防止和治療阿爾茨海默病的肽偶聯物組合物和方法

2023-07-19 16:31:01

專利名稱：：防止和治療阿爾茨海默病的肽偶聯物組合物和方法防止和治療阿爾茨海默病的肽偶聯物組合物和方法發明領域本發明涉及防止和治療澱粉樣形成(amyloidogenic)疾病，尤其是阿爾茨海默病的組合物和方法。發明背景阿爾茨海默病(AD)以進行性的記憶受損和認知衰退為特徵。其標誌性的病理損傷為特定腦區域的澱粉樣蛋白沉積(老年斑)、神經原纖維纏結和神經元喪失。該澱粉樣蛋白沉積由40至43個胺基酸殘基的澱粉樣卩肽(A(3)構成，它們為澱粉樣前體蛋白(APP)的蛋白酶解產物。神經原纖維纏結為細胞內高度磷酸化的tau蛋白的絲狀聚集物(Selkoe,Sc認e—275:630-631,1997)。AD的發病機理並沒有完全清楚，但預期是多因素事件。A(3在腦組織中的積累和聚集被認為在疾病過程中起關鍵作用，也稱為澱粉樣蛋白級聯假說(Golde,BrainPathol,15:84-87,1995)。根據該假說，A卩尤其是A卩42傾向於形成多種形式的聚集體，從小的寡聚體至大的伸長的纖維蛋白原結構。這些聚集體為神經毒性的並且引起與該疾病早期階段的記憶喪失和認知衰退有關的突觸病理學(Kleme,Neurobiol.Aging:25:569-580,2004)。最近的出版物指出在多重轉基因小鼠模型中A卩的減少也防止糹田胞內tau沉積(Oddoetal.,Proc.腸謂，43:321-332,2004)。這個發現提示細胞外的澱粉樣蛋白沉積可能引起隨後的神經原纖維纏結形成，而其反過來可導致神經元丟失。用A(3抗原免疫APP轉基因小鼠可減少腦部AP沉積並緩解疾病進展。這首先由Shenk"a/.,Nature,400:173-177,1999報導，現在已為大量的涉及不同轉基因動物模型、多種活性疫苗以及用A(3特異的單克隆抗體進行被動免疫的研究所確證(Bard"a/.,NatureMed—6:916-919,2000;Janusefa/.，Nature.408:979-982,2000;Morgana/"Nature:408:982-985,2000;DeMattose"/"Proc.Natl.Acad.Sci—98:8850-8855,2001;Bacskai"J.Neurosci—22:7873-7878,2002;Wilcock"a/.,JLNeumm.,23:3745-3751,2003)。與這些動物數據一致，三份發表的對生前接受了聚集前A卩(1-42)免疫原(AN1792,Betabloc)主動免疫的患者死後人腦組織的評估顯示了局部老年斑的清除(Nicoll"W.,NatureMed—9:448-452,2003;Ferrer"a/.,BrainPathoL14:11-20,2004;Masliah"a/.,Neurology—64:129-131，2005)。這些數據共同表明有效引起針對A(3抗原的抗體應答的疫苗對AD中發現的病理性老年斑有效。但是，疫苗或抗體有效性的才幾制仍不明確。公眾域內最先進的基於免疫治療的AD計劃曾為採用AN1792(Betabloc)的主動免疫II期疫苗試驗，其中AN1792為由聚集前Ap(l-42)組成的與佐劑QS-21TM(Antigenics,NewYork,NY)共給藥的疫苗。在2002年1月，當有4名患者顯示與腦膜腦炎一致的症狀時，這項研究被沐ih(Senior，LancetNeurol..1:3,2002)。最後，298名經治療的患者有18名出現了腦膜腦炎跡象(Orgogozo"Neurology.61:46-54,2003)。在腦炎和抗體滴度之間沒有相關性，曾有報導稱這種作用的很可能的引發機制為針對自身免疫原，尤其是針對Ap42肽的中間和羧基端部分的T細胞的活化(Monsonego"a/.,J.Clin.Invest"112:415-422,2003)。作為對這種結論的支持，對出現腦炎的兩名疫苗接受者腦組織的死後一全查顯示,在一名患者中有大量的CD4+T細胞的腦膜滲透(Nicoll"a/.,NatureMe^，9:448-452,2003),而在另一名患者中則有大量的CD4+、CD8+、CD3+、CD5+、CD7+T細胞的腦膜滲透(FerrerW"/.,BrainPathol14:11-20,2004)。目前的證據提示在被動或主動免疫後血漿A(3水平的增加反映出外周滲透(penpheralsmk)的啟動可作為後來腦A卩降低的前兆。外周滲透指腦和血漿Ap儲庫平衡的變化，該變化導致中樞AP淨外流至外周(參見，侈寸3口Deaned(J.Ne腦scL25:11495-11503,2005;DeMattosefa/.,Pro.Natl.Acad.Sci.USA—98:8931-8932,2001)。其它的研究提示在抗A(3免疫治療後觀察到血漿Ap的這種升高是實現隨後中樞AP降低所必須的(Cribbs"a/.,7thInternationalConferenceonAD/PD,Sorrento,Italy,2005)。因此，當AP內的兩個胺基酸被置換(例如出現在Dutch和Iowa突變中的那些)時，該肽就不再能穿過中樞到達外周區室(Davis"a/.,Ne翻編Aging,出版中，2005年8月18日可在網絡上獲得)。當表達這種突變體形式的A(3和Swedish突變的小鼠被免疫時，沒有發現血漿A(3的升高並且沒有觀察到隨後腦A(3的降低。與此相反，表達野生型人A(3序列加上Swedish突變的小鼠應答主動免疫，伴有血漿AP的升高和隨後中樞Ap的降低(Cribbs"a/.,7thInternationalConferenceonAD/PD,Sorrento,Italy,2005)。因此，預計能夠產生導致血漿A|3水平升高的免疫應答的任何活性疫苗免疫原可用於治療阿爾茨海默病以及以升高的腦A卩水平為特徵的相關疾病。本發明申請人出人意料地發現去除了T細胞表位以避免自身T細胞應答的抗原具有免疫原性並可升高血漿A卩水平。這代表了產生安全有效的AD疫苗的潛在手段。本發明的申請人提供了這種抗原以及用作AD疫苗的製劑。
發明內容在一個實施方案中，本發明提供了藥物組合物，包含AP的免疫原性片段，所述AP的免疫原性片段缺乏T細胞表位，能以針對A(3的抗體形式誘導免疫應答。在一方面，這種組合物包含AP的線性8胺基酸肽(8-mer)。在另一方面，這種組合物包含散布有至少一個間隔物的多價線性8-mer或多價分枝的多抗原肽(MAP)。所述藥物組合物可用作AD和相關的澱粉樣蛋白病的疫苗。在本發明的另一實施方案中，所述藥物組合物為A卩血漿升高劑，包含A|3的免疫原性片段，所述免疫原性片段缺乏T細胞表位，能以針對升高血漿AP水平的AP的抗體形式誘導免疫應答。該藥物組合物可用作AD和相關的以升高的腦A卩水平為特徵的澱粉樣蛋白病的疫苗。在本發明的另一實施方案中，所述藥物組合物連接至載體分子以形成偶聯物，其中該載體協助引起包括針對AP片段的抗體的免疫應答。在本發明優選的實施方案中，該載體為腦膜炎奈瑟球菌(A^Menflwem"g"k/^)的外膜蛋白複合物(OMPC)。在本發明其它的實施方案中，所述藥物組合物與藥物可接受的佐劑一起給藥。在優選的實施方案中，該佐劑為氧化鋁佐劑(Merck明礬佐劑，MAA)或基於急戒的佐劑(ISCOMATRIX⑧，CSLLtd.,Parkville,Australia)。在另一實施方案中，本發明提供了防止或治療與患者腦中Ap的澱粉樣沉積有關的疾病的方法。這些疾病包括阿爾茨海默病、唐氏症候群、認知受損或其它形式的老年性痴呆。該方法包括給予A卩的免疫原性片段，所述Ap的免疫原性片段缺乏T細胞表位，選自線性8胺基酸肽(8-mer)、散布有至少一個間隔物的多價線性肽和多價分枝的多抗原肽(MAP)。在優選的實施方案中，該免疫原性片段包含具有聚乙二醇(PEG)間隔物的多價線性肽。在更優選的實施方案中，該免疫原性片段包含偶聯至OMPC的多價分枝的MAP,A卩(3-10)/(21-28)偶聯物，構建體No.12,圖6A。這些方法需要向需要這種治療的患者給予有效劑量的缺乏T細胞表位的AP免疫原性片段，這將以針對Ap的抗體形式誘導免疫應答。所述抗體應答能夠升高血漿AP水平。在該實施方案的另一方面，該待給藥的免疫原性片段被連接到載體分子。在該實施方案的另一方面，該免疫原性片段與佐劑一起給藥。附圖筒要說明圖1顯示了衍生自A卩(1-42)(SEQIDNO:l)的合成的8胺基酸肽(8-mer)(SEQIDNO:2-36),從中選4奪肽進4亍線性肽掃描以鑑定Ap的表位。圖2顯示了所選的用於偶聯至KLH(圖2A)和OMPC(圖2B)的8-mcr。圖3顯示了圖2中描述的所選的A卩偶聯物在第一次(PD1)、第二次(PD2)和第三次(PD3)給藥後的免疫原性。圖4顯示了從之前用AP(3-10)-KLH偶聯物(SEQIDNO:40)免疫的豚鼠提取的血清與人AD腦組織的交叉反應性。圖4A顯示抗AP單克隆抗體6F3D(它識別A(3的胺基酸8-17)的免疫反應性。染色模式揭示在該人腦中的廣泛的澱賴4羊蛋白沉積病理學。圖4Bi正實該同一腦與來自經免疫的豚鼠在免疫接種前的免疫前血清之間缺乏免疫反應性。圖4C顯示來自經免疫的豚鼠的血清的免疫反應性。圖5顯示代表性的多價線性8-mer肽，它們是基於豚鼠實驗中(實施例3)各8-mer的免疫原性選出的。這些偶聯物按所述的方法合成並偶聯至OMPC(實施例l.J和l.K)。圖6顯示代表性的多價分枝的MAP偶聯物，它們是基於豚鼠實驗中(實施例3)各8-mer的免疫原性選出的。圖6A顯示代表性的二價MAP,圖6B顯示代表性的溴乙醯基半胱氨酸MAP。這些偶聯物按所述的方法合成並偶聯至OMPC(實施例2)。圖7顯示在用偶聯至OMPC的A(3(l-18)肽注射1(PD1)或2(PD2)次後從恆河侯收集的血清的抗A(340滴度，其中所述A(3(l-18)肽被配製在作為佐劑的單獨的Merck明礬中或Merck明礬力。上IMX(ISCOMATRIX,CSL,Ltd.,Parkville,Australia)中。圖8顯示在給予AP偶聯物後血漿AP水平的升高。圖8A顯示，與給予單體構建體A卩(3-10)(SEQIDNO:69)和A卩(21-28)(SEQIDNO:73)後相比，在給予包含偶聯至OMPC的A卩(3-10)/(21-28)(構建體No.12,圖6A)後超過三倍的升高(口，構建體No.12,圖6A;氣A卩(3-10)(SEQIDNO69),▲,A卩(21-28)(SEQIDNO:73)。圖8B顯示血漿水平與滴度水平無關(口，構建體No.12，圖6A;，A卩(3-10)(SEQIDNO69),▲,A卩(21-28)(SEQIDNO:73)。定義術語"8-mer"指8胺基酸肽，它對應於A卩片段、天然A卩肽的類似物或肽才莫擬物。一個或多個8-mer可以與至少一個間隔物結合以形成多價線性肽或形成多價分枝的MAP。術語"AP偶聯物"指的是，通過化學或生物學方式與載體例如鑰孔血藍蛋白或月莫炎奈瑟:昧菌(A^Mena外月莫蛋白複合物(OMPC)連接的A卩的8-mer或免疫原性片段。術語"A卩肽"指本文描述的任何A卩肽，包括1"旦不限於線性8-mer、具有至少一個間隔物的多價線性肽以及多價分枝的多抗原肽(MAP)。術語"表位"指B和/或T細胞應答的抗原上的位點。B細胞表位可由連續胺基酸或通過蛋白三級摺疊而並置的非連續胺基酸形成。從連續胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑時仍保留，而通過三級摺疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時喪失。T細胞表位由能夠與宿主MHC分子形成複合物的肽組成。用於人I類MHC分子的T細胞表位負責誘導CD8+T細胞應答，通常包含9至11個胺基酸殘基，而用於人II類MHC分子的表位負責CD4+T細胞應答，通常包含12個或更多個氨基酉臾歹戔基(BjorkmanwNalure_329:506-512,1987;Maddene/1Cell75:693-708;BataliaandCollins;EngelhardAmiuRevImmunol—12:181-207-622.1995;Madden,A醒RevImm漏L13:587-622.1995)。與T細胞不同，B細胞能夠識別少至長4個胺基酸的肽。正是T細胞受體識別的T細胞表位/MHC複合物導致T細胞活化。用在本文時，術語"A卩的免疫原性片段"或"缺乏T細胞應答的A(3免疫原性片段"指能夠誘導針對Ap的抗體的形式的免疫應答，但該應答不包括針對自身抗原A卩的T細胞應答的8-mer或A卩片段。術語"免疫學的"或"免疫"或"免疫原性"應答指針對脊推動物中的抗原的體液(抗體介導的)和/或細胞(通過抗原特異性T細胞或它們的分泌產物介導的)應答。這種應答可為通過給予免疫原誘導的主動免疫或通過給予抗體誘導的被動免疫。術語"多價肽"指具有多於1個抗原決定簇的肽。術語"藥物組合物"指適合向哺乳動物個體給藥的化學或生物組合物。用在本文時，它指包含本發明描述的A卩的8-mer、免疫原性片段和A卩偶聯物的組合物，任選地與或不與佐劑一起給藥。發明詳細說明如之前所述，臨床前研究提示，引起抗AP多克隆抗體應答的主動免疫對轉基因小鼠(過表達澱粉樣前體蛋白)中AD相關的病理和認知症狀具有效力(Bard"a/.,NatureMed—6:916-919,2000;Janus"/.,Nature，408:979-982,2000;Morgan"a/.,Nature:408:982-985，2000;DeMattosProc.Natl.Acad.Scl98:8850-8855,2001;Bacskai"/.,J.Neurosci一22:7873-7878,2002;Wilcoc，"a/.,J.Ne脆sci一23:3745-3751,2003)。這些臨床前研究得到一項臨床試驗的支持，其中聚集體形式的AP42被用作主動免疫原。這項研究的初步證據表明，在治療後有病理(Nicoll"a/.,NatureMed.r9:448-452,2003;Ferrer"a/.,BrainPathoL14:11-20,2004;Masliaha/"Neurology:64:129-131,2005)和認知政善(GilmanWa/.:Neurology，64(9):1553-1562,2005)。儘管這些研究結果是鼓舞人心的，並且與臨床前研究一致，但該治療被證明是不安全的，並在大約6%的經治療患者中出現腦膜腦炎後終止(OrgogozoWa/.,Neurology.61:46陽54:2003、—因此，亟需能夠激發有效免疫應答並避免不利安全問題的主動免疫方法。在了(Nicoll,"a/.:NatureMed.:9:448-452,2003;Ferrer"a/.,BrainPathoL14:11-20,2004),暗示存在針對自身肽AP42的T細胞應答。但是，儘管本領域技術人員意識到在保持合適的抗體應答(B細胞介導的)時需要避免針對自身的T細胞應答，但還未知生產具有這種性質的試劑的方法。這個問題由於缺乏預測性的動物模型或其它能對這些活性有效預測的臨床前測定法而變得複雜。為此，本發明的申請人採用了T和B細胞表位的不同性質來設計用於本發明的表位。通過將線性肽大小限制至8胺基酸，並且如果需要，還移除任何潛在的C末端T細胞錨定殘基，來設計疫苗構建體。因而，本方面的一個方面是鑑別有免疫原性但缺乏T細胞表位的A卩片段，以用作AD疫苗。在本申請之前，還不是明確知道AP肽的哪些胺基酸片段會產生免疫原性應答，同時也缺乏T細胞表位。本領域技術人員會意識到本領域中以前的教導沒有預測到例如8-mer會產生免疫原性應答以及沒有將有用的片段與Ap肽的不同區域區分開。參見，例如美國專利No.6,808,712和6,787,144。本發明的其它方面包括鑑別A卩血漿升高劑，它包含A卩的缺乏T細胞表位的免疫原性片段，以針對A(3的抗體的形式誘導免疫應答並提高血漿A卩水平。這類試劑可用作AD疫苗，並用於以升高的腦A卩水平為特徵的相關澱粉樣蛋白病。在申請人的發明之前，尚不清楚或者i兌無法預測A卩的哪些免疫原性片段會導致血漿A卩水平升高。不希望被任何理論所束綽，但據信本文描述的A|3血漿升高劑起以針對AP的抗體形式誘導免疫應答的作用，根據A|3清除的外周滲透理論，所述免疫應答產生升高水平的血漿AP，從而導致隨後腦A卩的降低。另外，儘管各個Ap的8-mer或免疫原性片段可能能夠誘導免疫應答，從而使得血漿A卩水平升高，但申請人發現偶聯至OMPC的多價分枝的MAP,A卩(3-10)/(21-28)(構建體No.12,圖6A),相對於其組成部分的單體構建體A卩(3-10)(SEQIDNO:69)或A卩(21-28)(SEQIDNO:73)來說,在升高血漿A卩水平方面尤其有效。澱賴—羊蛋白病本發明提供了預防和治療以澱粉樣蛋白沉積的積累為特徵的疾病的組合物和方法。澱粉樣蛋白沉積包含聚集成不溶物的肽。該肽的性質在不同的疾病中有變化，但是在大多數情況下，該聚集物具有P片層結構且可用剛果紅染色。以澱粉樣沉積為特徵的疾病包括晚期或早期發作的阿爾茨海默病(AD)。在兩種疾病中，澱粉樣沉積包括稱為澱粉樣蛋白卩(A(3)的肽，它在患病個體的腦中積累。因此，術語"澱粉樣蛋白病"也指以升高的腦AP水平為特徵的疾病。治療劑用在本發明中的治療劑以針對A卩的抗體形式誘導免疫應答。免疫應答的誘導可以是主動的，如當給予免疫原以在個體中誘導與Aj3有反應性的抗體或T細胞時；也可以是一皮動的，如當給予本身結合個體中的A卩的抗體時。用於防止或治療諸如AD的澱粉樣蛋白病的治療劑包括A卩的肽片段，它可為任何天然存在的形式(即Ap39、AP40、A卩42、Ap42或A|343)。這些序列在現有技術中是已知的，例如，參見Hardyetal.,TINS20:155-158,1997。當用在本文時，在優選的實施方案中，治療劑為免疫原性片段，它缺乏T細胞表位，但能以針對A|3的抗體形式誘導免疫應答。A|3的免疫原性片段可以是8-mer、具有至少一個PEG間隔物的多價線性A卩偶聯物或多價分枝的MAPA(3偶聯物的形式。治療劑可以藥物組合物的形式給藥。在另一實施方案中，治療劑為A卩血漿升高劑，其能以針對A卩的抗體形式誘導免疫應答，並且在個體中升高血漿A(3水平。這類試劑可包括天然存在的肽片段或可以包括一個或多個置換、添加或缺失，以及可以包括合成或非天然存在的胺基酸。可在本文實施例描述的測定法中篩選有預防和治療效果的片段和構建體。儘管在優選的實施方案中，所述治療劑包含A卩的肽片段，但是，這些試劑也可以包括不必與AP有顯著胺基酸序列相似性，然而可用作A卩模擬物且誘導類似免疫應答的肽和其它化合物。例如，可篩選適用於本發明的形成P摺疊片層的肽和蛋白。類似地，可篩選適用於本發明的組合庫和其它化合物。於它們用作免疫原。、這類載;包括血;1白蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、免疫球蛋白分子、卵清蛋白、破傷風類毒素蛋白，或來自其它諸如白喉、大腸桿菌、霍亂或幽門螺旋桿菌(//./^/on)等病原菌的類毒素，或減毒的毒素衍生物。在本發明優選的實施方案中，所述載體為膜炎奈瑟球菌外膜蛋白複合物(OMPC)。本發明也關注這類治療劑在藥物組合物中的用途，該藥物組合物包含任選地與佐劑一起給藥的A卩的8-mer或免疫原性片段，它們可以被連接到載體。適合的佐劑包括鋁鹽(明礬)、諸如3De-O-醯化單磷醯脂A(MPL)的脂質，或基於皂戒的佐劑。在優選的實施方案中，所述佐劑為鋁佐劑(Merck明礬佐劑，MAA)或基於皂戒的佐劑(ISCOMATRIX,CSLLtd,Parkville,Australia。治療方案本發明用於預防或治療AD和其它澱粉樣蛋白病的組合物的有效劑量將隨很多因素而變化，這些因素包括但不限於給藥方式、靶位點、患者的生理狀態、所給予的其它藥物以及處理是治療性的(即在疾病症狀出現後)還是預防性的(即防止疾病症狀出現)。在優選的實施方案中，患者為人，並且治療劑通過注射給藥。免疫原或治療劑的使用量也將依賴於佐劑是同時給藥還是序貫給藥，在沒有佐劑時使用較高的劑量。免疫原或治療劑的給藥量會有變化，但每次注射0.5-50jng肽(基於A卩肽含量)的量被考慮用於人用。本領域技術人員會知道如何配製包含本文描述類型的抗原的組合物。給藥方案由初級免疫及隨後的設定間隔的加強注射構成。初級免疫和加強免疫之間的間隔、加強注射之間的間隔以及加強免疫的次數將取決於抗體滴度和疫苗誘導的時長。它也將取決於抗體應答的功能有效性，即防止AD出現或在AD患者中表現出治療效果所需的抗體滴度水平。典型的方案由原始設定的在1、2和6個月時的注射組成。另一方案由在1和2個月時的初始注射組成。對於任一種方案，加強注射將每6個月或每年進行一次，這取決於抗體滴度和持續時間。給藥方案也可以是基於需要，如通過監測患者體內的免疫應答來確定。鑑別AD疫苗表位為了確定A(3肽的哪些8胺基酸片段("8-mer")足以產生免疫原性應答，申請人系統性地用小的(8胺基酸)交疊合成肽(SEQIDNO:2-37)掃描了全長AP42，該小的交疊合成肽衍生自顯示在圖1的天然存在的AP序列(SEQIDNO.1)。合成用作抗原、跨越全長Ap42的29個交疊的8胺基酸肽(圖2A)。為了改善溶解性，通過加入三聯賴氨酸(SEQIDNO:52、53、54、56、59、60、62、64和65)或穀氨醯胺(EEE)(SEQIDNO:50、51和61)殘基或使用聚乙二醇(PEG)(SEQIDNO:55和63)間隔物對幾種肽進行修飾。為此，將跨越對應於殘基(ll-18)和(13-20)的A卩序列的肽製備成多種形式，第一種形式在N末端具有6-氨基己酸(Aha)間隔物和用於化學交聯的官能團，而其它形式在C末端具有Aha和官能團。作為對照，申請人包括進了較長肽，Ap(l-18)。用在本文時，免疫原性肽可以是衍生自天然存在的即野生型的或合法產生。這種變體的一個實例為EV底物IDNO:66),為對應於A卩(l-42)的肽，其中野生型Ap的位置1和2被改變。用在疫苗製劑中的AP偶聯物對用於配製疫苗的AP偶聯物的選擇是基於8-mer的免疫原性。為了確定物種中帶有與人A(3序列相同的序列的8-mer的免疫原性，將29種肽(圖2A)偶聯至KLH以形成A卩偶聯物並在豚鼠中測試(圖3)。作為對照免疫原，將AP(l-18)-KLH(SEQIDNO:37)包括在該分析中。如實施例3.B中所描述的，用配製在明石凡和50|LigISCOMATRIX(CSL,Ltd.,Parkville,Austmlia)中的偶聯的免疫原免疫豚鼠。為了區分免疫原性的和非免疫原性的A(342片段，將豚鼠以4周的間隔期免疫三次。在免疫後三周，收集血樣並通過ELISA測試針對A(34Q肽的抗體滴度。這些滴度顯示在圖3中，分別為給藥1次後(PD1)、給藥2次後(PD2)和給藥3次後(PD3)。在首次注射後(PD1),如所述18-mer對照一樣，一些肽區域引起了顯著的抗體滴度。具體地，對應於AP胺基酸1-8、2-9、3-10、17-24、21-28和33-40的A(3偶聯物都產生了超過1:800的滴度。在第二次注射後(PD2),A卩偶聯物中的15個引起超過1:1000的抗體滴度。對給藥3次後(PD3)的分析進一步證實，A卩的某些區域相對於其它區域有更高的免疫原性。11區域表現超過1:6000的滴度。這些包括對應於AP胺基酸1-8、3-10、7-14、11-18、13-20、15-22、19-26、21-28、23-30、27-34和29-36的區域。這些區域中，5個區域為高免疫原性的(>1:10000),包括區域1-8、15-22、21-28、23-30和29-36。該悽t據提示A卩的某些8胺基酸區域為高免疫原性的，而其它區域(例如5-12、25-32、31-38和35-42)為非免疫原性的(滴度<1:300)。這些結果也證實，儘管Ap偶聯物能夠引起A(340肽特異的抗體應答，但不是所有的Ap片段具有同等的免疫原性。A卩肽-KLH偶聯物的免疫反應性為了證實在用A(3肽-KLH偶聯物免疫後的豚鼠中生成的免疫血清與人AD有關，進行了研究以評估來自用Ap(3-10)-KLH(SEQIDN〇40)偶聯物免疫的豚鼠的多克隆血清的免疫反應性。通過免疫組織化學測試在第二次注射A(3(3-10)-KLH(SEQIDNO:40)偶聯物後4周時從豚鼠收集的血清樣品與人AD腦組織的反應性(實施例4)。如圖4所示，A卩(3-10)-KLH(SEQIDNO:40)偶聯物產生的免疫原性應答產生抗體應答，其直接針對人AD腦組織。圖4A顯示單克隆抗A卩抗體6F3D(VectorLaboratories)的免疫反應性。如所顯示的，該腦具有廣泛的AP沉積，其具有預期的人AD的典型方式。圖4B顯示免疫前的豚鼠血清缺乏免疫反應性。圖4C顯示在兩次注射A(3(3-10)-KLH(SEQIDNO:40)偶聯物之後該相同豚鼠血清的陽性免疫反應性。總之，該數據證實通過ELISA監測的免疫原性包含針對該AD組織中發現的人A卩驚人發現擴展至證實這種應答以與治療應用一致的方式被控制。生成OMPC偶聯物和多抗原性偶聯物基於豚鼠中的免疫原性、A(342胺基酸序列內肽片段的相對位置、AP片段的溶解性和採用OMPC作為載體蛋白的可行性，申請人選擇了7種8-mer(圖2B)用於OMPC偶聯。這些肽片段對應於A(3的以下胺基酸區域l國8、2陽9、3-10、7-14、17-24、21-28和33-40。本文描述的發明包括多價肽偶聯物，如那些顯示在圖5、6A和6B中的。多價分枝的MAP-OMPC偶聯物(圖6A和6B)通過採用基於賴氨酸的骨架來生成，而多價線性8-mer-OMPC偶聯物(圖5)則採用PEG接頭來製備。本領域技術人員會理解，與也可用在本發明中的常規胺基酸接頭相比，PEG接頭具有免疫原性較低和肽溶解性較大的優點。在本發明優選的實施方案中，免疫原性片段為偶聯至OMPC的多價MAP。本領域技術人員應理解的是，這種偶聯物並非是肽與載體是1:1比例。相反，多個肽以球形方式附著到每個OMPC分子。本領域技術人員還應理解的是，多價線性構建體和MAP的使用將增強溶解性、製劑穩定性、免疫原性和多克隆應答的多樣性。OMPC偶聯物疫苗的免疫原性為了評估Ap肽-OMPC偶聯物的免疫原性並進一步評估佐劑對這種疫苗構建體的好處，申請人著手在恆河猴中的研究。用Ap(l-18)-OMPC(劑量基於AP肽含量)偶聯物接種恆河猴，該偶聯物配製在Merck明礬佐劑(MAA)或MAA和ISCOMATRIX(CSL,Ltd.,Parkville，Australia)中。收集血樣並用於確定針對Ap40的抗體滴度。對該進行中的研究的中間分析證實在第一次給藥後(PD1),接受含5昭疫苗的明礬的猴沒有出現任何可檢測的滴度，而那些接受含30pg疫苗的明礬的猴出現了低的A(340特異滴度。接受明礬和ISCOMATRIX⑧製劑的所有猴都出現了顯著的抗體滴度。在給藥2次後(PD2)，在僅有明礬中的兩種劑量的A卩偶聯物產生類似的滴度水平，而接受明鞏和ISCOMATRIX⑧的組出現了相對於僅有明礬組高10倍的抗體滴度。這項研究的結果證實AP-OMPC偶聯物在非人靈長類中有免疫原性。該數據還證明這種偶聯物疫苗的有效性被基於皂甙的佐劑如ISCOMATRIX⑧顯著增強。實施例實施例1製備A(3偶聯物本實施例描述A卩肽片段的製備，所述A卩肽片段隨後用於A卩偶聯物以針對A|3的抗體形式誘導免疫應答。A.製備A卩(8-mer)肽(SEQIDNO:37-65;圖2A)合成打算偶聯至馬來醯亞胺衍生的載體蛋白的肽，在羧基末端具有半胱氨酸殘基。在原始肽序列和羧基末端半胱氨酸之間併入間隔物Aha(6-氨基己酸)作為結構元件，以在偶聯過程中最小化對載體蛋白的空間可及性。此外，以EEE、KKK或PEG為代表的增溶殘基被引入序列14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29中的C末端。PEG單元作為0-(N-Fmoc-2-氨乙基)-0'-(2-羧乙基)-十一二醇[Fmoc-NHCH2CH2O(CH2CH2O)10CH2CH2OCH2CH2CO2H]引入。從RinkAmideMBHA樹脂開始，採用製造商(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)提供的Fmoc化學操作在自動肽合成儀上通過固相合成來製備AP肽。在組裝之後，結合樹脂的肽被脫保護並採用94.5%三氟乙酸、2.5%1,2-乙二闢u醇(ethanedithiol)、1%三異丙基石圭步克(tnisopropylsilane)和2.5%H20的混合物從樹脂切下。在處理兩小時後，過濾反應物、濃縮並用乙醚研磨得到的油狀物。將固體產物過濾，溶於50%乙酸氾2〇中並冷凍乾燥。通過在C-18支持物上採用0.1%TFA/H20/乙腈梯度通過RPHPLC實現對半純產物的純化。通過分析HPLC評估級分。合併純級分(〉98%)並冷凍乾燥。通過胺基酸分析和質譜分析證實同一性。B.製備A卩肽-KLH偶聯物(SEQIDNO:37-65;圖2A)為了製備KLH偶聯物，將2mg的具有C末端半胱氨酸的A(3肽(8-mer)懸浮在1ml商品化的馬來醯亞胺偶聯緩衝液(83mM磷酸鈉、0.1MEDTA、0.9MNaCl、0.02%疊氮鈉,pH7.2)(PierceBiotechnology,Rockford,IL)中。將2mg商品化的馬來醯亞胺活化的KLH(PierceBiotechnology,Rockford,IL)樣品加至肽，並使其在25。C反應4小時。通過採用100,000Da透析袋的徹底的PBS緩衝液透析從未反應的肽和試劑中分離出偶聯物。在70小時酸水解後通過胺基酸分析評估引入偶聯物中的肽的量。肽濃度一皮確定為在0.24和0.03mg/ml之間。C.合成溴乙醯化的A卩肽(SEQIDNO:67-77;圖2B)通過標準的t-Boc固相合成，採用引入胺基酸的雙偶聯法在AppliedBiosystems430A型自動分析4義上來製備溴乙醯化的肽。/人對甲基二苯甲胺樹脂開始，引入羧基末端胺基酸t-Boc-Lys(Fmoc)-OH，隨後引入序列中後面的胺基酸。將Aha作為間隔物引入到所有這些序列，將PEG單元引入序列35和37以幫助水溶。將PEG單元作為0-(N-Boc-2-氨乙基)-O'-(N-二羥乙醯基-2-氨乙基)己二醇[Boc-NHCH2CH20(CH2CH20)6CH2CH2NHCOCH2OCH2C02H]引入。氨基末端通過偶聯乙酸來加帽。在組裝原始序列之後，通過用哌啶處理移除羧基末端賴氨酸s氨基的Fmoc保護基團。之後，使N^氨基基團與淡乙酸酐在作為溶劑的二氯曱烷中反應30分鐘。通過用液體氫氟酸和作為清除劑的10%茴香醚處理，完成肽的脫保護和從樹脂支持物移除肽。採用0.1%TFA/乙腈梯度在反相C-18矽膠柱上通過製備HPLC純化所述肽。通過分析HPLC和質譜分析證實了肽的同一性和均一性。D.合成溴乙醯化的二價MAP,構建體No.8,圖6A溴乙醯化的多抗原肽(MAP)的合成類似於實施例l.C中所描述的合成方法。在將羧基末端的Fmoc-Lys(ivDde)-OH[ivDde=1,(4,4-二甲基畫2,6-二氧-亞環己基)-3-曱基-丁基]偶聯至MBHA樹脂後，採用哌啶移除a氨基Fmoc保護基團並通過引入t-Boc-Lys(Fmoc)-OH繼續合成。在t-Boc基團脫保護後，用以下的t-Boc保護的胺基酸延伸序列Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E,並通過在ABI合成儀上偶聯乙酸來給氨基末端加帽。用哌啶除去側鏈賴氨酸Fmoc保護基團，並通過引入以下被保護的基團在ABI合成儀上延伸賴氨酸的W臂Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D,並通過偶聯乙酸給氨基末端加帽。通過用含5%醯肼的二甲基曱醯胺處理5分鐘移除ivDde保護基團，以提供羧基末端賴氨酸上未阻斷的Ns氨基基團，如實施例i.c所述，所述isr氨基基團被溴乙酸酐進一步處理。從樹脂切下肽。它隨後的純化和表徵如實施例l.C所述。E.合成溴乙醯化的MAP,構建體No.11和12，圖6AMAP構建體No.11和12的製備如同實施例l.D中所描述的。F.合成半胱氨酸多價MAP,構建體No.9,圖6A從MBHA樹脂開始，在ABI自動合成4義上組裝以下的t-Boc保護的胺基酸C、Lys(Fmoc)、Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E，然後用乙酸偶聯。除去賴氨酸的1^氨基Fmoc保護基團，並通過引入以下的t-Boc保護的胺基酸然後偶聯乙酸來繼續合成Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D。樹脂結合肽的分離、純化和表徵如實施例l.C。注意在HF切割中，不是使用實施例l.C的10%茴香醚而是對甲酚:對硫代曱酚的1:1混合物作為清除劑。G.合成半胱氨酸二價MAP,構建體No.10、13和14，圖6A如實施例6.F所述製備二價MAP，構建體No.10、13和14,圖6A。將PEG單元作為0-(N-Boc-2-氨乙基)-0'-(N-二羥乙醯基-2-氨乙基)己二醇[Boc-NHCH2CH20(CH2CH20)6CH2CH2NHCOCH2OCH2C02H]引入。H.合成溴乙醯化的多價MAP,構建體No.16,圖6B採用ABJ自動合成儀，使Fmoc-Lys(t-Boc)-OH偶聯至MBHA樹脂。在除去賴氨酸W氨基的t-Boc保護基團後，通過引入以下的t-Boc保護的胺基酸延伸序列Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E,然後偶聯乙酸。通過用哌啶手動處理除去賴氨酸的NaFmoc保護基團。通過引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH，然後引入以下的t-Boc保護的胺基酸(在ABI合成儀上)並偶聯乙酸來進一步處理序列Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D。如之前所述除去賴氨酸FmocNa氨基保護基團，並通過引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH,然後引入以下t-Boc保護的胺基酸並偶聯乙酸來繼續合成Aha、K、N、S、G、V、D、E、A。除去賴氨酸上的NaFmoc<呆護，並通過引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH,然後引入以下t-Boc保護的胺基酸並偶聯乙酸來繼續合成Aha、V、V、G、G、V、M、L、G。在除去賴氨酸NaFmoc保護基團後，使樹脂結合肽與溴乙酸酐反應，如實施例l.C所述。分離和表徵終產物如同實施例l.C所述。I.合成多價MAP,構建體No.15和17,圖6B如實施例l.F和l.H所述合成MAPAp偶聯物，構建體No.15和17,圖6B。J.合成溴乙醯化的多價線性肽，構建體No.1,圖5從MBHA樹脂開始，採用t-Boc化學在ABI自動合成儀上合成原始序列，如實施例6.A所述。採用BOP試劑作為偶聯劑，中間的PEG單元被作為Fmoc-l-氨基-4,7,10-三嗜烷13-十三胺琥珀酸[Fmoc-NHCH2CH2CH20(CH2CH20)2CH2CH2CH2NHCOCH2CH2C02H]引入。哌啶被用於使Fmoc基團脫保護。氨基末端的溴乙醯化如實施例l.C所述。分離和表徵期望的產物如實施例l.C所述。K.合成多價線性A卩肽，構建體No.2、5、6和7,圖5如實施例l.J所述合成多價線性A卩肽，構建體No.2、5、6和7。實施例2AP肽化學偶聯至OMPC本實施例介紹將來源於人A|342的肽化學偶聯至純化的膜炎奈瑟球菌B型外膜蛋白複合物(OMPC)。該偶聯的化學性質為卣乙醯基衍生的肽和巰基衍生的膜複合物蛋白之間的反應。如上所述合成澱粉樣肽，溴乙醯基官能團在二價線性表位肽的N末端，或者在單價線性和分枝的MAP形式的C末端或通過賴氨酸殘基的s氨基連接。通過由6-氨基己酸(Aha)組成的間隔物分開BrAc基團和成熟肽。參見以上描述的序列。將描述代表性肽AP(3-10)的偶聯。按照標準的無菌操作，在層流環境中進行含OMPC溶液的所有操作。A.OMPC的石克醇化從例如Fu的用於生產PedvaxHIB⑧和肺炎球菌偶聯疫苗的美國專利No.5,494,808中描述的方法獲得純化的無菌OMPC，採用試劑N-乙醯基高半胱氨酸硫代內酯(NAHT,Aldrich,St.Louis,MO)在其表面易接近的賴氨酸殘基的一部分上硫醇化。在4。C下，水中的117mgOMPC通過289,000xg離心60分鐘而沉澱，棄去上清。將鼓泡通入N2的活化溶液(0.11M硼酸鈉，pHll)加入離心管，以玻璃攪拌棒取出沉澱。將懸浮液轉移至玻璃Dounce勻漿器，以30次抽動使其重懸。洗滌離心管，並將洗滌液用Doimce勻漿器30次抽動來洗滌。將重懸的沉澱和洗滌液合併在清潔的容器中，得到10mg/mL濃度的OMPC。將固體DTT和EDTA溶解在鼓泡通入N2的活化溶液中，並以0.106mgDTT/mgOMPC和0.57mgEDTA/mgOMPC的比例加入反應容器。在溫和攪拌後，NAHT被溶解在鼓泡通入N2的水中，並以0.89mgNAHT/mgOMPC的比例加入至反應中。在環境溫度下在N2罩中避光反應3小時。結束時，如上所述OMPC被沉澱並通過在鼓泡通入N2的偶聯物緩衝液(25mM硼酸鈉(pH8.5)、0.15MNaCl)中進行Dounce勻漿重懸為6mg/mL來洗滌沉澱。對於最後的重懸，將OMPC按以上方式沉澱並在鼓泡通入N2的偶聯緩沖液中通過Dounce勻漿重懸為10mg/mL。取出等^f分試^^羊用於通過Ellman測定確定游離巰基，大量的產物被避光存貯在冰上，直至使用。測量的巰基含量為0.2至0.3|umol/mL。B.A{3肽偶聯至OMPC肽的官能團BrAc含量被認為是1:1(摩爾比)。稱取足夠的肽以使BrAc相對於總巰基摩爾過量1.6摩爾。用於每個偶聯的總的目標OMPC蛋白為15mg。肽以2.6mg/mL被重懸在鼓泡通入N2的偶聯緩衝液中，緩慢加入硫醇化的OMPC溶液。避光反應，在環境溫度下孵育約22小時。在環境溫度下用5倍摩爾過量的N-乙基馬來醯亞胺將殘留的游離OMPC巰基基團淬滅18小時。按照偶聯操作平行進行僅有硫醇化OMPC的對照。完成淬滅後，將偶聯物和對照轉移至100,000Da分子量截止透析單元，並相對於至少更換5次偶聯緩衝液徹底透析。完成透析後，將樣品轉移至15ml聚丙烯離心管並在4。C下以2,280xg離心5分鐘除去任何聚集物。取出等份試樣用於分析，大量產物被儲存在4。C。C.分析A卩肽-OMPC偶聯物通過改進的Lowry測定確定總蛋白，通過定量胺基酸分析(AAA)來分析偶聯物和對照樣品。根據對酸水解新生的肽-OMPC鍵釋放的獨特殘基S-羧曱基高半胱氨酸的定量，確定肽與OMPC摩爾比。由水解穩定殘基確定OMPC特定濃度，所述水解穩定殘基不存在於肽序列，因而是OMPC蛋白所獨有的。假定對於每摩爾SCMHC為1摩爾的肽，則SCMHC/OMPC的比例就等於肽/OMPC含量。採用肽分子量和平均OMPC質量40,000,000Da，從該比例可計算肽的加載量。偶聯的共價性質通過採用4-20%Tns-甘氨酸凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)的SDS-PAGE分析來定性確定，其中觀察到考馬斯染色的偶聯物條帶相對於對照泳動性向上偏移。tableseeoriginaldocumentpage21A(3偶聯物的免疫原性本實施例描述了能以針對AP的抗體形式誘導免疫應答的A{3偶聯物的配製和給藥。A.配製疫苗偶if關物將A卩肽-KLH偶聯物疫苗配製在ISCOMATRIX(CSLLtd.,Parkville,Australia)中。所有的A卩肽-OMPC偶聯物疫苗配製在明磯中，無論有沒有第二種佐劑如基於皂甙的佐劑ISCOMATRIX(CSLLtd.,Parkville,Australm)均可。所有樣品操作都在無菌條件下進行。對於明礬製劑，偶聯物以指定的肽濃度被1倍鹽水稀釋並與對應於製備在無菌鹽水(150mM無菌氯化鈉溶液)中的900pg/mLMerck明礬的兩倍明磯(Merck,產品號39943)混合。因此，疫苗中的覃巴濃度為450fig/mLMerck明礬或一倍的Merck明礬。對於動物研究，靶肽(抗原)濃度如下小鼠-12.1昭/mL(劑量0.1mL);猴-10嗎/mL或60|ig/mL(劑量0.5mL)以及豚鼠-12.5|ig/mL(劑量0.4mL)。將該混合物在室溫下孵育兩小時。為了獲得該注射劑量，將明礬吸收的偶聯物用一倍的明礬稀釋以達到目標肽濃度。當需要第二種佐劑即ISCOMATRD^時，對於小鼠研究目標濃度為10叱/ML,對於猴研究，目標濃度為0、100或200pg/mL以及對於豚鼠為125昭/mL。1.ISCOMATRIX⑧的製備採用盒式膜(Slide隱A隱Lyzer⑧DialysisCassett，10KMWCO,Pierce,Rockford,IL)，將ISCOMATRIX⑧在2-8。C透析進無菌鹽水溶液。在透析過程中無菌鹽水溶液更換2-3次。完成透析後，採用注射器式濾器(0.22(iMMillex-GV注射器式濾膜，Millipore,Billerica,MA)無菌過濾ISCOMATRIX⑧。無菌的經透析的ISCOMATRIX⑧的濃度通過RP-HPLC確定。將ISCOMATRIX⑧無菌保存在2-8匸，直至使用。2.A卩肽-OMPC偶聯物和Merck明礬的製備將A卩肽-OMPC偶聯物儲備液稀釋進無菌IX鹽水溶液。然後將稀釋的AD肽-OMPC偶聯物儲備液加至含2XMerck明礬的IX無菌鹽水溶液中並在室溫下在旋轉輪上混合1小時。室溫下使該混合物在工作檯上靜置15分鐘，然後以1500rpm離心10分鐘。小心傾出上清(對上清進行UV分析以確定結合到明鞏的A卩肽-OMPC偶聯物％)，並將沉澱重懸在無菌1X鹽水中。將混合物等分進無菌3mL管式玻璃瓶，然後保存在2-8。C直至最後與ISCOMATRIX⑧配製。3.A卩肽-OMPC/明礬和ISCOMATRIX⑧疫苗的配製在最後與ISCOMATRIX⑧配製前，通過靜態光散射法確定A卩肽-OMPC/明礬在鹽水中的顆粒大小以證實結合併監測顆粒穩定性。在攪拌下，將無菌經透析的IX鹽水中的ISCOMATRIX⑧加至無菌的150mMNaCl中的A卩肽-OMPC/明礬。給瓶加塞、加帽並壓皺，直至完全密封。在注射前將疫苗保存在2-8i:。注射前，每種疫苗渦動3-5分鐘。B.在豚鼠中偶聯物疫苗的免疫原性從HarlanInc.,Indianapolis,IA得到6至10周齡的雌性豚鼠並才艮據常規指導銅養在Merck研究實驗室的動物房中。所有的動物實驗都得到MerckResearchLaboratoriesInstitutionalAnimalCareandUseCommittee(IACUC)的批准。將抗原製備在磷酸鹽緩沖鹽水中並配製在指定的佐劑中。在40pgISCOMATRIX⑧存在下通過肌內注射400pl的偶聯物疫苗用顯示在圖2A中的A卩肽-KLH偶聯物(8pg肽含量或50昭的總偶聯物)免疫每組兩隻動物。以四周的間隔免疫三次。在首次免疫之前(pre-bleed)以及每次免疫三周之後收集血清才羊品並在抗體滴度測定前保存在4°C。採用AP40作為耙抗原按照以下方法通過ELISA測定抗體滴度。該基於ELISA的分析如下用每孔50)al在50mM碳酸氫鹽緩衝液(pH9.6)中濃度為4iug/ml的AP包被96孔板，4。C過夜。將板用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌並用含有0.05%Tween-20的PBS中3%脫脂乳(乳-PBST)封閉。測試樣品在PBST中以4倍系列稀釋。將100pl稀釋的樣品加入每孔，並將板在24。C孵育兩小時，隨後用PBST洗滌6次。每孔加入50jal在乳-PBST中1:5000稀釋的HRP-偶聯第二抗體，並將板在24。C孵育l小時。將板洗滌三次，每孔加入100mM檸檬酸鈉(pH4.5)中的100|ul1mg/ml的鄰苯二胺二鹽酸鹽。在24。C孵育30分鐘後，通過每孔加入100|ul的INH2SO4終止反應，並採用ELISA讀板儀在490nm處讀數。抗體滴度被定義為給出OD490nm值高於均值加上偶聯物對照孔兩倍標準差的最高稀釋度的倒數。顯示在圖3中的該分析結果證明在第一次注射後(PD1),—些肽區域引起顯箸的抗體滴度，如同18-mer對照。尤其是，對應於Ap胺基酸1-8、2-9、3-10、17-24、21-28和33-40的Ap肽片段都產生超過1:800的滴度。在第二次注射後(PD2),15種8-mer偶聯物引起超過1:1000的抗體滴度。對給藥3次後(PD3)的分析進一步證實AP肽的某些區域相對於其它區域免疫原性更強。11個區域表現出大於1:6000的滴度。這些區域包括對應於Ap胺基酸1-8、3-10、7-14、11-18、13-20、15-22、19-26、21-28、23-30、27-34和29-36的區域。在這些區域中，五個區域是高免疫原性的(>1:10000)，包括區域1-8、15-22、21-28、23-30和29-36。該結果證實8-mer偶聯物能夠引起AP4o特異性抗體應答。出人意料並且與以前的教導相反的是，並非AP的所有片段都有相等的免疫原性。實際上，這些數據表明某些8-mer為高免疫原性的，而其它的A卩區域(例如5-12、25-32、31-38和35-42)則是無免疫原性的(滴度<1:300)。C.偶聯物疫苗在恆河侯中的免疫原性在非人靈長類即恆河侯中進行了研究，與在豚鼠中進行的相似，以確定A卩肽-OMPC偶聯物和明鞏以及ISCOMATRIX⑧佐劑是否提供免疫應答。才艮才居MerckResearchLaboratoriesandNewIberiaResearchCenter(TheUniversityofLouisianaatLafayette,NewIberia,LA)的學會動物關懷"i十戈寸々司養'f"亙;^可1^矣(iWac"c"。申請人採用偶聯至OMPC的Ap肽作為模型抗原，包括圖2B中顯示的8-mer:A(3(1-8)(SEQ.IDNO:67)、A卩(3-10)(SEQ.IDNO:69)、AJ3(7-14)(SEQIDNO:70)、A卩(17-24)(SEQIDNO.72)、A(3(21-28)(SEQIDNO:73)和A卩(33-40)(SEQIDNO.74);圖5中顯示的二價線性肽A，(3-10)(7-14)(構建體No.1)、A卩(3-10)(21-28)(構建體No.2)、A卩(1-8)(21-28)(構建體No.5);以及顯示在圖6A中的多價分枝的MAP:A(3(3-10)(7-14)(構建體No.8)、A卩(l-8)(21-28)(構建體No.11)、A卩(3-10)(21-28)(構建體No.12)。用配製在Merck明礬佐劑(MAA)中的5每種疫苗加上100叱的ISCOMATRIX⑧每4周免疫一次恆河侯(N二3)。在每次注射四周後收集血清樣品並通過ELISA確定A|3特異的抗體應答。與來自豚鼠研究的結果一致，所有的偶聯物發現在猴中有免疫原性。Ap特異的抗體滴度在單次注射後就可檢測，在隨後的注射後進一步增強。通常，對於所測試的偶聯物，在第二或第三次免疫之後達到峰值滴度，其中幾何平均滴度在25,000至500,000的範圍。這些結果證實本文描述的A卩偶聯物能夠引起AP特異的抗體應答這一發現。D.佐劑對恆河侯中偶聯物疫苗免疫原性的影響另一項研究在非人靈長類即恆河侯中進行，以確定A卩肽-OMPC偶聯物和基於皂戒的佐劑如ISCOMATRIX是否能提供改善的免疫應答。申請人採用偶聯至OMPC的A(3(l-18)肽作為模型抗原。根據MerckResearchLaboratoriesandNewIberiaResearchCenter(TheUniversityofLouisianaatLafayette,NewIberia,LA)的學會動物關懷計劃飼養恆河侯向五組猴(每組三隻)給予以下的AP(l-18)-OMPC偶聯物(1)明礬中的5iLig偶聯物(基於肽含量)，(2)明鞏中的5ng偶聯物+100叱ISCOMATRIX,(3)明礬中的5iug偶聯物+50mgISCOMATRIX,(4)明礬中的30嗎偶聯物，(2)明石凡中的30jug偶聯物+100)ugISCOMATRIX。通過在0、8和24周採用結核菌素注射器(Becton-Dlckmson,FranklinLakes,NJ)肌內注射0.5ml的等份試樣進行免疫。從0周起(pre-bleed)以四周的間隔收集血清樣品並通過ELISA測定針對AP40的抗體滴度，如在以上實施例中所描述的那樣進^^。該進行中的研究的中間分析證明在PD1時，接受明礬中的5mcg偶聯物疫苗的猴沒有出現可檢測的滴度，而那些接受明礬中的30嗎偶聯物疫苗的猴出現低的AP4o特異性滴度。接受明礬加ISCOMATRIX⑧製劑的所有猴都出現了顯著的抗體滴度。在PD2時，在僅有明礬中的兩個劑量產生類似的滴度水平，然而接受明礬加Iscomatrix⑧的組出現了相對於僅有明礬條件高10倍的抗體滴度。這項研究的結果證實該AP肽-OMPC偶聯物在非人靈長類中有免疫原性。該數據進一步證實這種偶聯物疫苗的有效性被基於皂戒的佐劑如ISCOMATRIX顯著增強。實施例4豚鼠多克隆血清的免疫反應性為了證明以上用8-merKLH偶聯物免疫後的豚鼠產生的免疫血清(實施例3.B)與人AD有關，進行了研究以評估用A卩(3-10)-KLH免疫原免疫的豚鼠的多克隆血清的免疫反應性。在第二次注射該構建體後四周，根據以下的方法從代表性豚鼠收集血液。在人AD腦切片(BioChainInstitute,Inc.,Hayward,CA)上評估多克隆血清的反應性。通過以下方法製備人腦切片在6(TC孵育30分鐘，隨後在室溫下用二曱苯洗滌兩次，每次5分鐘。隨後將切片浸入100%EtOH中兩次，每次5分鐘，在每次之後在ddH20中浸泡5分鐘。將切片浸在99%曱酸中3分鐘，隨後是在ddH20中的短暫洗滌以及在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中浸泡5分鐘。隨後將切片與過氧化物酶阻斷劑一起孵育10分鐘，接著是5分鐘的PBS洗滌。通過暴露於10%山羊血清10分鐘來封閉切片並隨後用PBS洗滌5分鐘。然後將切片與稀釋的豚鼠血清在4°C孵育過夜或在室溫下孵育1小時。在5分鐘的PBS洗滌之後，將切片與稀釋的生物素化的山羊抗豚鼠IgG或生物素化的馬抗小鼠抗體(5mlPBS中一滴)一起孵育10分鐘。在PBS中洗滌切片5分鐘，隨後與ABC溶液(VectorstainABCkit;VectorLaboratories,Inc.)—起將育30分鐘。用PBS洗滌切片5分鐘。然後用DAB(DakoCytomation)對切片染色5分鐘並用ddH20洗滌。接著，將切片在蘇木精中復染30秒並在梯度EtOH和二曱苯(70%EtOH5分鐘，80%EtOH5分鐘，100%EtOH5分鐘以及二甲苯5分鐘)中脫水。然後對切片加上蓋玻片，通過光學顯微鏡評估。通過A(3(3-10)-KLH偶聯物產生的免疫應答產生針對人AD腦組織的抗體應答。如圖4所示，這個人腦切片具有廣泛的AJ3沉積，沉積方式為人AD通常所預期的。儘管免疫前豚鼠血清被證實在暴露於該組織時缺乏免疫反應性，但在兩次注射A(3(3-10)-KLH構建體後，觀察到來自同一隻豚鼠的血清有陽性免疫反應性。這些數據證實，通過ELISA檢測的並顯示在圖3中的免疫原性含有針對該AD組織中存在的人A(3的顯著抗體應答。因此，該結果將一些A(3片段的不同免疫原性的驚人發現擴展至進一步證實該應答是與治療應用一致的方式被控制的。實施例5鑑別缺乏T細胞表位的免疫原性片段為了鑑定用於本發明的缺乏T細胞表位的免疫原性片段，以下的酶聯免疫斑點(ELISpot)測定可被用作評價T細胞對特定抗原的應答。具有T細胞表位的免疫原片段通過在白色膜表面存在暗點來鑑別；每個點表明存在應答抗原(即免疫原性片段)而分泌幹擾素y(IFN-力的T細胞。疫苗和免疫學領域一支術人員熟悉這種測定法，參見，例如LarssonW"/.，AIDS3:767-777,1999,andMwau"a/.，AIDSResearchandHumanRetroviruses18:611-618,2002。最近的綜述可參考A.E.Kalyuzhny,MethodsMoBiol.302:15-31,2005。申請人使用來自恆河侯(NewIberiaResearchCenter,TheUniversityofLouisianaatLafayette,NewIberia,LA)的外周血單核細月包(PBMC)用於應答肽A卩1-40(AmericanPeptideCo.,Sunnyvale,CA)(胺基酸序列NO:78)和A卩1-20(Synpep,Dublin,CA)(胺基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF)(SEQIDNO:79)。純化的多克隆小鼠抗猴IFN-y(克隆MD-1,CatNo.CT525,U-CyTechbiosciences,Utrecht,TheNetherlands)被稀釋在含有1%青黴素和硫酸鏈黴素(GIBCO青黴素-鏈黴素，CatNo.15140-122,Invitrogen,Carlsbad,CA)的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，然後加至96孑LHTSIP無菌板(Cat.No.MSIPS4W10,Millipore,Billerica,MA),並在4°C終育超過12小時。洗板，並在37。C孵育至少2小時之前，加入RIO[RPMI培養基1640(GIBCOCat.No.11875-093)、10。/。胎牛血清(HyCloneSH30070.03,Logan,UT)、0.1%50mM2-巰基乙醇(GIBCC^Cat.No.21985-023)、1%1MHEPES緩衝液(GIBCO⑧15630-080)、1。/。200mM左旋穀氨醯胺(GIBCO⑧Cat.No.25030-081)、1%lOOmMMEM丙酮酸鈉溶液(GIBCO⑧Cat.No.11360-070)、1。/o青黴素-鏈黴素溶液(GIBCO⑧Cat.No.15140-122)]。離心PBMC,在R10中重懸。在Z2庫爾特計數儀(BeckmanCoulter，Fullerton,CA)上對PBMC計數。吸乾的板的每孔接受0.4口)igofA卩1-40、A(31-20、PHA(植物凝集素,CatNo.L-8902,Sigma,St.Loms,MO,陽性對照)或稀釋的DMSO(Sigma,陰性對照)；然後向每孔加入400000PBMC。將板在37。C下在溼潤的C02培養箱中孵育18-24小時。將板在含有5%FBS和0.005%Tween的PBS中洗滌；將生物素偶聯的抗猴IFN-y多克隆抗體(U-CyTechbiosciences,Utrecht,TheNetherlands)稀釋在相同培養基中並添加至每板；然後將板在4。C孵育18-24小時。將抗生物素蛋白鏈黴素-AP(CatNo.l3043E，BDPharMmgen,FranklmLakes,NJ)稀釋在相同培養基中並添加至經洗滌的澤反；將才反在室溫下避光孵育2小時。添加過濾的1-StepNBT/BCIP底物(P跳e,Rockford,IL,Cat.No.34042),並在室溫下再避光孵育10分鐘。洗滌後，在用CCD照相機成4象前使板乾燥，通過計算機自動對每孔內的斑點計數。申請人確認每百萬PBMC中的斑點形成細胞(SFC/106PBMC)必須超過55並且必須超過4倍陰性對照才被定義為陽性結果；沒有達到以上兩標準定義為陰性結果。用包含偶聯至OMPC的Ap(3-10)/(21-28)(構建體No.12,圖6A)的MAP構建體，或用兩種偶聯至OMPC的單體構建體A卩(3-10)(SEQIDNO:69)和A卩(21-28)(SEQIDNO:73)接種獼猴。接種期間每月測定每隻獼猴，持續三或四月；曾記錄到的針對A卩1-40或A卩1-20的最強信號僅為18SFC/l6pBMC，顯著低於55SFC/106PBMC的標準。因此，全都產生陰性分值，為所述疫苗不引起T細胞應答提供了可靠證據，因而不包括T細胞表位。實施例6升高血漿A卩用5嗎的連接至作為載體的OMPC並配製在MAA中的MAPA卩。-10)/("-M)偶聯物(構建體No.l2,圖6A)或其單體成分偶聯物A卩(3-10)(SEQIDNO:69)和A卩(21-28)(SEQIDNO:73)加上100|igISCOMATRIX⑧免疫非人靈長類獼猴(N4)。該獼猴靈長類每四周接受接種，在每次注射後四周收集血液並進行分析。確定了抗Ap犯滴度和總的A(3!4。水平。採用6E10/G210ELISA在這些經免疫的動物中確定血漿A(3"o水平。這種測定採用夾心ELISA測量Ah,,該ELISA包括N末端捕獲抗體6E10(A卩1-8)(SignetLaboratories,Dedham,MA)和偶聯至石成性磷酸酶的C匿末端A卩4。新表位抗體(G210)(TheGeneticsCompany,Inc.,Zunch，Switzerland)。將抗體6E10以5叱/ml的濃度包被各板。稀釋的血漿樣品(l:3)以50pl/孔使用，重複三次。A(3p4q標準品在6E10免疫耗盡(immuno-depleted)的獼猴血漿基質中製備為400pM-3pM。該測定具有約5-20的信噪比。CDP-sta"鹹性磷酸酶底物從AppliedBiosystems,FosterCity,CA獲得。預配製的封閉緩衝液SuperBlock⑧從PierceBiotechnology,Rockford,IL(Ca說37515)獲得。採用擬合標準品的三級樣條函數，將各個樣品計數(重複進行三次)轉變為實際的分析物濃度。進行QC樣品分析以評估板間信號變異性。如圖8A所示，這些分析的結果證實在用MAPA卩(3-10)/(21-28)構建體(構建體No.12,圖6A)免疫後在PD3時血漿A卩4o有大於3倍的升高。血漿AP4q的這種升高沒有在用單體AP偶聯物/OMPC疫苗構建體免疫的動物中觀察到。具體地，用A卩(3-10)(SEQIDNO:69)或A卩(21-28)(SEQIDNO:73)免疫對該量度不產生應答或產生顯著較低的應答。值得注意的是，這些差異獨立於顯示在圖8B中的滴度水平。綜上所述，這些數據證實一些構建體相對於其它免疫原性構建體在它們升高血漿AP水平的能力方面具有優勢。本領域技術人員會理解，免疫原性片段的這種選擇性，即升高血漿A(3水平的能力，在本發明之前並未被揭示並且不能從現有技術預測得來。因此，對缺乏T細胞表位並在免疫後升高血漿A(3的8-mer或MAP免疫原的鑑定提供了選擇用於疫苗構建體的8-mer或MAP的方法。由於本發明，現有技術人員現在能夠定性(即免疫原性)和定量地(即多克隆抗體應答的性質-升高血漿A卩水平的能力)表徵所述疫苗構建體。本領域技術人員還應理解的是，本發明不限於8胺基酸A卩片段，而是包括任何能夠在宿主生物體中產生與AP反應的多克隆抗體應答的抗原。權利要求1.一種藥物組合物，包含Aβ免疫原性片段，所述Aβ免疫原性片段缺乏T細胞表位，能以針對所述Aβ片段的抗體形式誘導免疫應答。2.權利要求1的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能夠升高血漿A卩水平。3.權利要求2的組合物，其中所述免疫原性片段選自Ap的線性8胺基酸肽(8-mer)、散布有至少一個間隔物的多價線性肽以及多價分枝的多抗原肽(MAP)。4.權利要求3的藥物組合物，還包含連接至所述組合物以形成偶聯物的載體分子，其中所述載體促進包含針對所述AP片段的抗體的免疫應答。5.權利要求4的藥物組合物，其中所述載體分子選自血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子和腦膜炎奈瑟球菌(A^w^nawem"g"zA^)外膜蛋白複合物(OMPC)。6.權利要求5的藥物組合物，其中所述載體分子是OMPC。7.權利要求4的藥物組合物，還包含藥物可接受的佐劑。8.權利要求7的藥物組合物，其中所述藥物可接受的佐劑選自氬氧化鋁和基於皂甙的佐劑。9.權利要求9的藥物組合物，其中所述藥物可接受的佐劑為基於皂甙的佐劑。10.防止或治療患者腦中與Ap的澱粉樣蛋白沉積有關的疾病的方法，包括給予有效劑量的Ap免疫原性片段，所述Af3免疫原性片段缺乏T細胞表位，能以針對所述AP片段的抗體形式誘導免疫應答。11.權利要求10的方法，其中所述免疫原性片段能夠升高血漿A卩水平。12.權利要求11的方法，其中所述免疫原性片段選自A(3的線性8胺基酸肽(8-mer)、散布有至少一個間隔物的多價線性肽以及多價分枝的多抗原肽(MAP)。13.權利要求12的方法，其中所述免疫原性肽被連接至載體分子以形成偶聯物並且其中所述載體促進包含針對所述AP片段的抗體的免疫應答。14.權利要求13的方法，其中所述載體分子選自血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、免疫球蛋白分子和腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白複合物(OMPC)。15.權利要求14的方法，其中所述載體分子為OMPC。16.權利要求13的方法，其中所述偶聯物與藥物可接受的佐劑一起給藥。17.權利要求14的方法，其中所述藥物可接受的佐劑選自氫氧化鋁和基於皂甙的佐劑。18.權利要求17的方法，其中所述藥物可接受的佐劑為基於皂戒的佐劑。全文摘要本發明提供了治療與患者腦中Aβ澱粉樣蛋白沉積有關的疾病如阿爾茨海默病的組合物和方法。這些方法需要給予Aβ的免疫原性片段，所述Aβ的免疫原性片段缺乏T細胞表位、能以針對Aβ的抗體形式誘導有益免疫應答。另一方面，Aβ的免疫原性片段能夠升高血漿Aβ水平。該免疫原性片段包括Aβ的線性或多價肽。藥物組合物包含化學上連接至可與佐劑一起給藥的載體分子的免疫原性片段。文檔編號A61K39/00GK101171031SQ200680015389公開日2008年4月30日申請日期2006年5月1日優先權日2005年5月5日發明者G·金尼,J·G·喬斯,J·W·希弗,P·M·克勒,V·M·加斯基,梁小平申請人:默克公司