鑑定生物藥物中與免疫原性相關表位的方法

2023-07-19 15:32:56 3

專利名稱：鑑定生物藥物中與免疫原性相關表位的方法
促成生物療法免疫毒性的一個方面是其免疫原性。具有免疫原性的生物藥物在臨床試驗中會產生導致效力喪失和不利事件如過敏反應、輸液反應或自身免疫性的抗體。產生免疫原性的可能性取決於蛋白質藥物序列中T細胞表位的存在。本發明涉及在誘導生物藥物(例如抗體或其它治療性蛋白質)免疫原性中起因果作用的表位的體外鑑定方法。更加具體而言，本發明的方法可用於鑑定經樹突狀細胞(其激發導致免疫原性的免疫反應)的肽受體遞呈的免疫原性肽的序列。對免疫原性表位的認識使得可以通過定點誘變降低治療性多肽的風險，其目的在於產生無免疫原性生物藥物。
本發明涉及用於鑑定可能賦予蛋白質免疫原性表位的方法。迄今為止，所用的方法依賴計算機(in silico)預測算法、T細胞活化分析或動物接種模型中重疊的成肽的體外篩選。該方法基於從經各個藥物蛋白質負載的人樹突狀細胞中分離免疫原性肽以及對該藥物蛋白質潛在T細胞表位序列的鑑定。本發明方法可用於鑑定工程化多肽、抗體或其它治療性蛋白質中含有的免疫原性表位。
幾乎任何治療性蛋白質在臨床試驗中呈現一定程度的免疫原性。免疫原性的初次激發為CD4+T淋巴細胞在對各個治療性蛋白質的肽片段識別基礎上的活化。這些肽稱作「T細胞表位」，或簡稱作「表位」。
只有當T細胞表位由主要組織相容性複合物(MHC)編碼的分子遞呈時才能實現CD4+T細胞的活化。在人體中，MHC分子稱為人白細胞抗原(HLA)。HLA結合肽較短，包含9-25個胺基酸(Kropshofer，H.和Vogt，A.B.，Immunol Today 18(1997)77-82)。
根據其功能，可區分兩類MHC-肽複合物(Germain，R.，Cell 76(1994)287-299)(i)MHC I類-肽複合物可由幾乎所有的有核細胞表達，以吸引可裂解感染細胞或腫瘤細胞的CD8+細胞毒性T細胞，(ii)MHC II類-肽複合物僅僅在所謂的抗原遞呈細胞(APC)上組成型表達，例如B淋巴細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞(DC)。具體而言，DC具有使CD4+T輔助細胞致敏的能力從而啟動免疫原性(Banchereau，J.和Steinman，R.M.，Nature 392(1998)245-254)。
因此，用於鑑定治療性蛋白質中免疫原性熱點的本創新方法為使用經選擇生物藥物負載的DC並確定與DC上的MHC II類分子結合的肽的序列。為了以適用於全部人群的方式確定生物藥物的潛在免疫原性，不得不使用來自一系列供血者的DC，其代表著各個群體MHC II類基因型的多樣性。
本發明提供用於分離和鑑定源自藥物蛋白質的飛摩爾量潛在免疫原性肽抗原的方法。所述方法涉及治療性蛋白質(如多肽、單克隆抗體或其它蛋白質)的免疫原性監測。本發明方法的優勢在於可通過從健康供體常規量外周血獲得的少量樹突狀細胞來對所結合和/或遞呈肽進行鑑定。所述方法可以確保所分離和鑑定的免疫原性肽是由DC在遇到治療性蛋白質時體內天然加工和遞呈的那些肽。
方法本發明提供用於分離和鑑定賦予生物藥物在施用於人之後具有免疫原性的肽的方法。本方法提供0.1至5μg量、優選0.2至3μg量的肽受體與潛在免疫原性肽的複合物。該量與正常情況下從獲自病人或健康供體外周血的DC細胞可得到的物質的量相當。現有技術中需要的物質最低量為約200μg的源自非限制性來源(近交系小鼠)的MHC II類分子(Dongre A R等，EJI 2001，31，1485-94)。這比從人外周血獲得的物質高兩個數量級。
具體地，本發明提供用於鑑定與免疫原性有關的肽的方法，其包括步驟a)提供以0.1-5μg、優選0.2-3μg的量表達抗原遞呈受體(APR)的細胞，
b)將來自(a)的細胞與免疫原性肽源接觸，c)從細胞分離APR-免疫原性肽複合物，d)從APR洗脫所結合的肽，e)鑑定免疫原性肽，f)鑑定為表位的免疫原性肽。
優選地，用於鑑定與免疫原性有關的肽的方法包括步驟a)提供以0.1-5μg、優選0.2-3μg的量表達抗原遞呈受體(APR)的細胞，b)將來自(a)的細胞與免疫原性肽源接觸，c)通過免疫沉澱或免疫親合層析從細胞分離APR-免疫原性肽複合物，d)用水或低鹽緩衝液洗滌ARP與抗原性肽的結合複合物，e)從APR洗脫所結合的肽，f)鑑定免疫原性肽，g)驗證被鑑定為表位的免疫原性肽。
優選地，抗原遞呈受體是MHC II類分子。
此外，本發明提供降低多肽免疫原性的方法，其包括a)如上所述鑑定多肽的免疫原性肽，b)修飾多肽的相應表位，以降低或消除APR分子的結合，c)由此產生具有降低免疫原性潛能或無免疫原性潛能的突變多肽。
本文所用的術語「多肽」指相連的胺基酸鏈。
本文所用的術語「免疫原性」指能激起針對物質的免疫應答的物質特性。對該物質能力的測量在於激發針對其的免疫應答。
本文所用的術語「免疫原性潛能」指多肽引發免疫應答的潛在能力。
本文所用的術語「免疫應答」指可識別入侵物質並產生抗該抗原特異性抗體的機體防禦反應。
為獲得例如100ng MHC II類分子所必需的組織或體液量依賴於表達MHC II類分子的細胞數量和MHC II類分子的表達速率如100ng MHCII類分子與來自約50ml血液的約2×105個成熟DC或5至10×106個外周血單核細胞或約5×107個外周血單個核細胞相當。
鑑定MHC II類分子結合肽所需的高靈敏度可以通過以下事實解釋，即這些肽受體的每一類型(如人MHC II類基因產物HLA-DR1)可攜帶約500至1000種不同的抗原肽(Chicz R M等，J Exp.Med.1993，178，27-47；Chicz R M和Urban R G，Immunol.Today，1993，15155-160)。然而，在500至1000種不同的肽當中，大多數僅達到很低的拷貝數，因此不太可能發揮生理作用。特別是在MHC II類中，那些免疫相關肽(如激活輔助T細胞並因此促進藥物蛋白質免疫原性的那些肽)可達到中等拷貝數至高拷貝數(Latek R R和Unanue E R，Immunol.Rev.1999，172209-228)。這些肽佔從MHC II類分子洗脫肽物質總量的約40％至50％，並等於約10至20種單個肽。
許多MHC II類分子結合肽代表著一組2-5個C末端和N末端截短變體(Rudensky A Y等，Nature 1992，359，429-431；Chicz等，Nature 1992，358764-768)，該些變體具有被T細胞受體識別所必需的大約10-13個胺基酸的共同核心序列。這些截短或延長的變體構成同一T細胞表位。這表示重要的不同表位的數目實際上更少，約5-70個不同的表位。因此免疫原性表位的豐度範圍為0.2％-5％。
肽的來源本發明的抗原肽是與人DC表面的MHC II類分子結合的肽。抗原肽可結合胞內或胞外MHC II類分子。本文所用的術語「免疫原性肽」指引發免疫應答的抗原肽。免疫原性肽源自與DC共孵育後的多肽。免疫原性肽可能來源的多肽是包括治療性多肽在內的多肽，例如細胞因子(即幹擾素、白細胞介素、促紅細胞生成素(EPO)、粒細胞/巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)或腫瘤壞死因子(TNF))、趨化因子、生長因子、抗體(即單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體或人源化)、酶、結構成分、激素和其片段。
由於所有這些肽受體能容納廣泛多樣的肽配體(參見上文)，所以必須要確定序列的每種單個肽僅有飛摩爾的量。1μg MHC II類分子(16pmol)可攜帶各種單個肽佔主要肽種類的0.1-2％(這等於約16-320飛摩爾)。本發明方法允許從0.1-5μg荷肽抗原遞呈受體分離飛摩爾量的這些潛在免疫原性肽並且隨後對它們測序。
抗原遞呈受體的來源本文所用的術語「抗原遞呈受體」或「APR」指結合抗原肽並將它們遞呈至其它免疫細胞並由此介導特異性體液免疫應答的肽受體。優選抗原遞呈受體是MHC II類分子。MHC II類分子包括但不限於HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP分子。備選地，起作用的APR是CD1家族的受體或其它迄今為止不明確的能向CD4+輔助T細胞遞呈潛在免疫原性肽的受體。
細胞材料的來源本發明方法包括表達抗原遞呈受體並同時使CD4+T細胞致敏或活化的所有細胞。這些細胞也稱為抗原遞呈細胞(APC)(Unanue，E.R.Macrophages，antigen presenting cells and the phenomena of antigenhandling and presentation.在Fundamental Immunology，第2版，(編者Paul，W.E)New York，Raven Press，1989)。所用的APC包括人B細胞、人巨噬細胞、優選人樹突狀細胞。除此之外，可使用含有APC的細胞混合物，例如外周血單個核細胞(PBMC)或外周血淋巴細胞(PBL)。
優選的APC是表達MHC II類分子的細胞。甚至更優選的APC是樹突狀細胞。
為了判斷多肽在特定人群中的免疫原性，使用一系列HLA型樹突狀細胞，HLA型代表了整個群體的HLA頻率。例如，為了在HLA-DR基因座的HLA多態性方面覆蓋高加索人群，必須用源自約15-20個HLA-DR基因型不同的血液供體的樹突狀細胞分析潛在免疫原性肽。
來自細胞的抗原遞呈受體的溶解作用為了純化來自細胞的抗原遞呈受體-肽複合物，必須將細胞膜溶解。用本領域公知方法實施細胞裂解，例如凍融和使用去汙劑及其組合。優選的裂解方法是用去汙劑溶解，去汙劑優選TX-100、NP40，n-辛基葡糖苷、Zwittergent、Lubrol、CHAPS、最優選TX-100或Zwittergent 3-12。通過離心從含有溶解的受體-肽複合物的細胞裂解液中去除細胞碎片和核。因此，在本發明另外的實施方案中，使用包括去汙劑溶解的方法將抗原遞呈受體與免疫原性肽的複合物從細胞中分離。
MHC-肽複合物的納級(Nano-Scale)純化此外，發明提供了通過包括免疫沉澱或免疫親合層析的方法從細胞裂解液中純化MHC-肽複合物。對於免疫沉澱或免疫親合層析，使用MHC II類分子特異的且適於這些方法的抗體。特異性抗體優選是單克隆抗體，並且是共價或非共價地(例如經蛋白A)與珠(如瓊脂糖凝膠珠或瓊脂糖珠)偶聯。現有技術中使用的一組抗-HLA抗體包括抗HLA-DR抗體L243、TU36、DA6.147，優選L243；抗HLA-DQ抗體SPVL3、TU22、TU169，優選TU22和TU169；抗HLA-DP抗體B7/21。
對不同MHC II類分子特異的單克隆抗體可商業獲得(如Pharmingen，Dianova)，或者使用蛋白A或蛋白G親合層析從各個雜交瘤上清中純化。純化的單克隆抗體可通過各種本領域公知方法偶聯，優選將抗體的氨基與CNBr-活化瓊脂糖凝膠共價偶聯。
通過在旋轉情況下將抗體-珠與細胞裂解液孵育幾小時，或通過泵送細胞裂解液經過微型柱的層析法，進行MHC分子的免疫分離。抗體-珠的洗滌在Eppendorf管或微型柱中進行。通過SDS-PAGE和使用識別變性MHC分子的抗體(抗HLA-DRα:1B5)進行蛋白質印跡來分析免疫沉澱的效果。
抗原遞呈受體結合肽的洗脫和分級分離將肽從受體分子上洗脫，得到源自潛在免疫原來源的或胞內和胞外來源多肽的天然加工肽的複雜混合物。只有在洗脫後，可能將肽分級分離並進行序列分析。
本文所用的術語「免疫原」指當導入體內時會激發免疫應答的任何多肽。
本發明方法中的免疫原性肽可通過本領域公知的多種方法洗脫，優選使用稀酸如稀乙腈(Jardetzky T S等，Nature 1991 353，326-329)、稀乙酸並加熱(Rudensky A Y等，Nature 1991，353，622-626；Chicz R M等，Nature 1992，358，764-768)或稀三氟乙酸並於37℃(Kropshofer H等，JExp Med 1992，175，1799-1803)洗脫。最優選地，在37℃用稀三氟乙酸洗脫肽。
在另外的實施方案中，在洗脫之前將分離的抗原遞呈受體-肽複合物用水或低鹽緩衝液洗滌，以除去殘留的去汙劑汙染物。低鹽緩衝液可以是0.5-10mM濃度範圍、優選0.5mM濃度的Tris緩衝液、磷酸鹽緩衝液或乙酸緩衝液。在更優選的實施方案中，抗原遞呈受體-肽複合物用常規用於HPLC分析的超純水(測序級)、優選用來自MERCK的超純水(測序級)進行洗滌。通過超濾實施洗滌步驟。在具有30kD、20kD、10kD或5kD、優選30KD截留分子量和0.5-1.0ml管體積的超濾管(「Ultrafree」管；Millipore)中進行超濾。在超濾管中用攜帶受體-肽複合物的珠的10-20倍體積、優選15倍體積洗滌4-12次、優選6-10次。使用相同超濾管從保留的抗原遞呈受體分子分離洗脫的肽。然後將洗脫的肽凍幹。通過液相層析質譜(LC-MS)分析肽序列。
在本發明另外的實施方案中，將所分離免疫原性肽分級分離、測序並鑑定。通過測序可知，在所分離的免疫原性肽混合物中各個肽的胺基酸序列可通過適於飛摩爾量肽測序的方法進行解析。通過鑑定可知，免疫原性肽源自哪個蛋白質或多肽以及它們構成這些蛋白質或多肽中的哪個序列。
在第一個步驟中，所洗脫肽的複雜混合物可通過多種可行層析法之一進行分級分離，如通過反相層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析或其組合。優選地，如MudPit所述(Washburn M P等，Nat Biotechnol.，(2001)，19，242-247)，通過C18反相層析或通過反相/陽離子交換二維HPLC實施分離。
可使用熔融石英微毛細管柱以HPLC方式進行分級分離，其中該微毛細管與質譜儀的納流電噴霧源相連，或與將級分點樣到用於MALDI分析的平板上的微分級分離裝置相連。
各種質譜技術是適宜的，優選MALDI-源後衰減(PSD)MS或電噴霧離子化串聯質譜(ESI-MS)，最優選離子阱ESI-MS。
可以通過本領域已知方法確定各個肽的序列。優選地，通過肽片段化以及使用例如MASCOT或SEQUEST的算法對片段譜進行計算機輔助解析來實現序列分析。兩種計算機算法均使用蛋白質和核苷酸序列資料庫以對實驗和理論產生的串聯質譜進行交叉相關分析。這允許進行自動化高通量序列分析。
通過MALDI質譜的定性肽分析為了對洗脫獲得的整個肽庫進行定性分析，開展了基質輔助雷射解吸和離子化飛行時間(MALDI-TOF)質譜分析。使用不對肽進行片段化的設置，MALDI-TOF分析提供關於肽混合物的複雜度和優勢肽存在的粗略概括。
定量肽分析為了評估從抗原遞呈受體洗脫的各個肽的數量，通過在214nm檢測波長下工作的流過UV檢測儀分析微毛細管柱的流過液。為了定量，將所分析肽的峰面積與合成的標準肽的分級數量的峰面積進行比較。
策略本發明策略預見，可以對已經負載到細胞培養APC的抗原遞呈受體上的免疫原性肽進行鑑定(體外方法，

圖1)。
在另外的實施方案中，本發明涉及與免疫原性有關的肽的鑑定方法，其包括步驟a)提供以0.1-5μg、優選0.2-3μg的量表達抗原遞呈受體(APR)的細胞，b)將細胞與免疫原性肽源接觸，c)從細胞分離APR-免疫原性肽複合物，d)從APR洗脫所結合的肽，e)鑑定免疫原性肽，f)驗證被鑑定為表位的免疫原性肽。
APR表達細胞可以是MHC II類表達細胞(APC)。優選地，APC是樹突狀細胞，更優選地，APC是未成熟的樹突狀細胞，最優選地，APC是由外周血單核細胞產生的未成熟的樹突狀細胞。
可從外周血單核細胞或從骨髓來源的CD34+幹細胞前體細胞產生樹突狀細胞。通過密度梯度離心從血樣分離外周血單個核細胞(PBMC)。然後通過本領域已知方法，如通過磁珠分選法，從PBMC分離單核細胞。樹突狀細胞源可以是哺乳動物物種，優選人。然後將單核細胞在細胞培養中分化形成未成熟的樹突狀細胞。通過流式細胞術分析(如細胞表面標記物CD83、CD80、CD86、HLA-DR的上調)監測分化狀態。
為獲得如100ng MHC II類分子所必需的細胞量依賴於表達MHC II類分子的細胞數和MHC II類分子的表達速率如100ng MHC II類分子與來自約50ml血液的約2×105個未成熟DC或5-10×106個外周血單核細胞或約5×107個外周血單個核細胞相當。然後將APC與治療性蛋白質源接觸。APC，優選未成熟的樹突狀細胞可通過本領域已知方法(如與炎性細胞因子、類TNFα或TNFα混合物、IL-6、IL-1β、PGE2共孵育)同時被激發成熟。
向APC提供的治療性蛋白質源選自非合成或合成蛋白質。對照APC除了不暴露於治療性蛋白質之外，它們進行相同處理(參照圖1)。
APC與多肽或其片段接觸，其中多肽或其片段可通過受體介導攝取或通過液相攝取和內化而被APC吸收。
通過從MHC分子洗脫肽，得到一組源自多肽或其片段的天然加工肽。該多肽可以是所選擇的治療性多肽或者是胞內來源(在不負載治療性多肽的情況況下由APC表達的自體蛋白質)或胞外來源(在不負載治療性多肽的情況下也存在的源自細胞培養基的蛋白質)的不相關多肽。
通過將從接觸潛在免疫原來源的細胞鑑定的肽，與從未接觸該來源的細胞鑑定的那些肽(對照)進行比較，鑑定分離的免疫原性肽。
MHC結合肽的表位驗證通過本發明方法鑑定的肽序列，可通過幾個標準之一(包括MHC結合基序、MHC結合能力和經CD4+淋巴細胞的識別)進行驗證。
MHC結合基序是特定MHC分子(等位變體)結合肽的共同結構特徵，其為與MHC分子形成穩定複合體所必需的。就MHC II類分子而言，因為肽結合槽的兩端開放，可結合肽長度為12-18個胺基酸和甚至更長的肽。在九聚體核心區包含相對位置P1、P4、P6、P9，多數HLA II類分子容納多達4個與結合有關的殘基，稱為「錨定殘基」。然而，該核心區在肽的N末端具有可變的長度。在多數情況中，2-4個N末端殘基位於核心區之前。因此，P1錨定殘基位於大多數HLA II類分子結合肽中的位點3、4或5。從HLA DR II類分子洗脫的肽共有一個大的疏水性P1錨，其為酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。
錨定殘基的位置和確切類型構成肽結合基序，其對於大多數常見HLA-DR II類等位基因產物是已知的。用於肽序列中基序確認的計算機算法是「Tepitope」，其可從www.vaccinome.com(由J.Hammer，Nutley，美國所提供)獲得。
通過本領域已知方法，使用例如分離MHC II類分子和具有與本發明方法所鑑定那些肽相同胺基酸序列的合成肽測試本發明方法所鑑定肽的MHC結合能力(Kropshofer H等，J.Exp.Med.1992；175，1799-1803；Vogt A B等，J.Immunol.1994；153，1665-1673；Sloan V S等，Nature 1995；375，802-806)。備選地，可以使用MHC II類表達細胞系和生物素化肽的細胞結合測定法證實所鑑定表位(Arndt S O等，EMBO J.，2000；19，1241-1251)。
在兩種測定法中，通過確定使標記報告肽的結合減少50％所需的濃度(IC50)來測量肽的相對結合能力。以適當親和力與相關HLA II類分子結合的肽的IC50值不超過已確認參考肽IC50值的10倍。
相同結合測定法可用於測試肽結合備選MHC II類分子的能力，備選MHC II類分子即使用本發明方法洗脫的那些分子以外的MHC II類分子。
使CD4+T細胞致敏的能力代表著最重要的表位驗證方法。該方法涉及測試本發明方法所鑑定肽激活CD4+T細胞群體的能力。合成具有與本發明方法鑑定的那些序列相同或者對應於源自本發明方法所鑑定嵌套組肽核心序列的胺基酸序列的肽。然後在可表達目的MHC II類分子的自體樹突狀細胞的環境中測試合成肽激活CD4+的能力。
通過本領域已知的各種體外方法測定CD4+T細胞應答。例如，在有或無候選合成肽存在情況下培養全外周血單個核細胞(PBMC)並通過例如[3H]-胸腺嘧啶向其DNA的摻入測定其增殖性反應。增殖性T細胞為CD4+T細胞這一情況可通過在分析前從PBMC中除去CD4+T細胞或者通過加入結合T細胞上CD4+分子的抑制性抗體(由此抑制CD4+細胞增殖)而測試。在兩種情況中，只有當CD4+T細胞是增殖性細胞時，增殖性反應會被抑制。或者，可從PBMC純化CD4+T細胞，並在表達合適MHC II類分子的APC存在情況下測試對肽的增殖性反應。所述的APC可以是B-淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞或所有PBMC。APC也可以是源自B-淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞的永生化細胞系。APC內源表達目的MHC II類分子，或者表達編碼該分子的轉染多核苷酸。在所有情況中，可通過例如電離輻射或絲裂菌黴C處理而使APC在分析前為非增殖性的。
作為測定細胞增殖的備選方法，可通過本領域技術人員已知方法測定由CD4+T細胞所產生的細胞因子。細胞因子包括但不限於白細胞介素-2(IL-2)、幹擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、TNF-α、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-12(IL-12)或TGF-β。測定它們的分析法包括但不限於ELISA、ELISPOT和生物測定法，其中在所述生物測定法中，在測試樣品存在下測試對相關因子作出響應的細胞的反應性(例如增殖)。
應用本發明方法可用於鑑定任何生物藥物，特別是具有下列情況的藥物中與免疫原性有關的肽，所述情況即由於中和性抗藥物抗體而導致不可接受的效力喪失或者臨床試驗中副作用或嚴重副作用被認為是依賴於免疫原性的。
所鑑定的免疫原性肽還用於消除各種(治療性)多肽具有免疫原性的風險。通過與MHC II類分子結合至關重要的一個或多個關鍵錨定殘基的交換，從而產生具有降低或沒有免疫原性潛能的突變的治療性多肽而實現風險消除。備選地，可以將對CD4+T細胞上的T細胞受體識別至關重要的殘基進行交換。
用於對MHC II類分子結合至關重要錨定殘基進行交換的方法是本領域眾所周知的，即通過丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸或帶電殘基取代HLA-DR1-限制性T細胞表位的P1錨點(參照Kropshofer等，EMBO J.15，6144-6154；1996)。
本發明方法可用於減少通過計算機表位預測算法所鑑定的表位數量。預測規則傾向於過多預測治療性多肽中含有的表位數量。此種過多預測的結果是對所預測的大量表位進行風險消除會導致在下列情況下生物活性的喪失，即某些序列延伸賦予了生物活性和免疫原性的那些情況。由於本發明鑑定的是天然遞呈的肽表位，其經歷了MHC結合位點的競爭並通過APC內部的肽編選者HLA-DM的質量控制，所以本文所用的方法將潛在表位數量減少至合理的較少數量。降低表位數的風險消除更可能保留治療性多肽的生物活性。
現已概述了本發明，通過參考具體實施例連同下列附圖可以更好地理解本發明，除非另外指出，本文包含的實施例僅用於解釋的目的而不旨在限制本發明。
附圖簡述圖1顯示研究源自加至人樹突狀細胞的治療性多肽的天然加工MHCII類結合肽表位的方法學圖解。
圖2顯示通過計算機預測算法TEPITOPE鑑定的和涉及樹突狀細胞的體外方法鑑定的OKT3來源肽表位的比較。預測了對於HLA-DRB1等位基因*0301、*0401、*0701和*1101的潛在T細胞表位，如蛋白質序列上面小的黑色矩形所示。用於TEPITOPE分析的閾值設定為1-4％。省略了未加工的OKT3輕鏈的信號肽。通過體外細胞技術所鑑定的表位用OKT3序列中的數字和框標記。
圖3顯示通過合成的OKT3來源肽#1-4活化CD4+T細胞的圖示。T細胞活化強度通過刺激指數(SI)表示。用於刺激(每種10μM)的肽序列如下#1，OKT3-lc 98-113，GSGTKLEINRADTAPT；#2，OKT-lc143-158，INVKWKIDGSERQNGV；#3，OKT3-hc 194-209，WPSQSITCNVA HPASS；#4，OKT3-lc 164-183，DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDE。用各個肽和成熟樹突狀細胞重刺激T細胞一次(B)或兩次(A，C)。每張圖上方顯示所採用樹突狀細胞和T細胞的HLA-DRB1基因型。誤差條表示從3次獨立試驗獲得的SD。將不加入肽的情況下的平均SI調整為1.0。使用了具有下列DRB1單體型的供體細胞*0401/*0701(A)、*0301/*1501(B)和*1001/*1201(C)。
實施例下列實施例與上述附圖結合，並以圖1中概括的方法學為基礎並在以下詳細描述。除非另外指明，實施例中所指的商業可得的試劑根據製造商的說明書使用。
本發明的方法學細胞系和培養如下所述，使用從單核細胞分化而來的人樹狀細胞開展研究。從人外周血純化單核細胞。所有細胞在補充1mM丙酮酸、2mM穀氨醯胺和10％熱滅活胎牛血清(Gibco BRL，Rockville，Md.)的RPMI 1640培養基(縮寫RPMI)中培養。
外周血單個核細胞(PBMC)的分離從作為來自健康供體的標準血沉棕黃層製劑的當地血庫獲得外周血。使用肝素(200I.U./ml血，Liquemine，Roche)以防止凝固。在LSM(1.077-1.080g/ml；ICN，Aurora，Ohio)中以800g(室溫)離心30分鐘以分離外周血單個核細胞(PBMC)。從中間相收集PBMC並在含有20mM Hepes的RPMI中洗滌兩次(500g，15分鐘；300g，5分鐘)。為了除去紅血球，用ALT緩衝液(140mM氯化銨，20mM Tris，pH 7.2)在37℃處理PBMC 3分鐘。用含有20mM Hepes的RPMI洗滌PBMC兩次(200g，5分鐘)。
外周血單核細胞的HLA分型用於分離單核細胞和分化成樹突狀細胞的PBMC的HLA-DR基因型通過Roche Molecular Systems(Alameda，CA，美國)確定。
樹突狀細胞從外周血單核細胞的產生根據製造商的方法，使用抗CD14磁珠(Miltenyi Biotech，Auburn，Calif.)的陽性分選法，從PBMC分離單核細胞。在補充1％非必需胺基酸(Gibco，BRL，Rockville，Md.)、50ng/ml重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF；S.A.1.1×107U/mg)(Leucomax；Novartis，Basel，瑞士)以及3ng/ml重組人IL-4(S.A.2.9×104U/mg)(RD Systems，Minneapolis，Minn.)的RPMI中培養單核細胞。將單核細胞以0.3×106/ml接種於6孔平板(Costar)中培養5天以獲得未成熟的樹突狀細胞。
通過流式細胞術分析常規監測單核細胞來源的未成熟樹突狀細胞的質量，未成熟樹突狀細胞符合下列表型CD1a(高)、CD3(陰性)、CD14(低)、CD19(陰性)、CD56(陰性)、CD80(低)、CD83(陰性)、CD86(低)和HLA-DR(低)。與此相反，成熟樹突狀細胞(參照以下)呈現下列表型CD1a(低)、CD80(高)、CD83(高)、CD86(高)和HLA-DR(高)。抗CD1a、CD3、CD14、CD19、CD56、CD80、CD83、CD86的單克隆抗體以及各自的同種型對照可從Pharmingen(San Diego，Calif.)購買。
樹突狀細胞暴露於治療性多肽為促使樹突狀細胞攝取藥物蛋白質，將6×106個未成熟樹突狀細胞暴露於5-50μg生物藥物中。同時，加入10ng/ml重組人腫瘤壞死因子(TNFαS.A.1.1×105U/mg)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，6×106的樹突狀細胞只和TNFα孵育(圖1)。
共培養24-48小時後，通過以300g離心10分鐘收集成熟樹突狀細胞。細胞用含有10％FCS的RPMI洗滌，並轉移至eppendorf管中。400g離心3分鐘後，徹底除去上清液並將細胞凍存於-70℃。
抗HLA II類分子珠的產生抗HLA-DR單克隆抗體(mAb)L243(ATCC，Manassas，Va.)通過培養各個小鼠雜交瘤細胞系產生。根據製造商的方法，使用蛋白A瓊脂糖凝膠(Pharmacia，Uppsala，瑞典)純化mAb L243，並以終濃度2.5mg/ml固定於CNBr活化的瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)。L243珠儲存於含有0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem，La Jolla，Calif.)的PBS中。
HLA-DR-肽複合物的納級純化將冷凍的樹突狀細胞沉澱重懸於10倍體積的冰冷裂解緩衝液(1％Triton-X-100，20mM Tris、pH 7.8，5mM MgCl2，含有蛋白酶抑制劑chyrnostatin、抑胃酶肽、PMSF和亮抑蛋白酶肽(Roche，Mannheim，德國)，並在水平振蕩器中於4℃下以1000轉/分裂解1小時。通過於4℃下以2000g離心10分鐘，去除細胞裂解液中的細胞碎片和核。裂解液與L243珠(每100μl細胞裂解液使用5-10μl L243珠)在水平振蕩器中於4℃下以1000轉/分共孵育2小時。結合到L243珠上的免疫沉澱的HLA-DR-肽複合物通過於4℃下以2000g離心5分鐘進行沉澱，並用300μl溶於PBS的0.1％Zwittergent 3-12(Calbiochem)洗滌三次。
通過在免疫沉澱之前和之後分析各個細胞裂解液監測HLA-DR-肽複合物的損耗效率。同時，使用抗HLA-DRα特異性mAb 1B5(Adams，T.E.等，Immunology 50(1983)613-624)通過蛋白質印跡法分析等份小珠。
HLA-DR結合肽的洗脫結合於L234珠上的HLA-DR-肽複合物重懸於400μl H2O(HPLC級；Merck，Darmstadt，德國)，轉入30kD截留分子量的超濾管UltrafreeMC(Millipore，Bedford，Mass.)中，並用400μl H2O(HPLC級)通過於4℃下以14000轉/分離心2-4分鐘洗滌10次。為了洗脫結合肽，加入50μl含0.1％三氟乙酸(Fluka，Buchs，瑞士)的H2O(HPLC級)，並於37℃孵育30分鐘。通過將超濾管以14000轉/分室溫離心3分鐘將洗脫的肽收集到一新eppendorf管中，並立即在Speed-Vac真空離心機中凍幹。
肽通過納-HPLC的分級分離從HLA-DR分子洗脫的凍幹肽溶於含0.05％三氟乙酸、5％乙腈(Merck，Darmstadt，德國)的H2O(HPLC級)中，並在連接於FAMOS自動取樣器和ULTIMATE納流HPLC(Dionex，Olten，瑞士)的75μm×15cmC18 PepMap毛細管(C18；3μm；100)(LC-Packings，Amsterdam，荷蘭)上分離。使用200nl/分鐘的恆定流速的下列非線性梯度在0-40分鐘運行5-50％的系統B；在40-50分鐘運行50-90％的系統B。系統A為0.05％三氟乙酸、5％乙腈/H2O，系統B為0.04％三氟乙酸、80％乙腈/H2O。通過在214nm和280nm的雙重UV吸收，監測分離情況。使用級分收集器PROBOTT(BAI，Weiterstadt，德國)收集級分(400nl)，並點樣在AnchorChip 600/384 MALDI-MS靶(Bruker，Bremen，德國)上。肽通過離子阱MS/MS質譜的序列分析為對複雜的肽混合物進行高通量測序，使用了MudPIT(多維蛋白質鑑定技術)(Washburn M P等，Nat Biotechnol 19(2001)，242-247)，MudPIT基於液相層析分級分離及隨後的質譜測序。
為此，從HLA分子洗脫的凍幹肽重懸浮於含有5％(v/v)乙腈、0.5％(v/v)乙酸、0.012％(v/v)七氟丁酸(HFBA)和5％(v/v)甲酸的緩衝液中。樣品在由Model P-2000雷射拉出器(Sutter Instrument Co.，Novato，Calif.)產生的熔融石英微毛細管柱(100μm內徑×365μm)上分離。微柱用3μm/C18反相材料(C18-ACE 3μm[ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS，Leonberg，德國])繼之以3cm的5μm陽離子交換材料(PartisphereSCX；Whatman，Clifton，N.J.)填充。
使用下列緩衝液，在Agilent 1100系列HPLC(Agilent Technologies，Waldbronn，德國)上實施完全自動化的8步驟梯度分離5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩衝液A)、80％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩衝液B)、250mM醋酸銨/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩衝液C)以及1.5M醋酸銨/5％ACN/0.02％HFBA/0.5％乙酸(緩衝液D)。第一步驟(106分鐘)為100分鐘的0至80％緩衝液B梯度和保持6分鐘的80％緩衝液B。接著的6個步驟(每個步驟106分鐘)為5分鐘的100％緩衝液A、2分鐘的x％緩衝液C、5分鐘的100％緩衝液A、3分鐘的0至10％緩衝液B梯度、55分鐘的10至35％緩衝液B梯度、20分鐘的35至50％緩衝液B梯度、16分鐘的50至80％緩衝液B梯度。下列是步驟2-7中2分鐘緩衝液C百分數(x)10、20、30、40、70、90和100％。步驟8為5分鐘的100％緩衝液A洗滌、用100％緩衝液D進行20分鐘的鹽水洗滌以及100分鐘的0-80％緩衝液B梯度。
HPLC柱與裝備有納-LC電噴霧電離源的Finnigan LCQ離子阱質譜儀(Finnigan，Bremen，德國)直接連接。根據製造商的方法，以MS-MS模式實施質譜分析。通過對swiss fasta資料庫進行SEQUEST算法來鑑定肽。通過TEPITOPE進行潛在表位的計算機預測通過使用TEPITOPE算法實現潛在T細胞表位的預測。應用下列檢索標準閾值(對於最佳分值為1-3％，對於中等分值天然配體為4-6％)、肽長度(15個胺基酸殘基)和混雜性(預測結合9個等位基因中的至少6個)。為了確定混雜性程度，選擇下列9個在高加索人群中頻繁出現的等位基因HLA-DRB1*0101、*0301、*0401、*0701、*0801、*1101、*1305、*1501和DRB5*0101。在表位檢索中不包括跨膜結構域和信號肽。
T細胞活化分析使用來自Miltenyi Biotech(Auburn，CA，美國)的CD4+T細胞分離試劑盒通過陰性選擇從新鮮PBMC製備CD4+T細胞。T細胞群體純度＞75％並且通過臺盼藍染色(Sigma-Aldrich)判斷存活率＞95％。T細胞以2×106細胞/ml重懸浮於AIM V培養基(Gibco BRL，Rockville，MD)。如所述從PBMC中分化出樹突狀細胞(DC)，並在完全的Macrophage-SFM培養基(Gibco BRL，Rockville，MD)中培養。在第4天，用10μg/ml的LPS(Sigma-Aldrich)刺激未成熟的DC。在第6天，將成熟DC洗滌，並以2×105細胞/ml重懸於AIMV培養基。對於共培養，將AIMV培養基中0.1ml的CD4+T細胞(2×105)和0.1ml的自體DC(2×104)在圓底96孔板中混合。分別以20μg/ml和1μg/ml的終濃度加入OKT3mAb和Inflexal V。加入合成肽至20μM終濃度。每一抗原以一式三份進行測定。在共培養的第5天，每孔加入10μM的5-溴-2』-脫氧尿苷(BrdU)(Roche，Basel，瑞士)。孵育24小時後，收集培養物並根據製造商的方法進行處理。未添加抗原的培養物中T細胞增殖作為參照，將其平均刺激指數(SI)設為1。
為了重刺激T細胞，將未成熟的DC(2-3×106/ml)於50％AB血清(Sigma-Aldrich)、40％RPMI和10％DMSO(Sigma-Aldrich)中在-70℃下冷凍。在重刺激的時間點，將DC解凍、洗滌並在10μg/ml LPS存在下培養兩天。在DC/T細胞共培養的第5天(第1次重刺激)或第10天(第2次重刺激)，在將0.1ml ATM V中的解凍成熟DC(2×104)與新鮮蛋白質或肽抗原共培養之前，從每個樣品孔取出0.1ml AIM V培養基。以終濃度100U/ml加入IL-2(Pharmingen，San Diego，CA)。
實施例1OKT3是第一個治療性抗體。它在1986年得到FDA批准。它是CD3特異的小鼠IgG2a抗體，並作為移植(L.Chatenaud，2003)、I型糖尿病(E.Masteller和J.Bluestone，2002)和銀屑病(T.Udset等，2002)中的免疫抑制藥物廣泛用於臨床。儘管OKT-3誘導的免疫抑制反應是深遠的，但出現對異種蛋白質的抗OKT3反應是早期臨床試驗中主要缺陷之一，其促進OKT-3的快速清除和中和(G.Goldstein，1987)。據報導在涉及OKT3治療個體研究中，免疫原性的發生頻率粗略計算為85％(C.Pendley等，2003)。
圖1中描述的策略用於鑑定由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0401/1302的樹突狀細胞遞呈的OKT3的肽表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0401/1302限制性OKT3表位，將表達HLA-DRB1*0401/1302基因型的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時，通過加入TNFα(10ng/ml)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0401/1302結合配體的序列分析揭示了OKT3來源表位，其表現為來自OKT3的7個肽序列(表1)。兩個表位源自κ輕鏈，一個表位位於重鏈。在至少2個獨立試驗中發現了與單體型DRB1*0401/1302相關的三個表位。
表位#1呈現為15-mer和16-mer的肽，其中15-mer肽是源自輕鏈恆定區99-113(表1)。表位#1包含DRB1*1302相關共顯性DRB3等位基因DRB3*0301的錨定基序(F.Verreck等，1996)作為P1錨的L-103，作為P4錨的N-106，作為P6錨的A-108和作為P9錨的A-111。如TEPITOPE算法所示，相同的錨定殘基具有結合DRB1*0401的性能(圖2)。通過誘導CD4+T細胞增殖的潛能證實表位#1是T細胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹突狀細胞環境中表位#1是刺激性的。
表位#2呈現為4種長度變體13-mer、14-mer、15-mer和16-mer的肽。該表位也源自輕鏈亞基的恆定區(表1)。通過TEPITOPE算法預測出在DRB1*0401情況下的表位#2(圖2)，表位#2含有下列錨定基序作為P1錨的W-147、作為P4錨的D-150、作為P6錨的S-152。在T細胞活化分析中，表位#2在基因型DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的情況下刺激T細胞的增殖。然而，它在基因型DRB1*1001/*1201的情況下不刺激T細胞增殖。在從EBV轉化的B細胞系(Friede等，1996)中得到的DRB1*0401等位基因的情況下描述表位#2的同源的人序列。
表位#3僅呈現為一種長度變體源自OKT3重鏈恆定區194-210的17-mer(表1)。與表位#1類似，表位#3含有DRB3等位基因DRB3*0301的錨定基序作為P1錨的I-199、作為P4錨的N-202、作為P6錨的A-204和作為P9錨的A-207。儘管TEPITOPE算法沒有預測出對於DRB1*0301、*0401、*0701或*1101的表位#3(圖2)，但表位#3在所測試的全部3種DRB1基因型的情況下能活化T細胞(圖3)。已有描述，相同表位與鼠MHC II類分子H2-A(s)結合(Rudensky等，1992)。
當應用TEPITOPE算法預測基因型為DRB1*0401/1302情況下OKT3κ輕鏈的表位時，僅能對DRB1*0401進行一種預測，因為該算法沒有包括其它等位基因(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預測出11個表位，然而它們當中僅有兩個是天然加工的肽表位，表現為表位#1和#2(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預測出13個表位，然而它們當中沒有一個包含表位#3(圖2)。
實施例2圖1中略述的策略也用於鑑定由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0701/1601的樹突狀細胞所遞呈的OKT3肽表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0701/1601限制性OKT3表位，將表達HLA-DRB1*0701/1601基因型的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時，通過加入TNFα(10ng/ml)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0701/1601結合配體的序列分析揭示一個OKT3來源的表位，其表現為源自OKT3的10個肽序列(表2)。表位#4源自κ輕鏈，並在至少2個獨立試驗中被發現。
表位#4呈現為10種長度變體(15-22-mer)肽，其中15-mer源自輕鏈恆定區168-182(表2)。表位#4包含DRB1*0701等位基因的錨定基序作為P1錨的Y-172、作為P4錨的S-175、作為P6錨的T-177和作為P9錨的L-180。如TEPITOPE算法所示，相同的錨定殘基具有結合DRB1*0401和DRB1*1101的性能(表2)。通過誘導CD4+T細胞增殖的潛能證實表位#1是T細胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹突狀細胞情況下表位#4是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情況下它不能活化T細胞。
最近在牛系統中報導了表位#4，所述牛系統為從血液單個核細胞得到的且表現為牛等位基因DRB3*2703(Sharif等，2002)。
當應用TEPITOPE算法預測基因型DRB1*0701/*1601情況下OKT3κ輕鏈的表位時，僅針對DRB1*0701進行預測，因為該算法不包括DRB1*1601等位基因(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預測出5個表位，然而僅僅一個是天然加工肽表位，表現為表位#4(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預測出8個表位，然而經過對天然存在肽進行分析，它們當中沒有一個得到支持(圖2)。
實施例3圖1中略述的策略用於鑑定OKT3中被HLA-DR基因型HLA-DRB1*1101/1202限制性T細胞所識別的肽表位。
為了鑑定HLA-DRB1*1101/1202限制性OKT3表位，將表達基因型HLA-DRB1*1101/1202的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時，通過加入TNFα(10ng/ml)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*1101/1202結合配體的序列分析揭示了2個OKT3來源的表位，#1和#3，表現為來自OKT3的6個肽序列(表3)。一個表位源自κ輕鏈，另一個表位位於重鏈。在至少2個獨立試驗中，發現了與單體型DRB1*1101/1202相關的兩個表位。
表位#1呈現為與上述基因型DRB1*0401/*1302情況下相同的15-mer和16-mer肽(參照表1和3)。表位#1包含DRB1*1101等位基因的錨定基序作為P1錨的L-103、作為P6錨的A-108和作為P9錨的A-111。通過誘導CD4+T細胞增殖的潛能證實表位#1是T細胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹突狀細胞情況下表位#1是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情況下它不能活化T細胞。
來自OKT3重鏈恆定區的表位#3(表1、3)呈現為4種長度變體194-207的14-mer、194-208的15-mer、194-210的17-mer和194-211的18-mer (表3)。儘管TEPITOPE算法針對DRB1*1101或1202沒有預測出表位#3(圖2)，但表位#3在測試的全部3種DRB1基因型情況下可活化T細胞(圖3)。
當應用TEPITOPE算法預測基因型為DRB1*1101/1202情況下OKT3κ輕鏈的表位時，僅針對DRB1*1101進行預測，因為該算法不包括其它等位基因(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預測出6個表位，然而僅僅一個表位是天然加工肽表位，表現為表位#1(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預測出9個表位，然而它們當中沒有一個包括表位#3(圖2)。
實施例4圖1中略述的策略也用於鑑定OKT3中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0301/0401的樹突狀細胞遞呈的肽表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0301/0401限制性OKT3表位，將表達基因型HLA-DRB1*0301/0401的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的抗體OKT3中。同時，通過加入TNFα(10ng/ml)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏OKT3但存在TNFα的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0301/0401結合配體的序列分析揭示了一個OKT3源的表位，呈現為源自OKT3的1個肽序列(表4)。表位#2來自κ輕鏈並在至少2個獨立試驗中被發現。
表位#2呈現為源自輕鏈恆定區143-159的17-mer肽(表4)。如上所述(實施例1)，表位#2包含DRB1*0401等位基因的錨定基序作為P1錨的W-147、作為P4錨的D-150、作為P6錨的S-152。如TEPITOPE算法所示，相同錨定殘基具有結合DRB1*0301的性能(圖2)。通過誘導CD4+T細胞增殖的潛能證實表位#2是T細胞表位在基因型為DRB1*0401/*0701(圖3B)和DRB1*0301/*1501(圖3C)的樹突狀細胞情況下表位#2是刺激性的。然而，在基因型DRB1*1001/*1201的情況下表位#2不能活化T細胞。
應用TEPITOPE算法在基因型為DRB1*0301/*0401的情況下預測OKT3κ輕鏈的表位(圖2)。TEPITOPE在κ輕鏈中預測出12個表位，然而它們當中僅僅一個是在天然加工肽表位，表現為表位#2(圖2)。同樣，TEPITOPE在OKT3重鏈中預測出18個表位，然而經過對天然存在肽進行分析，它們當中沒有一個得到支持(圖2)。
實施例5目前幹擾素-β(IFN-β)是治療多發性硬化的首要療法(Deisenhammer等2000)。目前有三種不同的IFN-β製劑投放市場Avonex、Rebif(二種均為IFN-β-1a)和Betaseron(IFN-β-1b)。其中Betaseron是第一個投放市場的，由FDA根據加速批准程序於1993年批准。與Avonex和Rebif相比，Betaseron具有異常免疫原性。用Betaseron治療後，多達28-47％的病人產生抗IFN-β的中和抗體，然而在Avonex治療的病人中僅2-6％產生中和性抗藥物抗體(Deisenhammer等，2000；Bertolotto等，2004)。在該情況中，應當指出Avonex和Rebif是在中國倉鼠卵巢細胞中表達的，其為具有天然胺基酸序列的糖基化蛋白質，然而Betaseron是在大腸桿菌(E.Coli)中表達的，其為具有Met-1缺失和第17位由Cys變成Ser的點突變的非糖基化形式(Mark等，1984；Holliday和Benfield，1997)。迄今為止不清楚這些差異是否是造成免疫原性不同的原因。
圖1中略述的策略用於鑑定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0101/0701的樹突狀細胞所遞呈的表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0101/0701限制性IFN-β-1b表位，將表達基因型HLA-DRB1*0101/0701的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時，通過加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0101/0701結合配體的序列分析揭示了一個IFN-β-1b來源的表位，表位#5，其表現為源自IFN-β-1b的3個肽序列(表5)。在基因型DRB1*0101/1401的環境下也發現與基因型DRB1*0101/0701相關的表位#5(參照表8)。
表位#5呈現為13-mer、16-mer和17-mer的肽，其中13-mer源自蛋白質區44-60(表5)。表位#5包含下列錨定基序作為P1錨的F-49、作為P4錨的E-52、作為P6錨的A-54和作為P9錨的T-57。與此相一致，在體外結合分析中證明包含表位#5的15-mer的肽對HLA等位基因DRB1*0101具有強結合能力(Tangri等，2005)。
實施例6圖1中略述的策略用於鑑定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0101/1404的樹突狀細胞遞呈的表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0101/1404限制性IFN-β-1b表位，將表達基因型HLA-DRB1*0101/1404的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時，通過加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0101/1404結合配體的序列分析揭示了2個IFN-β-1b來源的表位，#6和#7，其表現為源自IFN-β-1b的24個肽序列(表6)。在基因型DRB1*0801的情況下也發現了表位#6(表7)。在基因型DRB1*0801(表7)、DRB1*0101/1401(表8)和DRB1*1303/1501(表9)的情況下也發現了表位#7。
表位#6呈現為22種長度變體(11-19-mer)，其中11-mer源自蛋白質區89-99(表6)。表位#6包含下列錨定基序作為P1錨的Y-91、作為P4錨的I-94、作為P6錨的H-96和作為P9錨的T-99。如TEPITOPE算法預測，這些錨定殘基具有結合HLA等位基因DRB1*1101和DRB1*0801的能力。儘管已經顯示包含表位#6的15-mer肽能夠結合DRB1*0701，但沒有證據證明在該HLA情況下能夠使T細胞活化(Barbosa等，2005)。
表位#7呈現為13-mer和15-mer肽，其中13-mer源自蛋白質區149-161(表6)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。也已經顯示包含表位#7的15-mer肽是對HLA等位基因DRB1*0101、DRB1*1101和DRB1*1501具有強結合能力的不加選擇的結合物(Tangri等，2005)。此外，已經描述包含表位#7的肽庫在DRB1*0701背景下誘導T細胞活化(Barbosa等，2005)。
實施例7圖1中略述的策略用於鑑定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型HLA-DRB1*0801/0801的樹突狀細胞遞呈的表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0801/0801限制性IFN-β-1b表位，將表達基因型HLA-DRB1*0801/0801的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時，通過加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0801/0801結合配體的序列分析揭示了2個IFN-β-1b來源的表位，其表現為源自IFN-β-1b的22個肽序列(表7)。在至少2個獨立試驗中發現與基因型DRB1*0801/0801相關的兩個表位。
表位#6呈現為17種長度變體(11-18-mer)，其中11-mer源自蛋白質區89-99(表7)。如上所述，對於DRB1*1101/1404表位#6包含下列錨定基序作為P1錨的Y-91、作為P4錨的I-94、作為P6錨的H-96和作為P9錨的T-99。如TEPITOPE算法所預測，這些錨定殘基具有結合HLA等位基因DRB1*1101和DRB1*0801的能力。
表位#7呈現為下列5種長度變體151-161的11-mer、149-161的13-mer、149-162的14-mer、148-161的14-mer和147-161的15-mer(表7)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。
實施例8圖1中略述的策略用於鑑定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*0101/1401的樹突狀細胞遞呈的表位。
為了鑑定HLA-DRB1*0101/1401限制性IFN-β-1b表位，將表達基因型HLA-DRB1*0101/1401的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時，通過加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*0101/1401結合配體的序列分析揭示了2個IFN-β-1b來源的表位，其表現為源自IFN-β-1b的9個肽序列(表8)。在至少2個獨立試驗中發現了與基因型DRB1*0101/1401結合的兩個表位。
表位#5呈現為7種長度變體46-60的15-mer、45-60的16-mer、44-60的17-mer、43-60的18-mer、43-61的19-mer、42-60的19-mer和39-60的22-mer(表8)。表位#5包含下列錨定基序作為P1錨的F-49、作為P4錨的E-52、作為P6錨的A-54和作為P9錨的T-57。
表位#7呈現為13-mer和15-mer肽，其中13-mer源自蛋白質區149-161(表8)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。
實施例9圖1中略述的策略用於鑑定IFN-β-1b中由HLA-DR基因型為HLA-DRB1*1303/1501的樹突狀細胞遞呈的表位。
為了鑑定HLA-DRB1*1303/1501限制性IFN-β-1b表位，將表達基因型HLA-DRB1*1303/1501的樹突狀細胞從外周血單核細胞中分化，並以0.5×106細胞/ml的濃度進行培養。將5×106個樹突狀細胞暴露於20μg/ml濃度的IFN-β-1b中。同時，通過加入1μg/ml濃度的脂多糖(LPS)誘導樹突狀細胞成熟。作為對照，在缺乏IFN-β-1b但存在LPS的情況下培養相同量的樹突狀細胞。孵育24小時後，兩組樹突狀細胞在去汙劑TX-100中裂解，並用固定於瓊脂糖凝膠珠的抗HLA-DR mAb L243沉澱HLA-DR分子。HLA-DR結合肽用0.1％TFA洗脫，並通過2D-LS/MS-MS分析。
對HLA-DRB1*1303/1501結合配體的序列分析揭示了1個IFN-β-1b來源的表位，其表現為源自IFN-β-1b的3個肽序列(表9)。在至少2個獨立試驗中發現了與基因型DRB1*1303/1501相關的兩個表位。
表位#7呈現為149-161的13-mer、148-161的14-mer和147-161的15-mer(表9)。表位#7包含下列錨定基序作為P1錨的F-153、作為P4錨的I-156、作為P6錨的R-158和作為P9錨的G-161。
表1.與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3(Orthoclone)表位
表2.與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3(Orthoclone)表位
表3.與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3(Orthoclone)表位
表4.與基因型HLA-DRB1*0301/*0401相關的OKT-3(Orthoclone)表位
表5.與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關的幹擾素-β-1b表位
表6.與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-β-1b表位
表7.與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-β-1b表位
表8.與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-β-1b表位
表9.與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關的幹擾素-β-1b表位
序列表110弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)120鑑定生物藥物中與免疫原性相關表位的方法1302309716087170PatentIn版本3.32101211213212PRT213小家鼠(Mus musculus)220
221OKT3輕鏈(κ)222(1)..(213)4001Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr85 90 95Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro100 105 110Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly115 120 125Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn145 150 155 160Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser165 170 175Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr180 185 190Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe195 200 205Asn Arg Asn Glu Cys2102102211449212PRT213小家鼠220
221OKT3重鏈(IgG2a)222(1)..(449)4002Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr115 120 125Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu130 135 140Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp145 150 155 160Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu165 170 175Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser180 185 190Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser195 200 205Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys210 215 220Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro225 230 235 240Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser245 250 255Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp260 265 270Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr275 280 285Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val290 295 300Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu305 310 315 320Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val340 345 350Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr355 360 365Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr370 375 380Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu385 390 395 400Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys405 410 415Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu420 425 430Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly435 440 445Lys210321115212PRT213小家鼠220
221表位#1222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4003Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15210421116212PRT213小家鼠
220
221表位#1222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4004Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 15210521113212PRT213小家鼠220
221表位#2222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4005Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10210621114212PRT213小家鼠220
221表位#2222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4006Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10210721115212PRT213小家鼠220
221表位#2222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4007
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly1 5 10 15210821116212PRT213小家鼠220
221表位#2222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4008Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val1 5 10 15210921117212PRT213小家鼠220
221表位#3222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0401/*1302相關的OKT-3表位4009Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15Thr2101021115212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT3表位40010Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15
2101121116212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT3表位40011Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp1 5 10 152101221117212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT3表位40012Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp1 5 10 15Glu2101321117212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT3表位40013Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15Asp
2101421118212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3表位40014Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys1 5 10 15Asp Glu2101521118212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3表位40015Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr1 5 10 15Lys Asp2101621119212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(19)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3表位40016Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
1 5 10 15Lys Asp Glu2101721120212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(20)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3表位40017Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Thr Lys Asp202101821121212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(21)223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3表位40018Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr1 5 10 15Leu Thr Lys Asp Glu202101921122212PRT213小家鼠220
221表位#4222(1)..(22)
223與基因型HLA-DRB1*0701/*1601相關的OKT-3表位40019Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu1 5 10 15Thr Leu Thr Lys Asp Glu202102021115212PRT213小家鼠220
221表位#1222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3表位40020Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 152102121116212PRT213小家鼠220
221表位#1222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3表位40021Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro Thr1 5 10 152102221114212PRT213小家鼠220
221表位#3222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3表位40022
Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala1 5 102102321115212PRT213小家鼠220
221表位#3222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3表位40023Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser1 5 10 152102421117212PRT213小家鼠220
221表位#3222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3表位40024Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15Thr2102521118212PRT213小家鼠220
221表位#3222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1202相關的OKT-3表位40025Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser1 5 10 15
Thr Lys2102621117212PRT213小家鼠220
221表位#2222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0301/*0401相關的OKT-3表位40026Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val1 5 10 15Leu2102721113212PRT213智人(Homo Sapiens)220
221表位#5222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關的幹擾素-γ-1b表位40027Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 102102821116212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關的幹擾素-γ-1b表位40028Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu
1 5 10 152102921117212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0101/*0701相關的幹擾素-γ-1b表位40029Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15Glu2103021111212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(11)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40030Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 102103121112212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(12)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40031Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10
2103221113212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40032Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 102103321114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40033Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 102103421115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40034Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 152103521116212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40035Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys1 5 10 152103621112212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(12)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40036Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 102103721113212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40037Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 102103821114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40038Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu
1 5 102103921115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40039Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 152104021116212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40040Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 152104121117212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40041Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 15Lys
2104221114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40042Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 102104321115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40043Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 152104421116212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40044Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 152104521117212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40045Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 15Glu2104621116212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40046Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 152104721117212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40047Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu2104821118212PRT213智人
220
221表位#6222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40048Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu Glu2104921119212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(19)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40049Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu Glu Lys2105021118212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40050Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15Leu Glu
2105121119212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(19)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40051Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15Leu Glu Glu2105221113212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40052Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102105321115212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1101/*1404相關的幹擾素-γ-1b表位40053Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 152105421111212PRT
213智人220
221表位#6222(1)..(11)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40054Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 102105521112212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(12)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40055Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 102105621113212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40056Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 102105721114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位
40057Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 102105821115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40058Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu1 5 10 152105921112212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(12)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40059Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 102106021113212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40060Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10
2106121114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40061Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 102106221115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40062Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 152106321113212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40063Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 102106421114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40064Leu Ala Asn Val Tyr His G1n Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 102106521115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40065Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 152106621116212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40066Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu1 5 10 152106721114212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40067Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr
1 5 102106821117212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40068Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu1 5 10 15Glu2106921115212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40069Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr1 5 10 152107021118212PRT213智人220
221表位#6222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40070Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val1 5 10 15
Leu Glu2107121111212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(11)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40071Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102107221113212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40072Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102107321114212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40073Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr1 5 102107421114212PRT
213智人220
221表位#7222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40074Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102107521115212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0801/*0801相關的幹擾素-γ-1b表位40075Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 152107621115212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40076Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10 152107721116212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(16)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位
40077Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu1 5 10 152107821117212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(17)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40078Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15Glu2107921118212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(18)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40079Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile1 5 10 15Tyr Glu2108021119212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(19)
223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40080Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile1 5 10 15Tyr Glu Met2108121119212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(19)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40081Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr1 5 10 15Ile Tyr Glu2108221122212PRT213智人220
221表位#5222(1)..(22)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40082Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala1 5 10 15Ala Leu Thr Ile Tyr Glu202108321113212PRT
213智人220
221表位#7222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40083Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102108421115212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*0101/*1401相關的幹擾素-γ-1b表位40084Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 152108521113212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(13)223與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關的幹擾素-γ-1b表位40085Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102108621114212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(14)223與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關的幹擾素-γ-1b表位
40086Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 102108721115212PRT213智人220
221表位#7222(1)..(15)223與基因型HLA-DRB1*1303/*1501相關的幹擾素-γ-1b表位40087Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly1 5 10 1權利要求
1.一種鑑定與免疫原性有關的肽的方法，其包括步驟a)提供以0.1至5μg分子的量表達抗原遞呈受體(APR)的細胞，b)將來自(a)的細胞與免疫原性肽源接觸，c)從細胞分離APR分子-免疫原性肽複合物，d)從APR分子洗脫所結合的肽，e)鑑定免疫原性肽，f)驗證被鑑定為表位的免疫原性肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中APR表達細胞是MHC II表達細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其中MHC II表達細胞是樹突狀細胞。
4.根據權利要求3所述的方法，其中樹突狀細胞在其被誘導成熟為樹突狀細胞的同時作為未成熟樹突狀細胞暴露於免疫原的潛在源。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中潛在的免疫原來源屬於包括治療性多肽在內的肽，例如細胞因子、趨化因子、生長因子、抗體、酶、結構蛋白質、激素或其片段。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的方法，其中通過使用包括用去汙劑溶解細胞和經免疫沉澱或免疫親合層析分離抗原遞呈受體與免疫原性肽複合物的方法，從細胞分離MHC分子與免疫原性肽的複合物。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中在洗脫肽之前，將分離的MHC分子與免疫原性肽的複合物在超濾管中用水洗滌。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的方法，其中用稀酸將免疫原性肽從MHC分子上洗脫。
9.根據權利要求1-8中任意一項所述的方法，其中將(d)的所分離免疫原性肽進行分級分離和測序。
10.根據權利要求9所述的方法，其中通過包括液相層析和質譜的方法將所分離免疫原性肽進行分級分離和測序。
11.根據權利要求1-10中任意一項所述的方法，其中通過將從與潛在免疫原來源接觸的細胞中鑑定的肽與從未接觸所述來源的細胞中分離的那些肽進行比較，來鑑定所分離的免疫原性肽。
12.根據權利要求1-11中任意一項所述的方法，其中免疫原性肽是天然加工的免疫原性肽。
13.一種降低多肽免疫原性的方法，包括a)根據權利要求1-12所述的方法鑑定多肽的免疫原性肽，b)修飾多肽的相應表位，以降低或消除抗原遞呈受體的結合，c)由此產生具有降低免疫原性潛能或無免疫原性潛能的經修飾的多肽。
14.基本上如前所述、尤其是參照前述實施例所述的方法和用途。
全文摘要
本發明涉及鑑定與免疫原性有關的肽的方法，其包括步驟a)提供能以0.1至5μg分子的量表達抗原遞呈受體(APR)的細胞，b)將來自(a)的細胞與免疫原性肽源接觸，c)從細胞分離APR分子－免疫原性肽複合物，d)從APR分子洗脫所結合的肽，e)鑑定免疫原性肽，f)驗證被鑑定為表位的免疫原性肽。
文檔編號C12Q1/02GK1877336SQ20061008988
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月20日 優先權日2005年4月20日
發明者H·克勞勃紹佛, A·沃格特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司