一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法
2023-07-19 22:51:11
專利名稱：一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法。
背景技術：
尿酸氧化酶(尿酸氧化還原酶，EC 1.7.3.3，Urate Oxidase，Uricase)是一種可將尿酸氧化為尿囊素的蛋白酶。機體嘌呤核苷酸分解產生的產物黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下產生尿酸，尿酸進一步在尿酸氧化酶、尿囊素酶、尿囊酸酶、尿素酶作用下分解為CO2和NH3。不同物種尿酸分解的程度不同，在哺乳動物體內產生的大部分次黃嘌呤和鳥嘌呤是通過磷酸核糖轉移酶轉變為肌苷單磷酸和鳥苷單磷酸，但仍有10％要被分解，排除體外。人體中，尿酸是嘌呤降解的最終產物，並隨尿排除體外。
正常男性成人24小時尿尿酸總量小於600mg，病理導致的尿酸大量產生往往高於這個值而出現許多臨床症狀。惡性腫瘤的增殖導致核酸分解代謝加強，嘌呤代謝產生大量尿酸，病人出現高尿酸血症(Hyperuricemia)。腫瘤放化療過程中也因為細胞大量裂解而出現伴隨高尿酸血症的腫瘤消退綜合症(tumor lysissyndrome，TLS)，病人體內一系列生理功能發生改變電介質紊亂、嘌呤代謝產生大量的尿酸、極性腎衰、虛弱、痙攣、心律不齊、腎結石或者死亡。在淋巴瘤、白血病、大塊腫瘤的治療中更容易出現。TLS增加了胞內物質如鉀、磷、鈣、尿酸等的濃度，大大超過了人體腎臟的排洩能力，導致高尿酸、高鉀、高磷、高鈣等症，最後導致腎衰的形成。
痛風是另一類與尿酸水平有關的疾病，由於遺傳性或獲得性病因導致嘌呤代謝障礙和血清尿酸持續升高所引起。升高的血尿酸水平導致在關節中發作形成尿酸鈉水合物微結晶時，就發生痛苦的痛風性關節炎，而且會反覆發作。結晶沉澱物在關節、骨骼、軟組織和軟骨的沉積稱為痛風石。尿酸鹽沉積於腎小管引起炎症，腎小球纖維化等病變。痛風病人以男性為主，約佔95％，且發病高峰在30-40歲之間。痛風發生的主要原因是內源性產尿酸過多，外源性富含嘌呤的食物攝入過多，尿酸排洩減少。
我國癌症腫瘤發病病人2000年為180～200萬人，佔世界的五分之一，預計2020年，全球每年新發癌症病人為1500萬人。我國近20年惡性腫瘤在死因中的構成比例已由12.6％升至17.9％，每年新發病人數約170萬，大部分在發病以後採用化療和放療等手段治療，化療與放療時細胞分裂過盛和急劇破壞，核酸分解突然增多產生大量尿酸，導致高尿酸血症，血尿酸濃度高達2380μmol/L～3570μmol/L(40～60mg/dl)。引起結石和腎衰，病人痛苦之極。
目前控制TLS的辦法有飲食控制、水合、鹼化酸毒症，用別嘌呤醇和尿酸氧化酶利尿等手段。但是別嘌呤醇抑制黃嘌呤氧化酶的活性，阻滯了黃嘌呤和次黃嘌呤轉化為尿酸，幹擾6-巰基嘌呤的代謝，影響腫瘤的治療。別嘌呤醇因為抑制黃嘌噙氧化酶阻滯尿酸形成，增加了腎臟排洩尿酸前體(次黃嘌呤和黃嘌呤)的負荷。與次黃嘌呤不同，黃嘌呤在尿中比尿酸難溶。有時別嘌呤醇治療的病人也可出現黃嘌呤腎病和結石。此外，對於病人體內存留的尿酸的排洩，使用別嘌醇治療無效。另外用別嘌呤醇治療的患者，2％產生過敏性反應，甚至出現嚴重的超敏反應綜合症。對於急性高尿酸血症病人，別嘌呤醇因為起效時間長而使病人不能及時得到治療。而尿酸氧化酶能夠將尿酸氧化為尿囊素，很容易被排出體外。極大地緩解了高尿酸導致的綜合症對病人產生的痛苦，提高了癌症、腫瘤病人的生活質量。
從黃麴黴(Aspergillus fiavus)提取的天然尿酸氧化酶Uricozyme已經在歐洲上市使用有20年的歷史，經注射給藥用於治療與白血病化療有關的嚴重高尿酸血症。美國也於1997年開始將該產品用於白血病患者。與別嘌呤醇相比，尿酸氧化酶降低血尿酸水平迅速而專一。痛風病人給予尿酸氧化酶可阻斷急性發作並減小痛風石的體積。
從培養的黃麴黴提取尿酸氧化酶不但培養周期長、產率低，而且容易受病原體汙染。基因工程技術為大量製備尿酸氧化酶開闢了新的道路。1992年，Legoux等克隆了黃麴黴尿酸氧化酶基因，並在大腸桿菌中嘗試表達，產物以可溶解的形式在胞內表達，並且具有酶活性，但表達量低，只有菌體全蛋白的4％，不具有產業化開發價值。天然黃麴黴尿酸氧化酶N端乙醯化有利於酶的穩定及抵抗蛋白酶降解，這對培養周期長的表達系統十分重要，但對活性並不是必須的。同年，Chevalet用尿酸氧化酶缺陷的黃麴黴菌株進行表達，結果轉化菌株不能以尿酸為唯一氮源，而且容易恢復為野生型。而Leplatois等在這一年取得了很大進展，他們在釀酒酵母中表達黃麴黴尿酸氧化酶基因，表達量達到13％。另外2000年，Hongoh等將Nilaparvata Iugens尿酸氧化酶基因在大腸杆進行融合表達，90％的目標蛋白以包含體形式存在，表達量估計有20％。國內朱獻軍等於2001年在大腸桿菌中克隆表達了產朊假絲酵母的尿酸氧化酶基因，產物以可溶形式表達，佔可溶性蛋白的30％。
目前的黃麴黴尿酸氧化酶大腸桿菌表達體系存在的主要問題是表達量不高，無法大規模生產。酵母表達的產物表達量達13％，培養周期長，成本高。因此有必要採用更高效表達尿酸氧化酶的製備體系，以滿足臨床的需要。
發明內容
本發明的目的在於提供一種表達量高的黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法。
黃麴黴尿酸氧化酶cDNA序列是已知的，編碼一個全長301個胺基酸的蛋白質。黃麴黴尿酸氧化酶的編碼序列可以來源於基因文庫，或根據文獻報導的黃麴黴尿酸氧化酶cDNA序列全基因合成，還可以設計引物，通過PCR擴增獲得。
本發明一種重組黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，包括如下步驟(1)、黃麴黴尿酸氧化酶基因的獲得；(2)表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌將合成的黃麴黴尿酸氧化酶cDNA片段插入到表達載體質粒的酶切位點，然後直接轉化大腸桿菌宿主菌；(3)、陽性克隆的篩選、培養、誘導表達篩選出陽性克隆在培養基上進行培養，經誘導使目標蛋白表達；(4)、融合蛋白的分離、純化首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經離心得到破菌液上清，然後對破菌液上清用層析技術純化；(5)、融合蛋白的酶切，其中所述的表達載體質粒是pET-15b、pET-19b、pET-30a-c、pET-32a-c；黃麴黴尿酸氧化酶基因的獲得是通過全基因合成或通過設計引物，再PCR獲得；所述的酶切位點是Nde I/BamH I或Nco I/BamH I位點；步驟(3)中是用氨苄青黴素做抗性篩選；步驟(3)中培養基培養的溫度控制在28℃～40℃，優選在30℃～35℃；步驟(3)中誘導表達使用濃度為0.1～1.5mmol/L的IPTG作為誘導劑，優選0.4～1.0mmol/L的IPTG作為誘導劑；層析技術是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法；步驟(5)中酶切所用的酶是凝血酶或牛腸激酶。
本發明一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其表達方案簡單，表達量高，純化工藝簡單，收率高。表達產物可溶，不需要復性，直接用層析方法進行純化，純化收率大大提高，適合大規模製備。
圖1本發明表達載體構建示意圖；圖2融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析結果圖；
其中1和8蛋白質分子量標準，自上而下分別為97.4kd、66.2kd、43kd、31kd、20.1kd、14.4kd；2未誘導全菌；3未誘導菌體破菌上清；4未誘導菌體破菌沉澱；5誘導全菌；6誘導菌體破菌上清；7誘導菌體破菌沉澱。
圖3離子交換層析圖譜；圖4融合蛋白的酶切後的SDS-PAGE電泳分析結果圖；其中1未加酶對照；2酶2000稀釋作用結果3酶200稀釋作用結果；4酶20稀釋作用結果；5酶對照。
圖5疏水層析圖譜；圖6活性分析結果圖。
具體實施例方式
實施例11、黃麴黴尿酸氧化酶基因的獲得表1黃麴黴尿酸氧化酶cDNA序列
表達載體採用pET-15b(Invitrogen)，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。根據文獻報導的黃麴黴尿酸氧化酶cDNA序列，見表1，合成30段互補的寡核苷酸，並在5』端和3』端分別引如酶切位點Nde I、BamH I，按分子克隆的常規方法，首先用T4噬菌體多核苷酸激酶37℃處理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩爾混合，94℃變性5min，立即65℃退火10min，然後加入T4連接酶，16℃連接過夜。
2、表達載體pET-15b-202的構建和轉化宿主菌pET-15b質粒用Nde I、BamH I雙酶切回收大片段，與合成的黃麴黴尿酸氧化酶cDNA片段連接，20μL反應體系基因片段與載體大片段的比例為10∶1，加T4DNA連接酶300單位，15℃連接過夜，取10μL連接產物直接轉化大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)感受態細胞，塗布於氨苄青黴素抗性平板，37℃培養過夜，獲得工程菌經進一步篩選，工程菌構建過程見圖1，3、陽性克隆的篩選、培養、誘導表達氨苄青黴素做抗性篩選，得到陽性克隆pET-15b-Uox。提取質粒，用限制性內切酶進行鑑定。陽性轉化子用通用引物進行序列分析，結果克隆序列與設計序列完全一致。
接種陽性克隆進行培養，經0.8mmol/L的IPTG誘導。
(4)、融合蛋白的分離、純化收集菌體，進行超聲破碎，然後收集上清和沉澱，用12％SDS-PAGE電泳分析，結果目標蛋白主要存在於破菌後的上清液中，電泳結果見圖2，根據電泳結果的條帶分析，誘導全菌的5號跑膠帶中的目標蛋白的表達量應該在30％以上。將收集到的破菌上清液用離子交換層析法分離純化，其過程為用pH值為8.5的20mmol/L Tris.CL緩衝液稀釋，使其電導率小於5mS/cm。用同樣的緩衝液平衡CM柱，上樣後用平衡緩衝液洗至基線，用0.01～0.5mol/LD NaCL梯度洗脫，收集目標蛋白峰，層析圖譜見圖3。
(5)、融合蛋白的酶切、純化將離子交換目標蛋白峰稀釋後使目標蛋白的濃度達到1mg/mL，樣品對凝血酶切割緩衝液(50mmol/L Tris.CL，150mmol/L NaCL，2.5mmol/L CaCL2，pH 7.5)透析進行緩衝液交換，然後加入20mg/mL(0.5U/mL)的凝血酶，稀釋比例分別為20、200、2000倍，25℃保溫過夜酶切，12％SDS-PAGE電泳分析，結果見圖4，20、200倍稀釋的凝血酶切割效果很好。經酶切後的目標蛋白補加(NH4)2SO4使終濃度為1.0-1.5mol/L，樣品上用1.2mol/L(NH4)2SO4，20mmol/L PB，pH7.4的緩衝液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通過降低鹽濃度梯度洗拖，收集目標蛋白峰，見圖5的疏水層析圖譜。
得到的疏水層析峰經Sephadex G-25脫鹽，平衡液為20mmol/L PB，pH7.4。樣品脫鹽後即為精細純化的黃麴黴尿酸氧化酶。
實施例2黃麴黴尿酸氧化酶活性分析純化後的黃麴黴尿酸氧化酶用文獻報導的方法(Legoux R.et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，(12)，8565-8570)分析酶活性，3ml緩衝液體系(TEA buffer，7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)中含尿酸0.18μmol，pH 8.9，30℃保溫，檢測波長292nm，每分鐘將1μmol尿酸氧化為尿囊酸所需的酶量為一個酶活性單位。加入1mg/mL的酶1μL、2μL、5μL、10μL，反應結束後測吸收值，結果見圖6。
權利要求
1.一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)、黃麴黴尿酸氧化酶基因的獲得；(2)表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌將合成的黃麴黴尿酸氧化酶cDNA片段插入到表達載體質粒的酶切位點，然後直接轉化大腸桿菌宿主菌；(3)、陽性克隆的篩選、培養、誘導表達篩選出陽性克隆在培養基上進行培養，經誘導使目標蛋白表達；(4)、融合蛋白的分離、純化首先將大腸桿菌工程菌菌體收集、破菌，經離心得到破菌液上清，然後對破菌液上清用層析技術純化；(5)、融合蛋白的酶切、純化將部分純化的融合蛋白經酶切後用層析技術純化得到黃麴黴尿酸氧化酶，其中所述的表達載體質粒是pET系列載體質粒。
2.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於pET系列載體質粒是pET-15b、pET-19b、pET-30a-c、pET-32a-c。
3.根據權利要求1所述的一種重組黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於黃麴黴尿酸氧化酶基因的獲得是通過全基因合成或通過設計引物，再PCR獲得。
4.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於所述的酶切位點是Nde I/BamHI或Nco I/BamHI位點。
5.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於步驟(3)中是用氨苄青黴素做抗性篩選。
6.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於步驟(3)中培養的溫度控制在28℃～40℃，優選在30℃～35℃。
7.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於步驟(3)中誘導表達使用濃度為0.1～1.5mmol/L的IPTG作為誘導劑，優選0.4～1.0mmol/L的IPTG作為誘導劑。
8.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於層析技術是離子交換層析、分子篩層析、疏水層析和親和層析中的一種或多種方法。
9.根據權利要求1所述的一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其特徵在於步驟(5)中酶切所用的酶是凝血酶或牛腸激酶。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其包括如下步驟(1)、黃麴黴尿酸氧化酶基因的獲得；(2)表達載體的構建及轉化大腸桿菌工程菌(3)、陽性克隆的篩選、培養、誘導表達(4)、融合蛋白的分離、純化(5)、融合蛋白的酶切、純化，其中所述的表達載體質粒是pET系列載體質粒，本發明一種重組黃麴黴尿酸氧化酶的製備方法，其表達方案簡單，表達量高，純化工藝簡單，收率高，表達產物可溶，不需要復性，直接用層析方法進行純化，純化收率大大提高，適合大規模製備。
文檔編號C12N9/02GK1690197SQ200410017948
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月27日 優先權日2004年4月27日
發明者劉國安, 方永強, 張玉良 申請人:杭州北鬥生物技術有限公司