用於預防及治療認知衰退和年齡相關的記憶障礙的無取代b環類黃酮和黃烷混合物的組合物的製作方法

2023-07-19 17:07:31

專利名稱：用於預防及治療認知衰退和年齡相關的記憶障礙的無取代b環類黃酮和黃烷混合物的組合物的製作方法
技術領域：
本發明總體而言涉及用於預防及治療因暴露於活性氧類(ROS)、炎性蛋白和類花生酸類物質(eicosanoids)而導致的神經退化、神經炎症和累積性認知衰退(cumulative cognitive decline)、障礙、疾病和病症的組合物。具體而言，本發明涉及包含兩類特殊的化合物——無取代B環類黃酮以及黃烷的混合物的新型組合物，其用於預防及治療由氧化性損傷、炎症以及環氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)途徑介導的與衰老、認知、神經炎性和神經退行性相關的疾病和症狀。這些疾病和症狀包括但不限於隨年齡增長導致的神經退行性疾病、中風、痴呆、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨庭頓氏舞蹈病、肌萎縮側索硬化症(ALS)和認知衰退。
背景技術：
花生四烯酸(AA)從細胞膜中的釋放與代謝通過幾種不同途徑導致生成促炎(pro-inflammatory)代謝物。可論證的，兩種最重要的發炎途徑都是由5-脂氧合酶(5-LO)和環氧合酶(COX)酶介導的。這些平行通道分別導致白三烯和前列腺素的生成，它們在炎症反應的引發和發展中扮演重要角色。這些血管活性化合物為化學吸引素，其促進發炎細胞滲透入組織並使炎症反應延長。因此，負責生成這些炎症介質的酶成為許多目的為治療炎症的新藥的目標，該炎症是導致如類風溼性關節炎、骨性關節炎、阿爾茨海默氏病和某些類型的癌症的疾病的發病機制的因素。
環氧合酶(COX)的抑制是大多數非甾體抗炎藥(NSAID)的作用機制。存在兩種不同的同種型COX酶(COX-1和COX-2)，它們共有大約60％的序列同序性，但表達譜(expression profile)以及功能不同。COX-1是與生理學重要的前列腺素的生成相聯繫的組成型酶，前列腺素與如血小板凝集的正常生理功能的調節、胃中細胞功能的保護以及正常腎功能的維持有關(Dannhardt和Kiefer(2001)Eur.J.Med.Chem.36109-26)。第二種同種型COX-2是可被促炎細胞因子如白細胞介素-1β(IL-1β)和其他生長因子誘導的酶的形式(Herschmann(1994)Cancer MetastasisRev.134241-56；Xie等，(1992)Drugs Dev.Res.25249-265)。該同種型催化從AA生成前列腺素E2(PGE2)。COX-2的抑制是常規NSAID具有抗炎活性的原因。
對COX-2和5-LO表現出雙重特異性、同時維持了對COX-2相對於COX-1的選擇性的抑制劑具有抑制AA代謝的多重途徑的明顯好處。這種抑制劑可通過抑制其生成而阻斷前列腺素(PG)以及多重白三烯(LT)的炎性作用。其包括PGE2、LTB4、LTD4以及也公知作為anaphalaxis慢反應物質的LTE4的血管舒張、血管通透性和趨化性作用。其中，LTB4具有最有效的趨化性以及化學增活作用(Moore(1985)，ProstanoidsPharmacological，Physiological and Clinical Relevance，CambridgeUniversity Press，N.Y.，pp.229-230)。
除上述雙重COX-2/5-LO抑制劑的好處外，許多雙重抑制劑不引發NSAID或COX-2抑制劑典型的副作用，包括傳統NSAID所引起的胃腸道損傷和不適。有人提出NSAID引發的胃炎主要歸因於5-LO代謝物，特別是LTB4，其將細胞吸引至胃損傷部位並因此引起進一步的損傷(Kircher等，(1997)Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids 56417-23)。白三烯代表前列腺素類被抑制後胃黏膜內主要的AA代謝物。看起來這些化合物在很大程度上促成了由應用NSAID所導致的胃上皮損傷。(Celotti和Laufer(2001)Pharmacological Research 43429-36)。COX和5-LO的雙重抑制劑還顯示出抑制大鼠模型中關節炎心臟(arthritic hearts)的冠狀血管收縮(Gok等(2000)Pharmacology 6041-46)。總之，這些特徵表明，由於既增強了功效還減少了副作用，因此雙重COX-2和5-LO抑制劑相對於特異性COX-2抑制劑和非特異性NSAID具有明顯的優勢。
由於COX抑制劑的作用機制與大多數常規的NSAID重疊，因此COX抑制劑被用於治療許多相同症狀如短期症狀中與發炎有關的疼痛和腫脹以及發炎在其中起關鍵作用的慢性疾病。短期症狀包括與輕度擦傷、曬傷或接觸性皮炎有關的炎症的治療，以及與緊張和偏頭痛有關的疼痛以及月經痛的減輕。慢性症狀包括關節炎疾病如類風溼性關節炎和骨關節炎。儘管類風溼性關節炎很大程度上是自身免疫性疾病而骨關節炎是由關節軟骨的退化導致的，但分別與其相關的炎症的減少使得這些疾病的患者的生活質量大幅提高(Wienberg(2001)Immunol.Res.22319-341；Wollhiem(2000)Curr.Opin.Rheum.13193-201)。由於發炎通常是風溼病的一部分，因此COX抑制劑的應用得以擴展至包括如系統性紅斑狼瘡(SLE)(Goebel等(1999)Chem.Res.Tox.12488-500；Patrono等(1985)J.Clin.Invest.761011-1018)以及風溼性皮膚病如硬皮病的疾病。COX抑制劑還用於減輕非風溼起因的炎症性皮膚症狀如牛皮癬，這些疾病中減輕由前列腺素過度生成導致的發炎具有直接的好處(Fogh等(1993)Acta Derm.Venereol(Oslo)73191-193)。
最近的科學進展確認了COX-2表達、普通炎症以及阿爾茨海默氏病(AD)之間的聯繫(Ho等(2001)Arch.Neurol.58487-92)。在動物模型中，COX-2酶過度表達的轉基因小鼠具有更易受損傷的神經元。國家衰老研究所(NIA)正在啟動一項臨床研究以確定NSAID是否能夠延緩阿爾茨海默氏病的進展。將對萘普生(一種非特異性NSAID)和羅非考昔(Vioxx，一種COX-2特異性選擇性NSAID)進行評價。先前的證據表明，炎症促進阿爾茨海默氏病。據阿爾茨海默氏病協會和NIA表示，在美國大約有4百萬人患有AD，並且預計到世紀中將達到1400萬。
NSAID在AD發病機制中的保護作用有助於抑制COX-2以及直接預防大腦中澱粉樣變性。(Xiang等，(2002)Gene Expression 10271-278)。通過抑制COX-2生成促炎前列腺素PGE2，周圍的神經元同樣得以免受可由活化的小膠質細胞生成的氧化和炎性損傷。(Combs等，(2001)Neurochem.Intl.39449-457)。該作用消除了隨後小膠質細胞生成供給周期(feed the circle)並傳播(propagate)神經退化的細胞因子和ROS。(Kalaria等，(1996)Neurodegeneration 5497-503；Combs等，(1999)J.Neurosci.19928-939)。NSAID還抑制γ-分泌酶活性，從而抑制澱粉樣前體蛋白(APP)加工、澱粉樣-β(Aβ)肽水平的升高、以及神經原纖維纏結(NFT)和神經元斑(neuritic plaque)的發展(Weggen等，(2001)Nature414212-216；Takahashi等，(2003)J.Biol.Chem.27818664-18670)。
由暴露於ROS、細胞因子和促炎性類花生酸類物質導致的進行性神經衰退(neural deterioration)其本身表現於許多疾病狀態中，這些疾病狀態具有相同的根源。這些疾病目前使用具有維持認知和神經保護性質的NSAID進行治療，這些性質源於這些NSAID對ROS、細胞因子以及促炎性類花生酸類物質的多因素活性(multifactoral activity)。它們抑制澱粉樣蛋白的沉積、減少血栓烷和前列腺素類化合物的生成、以及在某些情況下具有高度的抗氧化活性。所有這些活性都可預防認知衰退和減緩由氧化應激和衰老導致的對神經退化的累積作用。
NSAID的神經保護活性構成當前關於各種變性疾病狀態、衰老、炎症和氧化應激中可見的身體和神經變性衰退的理論基礎。暴露於電離輻射通過在被輻射器官中導致相似的組織病理學變化以及它們的抗氧化狀態來模擬這些疾病中的一些疾病，這一最初的觀察結果表明自由基的形成是一種誘發因素。(Gerschman等，(1954)Science 119623-626；Harman(1956)J.Gerontol.11289-300；Harman(1957)J.Gerontol.2298-300)。暴露前給藥抗氧化劑為有機體提供了抵抗輻射破壞作用的一定的保護作用。由這些研究得到的結論是，如果未通過抗氧化防禦加以控制，長期暴露於由電離輻射或氧化代謝產生的自由基氧化應激會干擾細胞內環境的REDOX平衡，且就其自身而言實質上是破壞性的。從這項觀察形成關於增加壽命和神經保護作用的領先的研究，包括通過限制熱量降低而控制基礎代謝從而降低自由基水平。(Berg和Simms(1960)J.Nutr.71255-261；Weindruch和Walford(1988)The retardation of aging anddisease by dietary restriction.C.C.Thomas，Sprongfield，IL)。
Berg和Simms提出，身體功能的維持與限制熱量攝入及隨之經氧化代謝產生的自由基減少、本質上即熱量限制(CR)相關連。(Berg和Simms(1960)J.Nutr.71255-261)。Harman認為通過應用抗氧化劑所得到的這種保護作用可通過防止脂質過氧化反應而擴展至神經系統。(Harman(1969)J.Gerontol.23476-482)。另一些研究者認為細胞損傷和DNA損害看來大致與機體的基礎代謝率(BMR)相關，並且證實BMR越高，壽命越短，且細胞損傷和DNA損傷越厲害。(Barja(2002)Free Rad.Biol.Med.331167-1172)。解釋是從線粒體生成的破壞性ROS及細胞質的氧化代謝產生在細胞和分子水平的自由基誘導的損傷的累積，並且部分地造成許多的退化性及年齡相關的疾病。然而，ROS導致的損傷可通過CR抑制BMR或通過增強抗氧化防禦以對抗ROS產生而減少。CR已經再三地被證明為增加許多物種壽命的有效方法。(Weindruch和Walford(1988)The retardation of aging and disease by dietary restriction，C.C.Thomas，Springfield，IL；Weindruch(1989)Prog.Clin.Biol.Res.28797-103)。這項研究已鼓舞研究者們去考察有機體關於隨衰老可見的進行性身體及神經衰退的抗氧化狀況，並導致隨後發展出衰老的自由基理論。(Harman(1994)Ann.NY Acad.Sci.7171-15)。
可證明與有機體抗氧化防禦的增強或增補與神經保護活性相關的其它研究能支持該理論。在齧齒動物的膳食裡補充微量養料(Liu等(2002)Ann.NY Acad.Sci.959133-166)、抗氧化劑(Floyd和Hensley(2002)Ann.NY Acad.Sci.899222-237；Joseph等(2000)Mech.Ageing Dev.116141-153；Galli等(2002)Ann.NY Acad.Sci.959128-132)和植物提取物(Bickford等(2000)Brain.Res.866211-217；Cartford等(2002)J.Neurosci.225813-5816)被證明除了改善了認知任務中的行為(Bickford等(1999)Mech.Ageing Dev.111141-154)和恢復了CNS電生理學反應(Gould等(1998)Neurosci.Lett.250165-168；Bickford等(1999)FreeRad.Biol.Med.26817-824)外，還保護了衰老的神經系統免受電離輻射(Lenton和Greenstock(1999)Mech.Ageing Dev.10715-20)或氧化損傷(Butterfield等(1998)Ann.NY Acad.Sci.854448-462；Cao等(1999)J.Applied Physio.861817-1822)。據認為，所有這些介入治療都可改變細胞內環境的抗氧化狀況並且可保護關鍵的細胞質及線粒體內容物免受ROS的降解，從而復原或維持了體內平衡。抗氧化狀況指標(indices ofantioxidant)已顯示出與這些膳食控制相應的變化。例如，脂質過氧化物標記丙二醛(MDA)(Gemma等(2002)J.Neurosci.226114-6120)和羥基壬烯醛(hydroxynonenal)(HNE)變少(Yoshimura等(2002)Free Rad.Res.36107-112)，異構前列腺素類化合物(isoprostanes)減少(Montine等(2003)Biochem.Pharmacol.65611-617)，8-羥基-2-脫氧鳥苷水平降低(Lee等(1998)Cancer Lett.132219-227)，蛋白羰基(Carney等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883633-3636；Stadtman和Berlett(1998)DrugMetab.Rev.30225-243)及硝基酪氨酸殘餘物下降(Whiteman和Halliwell(1996)Free Rad.Res.25275-283)，以及自旋捕獲抗氧化劑顯示活性降低(Carney等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883633-3636)。
用自旋捕獲抗氧化劑N-叔丁基-α-苯基硝酮(nitrone)(PNB)治療顯示出藥理學上減弱由衰老及ROS誘導的神經退化的能力。PBN是自由基清除劑，已證實其可減少ROS(Floyd(1999)Proc Soc Exp Biol Med.222(3)236-245.)、降低加速衰老的小鼠模型的蛋白羰基生成(Butterfield等(1997)Proc.Natl Acad.Sci.USA 94674-678)、保護受到局部缺血再灌注損傷的沙土鼠(gerbil)的腦部(Floyd和Hensley(2000)Ann.NY Acad.Sci.899222-237)、保持老年大鼠的小腦反應性(Gould和Bickford(1994)Brain Res.660333-336)、以及降低人類成纖維細胞端粒縮短的速率(vonZglinicki等(2000)Free Rad.Biol.Med.2864-74)。還已證明PNB可有效地減少老年沙土鼠的蛋白羰基含量以及改善它們在放射臂迷宮行為任務(radial arm maze behavorial task)中的行為。(Carney等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883633-3636)。因此，通過各種營養介入(nutritionalinterventions)增強機體抗氧化防禦仍然是強制性的建議(compellingproposition)。
如由空間學習、記憶形成所見的缺陷以及鞏固記憶必需的長時程增強(LTP)的衰退所證實的，衰老和氧化應激與海馬信息加工衰退相關(Barnes(1990)Prog.Brain Res.8689-104；McGahon等(1997)Neuroscience 819-16，Murray和Lynch(1998a)J.Neurosci.27312161-12168)。本文公開的組合物為COX和LOX抑制劑以及強效抗氧化劑，其可降低由氧化應激、炎症或衰老導致的海馬加工衰退。
最後，炎性前列腺素類通過增量調節炎性細胞因子IL-1β而損害LTP。、已證明隨年齡及氧化應激增加，該細胞因子抑制海馬CA1區和DG內的LTP。(Murray和Lynch(1998a)J.Neurosci.27312161-12168)。與IL-1β表達增量調節相關的是海馬內的脂質過氧化反應的增加。(Murray等(1999)Gerontology 45136-142)。對此過程的進一步評價揭示，用富含抗氧化劑的膳食處理的動物經歷了IL-1β、脂質過氧化反應及有關的LTP缺陷與年齡相關的變化相反的變化。(Lynch(1998)Prog.Neurobiol.56571-589)。此外，增補抗氧化劑的膳食還可改善膜AA濃度的年齡相關的減少。(Murray和Lynch(1998b)J.Biol.Chem.27312161-12168)。所有這些因素清晰地表明，由暴露於氧化應激、炎症和衰老導致的認知衰退可通過膳食及藥理學介入而延緩或改善。
類黃酮或生物類黃酮為廣泛分布的天然產物，據報導其具有抗菌、抗炎、抗過敏、抗誘變劑、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓形成(anti-thrombic)及血管舒張活性。這組化合物共有的結構單元包括兩個位於3-碳環兩側的苯環，如下結構通式所示 連接至該總三環結構的羥基、糖、氧及甲基的各種組合產生多種類型的類黃酮，包括黃烷醇、黃酮、黃烷-3-醇(兒茶素)、花色苷和異黃酮。
據證實，攝入類黃酮與痴呆發作的風險呈反相關。雖然作用機制還未知，但據推測是因為類黃酮的抗氧化作用。(Commenges等(2000)Eur.J.Epidemiol.16357-363)。多酚類的黃酮通過在mRNA水平作用於包括cox-2、核因子kappa B(NFκB)及bcl-X(L)的基因而誘導轉化的(transformed)結腸細胞程序性細胞死亡、並抑制分化以及生長。(Wenzel等(2000)Cancer Res.603823-3831)。據報導，B環上羥基的數量對抑制cox-2的轉錄活性很重要。(Mutoh等(2000)Jnp.J.Cancer Res.91686-691)。
最近有報導提出，從草藥黃芩分離的類黃酮可能涉及cox-2基因表達的改變。(Wakabayashi和Yasui(2000)Eur.J.Pharmacol.406(3)477-481；Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.611417-1427；Chi等(2001)Biochem.Pharmacol.611195-1203；Raso等(2001)Life Sci.68(8)921-931)。術語基因表達常用於描述mRNA生成及蛋白質合成。事實上，實際基因表達的變化永遠不會導致可觀察到的蛋白水平上的變化。蛋白水平的變化並不總是由基因表達變化所引起的這一推論也可以是正確的。在從基因組DNA導向功能蛋白的途徑中存在6個可能的調節點(1)核因子及其他導致前mRNA生成的信號的轉錄調節；(2)前mRNA加工調節包括外顯子剪接、5』位帽子結構和3』位聚腺苷化序列的附加以及成熟mRNA從細胞核到細胞質的轉運；(3)mRNA轉運調節，其控制mRNA定位至特定的細胞質位點以翻譯成為蛋白質；(4)mRNA降解調節，其在任何蛋白翻譯之前或作為從該特定mRNA結束翻譯的方法控制mRNA庫的大小；(5)蛋白質翻譯起始的比速率的翻譯調節；以及(6)翻譯後加工調節，包括如糖基化和蛋白酶剪切的修飾。在基因組研究領域中，重要的是應用測量該途徑中接近於初始步驟(例如mRNA水平)而不是後續步驟的基因表達水平(例如蛋白質水平)的技術。
所有上述引用的對cox-2基因表達的研究都使用蛋白質印跡技術評價未經在DNA或mRNA水平確認的推定的基因表達的改變。由於蛋白質印跡技術僅測定蛋白質水平而非具體轉錄產物mRNA，因此導致觀察到的蛋白質表達的增加的原因有可能包括其他機制。例如，據報導LPS通過存在於mRNA的3』非翻譯區(3』UTR)的不穩定序列調節mRNA的半衰期(Watkins等(1999)Life Sci.65449-481)，其可解釋為何基因轉錄速率不變而蛋白質表達增加。因此，這些治療條件是否會帶來基因表達有意義的改變這一問題仍懸而未決。
如RT-qPCR和DNA微陣列分析的技術依靠對mRNA水平進行分析，並且可用於在不同的條件下、即有或無藥物活性劑存在的條件下對基因表達水平進行評價。迄今為止，申請人不知道有任何報導的方法在以包含無取代B環類黃酮和黃烷的組合的組合物作為治療劑應用時直接或間接地特異性地測定了mRNA的量。
無取代B環黃酮及黃酮醇是一類特殊的類黃酮，其芳香B環上無取代基(下文稱作無取代B環類黃酮)，由如下通式所示 其中
R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，碳、氧、氮或硫，單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括但不限於戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子組中，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、氟離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、碳酸根等。
無取代B環類黃酮相對稀少。在9,396種合成或自天然來源分離的類黃酮中，已知僅有231種無取代B環類黃酮(The Combined ChemicalDictionary，ChapmanHall/CRC，Version 5:1 June 2001)。據報導無取代B環類黃酮具有種種生物活性。舉例而言，高良姜精(3，5，7-三羥基黃酮)可用作抗氧化劑及自由基清除劑，並且據信是一種有前景的抗遺傳毒性和癌症化學預防劑的候選物(Heo等(2001)Mutat.Res.488135-150)。其為酪氨酸酶單酚酶抑制劑(Kubo等(2000)Bioorg.Med.Chem.81749-1755)、兔心臟羰基還原酶抑制劑(Imamura等(2000)J.Biochem.127653-658)，具有抗菌活性(Afolayan和Meyer(1997)Ethnopharmacol.57177-181)和抗病毒活性(Meyer等(1997)J.Ethnopharmacol.56165-169)。黃芩黃素及另外兩種無取代B環類黃酮對人乳腺癌細胞具有抗增殖活性(So等(1997)Cancer Lett.112127-133)。
通常，基於類黃酮的有效性隨機測試其生物活性。偶爾地，特定生物活性強調需要B環上的取代，如與p-糖蛋白高親和力結合(Boumendjel等(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11(1)75-77)、強心作用(Itoigawa等(1999)J.Ethnopharmacol.65(3)267-272)、抗亞油酸過氧化氫誘導的毒性的對內皮細胞的保護作用(Kaneko和Baba(1999)Biosci Biotechnol.Biochem 63(2)323-328)、COX-1抑制活性(Wang(2000)Phytomedicine715-19)以及前列腺素內過氧化物合酶(Kalkbrenner等(1992)Pharmacology 44(1)1-12)需要B環上被取代。僅有為數不多的出版物提到無取代B環類黃酮中未取代的B環的重要性。一個實例為抑制NADPH醌受體氧化還原酶的2-苯基黃酮作為潛在的抗凝血劑的應用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)1417-1427)。
各種無取代B環類黃酮抗炎活性的作用機制存在爭議。無取代B環類黃酮柯因(Liang等(2001)FEBS Lett.496(1)12-18)、漢黃芩素(Chi等(2001)Biochem.Pharmacol.611195-1203)以及halangin(Raso等(2001)Life Sci.68(8)921-931)的抗炎活性通過過氧化物酶體增生物活化受體γ(PPARγ)的活化以及對脫粒和AA釋放的影響從而與誘導型環氧合酶和一氧化氮合酶的抑制有關。(Tordera等(1994)Z.Naturforsch[C]49235-240)。據報導，木蝴蝶素、黃芩黃素和漢黃芩素抑制12-脂氧合酶活性而不影響環氧合酶(You等(1999)Arch.Pharm.Res.22(1)18-24)。新近據報導，漢黃芩素、黃芩苷和黃芩黃素的抗炎活性通過由一氧化氮抑制劑和脂多糖誘導的誘導型一氧化氮合酶的抑制和cox-2酶的基因表達而產生(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)1417-1427)。還有報導顯示木蝴蝶素通過抑制NFκB的活化起作用(Chen等(2001)Biochem.Pharmacol.61(11)1417-1427)。最後，有報導顯示漢黃芩素抑制巨噬細胞中誘導型PGE2的生成(Wakabayashi和Yasui(2000)Eur.J.Pharmacol.406(3)477-481)。
據報導，黃芩根抗炎活性的機制是黃芩黃素對絲裂原活化蛋白激酶磷酸化的抑制以及對Ca2+離子載體A23187誘導的PGE2釋放的抑制(Nakahata等(1999)Nippon Yakurigaku Zasshi 114，Supp.11215P-219P；Nakahata等(199g)Am.J.Chin.Med.26311-323)。據報導源自黃芩的黃芩苷抑制超抗原葡萄球菌外毒素刺激的T細胞增生和IL-1β、IL-6、腫瘤TNF-α以及幹擾素-γ(IFN-γ)的生成(Krakauer等(2001)FEBS Lett.50052-55)。因此，黃芩苷的抗炎活性與由超抗原活化的促炎細胞因子介導的信號傳導途徑的抑制有關。然而，還有人提出黃芩苷的抗炎活性是由於對各種趨化因子的結合，而該結合限制了它們的生物活性(Li等(2000)Immunopharmacology 49295-306)。近來，有報導表明黃芩苷對由凝血酶和凝血酶受體激動肽誘導的粘附分子的表達(Kimura等(2001)Planta Med.67331-334)，以及抑制絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)級聯(Nakahata等(1999)Nippon Yakurigaku Zasshi 114，Supp 11215P-219P；Nakahata等(1998)Am.J.Chin Med.26311-323)的作用。
中國藥用植物黃芩含有大量的無取代B環類黃酮，包括黃芩黃素、黃芩苷、漢黃芩素和baicalenoside。傳統上，該植物用於治療許多病症，包括清熱、瀉火、溼溫和暑熱病；高燒引起的煩渴；癰、潰瘍和其他化膿的皮膚感染；上呼吸道感染如急性扁桃體炎、咽喉炎和猩紅熱；病毒性肝炎；腎炎；盆腔炎(pelvitis)；痢疾；嘔血和鼻出血。該植物傳統上還用於預防流產(見Encyclopedia of Chinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中國，1998)。臨床上，黃芩現用於治療病症如小兒肺炎、小兒細菌性腹瀉、病毒性肝炎、急性膽囊炎、高血壓、由傷口和外科手術引起的局部急性發炎、支氣管哮喘和上呼吸道感染(Encyclopediaof Chinese Traditional Medicine，上海科技出版社，上海，中國，1998)。黃芩根治療支氣管哮喘的藥理學功效據報導與無取代B環類黃酮的存在以及其抑制作用有關，它們可以抑制嗜酸性細胞的與嗜酸性細胞趨化因子相關的補充(Nakajima等(2001)Planta Med.67(2)132-135)。
迄今為止，許多天然存在的無取代B環類黃酮得以商品化用於各種用途。例如，黃芩提取物的脂質體劑型用於護膚(美國專利No.5,643,598；5,443,983)。由於對致癌基因具有抑制作用，黃芩苷被用於預防癌症(美國專利No.6,290,995)。黃芩苷和其他化合物被用作抗病毒、抗菌和免疫調節劑(美國專利No.6,083,921和WO 98/42363)並作為天然的抗氧化劑(WO 98/49256和波蘭專利公開No.9,849,256)。黃芩根提取物已被配製為輔助的防曬劑(supplemental sun screen agent)，其對局部用組合物中的各單一組分的累積SPF具有加成作用(WO 98/19651)。柯因由於其降低焦慮性質得以應用(美國專利No.5,756,538)。抗炎類黃酮用於控制和治療肛門直腸和結腸疾病(美國專利No.5,858,371)以及抑制脂氧合酶(美國專利No.6,217,875)。這些化合物還與葡糖胺膠原以及其他成分一起配製用於修復和維護結締組織(美國專利No.6,333,304)。類黃酮酯可構成美容組合物的活性成分(美國專利No.6,235,294)。於2002年3月1日提交的序列號為10/091,362名為「Identification of Free-B-ringFlavonoids as Potent COX-2 Inhibitors」以及於2003年4月30日提交的序列號為10/427,746名為「Formulation With Dual Cox-2 And 5-LipoxygenaseInhibitory Activity」的美國專利申請都公開了通過向需要的主體給藥含有無取代B環類黃酮的組合物或含有無取代B環類黃酮混合物的組合物來抑制環氧合酶COX-2的方法。這是首篇將無取代B環類黃酮與COX-2的抑制活性相聯繫的報導。該申請於此全文併入作為參考。
日本專利No.63027435描述了黃芩黃素的提取及富集，日本專利61050921描述了黃芩苷的純化。
黃烷包括以下結構通式所表示的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，其中所述取代基的酯包括但不限於沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯、以及它們的化學衍生物，所述糖包括但不限於戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根等。
兒茶素是一種黃烷，主要發現於綠茶，其具有下列結構 兒茶素兒茶素既單獨起作用又可與其他在茶中發現的類黃酮一同起作用，並且其既具有抗病毒又具有抗氧化活性。據證實，兒茶素對病毒性肝炎的治療有效。其還顯示可預防對心臟、腎、肺、脾的氧化損傷，並可抑制胃癌細胞的生長。
兒茶素與其異構體表兒茶素抑制前列腺素過氧化物合酶，IC50值為40μM。(Kalkbrenner等(1992)Pharmacol.441-12)。從4種植物Atunaracemosa、Syzygium carynocarpum、Syzygium malaccense和Vantaneaperuviana中分離出來的五種黃烷-3-醇衍生物，包括(+)-兒茶素和沒食子兒茶精相對於COX-1對COX-2顯示出同等或較弱的抑制作用，其IC50值從3.3μM到138μM不等(Noreen等(1998)Planta Med.64520-524)。從吉貝(Ceiba pentandra)皮中分離出的(+)-兒茶素抑制COX-1的IC50值為80μM(Noreen等(1998)J.Nat.Prod.618-12)。可從商業途徑得到的純(+)-兒茶素抑制COX-1的IC50值視試驗條件而定，約為183到279μM，對COX-2不具有選擇性(Noreen等(1998)J.Nat.Prod.611-7)。
綠茶兒茶素當補充加入至Sprague dawley雄性大鼠的膳食中時，降低了血小板PLA2的活性水平並顯著減少了血小板環氧合酶水平(Yang等(1999)J.Nutr.Sci.Vitaminol.45337-346)。兒茶素和表兒茶素據報導可微弱抑制cox-2基因在人結腸癌DLD-1細胞中的轉錄(IC50＝415.3μM)。(Mutoh等(2000)Jpn.J.Cancer Res.91686-691)。來自紅酒的(+)-兒茶素的神經保護能力源自兒茶素的抗氧化性能，而不是其對細胞內酶類如環氧合酶、脂氧合酶或一氧化氮合酶的抑制作用(Bastianetto等(2000)Br.J.Pharmacol.131711-720)。由綠茶和紅茶中純化而得的兒茶素衍生物如表沒食子兒茶精-3-沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶精(EGC)、表兒茶素-3-沒食子酸酯(ECG)和茶黃素顯示出對人結腸黏膜和結腸腫瘤組織中AA的環氧合酶和脂氧合酶依賴性代謝(Hong等(2001)Biochem.Pharmacol.621175-1183)以及誘導型(induce)cox-2表達和PGE2生成的抑制(Park等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.286721-725)。由南蛇藤(Celastrus orbiculatus)的氣生部分分離得到的表阿夫兒茶精展現出對COX-1活性的劑量依賴性抑制，其IC50值為15μM，並且據證實，在以口服100mg/kg劑量給藥之後其對角叉菜膠誘導的鼠踝腫脹具有抗炎活性(Min等(1999)Planta Med.65460-462)。
金合歡是豆科樹木和灌木屬。金合歡屬包括多於1000種屬於豆科及含羞草亞科的物種。金合歡分布於全世界如中、南美洲、非洲、亞洲部分地區以及具有最多特有品種的澳洲的熱帶和亞熱帶地區。金合歡有重大的經濟意義，其提供了鞣質、樹膠、木材、燃料和飼料的原料。鞣質主要從樹皮中分離得到，被廣泛用於鞣製皮革和碎革。一些金合歡樹皮還用於當地醑劑的調味。如藤金合歡(A.sinuata)的一些土著物種也產出皂苷，其為各種植物多糖中的任何一種，當與水一同混合併攪拌時，形成象肥皂的泡沫。皂苷用於洗滌劑、發泡劑和乳化劑。金合歡屬的一些物種的花氣味芬芳因此用於生產香水。許多金合歡的心材用於製造農業工具，還是木柴的來源。金合歡樹膠廣泛用於藥物和甜點，並用作紡織工業中的定型和修整材料。
迄今為止，約從各種金合歡品種中分離出330種化合物。類黃酮為從金合歡中分離出的主要類型的化合物。已鑑定有大約180種不同的類黃酮，其中111種為黃烷。萜類是從金合歡屬物種中分離出的第二大類化合物，已鑑定出48種化合物。從金合歡中分離出的其他類型化合物包括生物鹼(28)、胺基酸/肽(20)、鞣質(16)、糖類(15)、含氧雜環(15)和脂肪族化合物(10)(Buckingham，The Combined Chemical Dictionary，ChapmanHall CRC，52版，Dec.2001)。
所有金合歡品種中具有中等到高濃度的酚類化合物，特別是黃烷(Abdulrazak等(2000)Journal of Animal Sciences.13935-940)。在歷史上，金合歡屬的大多數植物和提取物被用作收斂藥治療胃腸道紊亂、腹瀉、消化不良以及止血。(Vautrin(1996)Universite Bourgogne(France)European abstract 58-01C177；Saleem等(1998)Hamdard Midicus.4163-67)。阿拉伯金合歡(Acacia Arabica Willd.)的樹皮和莢中含有大量的鞣質，因此被用作收斂藥和祛痰藥(Nadkarni(1996)India MateriaMedica，Bombay Popular Prakashan，pp.9-17)。據報導，從來自索馬利亞的Acacua tortilis的莖皮中分離出的二芳基丙醇衍生物具有鬆弛平滑肌作用。(Hagos等(1987)Planta Medica.5327-31，1987)。還有報導指出分離自勝利金合歡(Acacia victoriae)的萜類糖苷對二甲基苯並蒽誘導的鼠皮膚致癌作用具有抑制作用(Hanausek等(2000)Proceedings AmericanAssociation for Cancer Research Annual Meeting 41663)且誘發細胞凋亡(Haridas等(2000)Proceedings American Association for Cancer ResearchAnnual Meeting.41600)。據報導阿拉伯膠金合歡(Acacia nilotica)的植物提取物具有致痙、血管收縮和抗高血壓活性(Amos等，(1999)Phytotherapy Research 13683-685；Gilani等(1999)Phytotherapy Research13665-669)，以及抗血小板凝集活性(Shah等，(1997)GeneralPharmacology 29251-255)。報導指出阿拉伯膠金合歡具有抗炎活性。據推測，類黃酮、多糖和有機酸為可能的活性成分(Dafallah和Al-Mustafa(1996)American Journal of Chinese Medicine 24263-269)。迄今為止，唯一有報導的由金合歡分離的5-脂氧合酶抑制劑為單萜氨甲醯(Seikine等(1997)Chemical Pharmaceutical Bulletin.45148-11)。
金合歡樹皮提取物在日本被授予的專利為作為增白劑外部應用(Abe，日本專利10025238)、作為葡萄糖轉移酶抑制劑的牙科應用(Abe，日本專利07242555)、作為蛋白質合成抑制劑(Fukai，日本專利07165598)、作為活性氧清除劑用於外部皮膚製劑(Honda，日本專利07017847，Bindra美國專利No.6,1266,950)，以及作為透明質酸酶抑制劑口服用於預防炎症、花粉熱和咳嗽(Ogura，日本專利07010768)。
迄今為止，申請人未發現任何有關混合無取代B環類黃酮和黃烷的組合物用於預防及治療神經退化、神經炎症及累積性認知衰退、障礙和疾病的報導。

發明內容
本發明包括可同時既有效地抑制環氧合酶(COX)又有效地抑制脂氧合酶(LOX)的方法。該同時雙重抑制COX及LOX酶的方法包括向需要的主體給藥包含合成和/或從單一植物或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物的組合物。本文將該組合物稱作LasoperinTM。無取代B環類黃酮與黃烷在組合物中的比例可基於適應症以及特定疾病或病症的預防及治療的特定要求進行調整。通常，組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明一個具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在優選的具體實施方案中無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。該方法的功效用純化酶在不同細胞系、多種動物模型並且最終於人體臨床試驗中得以證實。
具體而言，本發明包括預防及治療COX和LOX介導的涉及神經和認知功能的疾病和病症的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或從一種或多種植物中分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受載體的組合物。該組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例可選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的一個具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在一個優選的具體實施方案中無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
在另一具體實施方案中，本發明包括預防及治療普通的認知衰退、年齡相關的記憶喪失、神經炎症和神經變性疾病的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或從一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受載體的組合物。無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例可選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在優選的具體實施方案中無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
在另一具體實施方案中，本發明包括調節涉及認知衰退和其它與年齡、神經退化及神經炎症相關的病症的mRNA生成的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或從一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受載體的組合物。無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例可選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的一個具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在一個具體實施方案中無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
本發明還包括調節控制涉及認知衰退和其它與年齡、神經退化及神經炎症相關病症的細胞因子mRNA生成的轉錄因子mRNA生成的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或從一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受載體的組合物。無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例可選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的一個具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在優選的具體實施方案中無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
在另一具體實施方案中，本發明包括調節控制涉及認知衰退和其它與年齡、神經退化及神經炎症相關的症狀的cox-2 mRNA而不是cox-1mRNA的mRNA轉錄因子的生成，所述的方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或從一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物以及藥物學可接受載體的組合物。無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例可選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。在優選的具體實施方案中無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物中分離，黃烷從一種或多種金合歡屬植物中分離。
儘管不受理論所限，據信本發明組合物通過減量調節核因子κB(NFκB)轉錄因子抑制促炎細胞因子而起作用，該轉錄因子控制白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNFα)及白介素-6(IL-6)的基因表達。還據信該組合物抑制其它轉錄因子、過氧化物體增殖物激活受體γ(PPARγ)的基因表達，從而有助於控制環氧合酶-2(COX-2)的基因表達。此外，本發明的組合物抑制COX-2和5-脂氧合酶(5-LO)的活性，從而抑制AA轉化成分別都可加劇炎症的前列腺素、血栓素和白三烯。該組合物還具有強的抗氧化能力，可中和活性氧類(ROS)、以及導致更多NFκB表達及由此導致更多細胞因子的促炎基因表達的分子。
此處所述無取代B環類黃酮也指可根據以下的發明應用的無取代B環黃酮和黃酮醇，包括以下結構通式所示的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，碳、氧、氮或硫，單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括但不限於戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子以及碳酸根等。
本發明的無取代B環類黃酮可由合成方法獲得，或從下列各科植物中提取，包括但不限於番荔枝科(Annonaceae)、Asteraceae、紫葳科(Bignoniaceae)、使君子科(Combretaceae)、菊科(Compositae)、大戟科(Euphorbiaceae)、唇形科(Labiatae)、樟科(Lauranceae)、豆科(Leguminosae)、桑科(Moraceae)、松科(Pinaceae)、鳳尾蕨科(Pteridaceae)、中國蕨科(Sinopteridaceae)、榆科(Ulmaceae)和姜科(Zingiberacea)。該無取代B環類黃酮可由下列高等植物屬提取、濃縮和純化，包括但不限於假鷹爪屬(Desmos)、Achyrocline、木蝴蝶屬(Oroxylum)、Buchenavia、香青屬(Anaphalis)、山芫荽屬(Cotula)、鼠麴草屬(Gnaphalium)、蠟菊屬(Helichrysum)、矢車菊屬(Centaurea)、澤蘭屬(Eupatorium)、Baccharis、烏柏屬(Sapium)、黃芩屬(Scutellaria)、Molsa、羽萼木屬(Colebrookea)、水蘇屬(Stachys)、牛至屬(Origanum)、新塔花屬(Ziziphora)、山胡椒屬(Lindera)、黃肉楠屬(Actinodaphne)、金合歡屬(Acacia)、魚藤屬(Derris)、甘草屬(Glycyrrhiza)、雞血藤屬(Millettia)、水黃皮屬(Pongamia)、灰毛豆屬(Tephrosia)、木波羅屬(Artocarpus)、榕屬(Ficus)、粉葉蕨屬(Pityrogramma)、隱囊蕨屬(Notholaena)、松屬(Pinus)、榆屬(Ulmus)和山姜屬(Alpinia)。
可根據以下發明應用的黃烷包括以下的結構通式所示的化合物通常以以下結構代表 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，其中所述取代基的酯包括但不限於沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯以及它們的化學衍生物，所述糖包括但不限於戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子以及碳酸根等。
本發明的黃烷可由選自金合歡屬的一種或多種植物中提取而來。在一個優選的具體實施方案中該植物選自以下組中兒茶(Acacia catechu)、Acacia concinna、金合歡(Acacia farnesiana)、阿拉伯膠樹(AcaciaSenegal)、Acacia speciosa、阿拉伯金合歡(Acacia arabica)、A.caesia、蛇藤(A.pennata)、藤金合歡(A.sinuata)、黑荊樹(A.mearnsii)、A.picnantha、白粉金合歡(A.dealbata)、大葉相思(A.auriculiformis)、A.holoserecia和馬佔相思(A.mangium)。
在一個具體實施方案中，本發明包括預防及治療許多COX和LOX介導的關於神經和認知功能的疾病和病症的方法，該疾病和病症包括但不限於普通的認知衰退、年齡相關的記憶喪失、神經炎症及神經變性疾病以及其它關於神經和認知功能的疾病。在其它具體實施方案中，本發明包括調節涉及認知衰退和其它年齡、神經退化及神經炎症相關症狀的mRNA生成。
本發明的預防和治療方法包括向需要的主體給藥治療有效量的從單一或多種來源分離的無取代B環類黃酮和黃烷的組合物。根據用於獲得該化合物的方法，所述單一和/或多種無取代B環類黃酮及黃烷的混合物的純度包括但不限於0.01％到100％。在一個優選的具體實施方案中，含有無取代B環類黃酮和黃烷的它們的混合物的劑量通常是選自基於組合物總重量的0.001％到100％範圍中的有效、無毒的量。本領域技術人員採用常規的臨床試驗即可決定用於治療特定疾病的最佳劑量。
本發明包括採用酶促及體內模型對無取代B環類黃酮和黃烷的不同組合物進行評價以優化組合物並獲得期望的生理活性。這些組合物的有效性和安全性通過人類臨床試驗得以證實。因此，本發明還包括含有本發明治療活性物質的治療組合物。本發明的組合物可通過本領域技術人員所知的任何方法給藥。給藥方式包括但不限於腸內(口服)給藥、胃腸道外(靜脈內、皮下和肌內)給藥和局部施用。
應理解為前述總體描述及下述詳細描述都僅是舉例說明和解釋，而並非對所要求保護的本發明的限制。


圖1A-1C所示為如實施例2中所述，在為期13周的放射臂水迷宮(RAWM)試驗中，向分別飼以正常膳食、補充了3、7、或34mg/kg的LasoperinTM的膳食的Fisher 344老年雄性大鼠每日給予LasoperinTM的作用。如實施例1所述，使用從兒茶樹皮及黃芩根分離所得的兩種標準化提取物製備所述LasoperinTM組合物(80∶20)。維持正常膳食的年輕Fisher344雄性大鼠作為正常年齡相關的行為變化的對照。數據顯示為平均總錯誤次數對試驗號(每測試日進行四次試驗)的作圖。圖1A所示為第1和2周預試驗後的結果(基線)。圖1B所示為5周(II期)後的結果以及圖1C為11周(III期)後的結果。
圖2所示為如實施例3所述，在進行場景恐懼條件反射(contextualfear conditioning)(CFC)試驗前向飼以正常膳食或補充了3、7或34mg/kgLasoperinTM的Fisher 344老年雄性大鼠每日給予LasoperinTM持續12周的作用。如實施例1所述，使用從兒茶樹皮及黃芩根分離所得的兩種標準化提取物製備所述LasoperinTM組合物(80∶20)。維持正常膳食的年輕Fisher 344雄性大鼠作為正常年齡相關的行為變化的對照。數據顯示為平均發呆(freezing)百分比對劑量組作圖。
圖3所示為如實施例4所示的LasoperinTM對複雜選擇反應時間的作用。每日向參與為期4周的臨床試驗的40名個體給藥LasoperinTM。結果與在相同時間內給予安慰劑的46個體組結果相當。如實施例1所述，使用從兒茶樹皮及黃芩根分離所得的兩種標準化提取物製備所述LasoperinTM組合物(80∶20)。數據顯示為相對基線的變化百分比。該圖顯示LasoperinTM(300mg/d)增加了對象面對複雜選擇及信息時的處理速度。
圖4所示為如實施例5所述的LasoperinTM對反應時間標準偏差(RTSD)的作用。每日向參與為期4周的臨床試驗的40名個體給藥LasoperinTM。結果與在相同時間內給予安慰劑的46個體組結果相當。如實施例1所述，使用從兒茶樹皮及黃芩根分離所得的兩種標準化提取物製備所述LasoperinTM組合物(80∶20)。數據顯示為相對基線的變化百分比。該圖顯示LasoperinTM(300mg/d)增加了試驗內(intra-trial)反應時間標準偏差，即得以改善的在苛刻的認知任務期間保持集中及注意力的能力。
圖5所示為LasoperinTM對COX-1和COX-2的抑制。如實施例1所述，使用從兒茶樹皮及黃芩根分離所得兩種標準化提取物製備所述LasoperinTM組合物(50∶50)。測定LasoperinTM對重組綿羊COX-1(◆)和綿羊COX-2(■)的過氧化物酶活性的抑制作用。數據顯示為百分抑制率對抑制劑濃度(μg/mL)作圖。COX-1的IC50為0.38μg/mL/酶單位而COX-2的IC50為0.84μg/mL/酶單位。
圖6所示為源自兒茶的純化的黃烷兒茶素對5-LO的抑制曲線。測定該化合物對重組馬鈴薯5-脂氧合酶活性(◆)的抑制作用。數據顯示為相對沒有抑制劑試驗的抑制百分比對抑制濃度(μg/mL)的作圖。對5-LO的IC50為1.38μg/mL/酶單位。
圖7所示為如實施例8中所示，將由ELISA測定的於未誘導的細胞中以3μg/mL LasoperinTM處理後殘留在HT-29細胞中的LTB4水平同以3μg/mL布洛芬的處理結果的對比。如實施例1所述使用從兒茶樹皮及黃芩根分離所得的兩種標準化提取物製備所述LasoperinTM組合物(80∶20)。
圖8所示為無取代B環類黃酮與黃烷混合物(80∶20)對暴露於脂多糖(LPS)以及不同濃度的無取代B環類黃酮及黃烷混合物1小時後周圍血單細胞(PBMC)中脂多糖誘導的TNFα水平的作用。用pg/mL表示TNFα的水平。
圖9所示為無取代B環類黃酮與黃烷混合物(80∶20)對暴露於脂多糖(LPS)以及不同濃度的無取代B環類黃酮及黃烷混合物4小時後周圍血單細胞(PBMC)中脂多糖誘導的IL-1β水平的作用。用pg/mL表示IL-1β的水平。
圖10所示為無取代B環類黃酮與黃烷混合物(80∶20)對暴露於脂多糖(LPS)以及不同濃度的無取代B環類黃酮及黃烷混合物4小時後周圍血單細胞(PBMC)中脂多糖誘導的IL-6水平的作用。用pg/mL表示IL-6的水平。圖中顯示了各數據的標準偏差。
圖11所示為不同濃度的LasoperinTM對cox-1和cox-2基因表達的作用的對比。將表達水平標準化至18S rRNA表達水平(內參照)，然後歸一化至未處理、無LPS的條件。該圖證實，在LPS刺激並暴露於LasoperinTM後，cox-2而非cox-1基因表達下降。
圖12所示為3μg/mL LasoperinTM對cox-1和cox-2基因表達的作用與同等濃度的其他NSAID作用的對比。表達水平標準化至18S rRNA的表達水平(內參照)，然後歸一化至未處理、無LPS的條件。
圖13A及13B所示為各種濃度的LasoperinTM對tnfα-1(圖13A)和i1-1β(圖13B)基因表達的作用。將表達水平標準化至18S rRNA的表達水平(內參照)，然後歸一化至未處理、無LPS的條件。這些圖證實，在LPS刺激並暴露於LasoperinTM後，tnfα-1和i1-1β基因表達下降。
圖14所示為如實施例11所述，LasoperinTM對源自暴露4小時後3名對象的脂多糖(LPS)誘導的周圍血單細胞(PBMC)中cox-1、cox-2、i1-1β、tnfα、i1-6、nfκb和pparγ的作用。
圖15所示為受nfκb及pparγ基因表達減少的減量調節影響的tnfα、i1-1β、i1-6和cox-2的啟動子。
圖16所示為在實施例14所述條件下進行的無取代B環類黃酮及黃烷混合物的高效液相色譜分析(HPLC)的色譜圖。使用所述條件，無取代B環類黃酮在11至14分鐘之間洗脫，黃烷在3至5分鐘之間洗脫。
圖17所示為在實施例14所述條件下進行的無取代B環類黃酮及黃烷混合物的HPLC色譜圖。使用所述條件，兩種黃烷(兒茶素和表兒茶素)在4.5至5.5分鐘之間洗脫，無取代B環類黃酮(貝加因(bacalein)和bacalin)在12至13.5分鐘之間洗脫。在實施例15所述條件下，該分離是基於無取代B環類黃酮與黃烷的摩爾吸附能力(absorbtivity)的差異。
具體實施例方式
本發明包括可同時既有效地抑制環氧合酶(COX)又有效地抑制脂氧合酶(LOX)的方法，其用於預防及治療與神經和認知功能相關的疾病和病症。該同時雙重抑制COX及LOX酶的方法包括向需要的主體給藥包含合成和/或從單一植物或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷的混合物的組合物。本文將該組合物稱作LasoperinTM。無取代B環類黃酮與黃烷在組合物中的比例可基於適應症以及預防和治療特定疾病或病症的特定要求進行調整。
此處所使用的各種術語涉及本發明的多個方面。提供以下定義以幫助闡明對本發明成分的說明。
除非已明確定義否則此處所用的全部技術及科學的術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常理解的意義。
應注意此處所用術語「一個」(「a」或「an」)實體是指一個或多個該實體；例如一種類黃酮指一種或多種類黃酮。同樣地，術語「一個」、「一個或多個」和「至少一個」在此處可互相替換。
此處所用的「無取代B環類黃酮」為一類特殊的類黃酮，如下列結構通式所示，其芳香B環無取代基 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-，碳、氧、氮或硫，單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括但不限於戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子以及碳酸根等。
「黃烷」為一類特殊的類黃酮，其通常可由下列結構通式代表 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，其中所述取代基包括但不限於沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯、以及它們的化學衍生物，所述糖包括但不限於戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根等。
本文所用「治療的」包括治療和/或預防。當使用時，治療是針對人類以及其他動物。
「藥物學或治療有效的劑量或量」指足以引發所需生物學結果的劑量水平。該結果可以是病徵、症狀或疾病的起因的緩解或任何其他所需的生物學系統的改變。精確劑量根據各種因素而不同，包括但不限於對象的年齡及體積大小、疾病及所實施的治療。
「安慰劑」指由非活性物質對足以引發所需的可緩解病徵、症狀或疾病的起因的生物學結果的藥物學或治療有效的劑量或量的替代。
「主體」或「患者」或「對象」為需要治療的為活著的哺乳動物、人或動物。該「主體」或「患者」或「對象」通常是指根據本發明方法實施的治療的接受者。
此處所用的「藥物學可接受的載體」是指任何不幹擾活性成分生物活性的有效性並對其所給藥的主體無毒的載體。「藥物學可接受的載體」的實例包括但不限於任何標準藥物載體如鹽溶液即林格溶液、緩衝鹽溶液、水、葡萄糖溶液、血清白蛋白，以及其它用於片劑和膠囊劑型的賦形劑和防腐劑。
「基因表達」是指基因轉錄至mRNA。
「蛋白表達」是指將mRNA翻譯成蛋白質。
此處所用的「RT-qPCR」是指將mRNA分子逆轉錄(RT)為cDNA分子，之後使用聚合酶鏈式反應(PCR)外加螢光報導基團(fluorescentreporter)對基因表達的水平加以定量評價的方法。
注意貫穿本申請出現各種引用。各個引用分別具體地全部併入本文作為參考。
本發明包括可同時既有效地抑制COX又有效地抑制LOX酶以用於預防及治療關於神經和認知功能的疾病和病症的方法。該同時雙重抑制COX和LOX酶的方法包括向需要的主體給藥包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物的組合物。此處稱作LasoperinTM的該組合物也以商品名UnivestinTM供銷，如於2003年4月30日提交，序列號為10/427,746，名為「Formulation With Dual Cox-2 and5-Lipoxygenase Inhibitory Activity」的美國專利申請所記載，此處併入其全文以作參考。無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。
於2002年3月1日遞交的名為「Identification of Free-B-ringFlavonoids as Potent COX-2 Inhibitors」的第10/091,362號美國專利申請記載了無取代B環類黃酮自黃芩屬植物中的分離和鑑別，此處全文併入作為參考。於2002年3月22日遞交，申請序列號為10/104,477的名為「Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor form Acacia」的美國專利申請記載了黃烷自金合歡屬植物中的分離和鑑別，此處全文併入作為參考。
本發明包括有效預防及治療與年齡、認知、神經退化及神經炎症相關的疾病和病症的方法。該預防及治療這些認知及神經疾病和病症的方法包括向需要的主體給藥包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物的組合物。組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。
本發明還包括預防及治療促炎細胞因子介導的神經及認知疾病和病症的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物以及藥物學可接受的載體的組合物。組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。
本發明還包括減少在與年齡、認知、神經退化及神經炎症相關疾病和症狀中的兩種重要成分TNFα及IL-1β的方法。該減少TNFα及IL-1β的方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物以及藥物學可接受的載體的組合物。組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的優選的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。
本發明還包括通過減少ROS預防及治療由ROS介導的疾病和病症的方法。ROS是氧化應激和脂質代謝的關鍵性產物並且在與年齡、認知、神經退化及神經炎症相關疾病和病症中顯著增加。該治療ROS介導的疾病及病症的方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物以及藥物學可接受的載體的組合物。組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99.9∶0.1無取代B環類黃酮比黃烷到0.1∶99.9無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。
最後，本發明還包括調節涉及認知衰退和其它與年齡、神經退化及神經炎症相關的症狀的mRNA生成的方法，包括調節控制細胞因子mRNA生成的轉錄因子的mRNA生成的方法以及調節是控制cox-2而不是cox-1 mRNA生成的轉錄因子的mRNA生成的方法。調節涉及認知衰退和其它與年齡、神經退化及神經炎症相關的症狀的mRNA生成的方法包括向需要的主體給藥有效量的包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物以及藥物學可接受的載體的組合物。組合物中的無取代B環類黃酮與黃烷的比例範圍可為99∶1無取代B環類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環類黃酮比黃烷。在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮與黃烷的比例選自以下組中約90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80和10∶90。在本發明的具體實施方案中，組合物中無取代B環類黃酮與黃烷的比例為約80∶20。
可以根據本發明方法應用的無取代B環類黃酮包括上述結構通式所示的化合物。本發明的無取代B環類黃酮可由合成方法獲得，或從下列各科植物中提取，包括但不限於番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科(Compositae)、大戟科、唇形科、樟科(Lauranceae)、豆科、桑科、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。該無取代B環類黃酮可由高等植物屬提取，包括但不限於假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
無取代B環類黃酮存在於植物的不同部位中，包括但不限於莖、莖皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。於2002年3月1日遞交的名為「Identification ofFree-B-ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors」的第10/091,362號美國專利申請以及於2002年4月30日遞交的名為「Formulation With DualCox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity」的第10/427,746號美國專利申請公開了分離和純化無取代B環類黃酮的方法，這兩篇文獻的全文都被併入作為參考。
根據本發明方法可以應用的黃烷包括上述結構通式所示的化合物。本發明的黃烷可由合成方法獲得，或可從選自以下組中的植物中提取，這些植物包括但不限於兒茶、A.concinna、金合歡、阿拉伯膠樹、A.speciosa、阿拉伯金合歡、A.caesia、蛇藤、藤金合歡、黑荊樹、A.picnantha、白粉金合歡、大葉相思、A.holoserecia、馬佔相思、Uncaria gambir、Uncariatomentosa、Uncaria africana和Uncaria qabir。
黃烷存在於植物的不同部位中，包括但不限於莖、莖皮、幹、主幹樹皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。於2002年3月22日遞交的名為「Isolation of a DualCOX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor form Acacia」的第10/104,477號美國專利申請公開了分離和純化黃烷的方法，此處全文併入作為參考。
在本發明的具體實施方案中，無取代B環類黃酮從一種或多種黃芩屬植物分離而黃烷從一種或多種金合歡屬植物分離。
本發明採用將若干體內認知任務及體外生化、細胞和基因表達篩選結合的策略以鑑定活性植物提取物，該活性植物提取物特異性地抑制COX和LOX酶活性、通過減量調節促進促炎細胞因子的mRNA生成關鍵轉錄因子而減少所述的細胞因子和減少ROS生成、維持涉及預防及治療由暴露於活性氧類(ROS)、炎性蛋白和類花生酸類物質而導致的神經退化、神經炎症及累積性認知衰退、障礙、疾病和病症的抗氧化性質。還進一步評價了該提取物對mRNA基因表達的影響。測試無取代B環類黃酮和黃烷作為食物添加成分經口服用時預防年齡相關的認知衰退的能力。
實施例1提出製備LasoperinTM的通用方法，採用分別提取自金合歡屬(Acacia)和黃芩屬(Scutellaria)的兩種標準化提取物以及一種或多種賦形劑。參考表1，該特定批次的LasoperinTM共含86％的活性成分，包括75.7％的無取代B環類黃酮和10.3％的黃烷。可向組合物中任選地添加一種或多種賦形劑。所述賦形劑的添加量可基於每種所需成分的實際活性含量進行調整。
為了評價LasoperinTM對認知功能的作用，採用動物模型進行了兩種特定的行為試驗——放射臂水迷宮(RAWM)和場景恐懼條件反射(CFC)——以評估海馬依賴性工作記憶(hippocampal-denpendent workingmemory)。實施例2描述LasoperinTM對由放射臂水迷宮(RAWM)試驗測定的海馬依賴性認知功能的作用。結果如圖1A-1C所示，圖示為在為期13周的放射臂水迷宮(RAWM)試驗中每日向分別飼以補充了3、7或34mg/kg LasoperinTM膳食的Fisher 344老年雄性大鼠給藥LasoperinTM的作用。將維持正常膳食的年輕Fisher 344雄性大鼠作為正常年齡相關的行為變化的對照。數據顯示為平均總錯誤次數對試驗號(每測試日進行4次試驗)作圖。圖1A說明第1周和2周預試驗後的結果(基線)。圖1B說明5周後(II期)的結果而圖1C說明11周後(III期)的結果。圖1A-C顯示的數據證明LasoperinTM(7和34mg/kg劑量組)可預防年齡相關的記憶損傷。
因為RAWM包含運動功能部分，所以若所給藥的組合物可減輕關節疼痛及不適則可在此任務中感受到改善。因為CFC試驗不要求動物移動，因此實施該試驗作為RAWM試驗的對照，並由此證實兩次任務的認知狀況(在評價CFC結果時採用疼痛休克閾值(nociceptive shock threshold)檢驗組合物的止痛性質)。實施例3說明了LasoperinTM對由條件性恐懼(CFC)試驗測定的海馬依賴性認知功能的作用。如實施例2所述，60隻Fisher 344雄性大鼠用於這項試驗。圖2顯示了結果，說明了於條件性恐懼試驗之前向飼以補充了3、7或34mg/kg LasoperinTM膳食的344老年雄性大鼠每日給藥LasoperinTM12周的作用。將維持正常膳食的年輕Fisher雄性大鼠作為正常年齡相關的行為變化的對照。數據顯示為平均發呆百分比對劑量組作圖。圖2證實LasoperinTM(7和34mg/kg劑量組)改善了年齡相關的損傷。
實施例4及5描述了在隨機、安慰劑對照、雙盲臨床試驗中向40位個體每日給藥LasoperinTM300mg/天持續4周對認知功能的作用。將結果與46位用安慰劑治療的個體作比較。採用一系列評估精神性運動速度、工作記憶速度(執行性決策(executive decision making)快速靈活)和即時記憶(語文(verbal)空間記憶處理)的基於網絡的認知護理(Cognitive Care)試驗測定認知表現。在試驗開始前，要求參與者連續兩天練習這些測試以建立基線表現(baseline performance)。比較基線表現與治療後表現以進行數據分析。
精神性運動速度或自然反應能力是簡單的反應時間試驗，要求人在數字出現於電腦屏幕後儘快地反應按下鍵。
工作記憶速度是同時出示一個單詞和圖像並要求人判定它們的異同。還隨機出示相反的提示要求人作出與正確反應相反的反應，因此對相同的一對的反應應該是不同，反之亦然。該任務要求壓制或「抑制學到的反應」並然後逆轉(「任務改變(task shifting)」)偶然性反應。從一項任務或反應模式切換至另一項的速度通常等同於頭腦靈活性及高級認知處理以及高級決策。
即時記憶類似於經典的Sternberg任務，其中先是需要記住的一列刺激「目標」項(「target」item)，然後是「探測」項(「probe」item)。對象必須判別探測項是否為之前所列目標中的一員。可變化列長(list length)以對個體短期記憶能力進行評價。在這項任務中同時測試了字母及其空間位置。
結果如圖3和圖4所示，圖3所示為LasoperinTM對複雜選擇反應時間的作用，圖4所示為LasoperinTM對反應時間標準偏差(RTSD)的作用。反應時間標準偏差反映試驗內差異。圖3和圖4證明，LasoperinTM增加了對象對所給出的複雜選擇及信息的處理速度。
實施例6描述使用LasoperinTM進行的COX抑制試驗。該用於測量COX的抑制的生化試驗依賴在血紅素及花生四烯酸存在下的蛋白質的過氧化物酶活性。圖5顯示LasoperinTM的劑量反應及IC50結果。COX-1的IC50是0.38μg/mL/酶單位而COX-2的IC50是0.84μg/mL/酶單位。
實施例7描述使用自兒茶分離的黃烷兒茶素抑制LOX的試驗。採用脂氧合酶體外篩選試驗評價對LOX活性的抑制。該試驗的結果如圖6所示。兒茶素抑制5-LO的IC50經測定為1.38μg/mL/酶單位。
實施例8描述所進行的旨在抑制LOX途徑中花生四烯酸分解中的化合物即LTB4的細胞試驗。結果如圖7所示。參考圖7可見LasoperinTM抑制HT-29細胞內新合成LTB4的80％的生成。布洛芬在相同期間僅顯示減少LTB4的量20％。
實施例9描述對LasoperinTM對LPS誘導的周圍血單細胞內的TNFα、IL-1β及IL-6作用的測量。結果如圖8-10所示。參考圖8可見，提取物在2至100μg/mL寬的濃度範圍充分地減少了分泌至細胞培養上清液的TNFα。參考這些圖可見，將10μg/mL濃度的LPS與LasoperinTM分別共溫育1和4小時後顯示最高的TNFα和IL-1β誘導水平。提取物在2至100μg/mL寬的濃度範圍充分地減少了分泌至細胞培養上清液的TNFα和IL-1β(見圖8及圖9)。由於TNFα、IL-1β及IL-6在炎症和年齡相關的疾病中得以增加，因此LasoperinTM可通過減少致敏炎性細胞(primedinflammatory cell)內的這些促炎細胞因子和轉錄因子從而對這些疾病具有顯著的效果。
實施例10描述所進行的測量LasoperinTM相對其它NSAID對cox-2基因的分化抑制的試驗。抑制cox-1和cox-2 mRNA生成的基因表達數據從半定量RT-qPCR試驗中獲得。結果如圖11-13所示。參考圖11可見，LasoperinTM抑制cox-2 mRNA生成而不影響cox-1基因表達。此外，與其它cox-2抑制劑藥物相比時，LasoperinTM還可減少LPS刺激的cox-1和cox-2基因表達的增加。重要的是，塞來昔布和布洛芬都減少cox-2基因表達(圖12)。最後，參考圖13A及13B可見，用LasoperinTM治療導致tnfα-1及i1-1αβ生成均減少。
實施例11描述如實施例11所述進行的測量LasoperinTM對三位暴露4小時後的對象的周圍血單細胞(PBMC)內的LPS誘導的cox-1、cox-2、i1-1β、tnfα、i1-6、nfκb及pparγ水平的作用的試驗。結果如圖14所示。參考圖14可見，LasoperinTM提取物顯著地降低了全部mRNA的基因表達。
實施例12描述LasoperinTM對炎性基因的啟動子元件的減量調節。圖15顯示這些啟動子元件。
實施例13描述通過氧自由基吸收能力(ORAC)試驗測量LasoperinTM作為抗氧化劑的效能的方法。ORAC分析使用螢光素作為螢光探針測量抗氧化劑清除體內所發現的一種最常見的活性氧類過氧化氫自由基的能力。結果如表2所示，說明相對若干周知的基於食物的抗氧化劑的濃縮物而言，LasoperinTM具有的高的ORAC分值。實際上，LasoperinTM的ORAC與抗氧化劑維生素C相當，並因此可有效地降低體內ROS水平。
實施例14及15描述兩種用於測定標準化的提取物中無取代B環類黃酮及黃烷的量的方法。結果如圖16和17所示。
下列實施例僅供以說明目的而並非意圖限制本發明的範圍。
實施例實施例1.以自金合歡屬和黃芩屬分離的提取物製備LasoperinTM採用兩種各自源自金合歡屬和黃芩屬的標準化提取物同一種或多種賦形劑共同製備LasoperinTM。所用的金合歡屬提取物含有＞60％的總黃烷，為兒茶素和表兒茶素，黃芩屬提取物含有＞70％的無取代B環類黃酮，其主要為黃芩苷。黃芩屬提取物包含如表1所示的其他少量無取代B環類黃酮。向組合物中加入了一種或多種賦形劑。黃烷和無取代B環類黃酮的比例可以基於有關對COX-2相對5-LO抑制的特定需要以及產品的效力的需要而加以調節。賦形劑的量可以根據每種成分的實際活性含量加以調節。用於產品的各單獨批次的混合表必須基於產品規格和質量控制(QC)結果。為達到產品規格，推薦2-5％附加量的活性成分。
表1描述所生成的一個批次的LasoperinTM的混合表(Lot#G1702-COX-2)。簡而言之，將無取代B環類黃酮含量為82.2％(黃芩苷)的黃芩根提取物(38.5kg)(lot#RM052302-01)、總黃烷含量為80.4％的兒茶樹皮提取物(6.9kg)(lot#RM052902-01)以及賦形劑Candex(5.0kg)加以混合得到混合比例為85∶15的LasoperinTM組合物(50.4kg)。表1提供該特定批次LasoperinTM的活性無取代B環類黃酮和黃烷的定量(Lot#G1702-COX-2)，其測定方法如於2003年4月30日提交的名為「Formulation With Dual Cox-2 And 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity.」的第10/427,746號美國專利申請所述，此處併入其全文以作參考。
表1.LasoperinTM組合物的無取代B環類黃酮和黃烷含量

參見表1可知，該特定批次的LasoperinTM含有86％總活性成分，包括75.7％無取代B環類黃酮和10.3％黃烷。採用該批次LasoperinTM(50.0kg)生產兩種不同劑量水平的膠囊形式最終產品每劑125mg(60膠囊)和每劑250mg(60膠囊)。採用相同方法製備混合比例分別為50∶50和20∶80的另外兩個批次的LasoperinTM。
實施例2.LasoperinTM對海馬依賴性認知功能(RAWM)的作用如實施例1(還可參見其全文於此處併入作為參考的於2003年4月30日提出的名為「Formulation With Dual Cox-2 And 5-LipoxygenaseInhibitory Activity」的第10/427,746號美國專利申請的實施例14)所述，通過以80∶20的混合比例混合自黃芩根部分離的標準化的無取代B環類黃酮提取物及自兒茶樹皮分離的標準化的黃烷提取物來製備LasoperinTM組合物(80∶20)。為了研究LasoperinTM對海馬依賴性認知功能的作用，使用放射臂測試迷宮(RAWM)評價60隻Fisher 344雄性大鼠(年齡如下所列)的表現。這項試驗測量在治療過程中學習及記憶的變化。在開始試驗膳食前測定基線，並且在試驗膳食開始後的第5及11周再次進行試驗。無延遲條件(No Delay condition)顯示動物執行任務的能力並作為執行任務的能力(如移動力、視覺、動機等)的差異的對照。在試驗3與4間引入4小時延遲的延遲條件使得該項任務難度更大。在延遲條件下可顯示出與年齡相關的記憶損傷。
動物將雄性Fisher 344大鼠(National Institute on Aging contractcolony；Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)(6月齡，n＝12和17月齡，n＝48)成對籠飼，環境控制為小室溫度21±1℃、12小時光/暗循環以及隨意進食食物和水。向年輕及老年對照動物提供NIH-31(TD00365；Harlan Teklab，Madison，WI)齧齒動物膳食。向受試組供以補充有LasoperinTM(3、7或34mg/kg)的NIH-31齧齒動物膳食。由HarlanTeklab製備對照膳食和試驗組合物，並且以擠出顆粒(extruded pellet)的形式供給動物。為大鼠配以微晶片以確保在所有試驗狀況下可正確鑑別大鼠。由於動物數量較多，將試驗分成各30隻大鼠的兩群，每群中每組有6隻動物。在進食試驗膳食前以RAWM評價以獲得這些動物的基線。一完成初始的RAWM測試就以均衡(counter-bananced)的方式將老年大鼠分配至四組(老年對照、3、7及34mg/kg LasoperinTM)中的一組，這樣每組的RAWM行為不確定(equivocal)。每周監測動物體重及食物攝取情況以確定總體健康狀況(general health)及食物的攝取。未發現各組間這些指數有任何差異。
放射臂水迷宮(RAWM)RAWM由從一個在1.5m儲水槽的圓形選擇區域(直徑60cm)輻射出的12根臂(15cm寬×43cm長)組成。其中一臂末端置有浸入水面下2cm的逃生平臺(10cm×13cm)。在迷宮中預訓練大鼠5天。預訓練包括通過先阻止動物進入非目標臂而使動物找到目標臂、然後逐漸增加可進入臂的數目直至12臂都打開。然後對動物進行兩個模塊(block)的訓練，每個模塊訓練5天。整個訓練過程需要3周。從11根可利用臂中以偽隨機方式確定每次試驗開始的臂。特定臂每天只使用一次，因此每天有四根不同的開始臂。為了避免大鼠對某區域及位置的優先選擇，在特定日中一組內的各動物的開始臂和目標臂不同，而組間相同。每日實施4次(每次最多180秒(s))試驗，每次試驗間隔30s。若大鼠在180s內未能找到逃生平臺，應溫和地將其導向正確臂。記錄進入含有逃生平臺的臂前所進入臂的次數(錯誤次數(Error))。第六天至第十天在試驗3和4間引入3小時的延遲。延遲期間，將大鼠放回它們的籠子。結果如圖1A-C所示。數據顯示為每次試驗平均值對試驗號作圖。
參考圖1A-C可見，隨試驗的進行，所有階段中的總錯誤次數都減少，表明大鼠可學會該項任務。在無延遲任務中，完成任務的表現無年齡或藥物相關的差異。在延遲任務中，三個延遲階段中(基線、II期、III期；分別參考圖1A、B及C)都存在顯著的年齡影響。試驗4中的老年大鼠的成績比年輕對照顯著地差。在基線(圖1A)和II期(圖1B)延遲測試中藥物沒有作用。然而，藥物在III期延遲測試(圖1C)中有顯著的作用。7及34mg/kg組的錯誤次數比老年對照的更少。它們與年輕對照相比無顯著性差異，表明LasoperinTM可預防年齡相關的記憶損傷。分析方法為重複測量的雙因素ANOVA。
實施例3.LasoperinTM對海馬依賴性認知功能(CFC)的作用如實施例2所述在該項試驗中使用60隻Fisher 344雄性大鼠。
場景恐懼條件反射(CFC)。完成RAWM測試一周後，將大鼠置於箱子(30.5cm×24.1cm×21cm，Med Associates，St.Albans，VT)中，該箱子具有連接恆流電擊設備(constant current shocker)(Med Associates)的格柵底面(直徑為4.8mm的條棒，間距1.6cm)。將各大鼠放入箱子前先用起初始場景特定增味劑作用的3％醋酸清潔該箱子。給予兩次連續的訓練模塊(training blocks)。每個訓練模塊長180s，且具有30s、85-dB白噪音(white noise)條件刺激(conditioned stimulus，CS)以及2s、0.5mA的足底刺激(US)。在訓練模塊末CS和US一同結束。全部大鼠對足底刺激的反應是跳躍。在第二次訓練模塊後使大鼠留在訓練箱內30s。訓練後兩天，首先將動物置於使用3％醋酸作為增味劑的同一裝置內測試記憶保持，之前已經在該箱子內進行了5分鐘(min)無CS或US的訓練。2至3小時後，將大鼠置於除格柵底用黑麗光板(black Formica)覆蓋及籠子用3％氫氧化銨清潔(新場景)外的相同小室6分鐘，期間最後3分鐘給予CS。由對治療大鼠不知情的試驗人員每10s手動定量大鼠的發呆。試驗人員每隔10s評價大鼠是否發呆。發呆百分比計算如下期間大鼠被評價為發呆的間隔次數/總間隔數×100。結果如圖2所示。
訓練場景中的發呆這項試驗中，老年對照相對年輕對照的發呆存在統計學顯著性減少(參見圖2)。7及34mg/kg劑量的LasoperinTM改善了此年齡相關的損傷。3mg/kg的劑量不存在改善此年齡相關的損傷的統計學顯著性趨勢。經LasoperinTM治療的大鼠與年輕對照大鼠相比無統計學顯著性差異。
對噪音條件刺激(CS)的發呆測定了非海馬依賴性記憶。對於該測試而言，任何組間的發呆都不存在統計學顯著性的差異(數據未顯示)。
對新場景的發呆是測定基線發呆的對照測量。為了實現該測量，將在訓練場景及CS中的發呆數量與基線發呆相比以確定學習行為是否發生。任意組間的發呆都不存在統計學顯著性差異(數據未顯示)。
傷害性感受閾。該裝置包括一30.5×25.4×30.5cm的測試室(CoulbournInstruments，Allenstown，PA)。測試室的頂部和兩邊是用鋁製成。其它兩邊用透明塑料製備。箱內供予微暗照明(xx lux)。底面由不鏽鋼條棒(半徑5mm，條棒間距1.68cm)組成。由精密調節的電擊設備(PrecisionRegulated Shocker)(Model H12-16，Coulbourn Instruments)輸出電擊。大鼠被放置於底面是金屬格柵(格柵尺寸)的籠子內。將鏡子放在測試室中與試驗人員相對的一面以便於觀察。試驗開始前全部大鼠都給予2分鐘的適應期。用鋼絲絨及水清潔格柵底面後將每隻大鼠置於室內兩分鐘，隨後開始系列電擊。每次電擊脈衝持續0.5s以及以約10s的間隔輸送電擊。可利用0.05至4.0mA、以對數分20階排列的電擊強度。測定閾值時未使用全範圍。從初步觀察估計其中可發現閾值的強度範圍。將這些範圍的中點作為試驗的開始強度。將畏縮定義為舉起一隻爪子，而跳躍定義為快速移動3隻或更多爪子，兩種反應都要求離開底面。採用改良的用於小樣品的「上下法」(up-and-down method)來確定各電擊系列中電擊強度的級別。
此方法的步驟如下1)第一系列開始於與觀察中的處理的畏縮或跳躍閾值儘可能接近的電擊強度；2)進行一系列試驗，對有反應(畏縮或跳躍)的逐漸減少(0.1log10單位)電擊強度，而對無反應的逐漸增加(0.1log10單位)電擊強度。每系列試驗持續進行直至發生行為變化並終止於其後四次試驗。由公式EI50＝Xf+kd計算估計的中間有效強度(EI50)(median effective intensity)，其中Xf＝最後給予的強度，k為Dixon參考文獻表1中的值(Dixon(1965)J.Am.Stat.Assoc.6047-55)，以及d為電擊強度間隔的對數。進行兩系列電擊以估算畏縮閾值，隨後進行兩系列電擊估算跳躍閾值。這項測試為場景恐懼條件反射行為實例中給定電擊強度的對照，並無與其相關的獨立結果。
實施例4.LasoperinTM對處理速度的作用為了評價LasoperinTM對認知功能的作用，對35-65歲的認知正常的個體進行為期4周的系列測試。個體接受如實施例1所述製備的LasoperinTM組合物(80∶20)300mg/天。採用一系列基於網絡的認知護理測試評價精神性運動速度、工作記憶速度(執行性決策快速靈活)和即時記憶(語文空間記憶處理)而測定認知表現。試驗開始前，要求參與者連續兩天練習這些測試以建立基線表現。通過比較基線表現和治療後的表現進行數據分析。每周對接受治療的個體進行檢測以確定膳食補充治療是否導致認知功能變化。比較接受治療的個體和那些在相同的時期內給予安慰劑的個體的基線表現進行數據分析。分析中僅包括在基線及全部給藥周完成測試的個體的數據。清除得分超過測試平均值2倍標準偏差的異常值及未與其它測試值保持內部一致的異常值以排除可能是由可使測試期無效的注意力分散或網絡/計算機「假信號」(glitch)引起的異常結果。用重複測量方差分析(ANOVA)分析測試日間的數據，並用適當的事後檢驗(post hoc tests)比較基線和最後周的測試。
精神性運動速度或自然反應是簡單的反應時間測試，其要求對象在數字出現於電腦屏幕後儘快反應按下鍵。全部年齡的對象在這項精神性運動任務中的總體表現非常穩定並且組間平均值、中值或標準偏差未顯示出任何顯著性差異(p＞0.05)。因此，精神性運動速度未表明治療及對照組間有任何差異。然而，測試期間所有組的表現都得到了改善。
工作記憶速度，複雜選擇反應時間任務，為同時出示單詞和圖片並要求人判定它們是否相同。還隨機出示相反的提示要求人作出與正確反應相反的反應，因此對同一對的反應應該是不同，反之亦然。該任務要求壓制或「抑制學到的反應」然後逆轉(「任務改變(task shifting)」)偶然性反應。從一項任務或反應模式切換至另一項的速度通常等同於頭腦靈活性及高級(higher-order)認知處理以及高級決策。該項測試的認知方面可評價執行性認知功能，包括處理速度、注意力維持、認知通性(cognitive fluidity)及在複雜及苛刻的認知任務中正確作出快速決定的能力。
即時記憶類似於經典的Sternberg任務，其中先是需要記住的一列刺激「目標」項，然後是「探測」項。對象必須判別探測項是否為之前所列目標中的一員。可改變列長以對個體短期記憶能力進行評價。在這項任務中同時測試了字母及空間位置。
結果如圖3所示，表明LasoperinTM在未減少選擇準確性情況下可增加認知處理(作決定)速率，從而改善了對認知上苛刻或複雜的選擇情形的反應速率。
實施例5.由反應時間標準偏差測量的LasoperinTM對集中和注意力的作用為了評價LasoperinTM對認知功能的作用，如實施例4所述，對35-65歲的認知正常的個體進行為期4周的系列試驗。反應時間標準偏差(RTSD)通常用於測量注意力，並且在認知科學中，通常被認為可反映處理效率及神經噪音(neural noise)(Jensen)。參考圖4可見，在4周測試期間RTSD得以顯著改善。即，服用LasoperinTM的對象第四周的相對基線的標準偏差下降。給藥安慰劑的對象也顯示出改善但達不到相同的程度。這表明該效果應歸因子與經LasoperinTM治療改善的任務表現一致的改善，而不是簡單的經學習而得到更好的試驗表現。這些結果表明LasoperinTM可增強注意力的維持、改善對認知上苛刻或複雜的選擇情形作出反應的一致性。
實施例6.LasoperinTM對COX-1和COX-2的抑制使用下列方法測定LasoperinTM的IC50。在測定中引入可切割的過氧化物發色團以在花生四烯酸作為輔因子存在下可視化各酶的過氧化物酶活性。通常，該測定於96孔規格進行。將取自100％DMSO中10mg/mL儲備液的各抑制劑一式三份在室溫下採用下列濃度範圍進行測定0、0.1、1、5、10、20、50、100和500μg/mL。向每孔中加入pH 7.5的100mMTris-HCl 150μL和22μM在三羧甲基氨基甲烷緩衝液中稀釋的正鐵血紅素10μL、在DMSO中稀釋的抑制劑10μL和25單位的COX-1或COX-2酶。在轉臺上將各成分混合10秒，之後加入20μL 2mM的N，N，N』N』-四甲基對亞苯基二胺二鹽酸鹽(TMPD)和20μL的1.1mM花生四烯酸以引發反應。振搖板10秒，之後，在於570nm處讀取吸收值前溫育5分鐘。將抑制劑濃度對百分抑制率作圖並通過沿等溫線取最大值中點並與濃度在x軸相交確定IC50。之後將IC50標準化至測定中酶單位的數目。圖5提供了LasoperinTM的劑量反應及IC50結果。
實施例7.從兒茶分離的兒茶素對5-脂氧合酶(5-LO)的抑制與炎症反應相關的最重要的途徑之一是由非血基質、含鐵的脂氧合酶(5-LO、12-LO和15-LO)產生，該酶催化分子氧加至脂肪酸如AA上以生成氫過氧化物5-、12-和15-HPETE，其然後轉化為白三烯。初步的跡象顯示自兒茶的黃烷提取物能提供一定程度的5-LO抑制，從而阻止5-HPETE的生成。採用脂氧合酶抑制劑篩選測定試劑盒(CaymanChemical，Inc.，Cat#760700)以評價自兒茶分離的純化黃烷是否直接在體外抑制5-LO。在通過微孔過濾完成由磷酸到基於三羧甲基氨基甲烷的緩衝液的緩衝液更換後，用馬鈴薯5-LO代替源自大豆的通常用於試劑盒中的15-LO。該測定通過氧敏產色(oxygen sensing chromagen)檢測氫過氧化物的生成。簡而言之，加入0.17單位/μL的馬鈴薯5-LO 90μL、1.1mM的AA 20μL、氧敏產色劑100μL以及1μL純化的黃烷抑制劑至最終濃度在0到500μg/mL範圍，以此一式三份進行測定。結果如圖6所示。兒茶素抑制5-LO的IC50經測定為1.38μg/mL/酶單位。
實施例8.以LasoperinTM治療後LTB4水平的測定如實施例所述製備LasoperinTM組合物，使用混合比例80∶20的源自黃芩根的標準化無取代B環類黃酮提取物和源自兒茶樹皮的標準化黃烷提取物的組合製備LasoperinTM(80∶20)組合物。將LasoperinTM及布洛芬，另一周知的5-LO抑制劑3μg/mL加入HT-29細胞、表達COX-1、COX-2和5-LO的單核細胞細胞系中，並在潮溼環境中，37℃且5％CO2條件下溫育48小時。所有經處理的細胞系都通過離心收集並通過生理緩衝液中的溫和少量均質溶胞作用使之破裂。用於LTB4(LTB4；Neogen，Inc.，Cat#406110)的競爭性ELISA被用以評價LasoperinTM組合物對每個細胞系中LTB4的新合成水平的作用，並作為LasoperinTM對5-LO途徑抑制作用的測定。在6孔板中每孔加入160,000到180,000細胞並由此一式二份地進行該測定。結果如圖7所示。如圖7所示，LasoperinTM抑制HT-29細胞內的80％新合成的LTB4的生成。相同時期內布洛芬僅顯示LTB4量的20％的減少。
實施例9.LasoperinTM對周圍血單細胞內LPS誘導的TNFα及IL-1β水平的作用使用Histopaque gradient(Sigma)分離源自人類血捐贈者的周圍血單細胞。然後將細胞在補充1％牛血清白蛋白的RPMI 1640中培養約12小時，隨後在各種濃度LasoperinTM(80∶20)存在下用濃度逐漸增加的脂多糖(LPS)誘導炎症。結果如圖8-10所示。
實施例10.LasoperinTM相對於其他NSAID對cox-2而不是cox-1基因表達的分化抑制為評估LasoperinTM是否在基因組水平起效，用脂多糖(LPS)刺激、用LasoperinTM、塞來昔布、布洛芬或對乙醯氨基酚處理分離的人類、周圍血單細胞(PBMC)，然後收集所產生的總RNA並用半定量RT-qPCR進行評價。具體而言，該測定由在6孔板上加入每孔130,000細胞構成。然後用10ng/mL LPS刺激細胞，並與1、3、10、30和100μg/mL的LasoperinTM以及3μg/mL的塞來昔布、布洛芬和對乙醯氨基酚一同在潮溼環境中5％CO2和37℃條件下溫育18小時。通過離心收集所有處理條件的細胞並用TRIzol試劑(InvitrogenTMLife Technologies，Cat#15596-026)及所推薦的TRIzol試劑方案分離所產生的總RNA。由莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉譯酶(M-MLV RT；Promega Corp.，Cat#M1701)應用隨機六聚物(Promega Corp.，Cat#C1181)逆轉錄總RNA。在ABIPrism7700序列檢測系統上使用預開發的經驗證的按需分析(Assays-on-Demand)產品(AOD，Applied Biosystems，Inc.，Cat#4331182)進行qPCR試驗，並用於18S rRNA內標和基因特異性分析。將基因特異性表達值標準化至其各自的18S rRNA基因表達值(內參照)並隨後將未經LPS和藥物處理的情況標準化至100。處理情況為相對於該零情況。LasoperinTM將cox-2的標準化的基因表達降低了超過100倍，而cox-1的標準化的表達顯示的變化不大。在相同的條件下，標準化的TNFα基因表達下降6倍而標準化的IL-1β基因表達下降超過100倍。當以3μg/mL的LasoperinTM、塞來昔布、布洛芬或對乙醯氨基酚處理PBMC時，僅LasoperinTM沒有增加cox-2的基因表達。該試驗中，還以基於ELISA的測定評價蛋白質水平的改變，以及以酶功能測定評價酶功能的變化。作為這些試驗的結果，證實了在以LasoperinTM治療後的既是基因組的又是蛋白組的偶聯的效果。文獻中引用的其他試驗應用蛋白質特異性方法來推斷而不是直接顯示基因表達。結果如圖11-13所示。
實施例11.LasoperinTM對關鍵的炎性蛋白質mRNA的減量調節使用Histopaque gradient(Sigma)分離源自人血捐贈者(從當地血庫獲得)的周圍血單細胞。然後將細胞在補充1％牛血清白蛋白的RPMI1640中培養約24小時，隨後用LPS(10μg/mL)及濃度增加的LasoperinTM(80∶20)進行處理。具體而言，該測定由在6孔板上加入每孔130,000細胞構成。然後用10μg/mL LPS刺激細胞，並與100μg/mL的LasoperinTM一同在潮溼環境中5％CO2和37℃條件下溫育18小時。通過離心收集所有處理狀況的細胞並用TRIzol試劑(InvitrogenTMLife Technologies，Cat#15596-026)及所推薦的TRIzol試劑方案分離所產生的總RNA。由莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉錄酶(M-MLV RT；Promega Corp.，Cat#M1701)應用隨機六聚物(Promega Corp.，Cat#C1181)逆轉錄總RNA。在ABIPrism7700序列檢測系統上使用預開發的經驗證的按需分析產品(AOD，Applied Biosystems，Inc.，Cat#4331182)進行18S rRNA內標和基因專一性分析的qPCR試驗。將基因特異性表達值標準化至其各自的cyclophylinmRNA基因表達值(內參照)並隨後將未經LPS和藥物處理的情況標準化至100。處理情況為相對於該零情況。結果如圖14所示。
參考圖14可見，LasoperinTM將cox-2的標準化的基因表達平均降低3倍，而cox-1的標準化的表達顯示的變化不大。在相同處理條件下，標準化的tnfα基因表達平均下降3倍，標準化的i1-1β基因表達平均下降45倍，以及標準化的i1-6基因表達平均下降37倍。文獻中引用的其他試驗應用蛋白質特異性方法來推斷而不是直接顯示基因表達，如圖14所示。
實施例12.LasoperinTM對炎性基因的啟動子元件的減量調節炎性基因tnfα、i1-1β、i1-6及cox-2的啟動子區域都包含NFκB結合位點，這可解釋當細胞用LasoperinTM處理時基因表達減量調節的原因。Cox-2啟動子區域還包括PPARγ反應元件(PPRE)，其可與類視黃醇X受體轉錄蛋白相互作用。LasoperinTM減量調節pparγ基因表達，據推測可減少PPARγ蛋白以致其不可相互作用以刺激cox-2基因表達。此外，LasoperinTM還可減量調節nfκb基因表達。因此，該化合物命中影響cox-2基因表達以及據推測影響COX-2生成的兩種轉錄因子。圖15顯示這些啟動子元件。
實施例13.LasoperinTM的氧自由基吸收能力(ORAC)的測量應用如Cao等(1994)Free Radic.Biol.Med.16135-137以及Prior和Cao(1999)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.220225-261所述的試驗方法檢測LasoperinTM相對若干知名的基於食物的抗氧化劑的氧自由基吸收能力(ORAC)。ORAC檢測法使用螢光素作為螢光探針測量抗氧化劑清除體內所發現的一種最常見的活性氧類的過氧化物自由基的能力。ORAChydro反映水溶性的抗氧化劑能力而ORAClipo是脂溶性的抗氧化劑能力。將Trolox，一種水溶性維生素E類似物用作校準用基準，並將結果表達為每克微摩爾Trolox當量(TE)。LasoperinTM的ORAChydro為5,517μmol TE/g及ORAClipo為87μmol TE/g，ORACtotal為5,604μmol TE/g。結果如表2所示，說明LasoperinTM具有與維生素C相當的ORAC並因此可降低體內的ROS水平。
表2.LasoperinTM相對常見抗氧化劑的ORAC

實施例14.通過反向高效液相色譜法(HPLC)對無取代B類黃酮及黃烷混合物的定量(方法1)將溶於80％∶20％甲醇∶四氫呋喃的無取代B環類黃酮及黃烷混合物(20μL的1.13mg/mL標準化提取物)進樣至Phenomenex Luna C-18柱(250×4.6mm，5μm粒徑)中，並用1.0mL/min、80％A至20％A線性梯度19分鐘(A＝0.1(v/v)磷酸；B＝乙腈)於35℃洗脫。如圖16所示，在這些條件下為主峰的無取代B環類黃酮(貝加因和bacalin)在11至14分鐘之間洗脫而黃烷(兒茶素和表兒茶素)為3至5分鐘之間洗脫的小峰。通過測量曲線下面積並與已知標準作比較對無取代B環類黃酮及黃烷進行定量。
實施例15.通過反向高效液相色譜法(HPLC)對無取代B類黃酮及黃烷混合物的定量(方法2)將溶於80％∶20％甲醇∶水的無取代B環類黃酮及黃烷混合物(20mL的3.55mg/mL標準化提取物)進樣至Phenomenex Luna C-18柱(250×4.6mm，5μm粒徑)並用80％A(A＝0.1(v/v)磷酸；B＝乙腈)於35℃等度洗脫。如圖17所示，兩種黃烷(兒茶素和表兒茶素)在4.5至5.5分鐘之間洗脫而無取代B環類黃酮(貝加因和bacalin)在12至13.5分鐘之間洗脫。如實施例14所述對黃烷峰進行定量。
權利要求
1.一種用於預防及治療環氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX)介導的涉及神經和認知功能的疾病和病症的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環類黃酮和至少一種黃烷的混合物的組合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中在所述組合物中的無取代B環類黃酮比黃烷的比例選自99∶1無取代B環類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環類黃酮比黃烷的範圍。
3.如權利要求2所述的方法，其中在所述組合物中無取代B環類黃酮比黃烷的比例為約80∶20。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-、碳、氧、氮或硫、單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子和碳酸根。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述黃烷選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，所述取代基的酯獨立地選自以下組中沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯，所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷為通過有機合成或自植物中分離得到。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷分離自選自以下組的植物部分莖、莖皮、幹、主幹樹皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
8.如權利要求6所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物科中番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。
9.如權利要求6所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物屬中假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
10.如權利要求6所述的方法，其中所述黃烷分離自選自以下組的植物物種中兒茶、Acacia concinna、金合歡、阿拉伯膠樹、Acacia speciosa、阿拉伯金合歡、A.caesia、蛇藤、藤金合歡、黑荊樹、A.picnantha、白粉金合歡、大葉相思、A.holoserecia、馬佔相思、Uncaria gambir、Uncariatomentosa、Uncaria africana和Uncaria qabir。
11.如權利要求6所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自黃芩屬植物中的一種或多種植物，所述黃烷分離自金合歡屬植物中的一種或多種植物。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物以0.001到200mg/kg體重的劑量給藥。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述給藥的途徑選自以下組中口服、局部、栓劑、靜脈內、以及真皮內、胃內、肌肉內、腹膜內和靜脈內給藥。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述藥物組合物還包括為藥物學、皮膚病學和美容學適宜的用於局部施用的傳統賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或常規或控釋載體。
15.一種用於預防記憶及認知障礙和神經變性病症的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環類黃酮和至少一種黃烷的混合物的組合物。
16.如權利要求15所述的方法，其中在所述組合物中無取代B環類黃酮比黃烷的比例選自99∶1無取代B環類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環類黃酮比黃烷的範圍。
17.如權利要求16所述的方法，其中在所述組合物中無取代B環類黃酮比黃烷的比例為約80∶20。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-、碳、氧、氮或硫、單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子和碳酸根。
19.如權利要求15所述的方法，其中所述黃烷選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，其中所述取代基的酯獨立地選自以下組中沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯，所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根。
20.如權利要求15所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷為通過有機合成或自植物中分離得到。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷分離自選自以下組的植物部分莖、莖皮、幹、主幹樹皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
22.如權利要求20所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物科中番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。
23.如權利要求20所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物屬中假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
24.如權利要求20所述的方法，其中所述黃烷分離自選自以下組的植物物種中兒茶、Acacia concinna、金合歡、阿拉伯膠樹、Acacia speciosa、阿拉伯金合歡、A.caesia、蛇藤、藤金合歡、黑荊樹、A.picnantha、白粉金合歡、大葉相思、A.holoserecia、馬佔相思、Uncaria gambir、Uncariatomentosa、Uncaria africana和Uncaria qabir。
25.如權利要求20所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自黃芩屬植物中的一種或多種植物，所述黃烷分離自金合歡屬植物中的一種或多種植物。
26.如權利要求15所述的方法，其中所述組合物以0.001到200mg/kg體重的劑量給藥。
27.如權利要求15所述的方法，其中所述給藥的途徑選自以下組中口服、局部、栓劑、靜脈內以及真皮內、胃內、肌肉內、腹膜內和靜脈內給藥。
28.如權利要求15所述的方法，其中所述藥物組合物還包括為藥物學、皮膚病學和美容學適宜的用於局部施用的傳統賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或常規或控釋載體。
29.一種同時抑制促炎細胞因子表達的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環類黃酮和至少一種黃烷的混合物以及一種藥物學可接受的載體的組合物。
30.如權利要求29所述的方法，其中在所述組合物中的無取代B環類黃酮比黃烷的比例選自99∶1無取代B環類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環類黃酮比黃烷的範圍。
31.如權利要求30所述的方法，其中在所述組合物中無取代B環類黃酮比黃烷的比例為約80∶20。
32.如權利要求29所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-、碳、氧、氮或硫、單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子和碳酸根。
33.如權利要求29所述的方法，其中所述黃烷選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，其中所述取代基的酯獨立地選自以下組中沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯；所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根。
34.如權利要求29所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷為通過有機合成或自植物中分離得到。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷分離自選自以下組的植物部分莖、莖皮、幹、主幹樹皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
36.如權利要求34所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物科中番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。
37.如權利要求34所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物屬中假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
38.如權利要求34所述的方法，其中所述黃烷分離自選自以下組的植物物種中兒茶、Acacia concinna、金合歡、阿拉伯膠樹、Acacia speciosa、阿拉伯金合歡、A.caesia、蛇藤、藤金合歡、黑荊樹、A.picnantha、白粉金合歡、大葉相思、A.holoserecia、馬佔相思、Uncaria gambir、Uncariatomentosa、Uncaria africana和Uncaria qabir。
39.如權利要求34所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自黃芩屬植物中的一種或多種植物，所述黃烷分離自金合歡屬植物中的一種或多種植物。
40.如權利要求29所述的方法，其中所述組合物以0.001到200mg/kg體重的劑量給藥。
41.如權利要求29所述的方法，其中所述給藥的途徑選自以下組中口服、局部、栓劑、靜脈內以及真皮內、胃內、肌肉內、腹膜內和靜脈內給藥。
42.如權利要求29所述的方法，其中所述藥物組合物還包括為藥物學、皮膚病學和美容學適宜的用於局部施用的傳統賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或常規或控釋載體。
43.如權利要求29所述的方法，其中所述促炎細胞因子選自以下組中cox-2、il-1β、tnfa、il-6和/或通過它們對選自過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)或核因子κB(NFκB)的轉錄因子的影響而被調節的上述細胞因子。
44.一種用於預防活性氧類(ROS)生成和增強腦部抗氧化防禦，以及預防及治療活性氧類(ROS)介導的智力疾病和病症的方法，所述方法包括向需要的主體給藥有效量的包含至少一種無取代B環類黃酮和至少一種黃烷的混合物的組合物。
45.如權利要求44所述的方法，其中在所述組合物中的無取代B環類黃酮比黃烷的比例選自99∶1無取代B環類黃酮比黃烷到1∶99無取代B環類黃酮比黃烷的範圍。
46.如權利要求45所述的方法，其中所述組合物中無取代B環類黃酮比黃烷的比例為約80∶20。
47.如權利要求44所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、-NR3+X-、碳、氧、氮或硫、單個糖或者多個糖結合的糖苷，該糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子和碳酸根。
48.如權利要求44所述的方法，其中所述黃烷選自具有下列結構的化合物中 其中R1、R2、R3、R4和R5獨立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-、取代基的酯、單個糖或者多個糖結合的碳、氧、氮或硫糖苷、二聚、三聚以及其他多聚黃烷，其中所述取代基的酯獨立地選自以下組中沒食子酸酯、乙酸酯、肉桂醯基和羥基肉桂醯基酯、三羥基苯甲醯酯和咖啡醯酯，所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖以及它們的化學衍生物；其中R是具有1-10個碳原子的烷基；以及X選自藥物學可接受的抗衡陰離子，其包括但不限於羥基、氯離子、碘離子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟離子、碳酸根。
49.如權利要求44所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷為通過有機合成或自植物中分離得到。
50.如權利要求49所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮和所述黃烷分離自選自以下組的植物部分莖、莖皮、幹、主幹樹皮、嫩枝、塊莖、根、根皮、嫩梢、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉及其他氣生部分。
51.如權利要求49所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物科中番荔枝科、Asteraceae、紫葳科、使君子科、菊科、大戟科、唇形科、樟科、豆科、桑科、松科、鳳尾蕨科、中國蕨科、榆科和姜科。
52.如權利要求49所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自選自以下組的植物屬中假鷹爪屬、Achyrocline、木蝴蝶屬、Buchenavia、香青屬、山芫荽屬、鼠麴草屬、蠟菊屬、矢車菊屬、澤蘭屬、Baccharis、烏柏屬、黃芩屬、Molsa、羽萼木屬、水蘇屬、牛至屬、新塔花屬、山胡椒屬、黃肉楠屬、金合歡屬、魚藤屬、甘草屬、雞血藤屬、水黃皮屬、灰毛豆屬、木波羅屬、榕屬、粉葉蕨屬、隱囊蕨屬、松屬、榆屬和山姜屬。
53.如權利要求49所述的方法，其中所述黃烷分離自選自以下組的植物物種中兒茶、Acacia concinna、金合歡、阿拉伯膠樹、Acacia speciosa、阿拉伯金合歡、A.caesia、蛇藤、藤金合歡、黑荊樹、A.picnantha、白粉金合歡、大葉相思、A.holoserecia、馬佔相思、Uncaria gambir、Uncariatomentosa、Uncaria africana和Uncaria qabir。
54.如權利要求49所述的方法，其中所述無取代B環類黃酮分離自黃芩屬植物中的一種或多種植物，所述黃烷分離自金合歡屬植物中的一種或多種植物。
55.如權利要求44所述的方法，其中所述組合物以0.001到200mg/kg體重的劑量給藥。
56.如權利要求44所述的方法，其中所述給藥的途徑選自以下組中口服、局部、栓劑、靜脈內以及真皮內、胃內、肌肉內、腹膜內和靜脈內給藥。
57.如權利要求44所述的方法，其中所述藥物組合物還包括為藥物學、皮膚病學和美容學適宜的用於局部施用的傳統賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或常規或控釋載體。
全文摘要
本發明提供一種用於預防及治療由氧化應激、炎症和衰老過程導致的記憶和認知障礙以及神經退行性疾病的新方法。該方法包括向需要的主體給藥包含合成和/或自一種或多種植物分離的無取代B環類黃酮和黃烷混合物的組合物。本發明還包括同時抑制促炎細胞因子、預防ROS產生以及增強抗氧化防禦的新方法。該組合物的活性有助於根本地保留認知功能及提供一定水平的神經保護作用。
文檔編號A61K31/353GK1845750SQ200480025200
公開日2006年10月11日 申請日期2004年9月1日 優先權日2003年9月2日
發明者賈琦, 布魯斯·伯內特, 趙垣 申請人:尤尼根製藥公司