中注射mLu-HHl顯示，在骨骼中存在較少攝取。已知游離的177Lu積聚於骨骼中，因此這一結果表明，該放射免疫偶聯物在體內是穩定的。在稍後時間點時，腫瘤中的攝取明顯高於其他器官中的攝取。這表明，對於使用HHl抗體的放射免疫療法，177Lu具有相關的半衰期。在表達⑶37的腫瘤異種移植物中mLu-HHl的生物分布數據顯示出一種相關的正常組織攝取和清除以及顯著的保留度。HHl抗體看起來特別適合放射免疫療法。mLu-HHl偶聯物看起來特別適合，因為在大部分放射性核素衰變前，獲得了有利的腫瘤與正常組織之比。表格表I
多种放射免疫偶聯物的免疫活性和比活性。
放射免疫偶聯物 IRF1 (%)比活性1 (MBq/mg) 尹
驗編號
125I-HH I66 士 17 (39-92) 75 土 15 (51-104)17
111In-HHl66- 14(51-78) 22± 12 (9-32)
3
177Lu-HHl5692I
125T-利妥昔單抗 62 士 6 (54-68) 69 ±30 (34-118)6
liiIn-利妥昔單抗 4516I
177Lu-利妥昔單抗 60137
I1平均值土標準偏差(範圍)表2對於抗體利妥昔單抗和HHl，Raji、Rael和Daudi細胞上抗原的平均數目(Bmax)、平衡解離常數(Kd)和締合速率常數(ka)。
抗體細胞系 Bmax (抗原/細胞) Kd (nM) ka
(nM/h)
HHlRaji 146 000 ±7 600 6.3 士 1.7 0.36 ±0.14
HHlRael 263 000 ± 27 000 12.7 ±5.5 0.07 ±0.01
HHlDaiidi 340 000 ± 5 000 2.7 ±0.3 0.72 ± 0.07
利妥昔單抗 Raji 272 000 士 69 000 4.8 土 0.9 0.08 士0.006
利妥昔單抗 Rael 626 000 ± 36 000 12.0 士 2.0 0.08 土
0.007表3
孵育2小時後每個Daudi細胞所結合的mLu原子數目。
權利要求
1.一種結合人類⑶37的放射免疫偶聯物，包含 a)鼠類單克隆抗體HHl， b)一個連接子，以及 c)一种放射性核素，該放射性核素選自由以下各項組成的組，即177Lu、211At、213Bi、212Bi,212Pb, 225Ac, 227Th,90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd,77As、67Cu 以及 47Sc。
2.根據權利要求I所述的結合CD37的放射免疫偶聯物，其中該連接子是一種螯合性連接子。
3.根據權利要求I到2中任一項所述的結合CD37的放射免疫偶聯物，其中該放射性核素是177Lu。
4.一種藥物組合物，包含根據權利要求I到3中任一項所述的放射免疫偶聯物和一種藥學上可接受的載體。
5.根據權利要求4所述的藥物組合物，另外包含一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯物。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中該一種或多種另外的抗體或放射免疫偶聯物以CD20為目標。
7.根據權利要求4到6中任一項所述的藥物組合物，用於對表達該⑶37抗原的B細胞惡性細胞進行治療。
8.根據權利要求7所述的藥物組合物，用於治療非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病。
9.一種根據權利要求I到3中任一項所述的放射免疫偶聯物的用途，用於治療B細胞惡性腫瘤。
10.根據權利要求9所述的用途，其中該放射免疫偶聯物是組合或連同另一種療法一起給予的。
11.根據權利要求10所述的用途，其中該療法選自預治療、化學療法、單克隆抗體療法、手術、放射療法和/或光動力療法。
12.根據權利要求10或11所述的用途，其中該療法包含在用根據權利要求I到3中任一項所述的放射免疫偶聯物進行治療之前，使用抗CD20和/或抗CD37的單克隆抗體進行預治療。
13.一種用於對選自非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病的一種B細胞惡性腫瘤進行治療的方法，包括給予一個有效量的根據權利要求4到8中任一項所述的藥物組合物。
14.一種用於製備根據權利要求I到3中任一項所述的放射免疫偶聯物的試劑盒，包含兩個或更多個小瓶，其中一個小瓶含有一種偶聯物，該偶聯物包含與一種鼠類單克隆抗體HHl連接的一種螯合劑；並且一個第二小瓶含有一种放射性核素。
15.根據權利要求14所述的試劑盒，其中這些小瓶中一個或數個的內含物是經過凍幹的或呈一種溶液的形式。
全文摘要
本發明涉及一種結合人類CD37的放射免疫偶聯物。用於治療癌症，特別是B細胞惡性腫瘤的多種藥物組合物和其多種用途是本發明涉及的方面。
文檔編號A61K51/10GK102762230SQ201180007272
公開日2012年10月31日 申請日期2011年1月28日 優先權日2010年1月29日
發明者奧伊溫德·S·布呂蘭, 約斯泰因·達勒, 羅伊·H·拉森 申請人:諾帝克納諾維科特公司