結合域-免疫球蛋白融合蛋白的製作方法

2023-08-06 11:42:51

專利名稱：結合域-免疫球蛋白融合蛋白的製作方法
背景技術：
本發明一般涉及具有免疫學活性的重組結合蛋白，具體涉及分子工程化的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，包括單鏈Fv-免疫球蛋白融合蛋白。本發明也涉及用於治療惡性狀況和B細胞疾病，包括特徵在於自身抗體產生的疾病的組合物和方法。
免疫球蛋白分子由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成，它們通過鏈間二硫鍵連接成大分子複合物。鏈內二硫鍵連接相同多肽鏈的不同區域，這導致形成環，該環與鄰近的胺基酸構成免疫球蛋白結構域。每條輕鏈和每條重鏈具有單個可變區，該區表現出抗體之間胺基酸組成的很大變異。輕鏈可變區VL與重鏈可變區VH締合，形成免疫球蛋白的抗原結合位點Fv。輕鏈具有單個恆定區結構域，重鏈有幾個恆定區結構域。IgG，IgA和IgE具有三個恆定區結構域，稱為CH1，CH2和CH3，IgM和IgE具有四個恆定區結構域。
免疫球蛋白重鏈可以分為三個功能區Fd、鉸鏈區和Fc。Fd區包含VH和CH1結構域，與輕鏈一起形成Fab。Fc片段一般認為負責免疫球蛋白的效應物功能，例如，補體固定和結合與Fc受體。在IgG，IgA和IgD中發現的鉸鏈區作為柔性的間隔基，允許Fab部分在空間中自由移動。與恆定區相反，鉸鏈區結構域結構多樣，各類和亞類的免疫球蛋白之間序列和長度都有變化。例如，人類IgG的三種亞類，IgGl，IgG2和IgG4具有12-15個胺基酸的鉸鏈區，而IgG3含有約62個胺基酸，包括21個脯氨酸殘基和11個半胱氨酸殘基。根據結晶學研究，鉸鏈區可進一步根據功能細分為三個區上鉸鏈區、核心和下鉸鏈區(Shin et al.，Immunological Reviews 13087(1992))。上鉸鏈區包含CH1的羧基端的胺基酸至限制運動的鉸鏈區的第一個殘基，一般是第一個半胱氨酸殘基，它在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。上鉸鏈區的長度與抗體的片段柔性相關。核心鉸鏈區含有重鏈間二硫鍵，下鉸鏈區連接CH2結構域的氨基末端並且包含CH2中的殘基。(Id.)人IgG的核心鉸鏈區含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，當形成而二硫鍵時，該序列形成一個環狀八肽，人們認為該八肽作為一個軸，由此賦予柔性。鉸鏈區也可以含有碳水化合物附著位點。例如，IgA1在鉸鏈區的一個17胺基酸的片段中含有5個碳水化合物位點，它們賦予了鉸鏈區對腸蛋白酶的例外抗性，這被認為是分泌性免疫球蛋白的有利特徵。
鉸鏈區的結構和柔性所允許的構象改變可以影響抗體的Fc部分的效應物功能。與Fc區相關的效應物功能的三個大類包括(1)激活經典的補體級聯，(2)與效應分子相互作用和(3)免疫球蛋白的區室化。不同的人IgG亞類在其激活和擴增補體劑量的步驟的相對效力方面有所不同。一般說來，IgG1和IgG3最有效固定補體，IgG2效力較低，而IgG4不激活補體。補體激活是由C1q與抗原抗體複合物的結合起始的，C1q是級聯中的第一個成分C1的一個亞基。儘管C1q的結合位點位於抗體的CH2結構域，鉸鏈區影響抗體激活級聯的能力。例如，缺乏鉸鏈區的重組免疫球蛋白不能激活補體。(Id.)如果沒有鉸鏈區所賦予的柔性，與抗原結合的抗體的Fab部分可能不能採用允許C1q與CH2結合所需的構象。(見id.)研究表明，鉸鏈區長度和片段柔性與補體激活相關；然而，該相關不是絕對的。具有與IgG4相同的剛性的改變的鉸鏈區的人IgG3分子仍然有效激活該級聯。
鉸鏈區的缺乏也影響人IgG免疫球蛋白結合免疫效應細胞上的Fc受體的能力。免疫球蛋白與Fc受體的結合促進抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，它被推定為消除腫瘤細胞的重要方式。人IgG Fc受體家族被分為三組，即，能夠結合具有高親和性的IgG的FcγRI(CD64)、都是低親和性受體的FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。三種受體的每一種和免疫球蛋白之間的分子相互作用還沒有精確確定，但實驗表明，CH2結構域的鉸鏈近端區中的殘基對抗體和Fc受體之間的相互作用的特異性是重要的。此外，IgG1骨髓瘤蛋白和缺乏鉸鏈區的重組IgG3嵌合抗體不能結合FcγRI，很可能是因為對CH2的可接近性減少(Shin et al.，Intern.Rev.Immunol.10177，178-79(1993))。
單克隆抗體技術和基因工程方法導致了用於診斷和治療人疾病的免疫球蛋白分子的迅速開發。已經應用了蛋白工程改進抗體與其關聯抗原的親和性，以減少與免疫原性相關的問題，並且改變抗體的效應物功能。免疫球蛋白的域結構容易順應工程化，這是由於抗原結合域和賦予效應物功能的結構域可以在免疫球蛋白種類和亞類之間交換。
此外，構建了較小的免疫球蛋白分子，以克服與完整的免疫球蛋白的治療相關的問題。單鏈Fv(scFv)包含通過短的接頭肽與輕鏈可變區連接的重鏈可變區(Huston et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-83，1988)。由於scFv分子較小，它們表現出很快從血漿和組織清除，並且比完整免疫球蛋白更有效穿透到組織中。抗腫瘤scFv表現出與相應嵌合抗體更迅速的腫瘤穿透和在腫瘤團塊中更平均的分布(Yokota et al.，Cancer Res.52，3402-08(1992))。ScFv與另一種分子，如毒素的融合利用了特異性的抗原結合活性和scFv的小尺寸而將毒素遞送到靶組織(Chaudary et al.，Nature 339394(1989)；Batra et al.，Mol.Cell.Biol.112200(1991))。
儘管scFv分子的優點實現了血清療法，該治療方法仍存在一些缺陷。儘管scFv的迅速清除可以減少在正常細胞中的毒性作用，這種迅速清除可能阻礙向靶組織遞送最小的有效劑量。由於不利影響產量的表達和分離的困難，製備足量的用於給予患者的scFv是具有挑戰性的。在表達過程中，scFv分子缺乏穩定性並且由於不同分子的可變區的配對而經常聚集。此外，哺乳動物表達系統中的scFv分子的產量水平低，因此限制了有效製備用於治療的scFv分子的可能性(Daviset al，J Biol.Chem.26510410-18(1990)；Traunecker et al.，EMBO J103655-59(1991))。已經探索了改進產量水平的策略，包括向可變區添加糖基化位點(Jost，C.R.US Patent num；5,888,773，Jost et al，J.Biol.Chem.26926267-73(1994))。
毒素與scFV的偶聯或融合提供了非常強效的分子，但由於毒素分子的毒性，給藥是有限的。毒性作用包括升高肝酶和血管滲漏症候群。此外，免疫毒素是高度免疫原性的，並且抗毒素的宿主抗體限制了其用於重複治療的可能性。
使用scFv進行治療的其它缺點是缺乏效應物功能。與免疫球蛋白恆定區締合的，沒有細胞毒性功能、ADCC和補體依賴性細胞毒性(CDC)的scFv可能對於治療疾病是無效的。儘管scFv的開發技術已經開始了12年多，目前還沒有scFv被批准用於治療。
對疾病治療的抗體恆定區相關效應物功能促進了融合蛋白的開發，其中用非免疫球蛋白序列取代了抗體可變區。例如，由HIV識別的T細胞表面蛋白CD4被重組融合於免疫球蛋白Fc效應物結構域(見Sensel et al.，Chem.Immunol.65129158(1997))。這種分子的生物學活性將部分依賴於所選擇的恆定區的類或亞類。IL-2-IgG1融合蛋白實現了補體介導的具有IL-2受體的細胞的裂解(見id.)。用免疫球蛋白恆定區構建這些和其它融合蛋白也可以賦予改進的藥代動力學特徵。
認為容易順應於一些類型的免疫球蛋白治療的疾病和紊亂包括癌症和免疫系統紊亂。癌症包括寬範圍的疾病，影響全世界大約四分之一的個體。惡性細胞的迅速和得到上調的增殖是許多癌症，包括血液系統惡性腫瘤的特點。在過去的20年中，具有血液系統惡性狀況的患者從癌症治療的進展得到了最多的益處(Multani et al.，J.Clin.Oncology 163691-3710，1998)。儘管緩解率增加，大多數患者仍然復發並且難以治癒其疾病。用細胞毒性藥物治療的障礙包括腫瘤細胞抗性和化療的高毒性，這阻礙了許多患者的最佳給藥。基於導向於特異性結合惡性細胞的分子，包括單克隆抗體(mAbs)的新治療可以改進有效性而不增加毒性。
由於首先在1975年記載了單克隆抗體(Kohler et al.，Nature 25649597(1975))，已經用腫瘤細胞上表達的單克隆抗體治療了許多患者。這些研究產生了關於選擇適於治療的靶抗原的重要經驗。首先，也是最重要的，關鍵的正常組織不應該表達靶抗原。幸運的是，血液系統惡性細胞表達許多在幹細胞或其它關鍵細胞上不表達的抗原。減少了正常和血液系統來源的惡性細胞的血液系統惡性狀況的治療已經被接受，因為在治療結束後發生了從祖細胞再生正常細胞。其次，靶抗原應該在所有克隆發生的腫瘤細胞群上都表達，並且儘管存在來自於免疫球蛋白治療的選擇壓力，該表達應該持續。因此，儘管抗原表現出高度的腫瘤選擇性，具有改變的獨特型表達的腫瘤細胞變體的生長限制了用於治療B細胞惡性腫瘤的表面獨特型的選擇(Meeker et al.，N.Engl.J Med.3121658-65(1985))。第三，所選擇的抗原在與免疫球蛋白結合後必須適當運輸。免疫球蛋白結合抗原後靶抗原的脫落或內化可以允許腫瘤細胞逃脫破壞，從而限制血清療法的有效性。第四，免疫球蛋白與傳送激活信號的靶抗原的結合可以導致腫瘤細胞中的功能性應答，從而導致生長停滯和凋亡。儘管所有的這些特徵都是重要的，免疫球蛋白結合抗原後凋亡的引發可能是達到成功的血清療法的關鍵因素。
已經驗證作為B和T細胞惡性腫瘤的血清療法的靶點的抗原包括Ig獨特型(Btown et al.，Blood 73651-61(1989))，CD19(Hekman et al.，Cancer Immunol.Immunother.32364-72(1991)；Vlasveld et al.，Cancer Immunol.Immunother.4037-47(1995))，CD20(Press et al.，Blood 69584-91(1987)；Maloney et al.，J；Clin.Oncol.153266-74，(1997))，CD21(Scheinberg et.al.，J Clin.Oncol.8792-803，(1990))，CD5(Dillman et.al.，J Biol.Respn.Mod.5394-410(1986))，和CD52(CAMPATH)(Pawson et al.，J Clin.Oncol.152667-72，(1997))。其中，用CD20作為B細胞淋巴瘤的治療靶獲得了最大的成功。其它靶的每一種受到了抗原的生物學特徵的限制。例如，通過體細胞突變可以改變表面獨特型，允許腫瘤細胞逃脫。在單克隆抗體結合後，CD5，CD21和CD19被迅速內化，允許腫瘤細胞逃脫破壞，除非單克隆抗體與毒素分子偶聯。CD22僅在B細胞淋巴瘤的一個亞型上表達，而CD52在T細胞和B細胞上都表達，並且由T細胞減少產生免疫抑制。
CD20實現了上述為治療B細胞惡性狀況而選擇適當的靶抗原的基本標準。用嵌合CD20單克隆抗體在許多患者中誘導了部分或完全的反應(McLaughlin et al，Blood 8890a(abstract，suppl.1)(1996)；Maloney et al，Blood 902188-95(1997))。然而，在6個月到1年內通常發生腫瘤復發。因此，需要進一步改進血清療法以誘導低分級B細胞淋巴瘤的更持續反應，並且允許有效治療高分級淋巴瘤和其它B細胞疾病。
改進CD20血清療法的一種方法是用CD20的特異性單克隆抗體將放射性同位素導向於B細胞淋巴瘤。儘管治療的有效性增加，與放射性抗體的長體內半衰期相關的毒性也增加，有時要求患者進行幹細胞拯救(Press et al.，N.Eng.J Med.3291219-1224，1993；Kaminski etal.，N.Eng.J Med.329459-65(1993))。用蛋白酶切割了CD20的單克隆抗體以便在連接於放射性同位素之前產生F(ab′)2或Fab片段。這改進了放射性同位素偶聯物穿透進入腫瘤，並且縮短了體內半衰期，從而減少了對正常組織的毒性。然而，CD20單克隆抗體的Fc區提供的效應物功能，包括補體固定和ADCC的優點卻喪失。因此，為改進放射性同位素的遞送，需要一種策略來製備保留了Fc依賴性效應物功能，但尺寸更小的CD20單克隆抗體衍生物，從而增加腫瘤穿透並縮短單克隆抗體半衰期。
CD20是第一個由單克隆抗體鑑定的人B細胞系特異性表面分子，但CD20在B細胞生物學中的功能仍然沒有完全了解。CD20是非糖基化的，疏水的35Kda的磷酸蛋白，具有在細胞質中的氨基和羧基端(Einfeld et al，EMBO J.7711-17(1988))。還沒有鑑定CD20的天然配體。CD20由所有正常的成熟B細胞，但前體B細胞不表達。
CD20單克隆抗體向正常B細胞遞送影響存活力和生長的信號(Clark et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494-98(1986))。最近的數據表明，CD20的廣泛交聯可以誘導B淋巴瘤細胞系的凋亡(Shan etal.，Blood 911644-52(1998))。細胞表面的CD20的交聯增加信號傳導的強度和動力學，這是通過測量酪氨酸殘基上的細胞底物的磷酸化而檢測的(Deans et al.，J.Immunol.146846-53(1993))。重要的是，通過加入Fc受體陽性細胞而交聯CD20單克隆抗體也誘導Ramos淋巴瘤細胞的凋亡(Shan et al.，Blood 911644-52(1998))。因此，除了通過補體和ADCC機制減少細胞，Fc受體與CD20單克隆抗體的體內結合可以通過CD20交聯而促進惡性B細胞的凋亡。這一理論與表明SCID小鼠模型中人淋巴瘤的CD20治療有效性依賴於CD20單克隆抗體對Fc受體的結合的實驗相一致(Funakoshi et al.，J.Immunotherapy 1993-101(1996))。
CD20多肽含有4個跨膜結構域(Einfeld et al.，EMBO J 7711-17，(1988)；Stamenkovic et al.，J.Exp.Med.1671975-80(1988)；Tedder et.al.，J Immunol.1414388-4394(1988))。多個跨膜結構域防止了抗體結合後的CD20內化。CD20的該特性被識別為當給B細胞淋巴瘤患者注射鼠CD20單克隆抗體1F5時B細胞惡性腫瘤的有效治療的重要特徵，這導致惡性細胞的顯著減少和部分臨床反應(Press et al.，Blood69584-91(1987))。
由於正常成熟B細胞也表達CD20，CD20抗體治療時正常B細胞減少(Reff，M.E.et al，Blood 83435-445，1994)。然而，治療完成後，從CD20陰性B細胞前體再生正常B細胞；因此，用抗CD20療法治療的患者不經歷嚴重的免疫抑制。在涉及自身抗體的不適當產生的疾病或B細胞可能起作用的其它疾病中，正常B細胞的減少可能是有益的。由與人IgG1重鏈和人κ輕鏈恆定區融合的小鼠來源的重鏈和輕鏈可變區組成的CD20的特異性嵌合單克隆抗體保留了與CD20的結合和介導ADCC以及固定補體的能力(Liu et al.，J.Immunol.1393521-26(1987)；Robinson et al.，U.S.Patent No.5,500,362)。該研究導致了嵌合CD20單克隆抗體RituximabTM的開發，目前已經被美國食品和藥品監督管理局批准用於B細胞淋巴瘤的治療。儘管RituximabTM治療後經常觀察到臨床反應，患者通常在約6-12個月後復發。
靜脈注射需要高劑量的RituximabTM，因為該分子是大約150kDa的大分子，並且擴散限制於進入許多腫瘤細胞存留的淋巴組織。人們認為RituximabTM的抗腫瘤活性機制是幾種活性的結合，包括ADCC、補體固定和在惡性B細胞中激發促進凋亡的惡性B細胞。RituximabTM的大尺寸防止了該分子進入含有惡性B細胞的淋巴組織的最優擴散，從而限制了這些抗腫瘤活性。如前面所討論，用蛋白酶切割為Fab或F(ab′)2片段使它們更小，並且更容易穿透到淋巴組織中，但失去了對於抗腫瘤活性來說很重要的效應物功能。儘管CD20mAb片段可能比完整抗體在遞送放射性同位素方面更有效，但仍然需要構建保留Fc部分的效應物功能，但更小的CD20mAb衍生物，以促進更好的腫瘤穿透並導致更短的半衰期。
CD20由B細胞來源的惡性細胞，包括B細胞淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病(CLL)表達。CD20不被惡性的前B細胞，例如急性成淋巴細胞白血病表達。因此CD20是治療B細胞淋巴瘤、CLL和B細胞參與疾病活性的其它疾病的良好靶點。其它B細胞疾病包括在B細胞分化為血漿細胞期間產生自身抗體的自身免疫病。B細胞疾病的例子包括自身免疫性甲狀腺疾病，包括格雷夫斯病和橋本氏甲狀腺炎、類風溼性關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、乾燥症候群、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)、多發性硬化(MS)、重症肌無力(MG)、牛皮癬、硬皮病和炎性腸病，包括克隆氏病和潰瘍性結腸炎。
從上文中看出，確實需要用於治療惡性狀況和B細胞疾病的改進的組合物和方法。本發明的組合物和方法通過提供結合域-免疫球蛋白融合蛋白而克服了先有技術的限制，該融合蛋白包含與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合域多肽，該鉸鏈區多肽與免疫球蛋白重鏈CH2恆定區多肽融合，CH2恆定區多肽與免疫球蛋白腫瘤CH3恆定區多肽融合，其中結合域-免疫球蛋白融合蛋白能夠介導ADCC或補體固定。此外，該組合物和方法提供了其它相關的益處。
發明概述本發明的一方面提供了結合域-免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合域多肽，其中所述鉸鏈區多肽選自(i)不含半胱氨酸殘基並且來源於具有一個或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽，(ii)含有一個半胱氨酸殘基並且來源於具有兩個或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽，(iii)野生型人IgA鉸鏈區多肽，(iv)不含半胱氨酸殘基並且來源於野生型人IgA區多肽的突變的人IgA鉸鏈區多肽和(v)含有一個半胱氨酸殘基並且來源於野生型人IgA區多肽的突變的人IgA鉸鏈區多肽；(b)與鉸鏈區多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區；和(c)與CH2恆定區多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽，其中(1)結合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一種選自抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和補體固定的免疫活性，並且(2)結合域多肽能夠特異性結合於抗原。在一種實施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區多肽是一種突變的鉸鏈區多肽，並且相對於野生型人免疫球蛋白G鉸鏈區多肽，表現出二聚化的能力降低。在另一種實施方案中，結合域多肽包括至少一種是免疫球蛋白輕鏈可變區多肽或免疫球蛋白重鏈可變區多肽的免疫球蛋白可變區多肽。在進一步的實施方案中，免疫球蛋白可變區多肽來源於人免疫球蛋白。
在另一種實施方案中，結合域Fv-免疫球蛋白融合蛋白的結合域多肽包含(a)至少一種免疫球蛋白輕鏈可變區多肽；(b)至少一種免疫球蛋白重鏈可變區多肽；和(c)至少一種與(a)的多肽和與(b)的多肽融合的接頭肽。在進一步的實施方案中，免疫球蛋白輕鏈可變區和重鏈可變區多肽來源於人免疫球蛋白。
在另一種實施方案中，至少一種免疫球蛋白重鏈CH2恆定區多肽和免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽來源於人免疫球蛋白重鏈。在另一種實施方案中，免疫球蛋白重鏈恆定區CH2和CH3多肽屬於選自人IgG和人IgA的同種型。在另一種實施方案中，抗原選自CD19，CD20，CD37，CD40和L6。在上述融合蛋白的某些進一步的實施方案中，接頭肽包括至少一種具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO21]的多肽，在某些其它實施方案中，接頭肽包括具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO21]的多肽的至少三次重複。在某些實施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區多肽包括人IgA鉸鏈區多肽。在某些實施方案中，結合域多肽包括CD154胞外域。在某些實施方案中，結合域多肽包括CD154胞外域和至少一種免疫球蛋白可變區多肽。
在另一種實施方案中，本發明提供了一種編碼上述任意一種結合域-免疫球蛋白融合蛋白的分離的多核苷酸，並且在相關的實施方案中，本發明提供了一種包含這種多核苷酸的重組表達構建體，並且在某些進一步的實施方案中，本發明提供了用這種重組表達構建體轉化或轉染的宿主細胞。在另一種實施方案中，本發明提供了生產結合域-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)在允許結合域-免疫球蛋白融合蛋白表達的條件下培養上述宿主細胞；和(b)從宿主細胞培養物中分離結合域-免疫球蛋白融合蛋白。
本發明也在某些實施方案中提供了含有與生理可接受載體組合的上述結合域-免疫球蛋白融合蛋白的藥物組合物。在另一種實施方案中，提供了一種治療具有或懷疑具有惡性狀況或B細胞疾病的受試者的方法，包括給予患者治療有效量的上述結合域-免疫球蛋白融合蛋白。在某些進一步的實施方案中，惡性狀況或B細胞疾病是B細胞淋巴瘤或以自身抗體產生為特徵的疾病，並且在某些其它的實施方案中，惡性狀況或B細胞疾病是類風溼性關節炎、重症肌無力、格雷夫斯病、I型糖尿病、多發性硬化或自身免疫病。
參考以下發明詳述和附圖將更明確本發明的這些和其它方面。在此引入此處公開的所有參考文獻的完整內容作為參考，如同單獨引入每一篇。


圖1表示一種能夠特異性結合CD20的結合域-免疫球蛋白融合蛋白2H7scFv-Ig的DNA和推測的胺基酸序列[SEQ ID NOS＿＿]。
圖2表示通過轉染的、穩定的CHO細胞系產生的2H7scFv-Ig的水平和通過純化的2H7scFv-Ig與表達CD20的CHO細胞的結合產生標準曲線。
圖3表示分離的2H7scFv-Ig蛋白的多個製備物的SDS-PAGE分析。
圖4表示由2H7scFv-Ig進行的補體固定(圖4A)和抗體依賴性細胞毒性(ADCC，圖4B)。
圖5表示CD20和CD40的同時連接對正常B細胞生長的作用。
圖6表示CD20和CD40的同時連接對B類淋巴母細胞系中CD95表達和凋亡誘導的作用。
圖7表示能夠特異性結合CD20和CD40的2H7scFv-CD154L2[SEQ ID NOS＿＿]和2H7scFv-CD154 S4[圖7B，SEQ ID NOS＿＿]結合域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA和推測胺基酸序列。
圖8表示通過流式細胞術測定的2H7scFv-CD154結合域-免疫球蛋白融合蛋白與CD20+CHO細胞的結合。
圖9表示2H7scFv-CD154結合域-免疫球蛋白融合蛋白與細胞結合後膜聯蛋白V與B細胞系Ramos，BJAB和T51的結合。
圖10表示2H7scFv-CD154結合域-免疫球蛋白融合蛋白結合後對B細胞系T51的作用。
圖11圖示了稱作CytoxB或CytoxB衍生物的2H7ScFv-Ig融合蛋白[SEQ ID NOS＿＿]CytoxB-MHWTG1C(2H7 ScFv，突變的鉸鏈區，野生型人IgG1 Fc結構域)，CytoxB-MHMG1C(2H7 ScFv，突變的鉸鏈區，突變的人IgG1 Fc結構域)和CytoxB-IgAHWTHG1C(2H7ScFv，人IgA來源的鉸鏈區[SEQ ID NOS＿＿]，野生型人IgG1 Fc結構域)的結構。箭頭表示認為對FcR結合和ADCC活性(粗箭頭)、以及補體固定(細箭頭)起作用的胺基酸殘基的位置編號。注意沒有鏈間二硫鍵。
圖12表示分離的CytoxB和2H7scFv-CD154結合域-免疫球蛋白融合蛋白的SDS-PAGE分析。
圖13表示CytoxB衍生物的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性。
圖14表示CytoxB衍生物的補體依賴性細胞毒性(CDC)。
圖15表示獼猴血樣中CytoxB-MHWTG1C的血清半衰期確定。
圖16表示CytoxB-MHWTG1C對獼猴血樣中循環的CD40+B細胞水平的作用。
圖17表示轉染的哺乳動物細胞系的HD37(CD19特異性的)ScFv-Ig產量水平，以及通過純化的HD37 ScFv-Ig與表達CD19的細胞的結合產生標準曲線。
圖18表示轉染的穩定CHO細胞系的L6(癌抗原)ScFv-Ig產量水平，以及通過純化的L6 ScFv-Ig與表達L6抗原的細胞的結合產生標準曲線。
圖19表示結合域-免疫球蛋白融合蛋白2H7 ScFv-Ig，HD37ScFv-Ig和G28-1(CD37特異性)ScFv-Ig的ADCC活性。
圖20表示L6 ScFv-Ig融合蛋白的ADCC活性。
圖21表示L6 ScFv-Ig和2H7 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析。
圖22表示G28-1 ScFv-Ig和HD37 ScFv-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析。
發明詳述本發明涉及用於免疫治療和免疫診斷應用，並且提供比現有技術的抗原特異性多肽更有某些優勢的結合域-免疫球蛋白融合蛋白。本發明的融合蛋白優選是在相關部分包含以下融合結構域的單多肽鏈結合域多肽、免疫球蛋白鉸鏈區多肽、免疫球蛋白重鏈CH2恆定區多肽和免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽。在特別優選的實施方案中，結合域-免疫球蛋白融合蛋白是或來源於人基因序列的產物，但本發明不需要限制於此，並且實際上可以涉及此處提供的來源於任何天然或人工來源的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，包括基因工程化和/或突變的多肽。
本發明部分涉及出人意料的觀察結果，即，此處描述的結合域-免疫球蛋白融合蛋白具有免疫學活性。更具體地，儘管具有預計不能促進效應物活性的結構，這些蛋白保留了參與公知的免疫學效應物活性的能力，所述活性包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC，例如細胞表面的抗原結合後，在適當條件下募集和誘導具有適當Fc受體的細胞毒性效應細胞，如具有FcRγIII的天然殺傷(NK)細胞)和/或補體依賴性細胞毒性中的補體固定(CDC，例如細胞表面的抗原結合後，募集和激活作為血液補體級聯成分的細胞裂解蛋白)。如下文的更詳細描述，ADCC和CDC是包含免疫球蛋白重鏈區的單體蛋白的預料不到的功能，選用於該融合蛋白的結構，特別是對不利於它們形成鏈間同二聚體二硫鍵的能力的鉸鏈區多肽的選擇有利於該功能。
本發明提供的另一優點是能以大量產生的結合域-免疫球蛋白融合多肽，其產量一般大於用現有技術的單鏈抗體構建體常規獲得的量。在一種優選的實施方案中，本發明的結合域-免疫球蛋白融合多肽在哺乳動物表達系統中重組表達，這提供了以下優點，即提供了體內(例如在生理條件下)穩定的多肽。根據非限制性的理論，這種穩定性可能部分來源於融合蛋白的翻譯後修飾和特異性糖基化。已經在靜態細胞培養物中通過重組哺乳動物表達而以每升培養物上清液大於50mg蛋白的水平產生了本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，在這種培養物中一般觀察到的產量是10-50mg/l，因此在靜態培養條件下優選可以產生至少10-50mg/l；也考慮了用本領域接受的大規模方法如「補料分批」(即非靜態)生產方法增加融合蛋白的產量，獲得了至少5-500mg/l的產量，在一些情況下為至少0.5-1g/l，取決於特定的蛋白產物。
本發明的結合域多肽可以是具有特異性識別和結合相關生物分子或一種以上分子的複合物或這種分子的穩定或瞬時組裝物或聚集物的能力的任何多肽，所述分子包括蛋白、多肽、胺基酸或其衍生物；脂質、脂肪酸等或其衍生物；碳水化合物、糖等或其衍生物等；或其任意組合，例如，糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂等；或可能存在於生物學樣品中的任意其它生物分子。可以通過從受試者或生物來源獲得血樣、活檢標本、組織外植體、器官培養物、生物流體或任意其它組織或細胞製備物而提供生物學樣品。受試者或生物來源可以是人或非人動物、原代細胞培養物或適合培養的細胞系，包括但不限於可能含有染色體整合或附加型重組核酸序列的基因工程化的細胞系、永生化的可永生化的細胞系、體細胞雜交細胞系、分化的或可分化的細胞系、轉化的細胞系等。在本發明的某些優選實施方案中，受試者或生物來源可以被懷疑或患有此處所述的惡性狀況或B細胞疾病，或者具有患此處所述的惡性狀況或B細胞疾病的風險，在某些進一步優選的實施方案中可以是自身免疫病，在本發明的某些其它優選實施方案中，受試者或生物來源可以已知沒有患所述疾病的風險，或沒有該疾病。
因此，結合域多肽可以是任何天然存在或重組產生的此處提供的相關生物分子的結合配偶體，該相關生物分子是感興趣的靶結構，此處稱作「抗原」，但根據本發明的公開，意欲包括任何需要使本發明的融合蛋白特異性與其結合的靶生物分子。如果結合域-免疫球蛋白融合蛋白以大於或等於約104M-1，優選大於或等於約105M-1，更優選大於或等於約106M-1，更優選大於或等於約107M-1的Ka結合需要的靶分子，則該結合域-免疫球蛋白融合蛋白定義為「免疫特異性」或能夠特異性結合。本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白的親和力可以使用常規技術，例如描述於Scatchard et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.51660(1949)中的技術容易測定。也可以使用任何已知用於鑑定和獲得特異性與其它蛋白或多肽相互作用的蛋白的方法，例如美國專利5,283,173和美國專利5,468,614，或其同族專利等描述的酵母雙雜交篩選系統進行融合蛋白與感興趣的靶抗原結合的這種測定。
本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白的優選實施方案包括含有至少一個免疫球蛋白可變區多肽的結合域，所述可變區多肽例如重鏈或輕鏈可變區的所有或部分或片段，前提是它能夠特異性結合於抗原或此處描述的感興趣的其它需要的靶結構。在其它優選的實施方案中，結合域包含一個單鏈免疫球蛋白來源的Fv產物，它可以包含至少一種免疫球蛋白輕鏈V區的所有或一部分和至少一種免疫球蛋白重鏈V區的所有或一部分；並且進一步包含與V區融合的接頭；此處更詳細描述了所述構建體的製備和檢驗，並且這也是本領域公知的。其它結合域多肽可以包括保留了特異性結合於此處提供的抗原的能力的任何蛋白或其部分，包括非免疫球蛋白。因此本發明考慮了包含來源於以下成分的結合域多肽的融合蛋白多肽配體如激素、細胞因子、趨化因子等；這種多肽配體的細胞表面或可溶受體；凝集素；細胞間粘附受體如特異性白細胞整聯蛋白、選擇蛋白、免疫球蛋白基因超家族成員、細胞間粘附分子(ICAM-1，-2，-3)等；組織相容性抗原等。
可以提供結合域多肽並且也可以選擇為本發明的結合域-Ig融合蛋白需要結合的靶分子或抗原的細胞表面受體的例子包括以下成分等HER1(如GenBank編號U48722，SEG_HEGFREXS，K03193)，HER2(Yoshino et al.，1994 J.Immunol.1522393；Disis et al.，1994 Canc.Res.5416；也見，例如GenBank編號X03363，M17730，SEGHUMHER20)，HER3(例如GenBank編號U29339，M34309)，HER4(Plowman et al.，1993 Nature 366473；也見，例如GenBank編號L07868，T64105)，表皮生長因子(EGFR)(例如GenBank編號U48722，SEG_HEGFREXS，KO3193)，血管內皮細胞生長因子(例如GenBank編號M32977)，血管內皮生長因子受體(例如GenBank編號AF022375，1680143，U48801，X62568)，胰島素樣生長因子-I(例如GenBank編號X00173，X56774，X56773，X06043，也見歐洲專利GB 2241703)，胰島素樣生長因子-II(例如GenBank編號X03562，X00910，SEG_HUMGFIA，SEG_HUMGFI2，M17863，M17862)，轉鐵蛋白受體(Trowbridge andOmarv，1981 Proc.Nat.Acad.USA 783039；也參見，例如GenBank編號X01060，M11507)，雌激素受體(如GenBank編號M38651，X03635，X99101，U47678，M12674)，孕激素受體(如GenBank編號X51730，X69068，M15716)，濾泡刺激素受體(FSH-R)(如GenBank編號Z34260，M65085)，視黃酸受體(如GenBank編號L12060，M60909，X77664，X57280，X07282，X06538)，MUC-1(Barnes et al.，1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 867159；也見，例如GenBank編號SEG_MUSMUCIO，M65132，M64928)，NY-ESO-1(如GenBank編號AJ003149，U87459)，NA 17-A(如歐洲專利WO 96/40039)，Melan-A/MART-1(KaWakami etal.，1994 Proe.Nat.Acad.Sci.USA 913515；也見，例如GenBank編號U06654，U06452)，酪氨酸酶(Topalian et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 919461；也見，例如GenBank編號M26729，SEG_HUMTYRO，也見，例如Weber et al.，J；Clin.Invest(1998)1021258)，Gp-100(Kawakami et al.，1994 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 913515；也見，例如GenBank編號S73003，也見歐洲專利EP 668350；Adema et al.，1994J.Biol.Chem.26920126)，MAGE(van den Bruggen et al.，1991Science 2541643；例如GenBank編號U93163，AF064589，U66083，D32077，D32076，D32075，U10694，U10693，U10691，U10690，U10689，U10688，U10687，U10686，U10685，L18877，U10340，U10339，L18920，U03735，M77481)，BAGE(例如GenBank編號U19180，也見美國專利5,683,886和5,571,711)，GAGE(例如GenBank編號AF055475，AF055474，AF055473，U19147，U19146，U19145，U19144，U19143，U19142)，任意CTA類的受體，具體包括由SSX2基因編碼的HOM-MEL-40抗原(例如GenBank編號X86175，U90842，U90841，X86174)，癌胚抗原(CEA，Gold and Freedman，1985 J Exp.Med 121439；也見，例如GenBank編號SEG_HUMCEA，M59710，M59255，M29540)，以及PyLT(例如GenBank編號J02289，J02038)。
其它可以作為結合域多肽的來源或可以作為相關抗原的細胞表面受體包括以下受體等CD2(例如GenBank編號Y00023，SEGHUMCD2，M16336，M16445，SEG_MUSCD2，M14362)，4-1BB(CDw137，Kwon et al.，1989 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 861963)，4-1BB配體(Goodwin et al.，1993 Eur.J.Immunol.232361；Melero et al.，1998 Eur.J.Immunol.3116)，CD5(例如GenBank編號X78985，X89405)，CD10(例如GenBank編號M81591，X76732)，CD27(例如GenBank編號M63928，L24495，L08096)，CD28(June et al.，1990 Immunol. Today 11211；也見，例如GenBank編號SEGHUMCD28，M34563)，CTLA-4(例如GenBank編號L1 5006，X05719，SEG_HUMIGCTL)，CD40(例如GenBank編號M83312，SEGMUSC040A0，Y10507，X67878，X96710，U15637，L07414)，γ幹擾素(IFN-γ，見例如Farrar et al.1993 Ann.Rev.Immunol.11571及其中引用的參考文獻，Gray et al.1982 Nature 295503，Rinderknecht et al.1984 J Biol.Chem.2596790，DeGrado et al.1982 Nature 300379)，白介素-4(IL-4，見例如53rdForum in Immunology，1993 Research inImmunol.144553-643；Banchereau et al.，1994 in The CytokineHandbook，2nded.，A.Thomson，ed.，Academic Press，NY，p.99；Keegan et al.，1994 J Leukocyt.Biol..55272，及其中引用的參考文獻)，白介素-17(IL-17)(例如，GenBank編號U32659，U43088)和白介素-17受體(IL-17R)(例如，GenBank編號U31993，U58917)。儘管包括前述內容，本發明特意不包括U.S.5,807,734，U.S.5,795,572或U.S.5,807,734所公開的任何免疫球蛋白融合蛋白。
其它可以作為結合域多肽的來源或可以作為相關抗原的細胞表面受體包括以下受體等CD59(例如，GenBank編號SEG_HUMCD590，M95708，M34671)，CD48(例如，GenBank編號M59904)，CD58/LFA-3(例如，GenBank編號A25933，Y00636，E12817，也見JP1997075090-A)，CD72(例如，GenBank編號AA311036，S40777，L35772)，CD70(例如，GenBank編號Y13636，S69339)，CD80/B7.1(Freeman et al.，1989 J.Immunol.432714；Freeman et al.，1991 J.Exp.Med.174625，也見，例如GenBank編號U33208，I683379)，CD86/B7.2(Freeman et al.，1993 J.Exp.Med.1782185，Boriello et al.，1995 J Immuno1.1555490；也見，例如GenBank編號AF099105，SEGMMB72G，U39466，U04343，SEGHSB725，L25606，L25259)，CD40配體(例如，GenBank編號SEG_HUMCD40L，X67878，X65453，L07414)，IL-17(例如，GenBank編號U32659，U43088)，CD43(例如，GenBank編號X52075，J04536)和VLA-4(α4β7)(例如，GenBank編號L12002，X16983，L20788，U97031，L24913，M68892，M95632)。以下細胞表面受體一般與B細胞相關CD19(例如，GenBank編號SEGHUMCD19W0，M84371，SEG MUSCD19W， M62542)，CD20(例如，GenBank編號SEGHUMCD20，M62541)，CD22(例如，GenBank編號I680629，Y10210，X59350，U62631，X52782，L16928)，CD30配體(例如，GenBank編號L09753，M83554)，CD37(例如，GenBank編號SEG_MMCD37X，X14046，X53517)，CD106(VCAM-1)(例如，GenBank編號X53051，X67783，SEG_MMVCAM1C，也見美國專利5,596,090)，CD54(ICAM-1)(例如，GenBank編號X84737，S82847，X06990，J03132，SEGMUSICAMO)，白介素12(見，例如Reiter et al，1993 Crit.Rev.Immunol.13:1，及其中引入的參考文獻)。輔助的細胞試劑也可以包括以下一般與樹突細胞相關的細胞表面受體CD83(例如，GenBank編號AF001036，AL021918)，DEC-205(例如，GenBank編號AF011333，U19271)。
上述免疫球蛋白鉸鏈區多肽包括任何天然存在的、作為人工肽或作為基因工程結果和位於負責在CH1和CH2區中形成鏈內免疫球蛋白-結構域二硫鍵的胺基酸殘基之間的免疫球蛋白重鏈多肽內的鉸鏈區肽或多肽；用於本發明的鉸鏈區多肽也可以包括突變的鉸鏈區多肽。因此，免疫球蛋白鉸鏈區多肽可以來源於上述經典地認為具有鉸鏈區功能的免疫球蛋白鏈區域，或是其部分或片段(即以肽鍵連接的一個或多個胺基酸，一般5-65個胺基酸，優選10-50個，更優選15-35個，更優選18-32個，更優選20-30個，更優選21，22，23，24，25，26，27，28或29個胺基酸)。但用於本發明的鉸鏈區多肽並不限於此，並且可以包括位於鄰接的免疫球蛋白結構域，如CH1結構域或CH2結構域中的胺基酸(根據用於分配特定殘基至特定結構域的結構標準可能不同，如本領域公知)，或者在某些人工工程化的免疫球蛋白構建體的情況下，可以包括免疫球蛋白可變區結構域。
野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽包括任何位於免疫球蛋白的恆定區結構域CH1和CH2之間的天然存在的鉸鏈區。野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽優選是人免疫球蛋白鉸鏈區多肽，優選包含來自人IgG免疫球蛋白的鉸鏈區，更優選包含來自人IgG1同種型的鉸鏈區多肽。如本領域所公知，儘管免疫球蛋白胺基酸序列具有極大的總體多樣性，免疫球蛋白一級結構在免疫球蛋白多肽鏈的特定部分表現出高度序列保守性，特別是存在半胱氨酸殘基，它們通過其巰基提供了與其它存在的巰基形成二硫鍵的潛能。因此，在本發明的內容中，野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽可以被認為特徵在於一個或多個高度保守的(如以統計學顯著的方式普遍存在於人群中)半胱氨酸殘基，在某些優選實施方案中，突變的鉸鏈區多肽可以選自含有0或1個半胱氨酸殘基的鉸鏈區並且來源於這樣的野生型鉸鏈區。
突變的免疫球蛋白鉸鏈區多肽可以包含來源於不同於CH2和CH3結構域的物種、免疫球蛋白同種型或類、或免疫球蛋白亞類的鉸鏈區。例如，在某些實施方案中，結合域-免疫球蛋白融合蛋白可以包含融合於含有野生型人IgA鉸鏈區多肽或此處描述的含有0或僅僅1個半胱氨酸殘基的突變的人IgA鉸鏈區多肽的免疫球蛋白鉸鏈區多肽的結合域多肽。這種鉸鏈區多肽可以融合於來自於不同的Ig同種型或類，如IgG亞類的免疫球蛋白重鏈CH2區多肽，該IgG亞類在某些實施方案中優選為IgG1亞類。
例如，如下面更詳細的描述，在本發明的某些實施方案中，免疫球蛋白鉸鏈區多肽選自來源於天然包括三個半胱氨酸的的野生型人IgA鉸鏈區，其中所選擇的鉸鏈區多肽相對於完整的鉸鏈區被截短，使得只剩下一個半胱氨酸殘基(如SEQ ID NOS35-36)。同樣，在本發明的某些其它實施方案中，結合域-免疫球蛋白融合蛋白包含融合於含有突變的鉸鏈區多肽的免疫球蛋白鉸鏈區多肽，突變的鉸鏈區多肽中的半胱氨酸殘基數通過胺基酸取代或缺失而減少。因此突變的鉸鏈區多肽可以來源於含有一個或多個半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區。在某些實施方案中，突變的鉸鏈區多肽可以含有0個或僅僅1個半胱氨酸殘基，其中突變的鉸鏈區多肽來源於分別含有一個或多個或兩個或多個半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區。在突變的鉸鏈區多肽中，野生型免疫球蛋白鉸鏈區的半胱氨酸殘基優選被不能形成二硫鍵的胺基酸取代。在本發明的一個實施方案中，突變的鉸鏈區多肽來源於人IgG野生型鉸鏈區多肽，該野生型鉸鏈區多肽可以包括四種人IgG同種型亞類IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的任意一種。在某些優選的實施方案中，突變的鉸鏈區多肽來源於人IgG1野生型鉸鏈區多肽。作為舉例，來源於人IgG野生型鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽可以含有在野生型免疫球蛋白鉸鏈區的三個半胱氨酸中的兩個或三個上發生的突變。
存在於野生型免疫球蛋白鉸鏈區並且根據本發明的特別優選的實施方案而進行的誘變所缺失的半胱氨酸殘基包括形成、或能夠形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。不希望受到理論的限制，本發明考慮了這些鉸鏈區半胱氨酸殘基的突變，這些半胱氨酸殘基被認為參與鏈間二硫橋形成，減少本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白通過二硫鍵形成而二聚化(或形成更高級的寡聚物)的能力，同時出乎意料地不減少融合蛋白促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或固定補體的能力。具體地，介導ADCC的Fc受體(FcR)(如FcRIII，CD16)具有對免疫球蛋白Fc結構域的低親和性，表示Fc與FcR的功能性結合需要Fc-FcR複合物的親和穩定，這是由於常規抗體中重鏈的二聚結構，和/或通過常規抗體Fc結構的FcR聚集和交聯而導致的。(Sonderman et al.，2000 Nature 406267；Radaev et al.，2001 J BioLChem.27616469；Radaev et al.，2001 JBiol.Chem.27616478；Koolwijk et al.，1989 J；Immunol.1431656；Kato et al.，2000Immunol.Today 21310.)。因此，本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白提供了與單鏈免疫球蛋白融合蛋白相關的優點，同時也出乎意料地保留了免疫學活性。同樣，固定補體的能力一般與包含Fc的重鏈恆定區為二聚化的免疫球蛋白相關，而本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白表現出出乎意料的固定補體的能力。
如上文所指出的，根據非限定性的理論，確信結合域-免疫球蛋白融合蛋白損害了它們二聚化的能力，並且進一步根據理論，該性質是減少存在於所選的包含於融合蛋白的構建中的免疫球蛋白鉸鏈區多肽中的半胱氨酸殘基數的結果。確定多肽二聚化的相對能力的方法是本領域公知的，其中可以用許多確立的方法檢測蛋白的二聚化(見，例如Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice，1987Springer-Verlag，New York)。例如，用於根據分子大小分辨蛋白的生化分離技術(例如凝膠電泳、凝膠過濾層析、分析性超速離心法等)和/或在引入巰基活性(例如碘乙醯胺、N-乙基馬來醯亞胺)或二硫鍵還原性(如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇)試劑之前和之後比較蛋白的生理化學特徵的方法，或其它相當的方法都可以用於檢測多肽二聚化或寡聚化的程度，並且確定二硫鍵對這種潛在四級結構的可能作用。在某些實施方案中，本發明涉及此處提供的相對於野生型人免疫球蛋白G鉸鏈區多肽表現出二聚化能力降低(即相對於適當的IgG來源的對照以統計學顯著的方式降低)的結合域免疫球蛋白融合蛋白。因此，本領域的熟練技術人員能夠容易確定特定融合蛋白是否表現出這種二聚化能力降低。
用於製備免疫球蛋白融合蛋白的組合物和方法是本領域公知的，例如美國專利5,892,019的描述，該專利公開了作為單個編碼性多核苷酸的產物但不是本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白的重組抗體。
對於用於人的本發明的免疫球蛋白融合蛋白，恆定區一般來源於人序列，以減少潛在的抗人免疫應答並且提供適當的效應物功能。操作編碼抗體恆定區的序列描述於Morrison和Oi的PCT公開WO89/07142。在特別優選的實施方案中，CH1結構域缺失，並且結合域的羧基端，或當結合域包含兩個免疫球蛋白可變區多肽時，第二個(即更接近於C末端)可變區通過鉸鏈區連接於CH2的氨基末端。描述兩個示例性結合域-免疫球蛋白融合蛋白的結構的概要圖見圖11，應該注意，在特別優選的實施方案中，不存在鏈間二硫鍵，在其它實施方案中，相對於野生型鉸鏈區多肽中的該鍵的數目，可以存在有限的鏈間二硫鍵數目，在其它實施方案中，融合蛋白包含相對於野生型人IgG鉸鏈區多肽表現出二聚化能力降低的突變鉸鏈區多肽。因此，分離的多核苷酸分子編碼單鏈免疫球蛋白融合蛋白，該融合蛋白具有提供對所選擇抗原的特異性結合親和性的結合域。
如上文所指出的，在某些實施方案中，結合域免疫球蛋白融合蛋白包含至少一個免疫球蛋白可變區多肽，該多肽可以是輕鏈或重鏈可變區多肽，並且在某些實施方案中，融合蛋白包含至少一個該輕鏈V區和一個該重鏈V區以及至少一個融合於每一個V區的接頭肽。構建這種結合域，例如單鏈Fv結構域的方法是公知的，並且在下文的實施例中由詳細描述，並且在例如美國專利5,892,019及其引用的參考文獻中有詳細描述；單鏈可變區和融合於每一個重鏈來源和輕鏈來源的V區的接頭多肽的選擇和組裝(例如產生包含單鏈Fv多肽的結合域)也是本領域公知的，並且在本文和例如美國專利5,869,620，4,704,692和4,946,778中有描述。在某些實施方案中，來源於非人來源的免疫球蛋白序列的全部或一部分可以根據公知程序進行「人源化」，以製備人源化抗體，即，引入了人Ig序列以減少人免疫系統將該蛋白識別為外源蛋白的程度的免疫球蛋白序列(見，例如美國專利5,693,762；5,585,089；4,816,567；5,225,539；5,530,101及其中引用的參考文獻)。
一旦設計了此處提供的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，可以通過描述於例如Sinha et al.，Nucleic Acids Res.，12，4539-4557(1984)中的寡核苷酸合成方法合成編碼該多肽的DNA，通過描述於例如Innis，Ed.，PCR Protocols，Academic Press(1990)和Better et al.J.Biol.Chem.267，16712-16118(1992)的PCR方法組裝；通過描述於例如Ausubel etal.，Eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York(1989)以及Robinson et al.，Hum.Antibod Hybridomas，2，84-93(1991)的標準程序進行克隆和表達；並且通過描述於例如Harlowet al.，Eds.，AntibodiesA Laboratory Manual，Chapter 14，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1988)和Munson etal.，AnaL Biochem.，107，220-239(1980)的方法檢測特異性抗原結合活性。
Fv區的單多肽鏈結合分子即單鏈Fv分子的製備描述於美國專利4,946,778，在此引入作為參考。在本發明中，通過編碼第一個重鏈或輕鏈可變區，然後分別編碼相應輕鏈或重鏈可變區的一個或多個接頭而合成單鏈Fv樣分子。兩個可變區之間的適當接頭的選擇描述於美國專利4,946,778。此處描述的示例性的接頭是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。接頭用於將天然聚集但化學上分離的重鏈和輕鏈轉化為單個多肽鏈的氨基末端抗原結合部分，其中該抗原結合部分將摺疊成類似於由兩條多肽鏈形成的原始結構，從而保持結合目的抗原的能力。通過編碼接頭的序列連接的編碼重鏈和輕鏈可變區的核苷酸序列連接於編碼抗體恆定區的核苷酸序列。恆定區是允許得到的多肽形成鏈間二硫鍵以形成具有所需效應物功能，例如介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的二聚體的區域。對於意欲用於人類的本發明的免疫球蛋白樣分子來說，恆定區一般基本來自於人，從而使潛在的抗人免疫應答減少到最小並且提供適當的效應物功能。對編碼抗體恆定區的序列的操作描述於Morrison和Oi的PCT公開89/07142，在此引入作為參考。在優選實施方案中，缺失CH1結構域並且通過鉸鏈區將第二個可變區的羧基末端連接於CH2的氨基末端。與輕鏈的相應Cys形成二硫鍵以保持天然抗體的重鏈和輕鏈的鉸鏈區Cys殘基可以缺失或被例如Pro殘基等取代。
如上文所述，本發明提供了能夠指導此處提供的結合域免疫球蛋白融合蛋白的表達的重組表達構建體。存在於此處提到的各種胺基酸序列中的胺基酸是根據它們的公知三字母或單字母簡稱而鑑別的。存在於此處的各種DNA序列或其片段中的核苷酸是根據本領域中常用的標準單字母命名法進行命名的。特定的胺基酸序列也可以包括具有微小改變的相似胺基酸序列，例如說明性而非限定性的共價化學修飾、插入、缺失和取代，可以進一步包括保守取代。彼此相似的胺基酸序列可以具有很大的序列同源區。以相似的方式，核苷酸序列可以包括僅具有微小改變的基本相似的核苷酸序列，例如說明性而非限定性的共價化學修飾、插入、缺失和取代，可以進一步包括由於遺傳密碼子的簡併性而導致的沉默突變。彼此相似的核苷酸序列可以具有很大的序列同源區。
受試者中存在惡性狀況是指存在受試者中存在發育異常的、癌性和/或被轉化細胞，包括，例如贅生性、腫瘤、非接觸抑制的或致癌性被轉化細胞等。在優選實施方案中，本發明考慮了例如這些癌細胞是惡性造血細胞，例如淋巴系的被轉化細胞，具體如B細胞淋巴瘤等；在某些優選實施方案中，癌細胞也可以是上皮細胞如上皮癌細胞。本發明也考慮了B細胞疾病，可以包括影響B細胞的某些惡性狀況(如B細胞淋巴瘤)，但不限於此，也可以包括自身免疫病，具體說是以自身抗體產生為特徵的疾病、紊亂和狀況。
自身抗體是與自身抗原反應的抗體。在一些自身免疫病(即宿主免疫系統產生不適當的抗「自身」免疫反應的疾病、紊亂或狀況)中檢測到了自身抗體，它們參與疾病活動。目前這些自身免疫病的治療是需要連續給藥、缺乏特異性並導致嚴重副作用的免疫抑制藥物。能夠消除自身抗體的產生並具有最小的毒性的新方法將解決影響許多人的各種疾病的未滿足的醫學需要。本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白是設計用於改進穿透到淋巴組織中。B淋巴細胞的消除中斷了自身抗體產生循環，並且允許免疫系統重新設置，同時從骨髓中的前體產生新的B淋巴細胞。
根據非限制性理論已經鑑定，對於許多疾病B細胞消除理論導致了有益的效果，這些疾病的一些例子的簡要描述如下。
自身免疫性甲狀腺疾病包括格雷夫斯病和橋本氏甲狀腺炎。在美國，有約2千萬人患有某種形式的自身免疫性甲狀腺疾病。自身免疫性甲狀腺疾病是由刺激甲狀腺而導致甲狀腺機能亢進(格雷夫斯病)或破壞甲狀腺而導致甲狀腺機能減退(橋本氏甲狀腺炎)的自身抗體的產生而導致的。甲狀腺的刺激是由結合併激活甲狀腺刺激激素(TSH)受體的自身抗體所導致的。甲狀腺的破壞是由與其它甲狀腺抗原反應的自身抗體所導致的。
當前格雷夫斯病的治療包括手術、放射性碘或抗甲狀腺藥物治療。放射性碘被廣泛使用，因為抗甲狀腺藥物具有顯著副作用，並且疾病復發率高。手術用於具有大的甲狀腺腫的患者，或需要使甲狀腺功能非常迅速地正常化的患者。目前還沒有靶向於刺激TSH受體的自身抗體的產生的療法。目前用於橋本氏甲狀腺炎的治療是左旋甲狀腺素鈉，並且該治療是終身的，因為該疾病消退幾乎是不可能的。已經發現抑制性治療在橋本氏甲狀腺炎腫使甲狀腺腫萎縮，但還沒有已知一種療法能夠減少抗體產生從而靶向於疾病機制。
類風溼性關節炎(RA)是一種以導致腫脹、疼痛和功能喪失的關節的炎症為特徵的慢性疾病。RA在美國影響了大約250萬人。RNA是由包括起始的感染或損傷的事件、異常免疫應答和遺傳因素的結合所導致的。儘管RA中存在自身反應性T細胞和B細胞，RA的診斷中使用了在關節中採集的高水平抗體，即稱作類風溼因子的抗體的檢測。目前用於RA的治療包括許多用於控制疼痛和延緩疾病進展的藥物。還沒有發現能夠治癒該疾病的治療。藥物包括非甾體類抗炎藥(NSAIDS)和疾病修飾性抗類風溼藥物(DMARDS)。NSAIDS在良性疾病中有效，但在嚴重RA中不能阻止進展為關節破壞和殘疾。NSAIDS和DMARDS都與嚴重的副作用相關。只在十多年中，只批准了一種新的DMARD，即來氟米特。來氟米特阻斷自身抗體的產生，減少炎症，並且延緩RA的進展。然而，該藥物也導致嚴重的副作用，包括噁心、腹瀉、脫髮、皮疹和肝損傷。
系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種由於多個器官，包括腎、皮膚和關節中的血管的反覆損傷導致的自身免疫病。SLE在美國影響了超過500,000人。在SLE患者中，T細胞和B細胞之間的異常相互作用導致了攻擊細胞核的自身抗體的產生。這些抗體包括抗雙鏈DNA和抗Sm抗體。在約半數的SLE患者中也發現了結合於磷脂的自身抗體，並且負責血管損傷和低血細胞計數。免疫複合物在SLE患者的腎、血管和關節中聚集，它們在此導致炎症和組織破壞。還沒有發現治癒該疾病的療法。根據疾病的嚴重程度，將NSAIDS和DMARDS用於治療。用於去除自身抗體的帶有血漿交換的血漿除去法可以導致SLE患者的暫時改進。普遍同意自身抗體與SLE有關，所以消除B細胞系，允許免疫系統重新設置，同時從前體產生新的B細胞的新療法為SLE患者的長期持續益處帶來了希望。
乾燥症候群是以身體中產生溼潤環境的腺體的破壞為特徵的一種自身免疫病。乾燥症候群是最普遍的自身免疫病之一，影響了多至400萬美國人。約半數乾燥症候群患者也患有結締組織病，如類風溼性關節炎，而另一半患有原發性乾燥症候群，沒有其它並發的自身免疫病。乾燥症候群患者中通常存在自身抗體，包括抗核抗體、類風溼因子、抗胞襯蛋白和抗毒蕈鹼受體抗體。常規治療包括皮質類固醇。
免疫性血小板減少性紫癜(ITP)是由結合於血小板並導致其破壞的自身抗體所導致的。一些ITP病例是由藥物導致的，其它與感染、妊娠或自身免疫病如SLE相關。約半數病例分類為「特發性」，表示原因未知。ITP的治療是由症狀的嚴重性所決定的。在一些病例中，不需要治療。在大多數病例中，用免疫抑制藥物，包括皮質類固醇或靜脈輸注免疫球蛋白來消除T細胞。另一種通常導致血小板數目增加的治療方法是切除脾，該器官破壞抗體包被的血小板。更強效的免疫抑制藥物，包括環孢黴素、環磷醯胺或硫唑嘌呤用於治療嚴重病例。通過使患者的血漿通過蛋白A株而去除自身抗體被用作嚴重疾病患者的二線療法。
多發性硬化(MS)是以中樞神經系統的炎症和髓鞘破壞為特徵的自身免疫病，它刺激腦、脊髓和身體中的神經細胞纖維。儘管MS的原因未知，普遍認為自身免疫性T細胞是該疾病發病的主要原因。然而，高水平的抗體存在於MS患者的腦脊液中，一些理論預測，導致抗體產生的B細胞應答在介導該疾病中是重要的。在MS患者中還沒有研究B細胞消除理論。MS不能治癒。目前的治療是皮質類固醇，它可以減少攻擊的持續時間和嚴重性，但不影響MS隨時間的進程。最近批准了MS的新的生物技術幹擾素(IFN)治療。
重症肌無力(MG)是一種慢性免疫性神經肌肉疾病，特徵在於隨意肌群的衰弱。MG影響了大約40,000美國人。MG是由結合於在神經肌肉接頭表達的乙醯膽鹼受體的自身抗體導致的。該抗體減少或阻斷乙醯膽鹼受體，阻止信號從神經傳遞到肌肉。MG還不能治癒。常見的療法包括用皮質類固醇、環孢黴素、環磷醯胺或硫唑嘌呤進行免疫抑制。手術切除胸腺通常用於鈍化自身免疫應答。用於降低自身抗體水平的血漿除去法在MG中有效，但作用時間短，因為持續產生自身抗體。血漿除去法通常在手術前用於嚴重的肌肉衰弱。
牛皮癬影響了大約500萬人。它是皮膚的自身免疫性炎症。30％的牛皮癬與關節炎相關(硬皮病關節炎)。有許多治療方法，包括甾體類、紫外線維生素A類、維生素D衍生物、環孢黴素、氨甲喋呤。
硬皮病是結締組織的一種慢性自身免疫病，也稱作系統性硬化。硬皮病的特徵在於膠原的過量產生，導致皮膚增厚。大約300,000美國人患有硬皮病。
包括克隆氏病和潰瘍性結腸炎的炎性腸病是消化系統的自身免疫病。
本發明進一步涉及編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的構建體，具體涉及用於給予編碼可以表達為例如所述多肽的片段、類似物和衍生物的所述蛋白的重組構建體的方法。當提到結合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白時，「片段」、「衍生物」和「類似物」是指任何保持與所述多肽基本相同的生物功能或活性的任何結合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白。因此，類似物包括可以被前蛋白部分的切割所激活而產生活性結合域-免疫球蛋白融合多肽的前蛋白。
此處提到的由cDNA編碼的結合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的片段、衍生物或類似物，包括結合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白可以是(i)其中的一個或多個胺基酸殘基被保守的或非保守的胺基酸殘基(優選保守的胺基酸殘基)所取代，並且所述被取代的胺基酸殘基可以或不可以由遺傳密碼編碼，或(ii)其中的一個或多個胺基酸殘基包含取代基，或(iii)其中的其它胺基酸融合於結合域免疫球蛋白融合多肽，包括用於檢測結合域免疫球蛋白融合多肽或前蛋白序列，或對其進行特異性功能改變。根據此處的教導，所述片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員公知的範圍內。
本發明的多肽包括具有與本領域公知的序列或其片段或部分相同或相似的結合域多肽胺基酸序列的結合域免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白。例如用於說明而不是限定性的，人CD154分子胞外域可考慮用於本發明，作為與報導的多肽和所述多肽的部分具有至少70％相似性(優選70％同一性)，更優選90％相似性(優選90％同一性)，更優選95％相似性(優選95％同一性)的多肽，其中所述結合域免疫球蛋白融合多肽的部分一般含有至少30個胺基酸，更優選50個胺基酸。
如本領域所公知，兩個多肽間的「相似性」通過比較多肽的胺基酸序列和多肽的保守胺基酸取代與第二個多肽的序列而確定。編碼本發明的多肽的核酸的片段或部分可以用於合成本發明的全長核酸。如此處所用到的，「百分比同一性」表示當使用有空位的BLAST算法如Altschul et al.，1997 Nucl.Ac.Res.253389)對兩個或更多多肽進行比對並分析其序列時，相應胺基酸殘基位置處的相同胺基酸百分比，該算法根據國家衛生部/NCBI資料庫提供的預設加權，對序列空位和序列錯配進行加權(Bethesda，MD；見WWW.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast)。
「分離的」表示該物質被從其來源環境(例如，如果天然存在，則為天然環境)中取出。例如，存在於活動物體內的天然存在的核酸或多肽不是分離的，但與天然系統中一些或全部共存物質分開的相同核酸或多肽則是分離的。所述核酸可以是載體的部分和/或所述核酸或多肽可以是組合物的一部分，並且仍然是分離的，因為所述載體或組合物不是其天然環境的一部分。
「基因」表示參與產生多肽鏈的DNA的片段，它包括在編碼區之前和之後的區域「前導區和非轉錄尾區」以及各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。
如此處所描述，本發明提供了由具有框內融合於額外的免疫球蛋白結構域編碼序列的結合域編碼序列的核酸編碼的結合域免疫球蛋白融合蛋白，所述框內融合提供了與額外的功能性多肽序列融合的結合域多肽序列的表達，從而，例如但不限於允許了融合蛋白的檢測、功能性改變、分離和/或純化。所述融合蛋白可以通過含有影響融合產物行為的額外的免疫球蛋白來源的多肽序列而允許結合域的功能性改變，例如(以及上文所述)減少參與二硫鍵形成的巰基和賦予加強ADCC和/或CDC的能力。
可以通過本領域技術人員公知的任何方法實現多肽的修飾。此處的優選方法依賴於編碼融合蛋白的DNA的修飾和所述修飾DNA的表達。編碼上文所討論的結合域-免疫球蛋白融合蛋白之一的DNA可以採用標準方法進行誘變，包括下文所述方法。例如，可以從多肽中去除或取代促進多聚體形成或促進特定分子構象的半胱氨酸殘基，例如負責聚集物形成的半胱氨酸殘基。如果必要，可以通過缺失和/或取代半胱氨酸殘基而從經驗上確定有利於聚集的半胱氨酸殘基，並且確定得到的蛋白在含有生理可接受的緩衝液和鹽中是否聚集。此外，可以構建和使用結合域-免疫球蛋白融合蛋白的片段。如上文所指出，已經描述了許多候選結合域-免疫球蛋白融合蛋白的反受體/配體結合域，因此本領域技術人員可以容易選擇用於引入本發明的瞬時表達構建體的編碼產物中的適當多肽結構域。
胺基酸的保守取代是本領域公知的，可以在不改變得到的結合域免疫球蛋白融合蛋白分子的生物活性的條件下進行。例如，所述取代一般是通過在極性殘基、帶電殘基。疏水殘基、小殘基等之間進行的。如果必要，所述取代可以僅僅用體外生物測定法檢測得到的修飾蛋白結合適當的細胞表面受體、或結合適當抗原或所需靶分子的能力而進行經驗確定。
本發明進一步涉及與此處提供的結合域-免疫球蛋白融合蛋白的編碼多核苷酸序列雜交的核酸分子，或其互補序列，這對本領域技術人員是容易理解的，條件是在序列之間存在至少70％，優選至少90％，更優選至少95％同一性。本發明特別涉及在嚴格條件下與此處提到的結合域免疫球蛋白融合蛋白的編碼核酸雜交的核酸。此處用到的「嚴格條件」表示只有當序列之間有至少95％，優選97％同一性時才能雜交的條件。與結合域-免疫球蛋白融合蛋白的編碼核酸雜交的核酸在此處的優選實施方案中是指，編碼保持與此處引用的參考的cDNA編碼的結合域-免疫球蛋白融合多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。
此處用到的在特定的嚴格性條件下「雜交」是描述在兩個單鏈核酸分子之間形成的雜交體的穩定性。雜交的嚴格性一般是以雜交體退火和洗滌的離子強度和溫度條件表達的。「高」、「中」和「低」嚴格性包括以下條件或與其相當的條件高嚴格性0.1 x SSPE或SSC，0.1％SDS，65℃；中嚴格性0.2 x SSPE或SSC，0.1％SDS，50℃；低嚴格性1.0 x SSPE或SSC，0.1％SDS，50℃。如本領域技術人員所公知，可以通過改變用於預雜交、雜交和洗滌步驟的溶液的時間、溫度和/或濃度而達到雜交條件的嚴格性的改變，適當的條件也部分依賴於所使用探針，以及印跡的先證者核酸樣品的特定核苷酸序列。因此，可以理解，不用過多的實驗就可以容易選擇適當的嚴格條件，其中基於與一種或多種先證者序列雜交而不與某些其它先證者序列雜交的能力而鑑定探針的所需選擇性。
本發明的核酸分子，此處也稱作多核苷酸，可以是RNA或DNA形式，所述DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。用於本發明的編碼結合域免疫球蛋白融合多肽的編碼序列可以與本領域公知的編碼任何結合域-免疫球蛋白融合蛋白的序列同一，或者可以是不同的編碼序列，其由於遺傳密碼的冗餘或簡併而編碼相同的結合域-免疫球蛋白融合多肽。
編碼用於本發明的結合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可以包括，但不限於只有結合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列；結合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列和額外的編碼序列；結合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列(任選額外的變序列)和非編碼序列，例如內含子或結合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列的5』和/或3』非編碼序列，例如可以進一步包括，但不限於，可以是被調節的或可調節的啟動子、增強子、其它轉錄調節序列、阻遏物結合序列、翻譯調節序列或其它調節核酸序列的一種或多種調節性核酸序列。因此，編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的「核酸」或「多核苷酸」包括僅含有結合域-免疫球蛋白融合多肽的編碼序列的核酸和含有額外的編碼和/或非編碼序列的核酸。
用於此處的核酸和寡核苷酸可以通過本領域公知的任何方法合成(見，例如WO 93/01286，美國申請系列號07/723,454；美國專利5,218,088；美國專利5,175,269；美國專利5,109,124)。用於本發明的寡核苷酸和核酸序列的鑑定包括本領域公知的方法。例如，有用的寡核苷酸的所需特性、長度和其它特徵是公知的。在某些實施方案中，可以將合成寡核苷酸和核酸序列設計為抗內源性宿主細胞核酸裂解酶的降解，這是通過含有硫代硫酸酯、甲基膦酸酯、碸、硫酸酯、羰遊基、二硫代硫酸酯、氨基硫酸酯、磷酸酯等鍵和其它證明可用於反義應用的鍵而實現的(見，例如Agrwal et al.，Tetrehedron Lett.283539-3542(1987)；Miller et al.，J Am.Chem.Soc.936657-6665(1971)；Stec etal.，Tetrehedron Lett.2621912194(1985)；Moody et al.，Nucl.AcidsRes.124769-4782(1989)；Uznanski et al.，Nucl.Acids Res.(1989)；Letsinger et al.，Tetrahedron 40137-143(1984)；Eckstein，Annu.Rev.Biochem.54367-402(1985)；Eckstein，Trends Biol.Scie 1497-100(1989)；Stein InOligodeoxynucleotides.Antisense Inhibitors of GeneExpression，Cohen，Ed，Macmillan Press，London，P97-117(1989)；Jager et al.，Biochemistry 277237-7246(1988))。
在一種實施方案中，本發明提供了用於結合域-免疫球蛋白融合蛋白的截短成分(如結合域多肽、鉸鏈區多肽、接頭等)，在另一種實施方案中，本發明提供了編碼具有所述截短成分的結合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸。截短的分子可以是任何包含少於分子的全長形式的分子。本發明提供的截短分子可以包括截短的生物聚合物，在優選實施方案中，截短的分子可以是截短的核酸分子或截短的多肽。截短的分子具有已知或已描述過的核酸分子的少於全長的核苷酸序列，所述已知或已描述過的核酸分子可以是天然存在的、合成的或重組的核酸分子，只有本領域技術人員認為它是全長分子。這樣，例如，相當於基因序列的截短的核酸分子含有少於全長的基因，其中該基因包含編碼和非編碼序列、啟動子、增強子和其它調節序列、側翼序列等，以及認為是基因的一部分的其它功能性和非功能性序列。在另一實施例中，相當於mRNA序列的截短的核酸分子含有少於全長的mRNA轉錄物，該mRNA轉錄物可以包含各種翻譯和非翻譯區以及其它功能性和非功能性序列。
在其它優選實施方案中，截短的分子是包含少於特定蛋白或多肽成分的全長胺基酸序列的多肽。此處用到的「缺失」具有本領域技術人員所理解的其常用的含義，並可以在任意末端或非末端區相對於相應的全長分子缺乏序列的一個或多個部分，例如，此處提供的截短分子。作為線性生物聚合物的截短分子如核酸分子或多肽可以在分子的任意末端具有一個或多個缺失，或者在分子的非末端區具有缺失，其中所述缺失可以是1-1500個連續核苷酸或胺基酸殘基的缺失，優選1-500個連續核苷酸或胺基酸殘基的缺失，更優選1-300個連續核苷酸或胺基酸殘基的缺失。在某些特別優選的實施方案中，截短的核酸分子可以具有270-330個連續核苷酸的缺失。在某些其它特別優選的實施方案中，截短的多肽分子可以具有80-140個連續胺基酸的缺失。
本發明進一步涉及此處提到的編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽的片段、類似物和/或衍生物的核酸的變體。編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸的變體可以是核酸的天然存在的等位變體或天然存在的變體。如本領域所公知，等位變體是可能具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加中的至少一種的核酸序列，其中任意一種都基本不改變被編碼的結合域-免疫球蛋白融合多肽的功能。
可以通過編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽的核苷酸序列的突變而獲得結合域-免疫球蛋白融合多肽的變體和衍生物。可以通過任意常規方法完成天然胺基酸序列的改變。可以通過合成含有突變序列的寡核苷酸將突變引入特定位點，其側翼為能夠與天然序列的片段連接的限制位點。連接後，得到的重構序列編碼具有所需胺基酸插入、取代或缺失的類似物。
或者，可以使用定位於寡核苷酸的位點特異性誘變程序來提供改變的基因，其中預定的密碼子可以通過取代、缺失或插入來改變。進行所述改變的示例性的方法公開於Walder et al.(Gene 42133，1986)；Bauer et al.(Gene 3773，1985)；Craik(BioTechniques，January1985，12-19)；Smith et al.(Genetic EngineeringPrinciples andMethods BioTechniques，January 1985，12-19)；Smith et al.(GeneticEngineering.Principles and Methods，Plenum Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad Sci.USA 82488，1985)；Kunkel et al.(Methods inEnzymol.154367，1987)；以及美國專利4,518,584和4,737,462。
例如，可以通過對編碼蛋白的DNA進行定點誘變並聯合使用DNA擴增方法而修飾DNA，在擴增方法中使用引物在DNA模板中引入並擴增改變，例如通過重疊延伸(SOE)進行PCR剪接。定點誘變一般是採用具有單鏈和雙鏈形式的噬菌體載體而實現的，所述載體如公知並可以購得的M13噬菌體載體。可以使用其它適當的含有單鏈噬菌體複製起點的載體(見，例如Veira et al.，Meth.Enzymol.153，1987)。概言之，通過製備編碼目的蛋白(如特定結合域-免疫球蛋白融合蛋白的全部或組成部分)的單鏈載體進行定點誘變。在與單鏈載體中的DNA同源的區域內含有所需突變的寡核苷酸引物與載體退火，然後加入DNA聚合酶，例如大腸桿菌DNA聚合酶I(克列諾片段)，該聚合酶使用雙鏈區作為引物，以產生異雙鏈體，其中一條鏈編碼改變的序列，另一條為最初的序列。將異雙鏈體引入適當的細菌細胞並選擇包含所需突變的克隆。得到的改變的DNA分子可以在適當宿主細胞中重組表達以產生修飾的蛋白。
本發明也包括編碼各種胺基酸殘基或序列的添加或取代，或末端缺失或生物活性所不需要的內部殘基或序列缺失的等同的DNA構建體。例如，如上文所討論，編碼不需要的或對生物活性不是關鍵的Cys殘基的序列可以進行改變，導致Cys殘基缺失或被其它胺基酸取代，從而防止在復性時形成異常分子內二硫橋。
宿主生物包括那些可以重組產生本發明的重組構建體編碼的結合域-免疫球蛋白融合產物的生物，例如細菌(如大腸桿菌)、酵母(例如啤酒糖酵母和巴斯德畢赤氏酵母)、昆蟲細胞和哺乳動物，包括體內和體外表達。因此宿主生物可以包括用於此處提供的疫苗的構建、繁殖、表達或其它步驟的生物；宿主也包括其中發生免疫應答的受試者，如上文所述。此處優選的宿主生物是大腸桿菌株，近交鼠系和鼠細胞系，以及人細胞、受試者和細胞系。
將編碼所需結合域-免疫球蛋白融合蛋白的DNA構建體引入用於在適當宿主中表達的質粒。在優選實施方案中，宿主是細菌宿主。編碼配體或核酸結合域的序列優選進行了密碼子優化，用於在特定宿主中表達。因此，例如，如果人結合域-免疫球蛋白融合蛋白在細菌中表達，將對密碼子進行優化用於細菌使用。對於小的編碼區，可以將基因合成為單個寡核苷酸。對於較大的蛋白，可以使用多個核苷酸的剪接、誘變或其它本領域公知的技術。質粒中的作為調節區的核苷酸序列，例如啟動子和操縱子，進行了彼此的操作性結合，用於轉錄。編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的核苷酸序列也可以包括編碼分泌信號的DNA，由此得到的肽是前體蛋白。得到的加工後的蛋白可以從周質間隙或發酵培養基中回收。
在優選實施方案中，DNA質粒也包含轉錄終止子序列。此處用到的「轉錄終止子區」是傳遞轉錄終止信號的序列。完整的轉錄終止子可以從蛋白編碼基因獲得，該基因可以與插入的結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼基因或啟動子來源相同或不同。轉錄終止子任選是此處的表達系統的成分，但在優選實施方案中使用。
此處使用的質粒包含與編碼目的蛋白或多肽的DNA操作性連接的啟動子，並且設計用於在上文所述宿主(例如細菌、鼠或人)中表達蛋白，這取決於質粒的所需用途(例如，給予含有結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼序列的疫苗)。用於表達此處的蛋白和多肽的適當啟動子可以從多種途徑獲得，並且是本領域公知的。優選連接於調節區的誘導型或組成型啟動子。這些啟動子包括，但不限於T7噬菌體啟動子或其它T7樣噬菌體啟動子，例如T3，T5和SP6啟動子，trp，lpp和lac啟動子，如大腸桿菌的lacUV5啟動子；杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的P10或多角體蛋白基因啟動子(見，例如美國專利5,243,041，5,242,687，5,266,317，4,745,051和5,169,784)以及來自於其它真核表達系統的誘導型啟動子。對於表達蛋白，將這些啟動子插入質粒，與控制區如lac操縱子處於操作性連接。
優選的啟動子區是在大腸桿菌中可誘導並且具有功能的。適當的誘導型啟動子和啟動子區的例子包括，但不限於，反應於異丙基-D-硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG；見Nakamura et al.，Cell 181109-1117，1979)的大腸桿菌lac操縱子；反應於重金屬(如鋅)誘導的金屬硫蛋白啟動子金屬調節元件(見例如Evans等的美國專利4,870,009)；反應於IPTG的噬菌體T7lac啟動子(見例如美國專利4,952,496；和Studier et al.，Meth.Enzymol.18560-89，1990)以及TAC啟動子。
質粒可以任選包含在宿主中具有功能的一個或多個可選擇標記基因。可選擇標記基因包括任何賦予細菌能夠使被轉化細菌細胞從大量未轉化細胞中鑑定出來並選擇性生長的表型的基因。用於細菌宿主的適當可選擇標記，例如包括氨苄青黴素抗性基因(Ampr)、四環素抗性基因(Tcr)和卡那黴素抗性基因(Kanr)。在此優選卡那黴素抗性基因。
質粒也可以包含編碼用於可操作性連接的蛋白的分泌信號的DNA。使用的分泌信號可以從多種途徑獲得並且是本領域公知的。此處優選的分泌信號包括，但不限於，由以下大腸桿菌基因編碼的信號ompA，ompT，ompF，ompC，β-內醯胺酶和鹼性磷酸酶等(von Heijne，JMoL BioL 18499-105，1985)。此外，可以使用細菌pelB基因分泌信號(Lei et al.，J.Bacteriol.1694379，1987)，phoA分泌細胞和在昆蟲細胞中有功能的cek2。最優選的分泌信號是大腸桿菌ompA分泌信號。也可以使用本領域公知的其它原核和真核分泌信號(見，例如vonHeijne，J MoL Biol.18499-105，1985)。採用此處描述的方法，本領域技術人員可以替換在酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中有功能的分泌信號以從這些細胞分泌蛋白。
用於轉化大腸桿菌細胞的優選質粒包括pET表達載體(如pET-lla，pET-12a-c，pET-15b；見美國專利4,952,496；可以從Novagen，Madison，WI.獲得)。其它優選的質粒包括pKK質粒，特別是pKK223-3，它含有tac啟動子(Brosius et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.816929，1984；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology；美國專利5,122,463，5,173,403，5,187,153，5,204,254，5,212,058，5,212,286，5,215,907，5,220,013，5,223,483和5,229,279)。已經通過用卡那黴素基因替代氨苄青黴素抗性基因而修飾質粒pKK(可以從Pharmacia；得自pUC4K，見例如Vieira et al(Gene 19259-268，1982；和美國專利4,719,179.)。杆狀病毒載體，例如pBlueBac(也稱作pJVETL及其衍生物)，特別是pBlueBac III(見例如美國專利5,278,050，5,244,805，5,243,041，5,242,687，5,266,317，4,745,051和5,169,784；可以從Invitrogen，San Diego得到)也可以用於在昆蟲細胞中表達多肽。其它質粒包括pIN-IIIompA質粒(見美國專利4,575,013；也見Duffaud et al.，Meth.Enz.153492-507，1987)，例如pIN-IIIompA2。
優選地，DNA分子在細菌細胞中複製，優選在大腸桿菌中複製。優選的DNA分子也包括細菌的複製起點，以保證DNA分子在細菌的各代中保留。以此方式，可以通過在細菌中的複製產生大量DNA分子。優選的細菌複製起點包括，但不限於fl-ori和col E1複製起點。優選的宿主細胞含有可操作性連接於誘導型啟動子，如lacUV啟動子的編碼T7 RNA聚合酶的DNA(見美國專利4,952,496)。所述宿主包括，但不限於溶原體大腸桿菌株HMS174(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysS，HMS174(DE3)和BL21(DE3)。菌株BL21(DE3)是優選的。pLys提供了低水平的T7溶菌酶，即T7 RNA聚合酶的一種天然抑制劑。
提供了DNA分子也可以含有編碼阻遏蛋白的基因。阻遏蛋白能夠抑制含有結合於阻遏蛋白的核苷酸序列的啟動子的轉錄。可以通過改變細胞的生理條件而解除啟動子的阻遏。例如，該改變可以通過在生長培養基中加入抑制與操縱子或調節蛋白或DNA的其它區域相互作用的能力的分子或通過改變生長培養基的溫度而完成。優選的阻遏蛋白包括，但不限於反應於IPTG誘導的大腸桿菌lacI阻遏物，溫度敏感性λcI857阻遏物等。
概言之，本發明的重組構建體也將含有轉錄和翻譯的必要元件。具體地，這些元件是優選的，其中含有編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸的重組表達構建體將用於在宿主細胞或生物中報導。在本發明的某些實施方案中，可以通過放置啟動子調節下的基因而完成細胞結合域免疫球蛋白-融合蛋白編碼基因的細胞類型優選性或細胞類型特異性表達。啟動子的選擇將取決於待轉化細胞類型和所需控制的程度或類型。啟動子可以是組成型的或有活性的，並且可以進一步是細胞類型特異性的，組織特異性的、各個細胞特異性的、事件特異性的、時間特異性的或誘導型的。細胞類型特異性啟動子和事件類型特異性的啟動子是優選的。組成型或非特異性啟動子的例子包括SV40旱期啟動子(美國專利5,118,627)、SV40晚期啟動子(美國專利5,118,627)、CMV早期基因啟動子(美國專利5,168,062)，以及腺病毒啟動子。除病毒啟動子外，細胞啟動子也用於本發明的內容。具體地，可以使用用於所謂的管家基因的細胞啟動子。病毒啟動子是優選的，因為它們一般是比細胞啟動子更強的啟動子。已經在許多真核生物，包括高等真核生物中鑑定了啟動子區，這樣本領域技術人員可以容易選擇用於特定宿主的適當啟動子。
也可以使用誘導型啟動子。這些啟動子包括由地塞米松誘導的MMTV LTR(PCT WO 91/13160)、由重金屬誘導的金屬硫蛋白啟動子；和由cAMP誘導的具有cAMP反應元件的啟動子。通過使用誘導型啟動子，編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸序列可以由本發明的表達構建體遞送至細胞，並且保持靜止，直到加入誘導劑。這允許了對基因產物的產生時間的進一步控制。
事件類型特異性啟動子僅僅在發生某種事件，如致腫瘤性或病毒感染時才有活性或被上調。HIV LTR是事件類型特異性啟動子的公知例子。該啟動子是無活性的，除非存在tat基因產物，這是在病毒感染時發生的。一些事件類型特異性啟動子也是組織特異性的。
此外，可以使用由特定細胞基因協同調節的啟動子。例如，當需要特定結合域融合蛋白編碼基因的表達與一個或多個額外內源性或外源性引入的基因協同時，可以使用協同表達的基因的啟動子。當已知與在免疫系統的特定組織中引入免疫應答相關的基因表達模式時，這種類型的啟動子特別有用，這樣該組織內的特異性免疫感受態細胞可以被激活或募集參與免疫應答。
除了啟動子外，可以插入阻遏序列、負調節子、或組織特異性沉默子，以減少某些情況下結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼基因的非特異性表達，所述情況例如，作為治療策略的一部分而瞬時無免疫應答的宿主。可以在啟動子區插入多種阻遏元件。轉錄的阻遏是不依賴於阻遏元件的方向或與啟動子的距離的。一種類型的阻遏序列是絕緣序列。這種序列抑制轉錄(Dunaway et al.，Mol Cell Biol 17182-9，1997；Gdula et al.，Proc Natl Acad Sci USA 939378-83，1996，Chan et al.，JVirol 705312-28，1996；Scott and Geyer，EMBO J 146258-67，1995；Kalos and Fournier，Mol Cell Biol 15198-207，1995；Chung et al.，Cell74505-14，1993)並將沉默本底轉錄。
也在II型(軟骨)膠原、鹼性醯基轉移酶、白蛋白(Hu et al.，J.CellGrowth Differ.3(9)577-588，1992)、磷酸甘油激酶(PGK-2)(Misuno etal.，Gene 119(2)293-297，1992)的啟動子區和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶基因中鑑定了阻遏元件(Lemaigre et al.，Mol.Cell Biol.11(2)1099-1106)。此外，在許多肝臟特異性基因中鑑定了陰性負調節元件Tse-1，發現其阻斷cAMP反應元件-(CRE)介導的肝細胞中基因激活的誘導(Boshart et al.，Cell 61(5)905-916，1990)。
在優選實施方案中，將增加所需產物的表達的元件摻入構建體中。所述元件包括內部核糖體結合位點(IRES；Wang and Siddiqui，Curr.Top.Microbiol.Immunol 20399，1995；Ehrenfeld and Semler，Curr.Top.Microbiol.Immunol.20365，1995；Rees et al.，Biotechniques 20102，1996；Sugimoto et al.，Biotechnology 12694，1994)。IRES增加翻譯效率。同樣，其它序列也增加表達。對於一些基因，特別是在5』端的序列抑制轉錄和/或翻譯。這些序列通常是可以形成髮夾結構的迴文序列。一般去除待遞送核酸中的這種序列。對轉錄或翻譯產物的表達水平進行了測定，以證實或確定哪些序列影響表達。可以用任何公知的方法測定轉錄水平，包括RNA印跡雜交，RNA酶探針保護等。可以通過任意公知的方法測定蛋白水平，包括ELISA，蛋白印跡，免疫細胞化學或其它公知方法。
可以將其它元件摻入本發明的結合域免疫球蛋白融合蛋白中。在優選實施方案中，該構建體包含轉錄終止子序列，包括聚腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，以及增強子。也可以摻入其它用於表達構建體和將其維持在哺乳動物細胞或其它真核細胞中的元件(如複製起點)。由於這些構建體可以方便地在細菌細胞中產生，摻入了對於在細菌中增殖是必要的，或者增強在細菌中增殖的元件。所示元件包括複製起點、可選擇標記等。
此處通過同時遞送兩種或更多的不同調節的核酸構建體而使用本發明的構建體將對結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸的表達的附加控制遞送給細胞。使用這樣的多核酸構建體方法可以允許免疫應答的協同調節，例如，依賴於細胞類型和/或另一所表達的被編碼成分的空間時間協同。本領域技術人員可以理解，通過選擇適當的調節序列可以用相似的方式完成多個水平的被調節基因表達，所述調節序列包括但不限於啟動子、增強子和其它公知的基因調節元件。
本發明也涉及載體，以及通過包含本發明的核酸的公知載體製備的構建體，特別涉及包含結合域-免疫球蛋白融合蛋白的任何編碼核酸的「重組表達構建體」和上文提供的本發明的多肽；涉及通過用本發明的載體和/或構建體而基因工程化的宿主細胞，以及通過重組技術施用包含本發明的所述結合域-免疫球蛋白融合多肽和融合蛋白，或其片段或變體的編碼核酸的方法。結合域-免疫球蛋白融合蛋白基本可以在適當啟動子的控制下在任何宿主細胞中表達，這取決於構建體的性質(如上文所述啟動子的類型)，以及所需宿主細胞的性質(如是有絲分裂後最終分化或活躍分裂；如表達構建體在宿主細胞中是作為附加體存在還是整合到宿主基因組中)。用於原核和真核宿主的適當克隆和表達載體描述於Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，(1989)，如上文所指出，在本發明的特別優選的實施方案中，在用本發明的重組表達構建體轉染或轉化的哺乳動物細胞中進行重組表達。
一般地，用質粒載體遞送構建體。優選的構建體是改進的pNASS載體(Clontech，Palo Alto，CA)，其具有編碼氨苄青黴素抗性基因的核酸、聚腺苷酸化信號和T7啟動子位點。其它適當的哺乳動物表達載體是公知的(見，例如，Ausubel et al.，1995；Sambrook et al.，supra；也見，例如catalogues from Invitrogen，San Diego，CA；Novagen，Madison，WI；Pharmacia，Piscataway，NJ，及其它)。目前可以製備的優選構建體包含適當調控下的二氫喋呤還原酶(DHFR)編碼序列，用於增加結合域-免疫球蛋白融合蛋白的產生水平，該水平是通過在施用適當選擇試劑(如methetrexate)後進行基因擴增而達到的。
一般地，重組表達載體包括允許宿主細胞轉化的複製起點和可選擇標記，以及來自於高表達的基因、用於指導下遊結構序列轉錄的上文所述的啟動子。異源結構序列與翻譯起始和終止序列組裝在適當噬菌體中。因此，例如，此處提供的結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸可以包含在各種表達載體中，所述載體構建為重組表達構建體，用於在宿主細胞中表達結合域-免疫球蛋白融合多肽。在某些優選實施方案中，構建體包含在體內給藥的製劑中。所述載體和構建體包括染色體的、非染色體的和合成DNA序列，如，SV40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；酵母質粒，來源於質粒和噬菌體DNA的聯合的載體、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒，以及假狂犬病病毒或複製缺陷逆轉錄病毒的DNA，如下文所述。然而，任何其它載體可以用於製備重組表達構建體，在優選實施方案中，所述載體是可複製的，並且可在宿主中存活。
可以通過各種程序將適當的DNA序列插入載體中。概言之，通過本領域公知的程序將DNA序列插入適當的限制性內切酶位點。用於克隆、DNA分離、擴增和純化的標準技術，用於酶促反應的標準技術，包括DNA連接酶，DNA聚合酶、限制性內切酶等，以及各種分離技術是本領域技術人員公知和通常使用的。許多標準技術描述於，例如Ausubel et al.(1993 Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publ.Assoc.Inc. John Wiley Sons，Inc.，Boston，MA)；Sambrook et al.(1989 Molecular Cloning，Second Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Plainview，NY)；Maniatis et al.(1982 MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY)；Glover(Ed.)(1985 DNA Cloning Vol.I and II，IRL Press，Oxford，UK)；Hames andHiggins(Eds.)，(1985 Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，Oxford，UK)；及其它。
表達載體中的DNA序列與至少一種適當的表達控制序列(如組成型啟動子或受調節的啟動子)操作性連接，以指導mRNA合成。這種表達控制序列的代表性例子包括真核細胞啟動於或上述真核細胞病毒。可以使用CAT(氯黴素轉移酶)載體或其它具有可選擇標記的載體從任何需要的基因選擇啟動子區。真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、逆轉錄病毒LTR啟動子和小鼠金屬硫蛋白-I啟動子。適當啟動子的選擇處於本領域普通技術人員的水平之內，此處描述了某些特別優選的重組表達構建體的製備，其中包含與編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽的核酸可操作性連接的至少一種啟動子或受調節啟動子。
由高等真核動物進行的編碼本發明的多肽的轉錄可以通過將增強子序列插入載體而增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10-300bp，作用於啟動子以增加其轉錄。增強子的例子包括位於複製起點晚期側100-270bp的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點晚期側的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。
此處在某些實施方案中提供的載體可以是病毒載體如逆轉錄病毒載體(Miller et al.，1989 Bio Techniques 7980；Coffin and Varmus，1996 Retroviruses，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.)。例如，可以得到逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄病毒包括，但不限於莫洛尼鼠類白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉錄病毒如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺腫瘤病毒。
逆轉錄病毒是一種通過DNA中間體能複製並整合到宿主細胞基因組中的RNA病毒。該DNA中間體，或前病毒，可以穩定整合到宿主細胞DNA。根據本發明的某些實施方案，疫苗可以包含摻入了編碼外源蛋白的外源基因而替代正常逆轉錄病毒RNA的逆轉錄病毒。當逆轉錄病毒伴隨感染進入宿主細胞時，外源基因也引入細胞中，然後可以作為逆轉錄病毒基因組的一部分而整合到宿主細胞DNA中。該外源基因的在宿主中的表達導致外源蛋白的表達。
開發用於基因治療的大多數逆轉錄病毒系統都是基於鼠逆轉錄病毒。所述逆轉錄病毒以兩種形式存在，即作為稱作毒粒的游離病毒顆粒，或作為整合到宿主細胞DNA中的前病毒。毒粒形式的病毒含有逆轉錄病毒的結構蛋白和酶蛋白(包括逆轉錄酶)、病毒基因組的兩個RNA拷貝、以及含有病毒被膜糖蛋白的來源細胞質膜的部分。逆轉錄病毒基因組組織為四個主要區域含有轉錄起始和終止所必須的順式作用元件並且位於編碼基因的5』和3』的長末端重複(LTR)，以及三個編碼基因gag，pol和env。這三個基因gag，pol和env分別編碼內部病毒結構、酶蛋白(如整合酶)以及賦予病毒感染性和宿主範圍特異性的被膜糖蛋白(稱為gp70和pl5e)，以及未確定功能的「R」肽。
已經開發了單獨的包裝細胞系和載體產生細胞系，這是出於逆轉錄病毒使用的安全性考慮，包括它們在本發明的疫苗中使用的安全性。簡言之，該方法使用了兩種成分，逆轉錄病毒載體和包裝細胞系(PCL)。逆轉錄病毒載體含有長末端重複(LTRs)、待轉移的外源DNA和包裝序列(y)。該逆轉錄載體自身不會複製，因為編碼結構蛋白和被膜蛋白的基因沒有包含在載體基因組中。PCL含有編碼gag，pol和env蛋白的基因，但不含包裝信號＂y＂。這樣，PCL自身只能形成空的毒粒。在此普通方法中，將逆轉錄病毒載體引入PCL中，從而建立載體產生細胞系(VCL)。該VCL製造僅含有逆轉錄病毒(外源)基因組的毒粒，因此被認為是用於質粒用途的安全的逆轉錄病毒載體。
「逆轉錄病毒載體」是指在本發明優選實施方案中能夠指導目的序列或基因，如結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸序列的表達的組裝體。簡言之，逆轉錄病毒構建體可以包含5′LTR、tRNA結合位點、包裝信號、第二條鏈DNA合成的起點和3′LTR。可以將多種異源序列包含在載體構建體中，例如，編碼蛋白(如細胞毒性蛋白、疾病相關抗原、免疫輔助分子或替代基因)的序列，或自身作為分子的序列(如作為核酶或反義序列)。
可以容易從多種逆轉錄病毒構建本發明的逆轉錄病毒構建體，包括例如B、C和D型逆轉錄病毒以及泡沫病毒和慢病毒(見，例如RNATumor Viruses，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。所述逆轉錄病毒可以容易從存放處或保藏中心獲得，例如從美國典型培養物保藏中心(＂ATCC＂；Rockville，Maryland)，或者使用常用技術從公知來源分離。根據此處提供的公開內容和標準重組技術，可以使用上述任意逆轉錄病毒以組裝或構建本發明的逆轉錄病毒載體構建體、包裝細胞或生產細胞(如Sambrook et al，MolecularCloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；Kunkle，PNAS 82488，1985)。
用於病毒載體中的適當啟動子可以包括，但不限於描述於Miller，etal.，Biotechniques 7980-990(1989)中的逆轉錄病毒LTR；SV40啟動子和人巨細胞病毒(CMV)啟動子，和任意其它啟動子(如細胞啟動子，如真核細胞啟動子，包括但不限於組蛋白、pol III和β肌動蛋白啟動子)。其它可以使用的病毒啟動子包括，但不限於腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。根據此處包含的教導和上文描述的受調節啟動子或啟動子，本領域技術人員可以明白適當啟動子的選擇。
如此處所描述，使用逆轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系以形成生產細胞系。可以轉染的包裝細胞系包括，但不限於Miller，HumanGene Therapy，15-14(1990)中描述的PE501，PA317，ψ-2，ψ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，ψCRE，ψCRIP，GP+E-86，GP+envAml2和DAN細胞系。載體可以通過本領域的任何方法轉導包裝細胞系。這些方法包括，但不限於，電穿孔，脂質體的使用和CaPO4沉澱。在另一選擇中，逆轉錄病毒質粒載體可以包被在脂質體中，或偶聯於脂，然後給予宿主。
生產細胞系產生包含編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列的感染性逆轉錄病毒載體顆粒。然後用這些逆轉錄病毒載體顆粒體外或體內轉導真核細胞。被轉導的真核細胞將表達編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白的核酸序列。可以轉導的真核細胞包括，但不限於，胚胎幹細胞，以及造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、循環外周血單核細胞和多形核細胞，包括骨髓單核細胞、淋巴細胞、成肌細胞、組織巨噬細胞、樹突細胞、肝巨噬細胞、淋巴結和脾的淋巴和網狀內皮細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。
作為本發明的用病毒載體製備重組結合域-免疫球蛋白融合表達構建體的實施方案的另一個例子，在一個優選實施方案中，用指導結合域免疫球蛋白融合多肽或融合蛋白表達的重組病毒構建體轉導的宿主細胞可以產生病毒顆粒，該病毒顆粒含有被表達的來源於病毒出芽時由病毒顆粒摻入的宿主細胞膜的部分的結合域-免疫球蛋白融合蛋白融合多肽或融合蛋白。
另一方面，本發明涉及含有上述重組結合域-免疫球蛋白融合表達構建體的宿主細胞。用本發明的載體和/或表達構建體基因工程化(轉導、轉化或轉染)的宿主細胞可以是，例如，克隆載體、穿梭載體或表達構建體。該載體或構建體可以是，例如，質粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。工程化的宿主細胞可以在經改進的常規營養培養基中培養，該培養基適於激活啟動子、選擇轉化體或擴增特定基因如編碼結合域-免疫球蛋白融合多肽或結合域-免疫球蛋白融合蛋白的基因。選擇用於表達的特定宿主細胞的培養條件，如溫度、pH等對於本領域技術人員是容易理解的。
宿主細胞可以是高等真核細胞，如哺乳動物細胞，或低等真核細胞，如酵母細胞，或宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞。適當宿主細胞的代表性例子包括，但不需要限於細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌、傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾Sf9；動物細胞，如CHO，COS或293細胞；腺病毒；植物細胞，或適於體外繁殖或從頭建立的適當細胞。本領域技術人員根據此處的教導應該能夠選擇適當宿主細胞。
也可以使用多種哺乳動物細胞培養系統來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統的例子包括由Gluzman，Cell 23175(1981)描述的猴腎成纖維細胞的COS-7系，以及其它能夠表達相容載體的細胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體將包含複製起點、適當的啟動子和增強子，以及必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列、和5』側翼非轉錄序列，例如此處所提供的關於結合域-免疫球蛋白融合表達構建體的製備。來源於SV40剪接的DNA序列，以及聚腺苷酸化位點可以用於提供需要的非轉錄遺傳元件。將構建體引入宿主細胞可以通過本領域技術人員熟悉的各種方法而實現，包括但不限於，例如，磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖苷介導的轉染或電穿孔(Davis et al.，1986 Basic Methods inMolecular Biology)。
可以將本發明的結合域-免疫球蛋白融合蛋白製劑化為藥物組合物，用於根據常規方法給藥。藥物組合物一般包含一種或多種重組表達構建體，和/或所述構建體的表達產物，並組合了可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。所述載體在使用的劑量和濃度下對接受者是無毒的。對於基於核酸的製劑，或包含本發明的重組構建體的表達產物的製劑，將給予約0.01μg/kg-約100mg/kg體重，一般通過真皮內、皮下、肌內或靜脈途徑或其它途徑。優選的劑量為約1μg/kg-約1mg/kg，約5μg/kg-約200μg/kg是特別優選的。本領域技術人員將明白，給藥的次數和頻率將取決於宿主的反應。用於治療用途的「可藥用載體」是製藥領域公知的，描述於，例如Remingtons Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。例如，可以使用生理pH的無菌鹽水和磷酸緩衝鹽水。可以通過藥物組合物形式提供防腐劑、穩定劑、染料和調味劑。例如，可以添加苯甲酸鈉、山梨酸和β-羥基苯甲酸的酯作為防腐劑。Id.1449。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。Id。
「可藥用鹽」是指本發明的化合物的鹽，它來自於所述化合物和有機或無機酸(酸加成鹽)或有機或無機鹼(鹼加成鹽)的組合。本發明的化合物可以以游離鹼或鹽形式使用，兩種形式都考慮處於本發明的範圍內。
含有一種或多種結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼構建體(或它們的表達產物)的藥物組合物可以是允許將該組合物給予患者的任何形式。例如，該組合物可以是固體、液體或氣體(氣溶膠)。典型的給藥途徑包括，但不限於口服、局部、腸胃外(如舌下或頰)、舌下、直腸、陰道和鼻內給藥。此處使用的術語腸胃外包括皮下注射、靜脈內、肌內、胸骨內、鞘內、腔道內、尿道內注射和輸注技術。對藥物組合物進行製劑化，從而允許其中含有的活性成分在將組合物給予患者時是生物可利用的。將給予患者的組合物是一種或多種劑量單位的形式，例如，片劑可以是單劑量單位，本發明的氣溶膠形式的一種或多種化合物的容器可以具有多個劑量單位。
對於口服給藥，可以存在賦形劑和/或粘合劑。其例子包括蔗糖、高嶺土、甘油、澱粉糊精、藻酸鈉、羧甲基纖維素和乙基纖維素。可以存在著色劑和/或調味劑。可以使用包衣。
組合物可以是液體，如酏劑、糖漿、溶液、乳狀液或懸浮液形式。該液體可以用於作為兩個例子的口服給藥或通過注射遞送。當用於口服給藥時，除一種或多種結合域-免疫球蛋白融合構建體或表達產物外，優選的組合物還含有一種或多種增甜劑、防腐劑、染料/著色劑和調味劑。在用於注射給藥的組合物中，可以含有一種或多種表面活性劑、防腐劑、潤溼劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑和等滲劑。
不論是溶液、懸浮液或其它形式，此處用到的液體藥物組合物可以包含一種或多種一些佐劑無菌稀釋劑如用於注射的水、鹽溶液，優選生理鹽水、林格氏液、等滲氯化鈉，固定的油，如可以作為溶劑或懸浮介質的合成甘油單酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節滲透壓的試劑如氯化鈉或右旋糖。腸胃外製劑可以包含於玻璃或塑料製備的安瓿、一次性注射器或多劑量管形瓶中。生理鹽水是優選的佐劑。可注射的藥物組合物優選是無菌的。
製劑中也可能需要包含其它成分，如遞送載體，包括但不限於鋁鹽、油包水乳狀液、生物可降解油載體、水包油乳狀液、生物可降解微膠囊和脂質體。用於所述載體中的免疫刺激物質(佐劑)包括N-乙醯胞壁醯-L-丙氨酸-D-異穀氨醯胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ幹擾素和IL-15。
儘管在本發明的藥物組合物中可以使用任何適當的本領域技術人員公知的載體，載體的類型將根據給藥方式和是否需要持續釋放而不同。對於腸胃外給藥，如皮下注射，載體優選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩衝液。對於口服給藥，可以使用任何上述載體或固體載體如甘露醇、乳糖、澱粉硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。也可以將生物可降解微球體(如polylactic galactide)也可以用作本發明的藥物組合物的載體。適當的生物可降解微球體公開於，例如美國專利4,897,268和5,075,109。在這一點上，微球體優選大於約25微米。
藥物組合物也可以包含稀釋劑如緩衝液、抗氧化劑如抗壞血酸、低分子量(小於約10個殘基)多肽、蛋白、胺基酸、糖，包括葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合劑如EDTA、穀胱甘肽及其它穩定劑和賦形劑。中性緩衝鹽水或與非特異性血清白蛋白混合的鹽水是極為適合的稀釋劑。優選地，用作為稀釋劑的適當賦性溶液(如蔗糖)將該產物製劑化為凍乾物。
如上文所述，本發明包括能夠遞送編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的核酸分子的組合物。所述組合物包括重組病毒載體(如逆轉錄病毒(見WO 90/07936，WO 91/02805，WO 93/25234，WO 93/25698和WO 94/03622)，腺病毒(見Berkner，Biotechniques 6616-627，1988；Liet al.，Hum.Gene Ther.4403-409，1993；Vincent et al.，Nat.Genet.5130-134，1993；和Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91215-219，1994)，以及痘病毒(見美國專利4,769,330；美國專利5,017,487和WO 89/01973))，複合於聚陽離子分子的重組表達構建體核酸分子(見WO 93/03709)，和脂質體相關的核酸(見Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847851，1987)。在某些實施方案中，DNA可以連接於殺死的或滅活的腺病毒(見Curiel et al.，Hum.Gene Ther.3147-154，1992；Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896094，1992)。其它適當的組合物包括DNA-配體(見Wu et al.，J.Biol.Chem.26416985-16987，1989)和脂質-DNA組合(見Felgner et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA847413-7417，1989)。
除了定位於體內程序，也可以使用體外程序，其中從宿主取出細胞，進行修飾，然後置於相同或另一宿主動物。明顯的是，可以使用上述任意一種組合物，將結合域-免疫球蛋白融合蛋白或結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼核酸分子引入體外的組織細胞。病毒、物理和化學攝取方法的程序是本領域公知的。
因此，本發明用於治療B細胞疾病或惡性狀況的患者，或用於治療來源於所述患者的細胞培養物。此處用到的「患者」是指任何溫血動物，優選人。患者可以患有癌症，如B細胞淋巴瘤或可以是正常的(即沒有可檢測的疾病和感染)。「細胞培養物」是任何可以進行離體處理的製備物，例如，含有免疫系統的免疫感受態細胞或分離細胞(包括但不限於T細胞、巨噬細胞、單核細胞、B細胞和樹突細胞)的製備物。所述細胞可以通過本領域公知的多種技術進行分離(如Ficoll-hypaque密度離心)。細胞可以(但不是必須)從B細胞疾病或惡性狀況的患者中分離，並且可以在治療後重新引入患者。
用於腸胃外或口服給藥的液體組合物可以含有一定量的結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼構建體或表達產物，從而獲得適當的劑量。一般地，該量為組合物中含有至少0.01wt％結合域-免疫球蛋白融合構建體或表達產物。當用於口服給藥時，該量可以是組合物的0.1-70wt％。優選口服組合物含有約4-50wt％的結合域-免疫球蛋白融合構建體或表達產物。優選組合物和製劑製備物一個腸胃外劑量單位含有0.01-1wt％活性化合物。
藥物組合物可以用於局部給藥，在此情況下載體可以適當包括溶液、乳狀液、油膏或凝膠基質。該基質，例如可以包含一種或多種一些成分礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑如水和醇，以及乳化劑和穩定劑。用於局部給藥的藥物組合物中可以存在增稠劑。如果用於經皮給藥，該組合物可以包含經皮貼劑或離子電滲設備。局部製劑可以含有濃度為約0.1-10％w/v(每單位體積的重量)的結合域-免疫球蛋白融合構建體或表達產物。
組合物可以用於以在直腸中溶解並釋放藥物的栓劑形式進行直腸給藥。用於直腸給藥的組合物可以含有油性基質，如適當的非刺激性賦形劑。所述基質包括，但不限於羊毛脂、可可油和聚乙二醇。
在本發明的方法中，可以通過插入物、珠、時間控制釋放製劑、貼劑或快速釋放製劑的形式給予結合域-免疫球蛋白融合蛋白編碼構建體或表達產物。
以下實施例是作為舉例而不是限制性的。
實施例實施例l2H7可變區的克隆和2H7SCFV-IG的測序該實施例說明了編碼單克隆抗體2H7的重鏈和輕鏈可變區的cDNA分子的克隆。該實施例也證明了2H7scFv-Ig的構建、測序和表達。
特異性結合於CD20的表達2H7單克隆抗體的雜交瘤細胞是由華盛頓州西雅圖的華盛頓大學的Ed Clark提供的。在收穫之前，將雜交瘤細胞在補加了穀氨醯胺、丙酮酸、DMEM非必須胺基酸和青黴素-鏈黴素的RPMI 1640培養基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中維持於對數生長期。通過離心從培養基重沉澱細胞，用2×107個細胞製備RNA。使用Pharmingen(San Diego，CA)總RNA分離試劑盒(目錄號45520K)根據試劑盒所附製造商的說明從產生2H7的雜交瘤細胞分離RNA。用1微克(μg)總RNA作為模板通過逆轉錄製備cDNA。結合RNA和300ng隨機引物並且在加入酶之前在72℃下變性10分鐘。在5X第二條鏈緩衝液存在下以總體積25μl向RNA加引物混合物中加入Superscript II逆轉錄酶，並且隨酶提供0.1M DTT。在42℃下使逆轉錄反應進行1小時。
用隨機引發的逆轉錄酶反應產生的2H7 DNA和V區特異性引物通過PCR擴增2H7抗體輕鏈和重鏈的可變區。以公開序列(VL的Genbank編號M17954，VH為M17953)為指導，設計V區特異性引物。兩個可變鏈設計為具有相容末端序列，使得可以通過在擴增和限制酶消化後連接兩個V區而組裝scFv。
通過向2H7的VL的反義引物加入額外的核苷酸而摻入將在兩個V區之間插入的(gly4ser)3肽接頭。也在兩個V區的接合處引入Sac I限制位點。用於擴增包含限制位點HindIII的2H7 VL和輕鏈前導肽的有義引物為5′-gtcaag cttgcc gccatggat ttt caa gtg cag att ttt cag c-3′(SEQ ID NO＿)。反義引物為5′-gtc gtcgag ctccca cct cct cca gat ccacca ccg ccc gag cca ccg cca cct ttc agc tcc agc ttg gtccc-3′(SEQ IDNO＿)。V區的閱讀框架表示為粗體，加下劃線的密碼子。Hind II和SacI位點表示為加下劃線的斜體序列。
對VH結構域進行擴增，而沒有前導肽，但包含用於融合於VL的5′SacI限制位點和用於融合於各種尾，包括人IgG1 Fc結構域和截短形式的CD40配體CD154的位於3』末端的BclI限制位點。有義引物為5′-gct gctgag ctctca ggc tta tct aca gca agt ctg g-3′(SEQ IDNO＿)。SacI位點表示為斜體和加下劃線的字體。VH結構域的第一個胺基酸的密碼子的閱讀框架表示為粗體和加下劃線的字體。反義引物為5′-gtt gtctga tcagagacg gtg acc gtg gtc cc-3′(SEQ ID NO＿)。BelI位點表示為斜體和加下劃線的字體。VH結構域序列的最後一個絲氨酸表示為粗體和加下劃線的字體。
通過將2H7 scFv HindIII-BclI片段插入含人IgG1鉸鏈區、CH2和CH3區、用限制性酶HindIII和BclI消化的pUC19中而組裝scFv-Ig。連接後，將連接產物轉化到DH5α細菌中。用位於作為診斷位點的2H7的VL-VH結合處的SacI位點篩選陽性克隆的適當插入的片段。使2H7scFv-Ig cDNA在熱循環儀上進行循環測序，採用25個循環的程序，在96℃變性10秒，在50℃退火30秒，在72℃延伸4分鐘。測序引物是pUC正向和反向引物和退火於IgG恆定區部分中的人CH2結構域的內部引物。用Big Dye Terminator Ready測序混合物(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)，根據製造商的說明進行測序反應。隨後用Centrisep柱(目錄號CS-901，PrincetonSeparations，Adelphia，N.J.)純化樣品，並且在Savant真空乾燥器中乾燥，在模板抑制試劑(PE-ABI)中變性，並且在ABI 310基因分析儀(PE-Applied Biosystems)上分析。用Vector Nti 6.0版(Informax，North Bethesda，MD)編輯、翻譯和分析序列。圖1表示2H7scFv-Ig構建體的cDNA和推測胺基酸序列。
實施例22H7 SCFV-IG在穩定CHO細胞系中的表達該實施例說明在真核細胞中表達2H7scFv-Ig，以及通過SDS-PAGE和功能測定，包括ADCC和補體固定鑑定被表達的2H7scFv-Ig。
將具有正確序列的2H7scFv-Ig HindIII-XbaI(約1.6kb)插入哺乳動物表達載體pD18，用QIAGEN治療製備試劑盒(QIAGEN，Valencia，CA)擴增陽性克隆的DNA。然後在非必要區通過用AscI消化將重組質粒DNA(100μg)線性化，通過酚提取而純化，在組織培養基Excell302(目錄號14312-79P，JRH Biosciences，Lenexa，KS)中重懸。使用於轉染的細胞CHO DG44細胞處於對數生長，每個轉染反應收穫107個細胞。將線性化的DNA以0.8ml的總體積加入CHO用於電穿孔。
通過可選擇、可擴增質粒pD18的電穿孔至中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中完成2H7scFv-Ig融合蛋白(SEQ.ID NO10)的穩定產生，該質粒含有CMV啟動子控制下的2H7scFv-Ig cDNA。將2H7表達盒作為約1.6kb的HindIII-XbaI片段亞克隆至CMV啟動子下遊載體多克隆位點中。pD18載體是編碼DHFR可選擇標記的pcDNA3的修飾形式，用減弱的啟動子增加質粒的選擇壓力。用Qiagen maxiprep試劑盒製備質粒DNA，然後在酚提取和乙醇沉澱之間在獨特的AscI位點線性化純化的質粒。將鮭魚精子DNA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)作為載體DNA加入，用100μg每種質粒和載體DNA通過電穿孔轉染107個CHO DG44細胞。在含有穀氨醯胺(4mM)、丙酮酸、重組胰島素、青黴素-鏈黴素和2x DMEM非必須胺基酸(均來自於Technologies，Gaithersburg，Maryland)的Excell 302培養基(JRHBiosciences，此後稱作「EXcell 302完全」培養基)中使細胞生長至對數期。用於被轉染細胞的培養基也含有HT(從次黃嘌呤和胸苷的100X溶液稀釋)(Life Technologies)。用於在選擇下轉染的培養基含有各種水平的作為選擇試劑的氨甲喋呤(Sigma-Aldrich)，濃度為50nM-5μM。在275伏特，950μF下進行電穿孔。允許轉染細胞在非選擇性培養基中回收過夜，然後在96孔平底板(Costar)中，以125細胞/孔-2000細胞/孔的各種系列稀釋進行選擇性鋪板。用於細胞克隆的培養基是Excell 302完全培養基，含有100nM氨甲喋呤。一旦克隆生長足夠，篩選孔中的培養上清液的系列稀釋液中與CD20-CHO轉染細胞的結合。將具有最高融合蛋白產量的克隆擴增至T25燒瓶，然後擴增至T75燒瓶中，以提供足夠數量的細胞，用於冷凍和2H7scFvIg的擴大產生。通過在含氨甲喋呤的培養基中逐步擴增而在三個克隆的培養物中進一步增加產生水平。在細胞的每個連續傳代中，Excell 302完全培養基含有增加濃度的氨甲喋呤，這樣只有擴增了DHFR質粒的細胞可以存活。
從表達2H7scFv-Ig的CHO細胞收集上清液，通過0.2μm PES加壓濾膜(Nalgene，Rochester，NY)進行過濾，然後通過蛋白A-瓊脂糖(IPA 300交聯瓊脂糖)柱(Repligen，Needham，MA)。用PBS洗滌柱，然後用pH3.0的0.1M檸檬酸緩衝液洗脫結合蛋白。收集級分並且用1M Tris，pH8.0中和洗脫的蛋白，然後在PBS中透析過夜。通過280nm處的吸光度測定純化的2H7scFv-Ig(SEQ ID NO＿)的濃度。用VectorNti軟體包(Informax，North Bethesda，MD)中的蛋白分析工具測定出1.77的消光係數。該程序使用胺基酸組合物數據計算消光係數。
通過流式細胞術分析轉染的穩定CHO細胞的2H7scFv-Ig產生水平。使CHO細胞的純化2H7scFv-Ig與表達CD20的CHO細胞(CD20CHO)結合，並且使用螢光素偶聯的抗人IgG第二步驟試劑(目錄號H10101和H10501，CalTag，Burlingame，CA)進行流式細胞術分析。圖2(上)表示通過滴定2H7scFv-Ig與CD20 CHO的結合產生的標準曲線。在2H7scFv-Ig的每一個濃度下，表示出了以線性單位表示的螢光信號平均亮度。從含有表達2H7scFv-Ig的穩定CHO細胞克隆的T燒瓶中收集上清液，然後使其與CD20 CHO結合，然後通過流式細胞術分析結合。測量由上清液中含有的2H7scFv-Ig產生的螢光信號，從標準曲線計算上清液中的2H7scFv-Ig濃度(圖2，下)。
通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析純化的2H7scFv-Ig(SEQ IDNO＿)。通過獨立的蛋白A瓊脂糖柱純化的2H7scFv-Ig樣品在沒有二硫鍵還原的SDS樣品緩衝液中煮沸，並應用於SDS 10％Tris-BIS凝膠(目錄號NP0301，Novex，Carlsbad，CA)。將20微克每種純化的批量樣品加載到凝膠上。電泳後通過考馬斯亮蘭(Pierce Gel Code BlueStain Reagent，目錄號24590，Pierce，Rockford，IL)顯色，然後在蒸餾水中脫色。在相同的凝膠上包含分子量標記(Kaleidoscope PrestainedStandards，目錄號161-0324，Bio-Rad，Hercules，CA)。結果表示於圖3。泳道上的數字表示獨立的純化批。以千道爾頓表示的大小標記的分子量表示於圖左側。用替代樣品製備條件進行的進一步實驗表示通過在含有DTT或2-巰基乙醇的SDS樣品緩衝液中煮沸蛋白而進行的二硫鍵還原導致2H7scFv-Ig聚集。
用本領域公知的常規測定可以監測任何其它的免疫參數。這些測定可以包括，例如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)測定，第二體外抗體應答，採用確立的標記抗原系統進行的多種外周血或淋巴單核細胞亞群流式免疫細胞螢光測定分析，免疫組化或其它相關測定。這些和其它測定可以參加，例如Rose et al.(Eds.)，Manual ofClinical Laboratory Immunology，5thEd.，1997 American Society ofMicrobiology，Washington，DC。
用B細胞系Ramos和Bjab在補體存在下檢測2H7scFv-Ig殺滅CD20陽性細胞的能力。在測定中使用最終稀釋度為1/10的兔補體(PelFreez，Rogers，AK)。用B細胞和補體在37℃下將純化的2H7scFv-Ig孵育45分鐘，然後通過臺昐藍排除計數活細胞和死細胞。圖4A的結果表明，在兔補體存在下，2H7scFv-Ig裂解表達CD20的細胞。
通過在4小時測定中使用100∶1的PBMC與Bjab細胞比例測量51Cr從標記的Bjab細胞的釋放而檢驗2H7scFv-Ig在外周血單核細胞(PBMC)存在下殺滅CD20陽性細胞的能力。圖4B所示結果表明，2H7scFv-Ig可以介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，因為PBMC和2H7scFv-Ig存在下的51Cr釋放高於PBMC或2H7scFv-Ig單獨存在下的51Cr釋放。
實施例3CD20和CD40的同時連接對正常B細胞生長，以及對CD95表達和凋亡誘導的作用該實施例說明了細胞表面表達的CD20和CD40的交聯對細胞增殖的作用。
通過Percoll分步梯度從人扁桃體分離密集的靜息B細胞，通過E-rosetting去除T細胞。通過4天實驗的最後12個小時的3[H]-胸苷攝取測量密集的扁桃體B細胞。在四份培養物中測量增殖，平均值和標準差如圖所示。使用單獨的或與抗鼠κmAb 187.1(抗CD20XL)交聯的鼠抗人CD20 mAb 1F5(抗CD20)。使用與鼠CD8(CD154)(Hollenbaugh et al.，EMBO J 114212-21(1992))融合的可溶性人CD154完成CD40激活，使用抗鼠CD8 mAb 53-6(CD154XL)完成CD40交聯。該程序允許細胞表面CD20和CD40的同時交聯。結果見圖5。
檢驗了CD20和CD40在一種B淋巴瘤細胞系Ramos細胞上的交聯。使用特異性結合於CD20(1F5)和CD40(G28-5)的鼠單克隆抗體分析處理(無山羊抗小鼠IgG(GAM))後18小時Ramos細胞的CD95(Fas)表達和凋亡百分比和/或交聯(+GAM)。用特異於CD3的非結合性同種型對照(64.1)處理對照細胞。
收穫處理後的Ramos細胞，用FITC-抗-CD95孵育，並且通過流式細胞術分析測定CD20或CD40交聯後細胞表面上的Fas相對表達水平。將數據作圖為用指出的刺激處理後細胞的平均螢光(圖6A)。
收穫相同實驗的處理後的Ramos細胞，測定膜聯蛋白V的結合，用於表示經處理的培養物中的凋亡百分比。使用1F5和G28-5以及隨後的與GAM的交聯，通過CD20和CD40交聯18小時後的膜聯蛋白V的結合而測量凋亡。使用FITC-膜聯蛋白V試劑盒(目錄號PN-IM2376，Immunotech，Marseille，France，)測量膜聯蛋白V的結合。已知膜聯蛋白V結合是細胞發展為凋亡中的早期事件。凋亡，或程序性細胞死亡，是以通過自殺導致細胞死亡的分解代謝反應級聯為特徵的過程。在凋亡的早期階段中，在細胞改變外形和水解DNA之前，保持了細胞膜的完整性，但細胞失去了它們的膜磷脂的不對稱性，暴露了帶負電的磷脂，如細胞表面的磷脂醯絲氨酸。膜聯蛋白V，即一種鈣和磷脂結合蛋白，優先結合磷脂醯絲氨酸，並且對其有高親和力。證明CD20和CD40的交聯對FAS受體(CD95)表達的作用的結果表示於圖6B。CD20和CD40的交聯對膜聯蛋白結合於細胞的作用見圖6B。
實施例42H7 ScFv-CD 154融合蛋白的構建和表徵為了構建能夠結合CD20和CD40這兩者的分子，將編碼2H7 scFv的cDNA與編碼CD154，即CD40配體融合的cDNA。從2H7 scFvIg構建體去除在HindIII-BclI片段上編碼的2H7 scFv cDNA，與編碼人CD154的胞外域的BamHI-XbaI cDNA片段一起插入pD18載體。胞外域在CD154的羧基末端編碼，與其它II型膜蛋白相似。
用隨機引物和來自於用PHA(植物凝集素)激活的人T淋巴細胞的RNA對人CD154的胞外域進行PCR擴增。引物組包括兩個不同的5』或有義引物，它們在CD154的胞外域中的兩個不同位置產生融合接合處。兩個不同融合接合處設計為產生一種包含胞外域的胺基酸108(Glu)-261(Leu)+(Glu)的短或截短形式(S4形)，以及包含胞外域的胺基酸48(Arg)-261(Leu)+(Glu)的長或完全形式(L2形)，它們都構建為BamHI-XbaI片段。將兩個不同的截短胞外域融合於2H7scFv的有義引物包括用於克隆的BamHI位點。CD154 cDNA的S4形的有義引物命名為SEQUENCE ID NO11或CD154BAM108，並且編碼具有以下序列的34聚體5′-gtt gtc gga tcc aga aaa cag ctt tgaaat gca a-3′，而反義引物命名為SEQUENCE ID NO12或CD154XBA，並且編碼具有以下序列的44聚體5′-gtt gtt tct aga tta tcactc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3′。
用於擴增CD154胞外域的長形式(L2)的編碼胺基酸48(Arg)-261(Leu)+(Glu)的寡核苷酸引物如下命名為CD154 BAM48(SEQUENCE ID NO13)的有義引物編碼具有以下序列的35聚體5′-gtt gtc gga tcc aag aag gtt gga caa gat aga ag-3′。命名為CD154XBA(SEQUENCE ID NO＿)的反義引物編碼具有以下序列的44聚體5′-gtt gtt tct aga tta tca ctc gag ttt gag taa gcc aaa gga cg-3′。其它PCR反應條件與用於擴增2H7 scFv的條件相同(見實施例1)。用PCR快速試劑盒(QIAGEN，San Diego，CA)純化PCR片段，在30μl ddH2O中洗脫，然後用BamHI和XbaI(Roche)限制性內切酶在37℃下以40μl的反應體積消化3小時。凝膠純化片段，根據製造商的說明(QIAGEN)用QIAEX試劑盒純化，並且與2H7 HindIII-BclI片段一起連接到用HindIII+XbaI消化的pD18表達載體中。將連接反應轉移到DH5-α化學感受態細菌中，並且鋪於含100μg/ml氨苄青黴素的LB板上。使轉染物在37℃生長過夜，用分離的菌落接種含100μg/ml氨苄青黴素的Luria培養液中的3ml液體培養物。微量質粒製備(QIAGEN)後篩選用於插入2H7 scFv和CD154胞外域片段的克隆。
在PE 9700熱循環儀上使用25個循環的程序對2H7scFv-CD154構建體cDNA進行循環測序，包括在96℃變性10秒，在50℃退火5秒，在60℃延伸4分鐘。使用的測序引物為pD18正向(SEQ ID NO＿5′-gtctatataagcagagctctggc-3′)和pD18反向(SEQ ID NO＿5′-cgaggctgatcagcgagctctagca-3′)引物。此外，使用了與人CD154序列(SEQ ID NO＿5′-ccgcaatttgaggattctgatcacc-3′)具有特異性的內部引物。測序反應包含3.2pmol的引物，約200ng DNA模板，以及8μl測序混合物。使用Big Dye Terminator Ready測序混合物(PE-AppliedBiosystems，Foster City，CA)，根據製造商的說明進行測序反應。隨後用Centrisep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)純化樣品。在Savant加速真空乾燥器中乾燥洗脫物，95℃下在20μl模板抑制試劑(ABI)中變性2分鐘，並且在ABI 310基因分析儀(PE-AppliedBiosystems)上分析。使用Vector Nti 6.0版(Informax，North Bethesda，MD)編輯、翻譯和分析序列。2H7scFv-CD 154 L2 cDNA序列和預測的胺基酸序列見圖7A，2H7scFv-CD154 S4 cDNA cDNA序列和預測的胺基酸序列見圖7B。
通過流式細胞術測定了2H7 scFv-CD154融合蛋白(SEQ.ID NO＿和＿)與CD20和CD40的同時結合活性。該測定使用表達CD20的CHO細胞靶。用2H7 scFv-CD154表達質粒轉染的細胞的上清液孵育CD20CHO細胞45分鐘後，洗滌CD20 CHO細胞兩次，用PBS/2％FBS中的生物素偶聯的CD40-Ig融合蛋白孵育。45分鐘後，洗滌細胞兩次，用1∶100溶於PBS/2％FBS的藻紅蛋白(PE)標記的鏈黴素(Molecular Probes，Eugene OR)進行孵育。孵育額外的30分鐘後，洗滌細胞兩次，通過流式細胞術進行分析。結果表明2H7 scFv-CD154分子能夠結合細胞表面上的CD20並且從溶液中捕獲生物素偶聯的CD40。
為確定2H7scFv-CD154對B淋巴瘤和成淋巴細胞系的生長和存活的作用，用2H7scFv CD154 L2(SEQ.ID NO＿)孵育細胞12小時，然後檢驗膜聯蛋白V的結合。使用FITC-膜聯蛋白V試劑盒(Immunotech，Marseille，France，目錄號PN-IM2376)測量膜聯蛋白V的結合。用來自於表達分泌形式的2H7scFv-CD 154融合蛋白的細胞的濃縮、經滲透上清液的稀釋液在1ml培養物中孵育B細胞系。
通過24小時培養的最後6小時的3H-胸苷攝取檢驗2H7scFv-CD154存在下Ramos B淋巴瘤細胞的生長速度。2H7scFv-CD154對細胞增殖的作用見圖10。
實施例5CYTOXB抗體衍生物的構建和表徵CytoxB抗體衍生自2H7 scFv-IgG多肽。通過改變的鉸鏈區(見圖11)將2H7 scFv(見實施例1)連接於人IgG1 Fc結構域。通過定點誘變和其它本領域公知的方法用絲氨酸殘基取代鉸鏈區的半胱氨酸殘基。將突變鉸鏈區融合於野生型Fc結構域以產生一種命名為CytoB-MHWTG1C的構建體，或融合於在CH2結構域中引入了額外突變的突變Fc結構域(CytoxBMHMG1C)。與效應物功能有關的CH2中的胺基酸序列見圖11。這些殘基中的一個或多個的突變可以減少FcR結合和效應物功能的介導。在此實施例中，在2H7 scFv融合蛋白CytoxB[MG1H/MG1C]中，本領域公知對Fc受體結合具有重要性的亮氨酸殘基234進行了突變。在另一構建體中，用人IgA鉸鏈區的一部分取代了人IgG1鉸鏈區，該部分與野生型人Fc結構域融合(CytoxB-IgAHWTHGIC)(見圖11)。該突變的鉸鏈區允許保持了人IgG1 CH2和CH3結構域的功能特性的單體和二聚體分子混合物的表達。根據實施例2中描述的方法構建了用於這些分子的重組cDNA表達盒並且在CHODG44細胞中表達了多肽。
根據實施例2中描述的方法通過SDS-PAGE分析了CytoxB-scFvIg分子的純化融合蛋白衍生物。在非還原和還原條件下進行了聚丙烯醯氨凝膠電泳。在每個凝膠上加載兩個不同的分子量標記系列BioRad預染色標記(BioRad，Hercules，CA)和Novex Multimark分子量標記。不同構建體和RituximabTM的遷移模式見圖12。
用Bjab B淋巴瘤細胞作為靶和新製備的人PBMCs作為效應細胞測量CytoxB-scFvIg分子的不同衍生物介導ADCC的能力(見實施例2)。效應物與靶的比例改變如下70∶1，35∶1，和18∶1，每孔的Bjab細胞數保持恆定，但PBMCs的數目不同。用51Cr標記Bjab細胞2小時，以5×104細胞/孔的細胞密度等分至平底96孔板的每個孔中。以10mg/ml的濃度將純化的融合蛋白或rituximab加入PBMCs的各種稀釋液。在不添加PBMC或融合蛋白的情況下測量自發釋放，通過向適當的控制加入洗滌劑(1％NP-40)而測量最大釋放。將反應孵育4小時，將100μl培養上清液收穫至Lumaplate(Packard Instruments)並且乾燥過夜，然後計數釋放的cpm。結果見圖13。
也測量了CytoxB衍生物的補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。基本按實施例2中的描述進行反應。結果見圖14，表示為每個融合蛋白濃度下死亡細胞佔總細胞數的百分比。
實施例6在獼猴中進行的體內研究在非人靈長類動物中進行了CytoxB衍生物的初步體內研究。圖15表示了鑑定CytoxB在猴中的血清半衰期的數據。在箭頭所示日，給予每隻猴6mg/kg的劑量後，對從兩隻不同的獼猴(J99231和K99334)獲得的血清樣品進行測量。對於每種樣品，通過與標準曲線比較評估存在的2H7scFvIg水平，標準曲線是通過純化CytoxB-(MHWTGIC)-Ig融合蛋白與CD20 CHO細胞的結合產生的(見實施例2)。數據見圖15下部。
研究了CytoxB-(MHWTGlC)Ig融合蛋白對所研究的獼猴中循環CD40+細胞水平的作用。在圖16所示的每一天進行全血計數。此外，使用CD40特異性螢光素偶聯的抗體對外周血淋巴細胞進行FACS(螢光激活細胞分類)測定，以檢測細胞群中的B細胞。然後用陽性細胞百分比計算原始樣品中的B細胞數。數據作圖為注射後的體定日測量的千B細胞數/升血液(圖16)。
實施例7抗-CD19 scFv-IG融合蛋白的構建和表達根據實施例1、2和5描述的方法以及本領域的標準構建了抗-CD19scFv-Ig融合蛋白，將其轉染到真核細胞，並進行表達。從分離自產生抗體HD37的雜交瘤細胞的RNA克隆重鏈可變區和輕鏈可變區，HD37特異性結合於CD19。測量了HD37scFv-IgAHWTG1C和HD37scFv-IgMHWTG1C的表達水平，並且與用純化HD37 scFvIg產生的標準曲線相比較，結果見圖17。
實施例8抗-L6 scFv-IG融合蛋白的構建和表達用來源於抗癌mAb即L6的可變區構建scFv-Ig融合蛋白。根據實施例1、2和5描述的方法以及本領域的標準構建融合蛋白，轉染至真核細胞中，並且進行表達。測量了L6scFv-IgAHWTG1C和L6scFv-IgMHWTG1C的表達水平，並且與用純化HD37 scFvIg產生的標準曲線相比較，結果見圖18。
實施例9多種scFv-IG融合蛋白的表徵除已經描述的scFv-Ig融合蛋白，基本按實施例1和5的描述製備G28-1(抗CD37)scFv-Ig融合蛋白。根據本領域公知的方法克隆重鏈和輕鏈可變區。根據上述方法(見實施例2)確定2H7-MHWTG1C，2H7-IgAHWTG1C，G28-1-MHWTG1C，G28-1 IgAHWTG1C，HD37-MHWTG1C和HD37-IgAHWTG1C的ADCC活性。結果見圖19。用2981人肺癌細胞系測量L6scFv-IgAHWTG1C和L6scFv-IgMHWTG1C的ADCC活性。結果見圖20。已知鼠L6單克隆抗體沒有ADCC活性。
通過SDS-PAGE在還原和非還原條件下分析純化蛋白。基本按實施例2和5的描述製備樣品和進行凝膠電泳。L6和2H7 scFv-Ig融合蛋白的結果見圖21，G28-1和HD37 scFv-Ig融合蛋白的結果見圖22。
從上文中可以理解，儘管處於說明的目的描述了本發明的許多特定實施方案，可以在不偏離本發明的精神和範圍的前提下進行多種修飾。因此，本發明並不受其限制，而是由所附權利要求進行限定。
序列表110基因工藝公司J.A.勒貝特爾M.海登-勒貝特爾120結合域-免疫球蛋白融合蛋白130390069.401PC140PCT1412002-01-1716038170PatentIn version 3.02101211812212DNA213人工序列220223合成的小鼠SCFV融合基因220221sig_肽222(13)..(78)220221V_區222(79)..(396)223抗CD20 scFv的輕鏈可變區220221misc_特徵222(397)..(444)223asp-gly3ser(gly4ser)2-ser肽接頭220221V_區222(445)..(808)223抗CD20 scFv的重鏈可變區4001aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct 120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg 180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct 240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggtg gcggtggctc gggcggtggt 420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg 480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac 540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg 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tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500ccgggtaaat gatctaga 151821042111518212DNA213人工序列220223合成的小鼠人嵌合融合基因220221misc_特徵222(13)..(807)223小鼠抗人CD20 scFv220221C_區222(808)..(1513)223突變為絲氨酸的鉸鏈區半胱氨酸(826-829；844-847；853-856)野生型CH2和CH3結構域介異效應物功能4004aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct 120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg 180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct 240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca 360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac 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gatctaga 151821052111524212DNA213人工序列220223合成的小鼠人嵌合融合基因220221misc_特徵222(1)..(796)223小鼠抗人CD20 scFv220221N_區222(797)..(864)223人IgA鉸鏈區220221C_區222(865)..(1518)223人IGG1 CH2和CH3野生型FC結構域4005atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataattgcc 60agaggacaaa ttgttctctc ccagtctcca gcaatcctgt ctgcatctcc aggggagaag120gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag180ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat gccccatcca acctggcttc tggagtccct240gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagagtggag300gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagtt ttaacccacc cacgttcggt360gctgggacca agctggagct gaaagatggc ggtggctcgg gcggtggtgg atctggagga420ggtgggagct ctcaggctta tctacagcag tctggggctg agctggtgag gcctggggcc480tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg540gtaaagcaga cacctagaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt600gatacttcct acaatcagaa gttcaagggc aaggccacac tgactgtaga caaatcctcc660agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgaag actctgcggt 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15242106211711212DNA213人工序列220223合成的人部分融合基因220221misc特徵222(1)..(705)223突變為絲氨酸的鉸鏈區半胱氨酸(19-21；37-39；46-48)4006gatcaggagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatccc caccgtcccc a9cacctgaa 60ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc120tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc180aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag240gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg300ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag360aaaacaatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca420tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat480cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc540acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac600aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac660aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgatctag a 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tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagt9aa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat ccaagaaggt tggacaagat agaagatgaa840aggaatcttc atgaagattt tgtattcatg aaaacgatac agagatgcaa cacaggagaa900agatccttat ccttactgaa ctgtgaggag attaaaagcc agtttgaagg ctttgtgaag960gatataatgt taaacaaaga ggagacgaag aaagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt 1020gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct 1080gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa 1140aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc 1200ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag 1260tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa 1320ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg 1380gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt 1440ggcttactca aactcgagtg ataatctaga1470210222111290212DNA213人工序列220223小鼠-人雜交體220221misc_特徵222(13)..(808)223小鼠抗人CD20 SCFV220221misc_特徵222(814)..(1275)223人胞外域，短型，CD15440022aagcttgccg ccatggattt tcaagtgcag attttcagct tcctgctaat cagtgcttca 60gtcataattg ccagaggaca aattgttctc tcccagtctc cagcaatcct gtctgcatct120ccaggggaga aggtcacaat gacttgcagg gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg180taccagcaga agccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atgccccatc caacctggct240tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc300agcagagtgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtggag ttttaaccca360cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaagatg gcggtggctc gggcggtggt420ggatctggag gaggtgggag ctctcaggct tatctacagc agtctggggc tgagctggtg480aggcctgggg cctcagtgaa gatgtcctgc aaggcttctg gctacacatt taccagttac540aatatgcact gggtaaagca gacacctaga cagggcctgg aatggattgg agctatttat600ccaggaaatg gtgatacttc ctacaatcag aagttcaagg gcaaggccac actgactgta660gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag ctcagcagcc tgacatctga agactctgcg720gtctatttct gtgcaagagt ggtgtactat agtaactctt actggtactt cgatgtctgg780ggcacaggga ccacggtcac cgtctctgat ccagaaaaca gctttgaaat gcaaaaaggt840gatcagaatc ctcaaattgc ggcacatgtc ataagtgagg ccagcagtaa aacaacatct900gtgttacagt gggctgaaaa aggatactac accatgagca acaacttggt aaccctggaa960aatgggaaac agctgaccgt taaaagacaa ggactctatt atatctatgc ccaagtcacc 1020ttctgttcca atcgggaagc ttcgagtcaa gctccattta tagccagcct ctgcctaaag 1080tcccccggta gattcgagag aatcttactc agagctgcaa atacccacag ttccgccaaa 1140ccttgcgggc aacaatccat tcacttggga ggagtatttg aattgcaacc aggtgcttcg 1200gtgtttgtca atgtgactga tccaagccaa gtgagccatg gcactggctt cacgtccttt 1260ggcttactca aactcgagtg ataatctaga12902102321143212DNA213人工序列220223寡核苷酸40023gtcaagcttg ccgccatgga ttttcaagtg cagatttttc agc 432102421174212DNA213人工序列220223寡核苷酸40024gtcgtcgagc tcccacctcc tccagatcca ccaccgcccg agccaccgcc acctttcagc60tccagcttgg tccc 742102521137212DNA213人工序列220223寡核苷酸40025gctgctgagc tctcaggctt atctacagca agtctgg 372102621132212DNA213人工序列220223寡核苷酸40026gttgtctgat cagagacggt gaccgtggtc cc 322102721134212DNA213人工序列220223寡核苷酸40027gttgtcggat ccagaaaaca gctttgaaat gcaa342102821144212DNA213人工序列220223寡核苷酸40028gttgtttcta gattatcact cgagt ttgag taagccaaag gacg442102921135212DNA213人工序列220223寡核苷酸40029gttgtcggat ccaagaaggt tggacaagat agaag 352103021123212DNA213人工序列220223寡核苷酸40030gtctatataa gcagagctct ggc232103121125212DNA213人工序列220223寡核苷酸40031cgaggctgat cagcgagctc tagca 252103221125212DNA213人工序列220223寡核苷酸40032ccgcaatttg aggattctga tcacc 2521033211482212PRT213人工序列220223小鼠-人雜交融合蛋白220221位點222(1)..(266)223小鼠抗人CD20 SCFV220221結構域222(268)..(481)223細胞外域，長型，人CD15440033Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ala Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys115 120 125Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser130 135 140Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala145 150 155 160Ser 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Glu Lys Gly290 295 300Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln305 310 315 320Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr325 330 335Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser340 345 350Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala355 360 365Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His370 375 380Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn385 390 395 400Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe405 410 415Gly Leu Leu Lys Leu Glu4202103521163212DNA213人(Homo sapiens)220221N_區222(1)..(63)223隻含1個半胱氨酸的人IGA鉸鏈區的部分40035ccagttccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca60tgc 632103621121212PRT213人(Homo sapiens)40036Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr1 5 10 15Pro Ser Pro Ser Cys2021037211763212DNA213人(Homo sapien)220221misc_特徵222(1)..(6)223融合於氨基末端SCFVS的BCLI位點220221N_區222(8)..(752)223野生型IGA鉸鏈區，CH2，CH3結構域截短以去除分泌成分連接40037tgatcagcca gttccctcaa ctccacctac cccatctccc tcaactccac ctaccccatc 60tccctcatgc tgccaccccc gactgtcact gcaccgaccg gccctcgagg acctgctctt 120aggttcagaa gcgatcctca cgtgcacact gaccggcctg agagatgcct caggtgtcac 180cttcacctgg acgccctcaa gtgggaagag cgctgttcaa ggaccacctg accgtgacct 240ctgtggctgc tacagcgtgt ccagtgtcct gccgggctgt gccgagccat ggaaccatgg 300gaagaccttc acttgcactg ctgcctaccc cgagtccaag accccgctaa ccgccaccct 360ctcaaaatcc ggaaacacat tccggcccga ggtccacctg ctgccgccgc cgtcggagga 420gctggccctg aacgagctgg tgacgctgac gtgcctggca cgtggcttca gccccaagga 480tgtgctggtt cgctggctgc aggggtcaca ggagctgccc cgcgagaagt acctgacttg 540ggcatcccgg caggagccca gccagggcac caccaccttc gctgtgacca gcatactgcg 600cgtggcagcc gaggactgga agaaggggga caccttctcc tgcatggtgg gccacgaggc 660cctgccgctg gccttcacac agaagaccat cgaccgcttg gcgggtaaac ccacccatgt 720caatgtgtct gttgtcatgg cggaggtgga ctgataatct aga 76321038211250212PRT213人(Homo sapiens)220221結構域222(3)..(250)223截短的形式，去除介導與分泌成分連接的最後三個胺基酸40038Asp Gln Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro1 5 10 15Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser Leu His Arg20 25 30Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Ile Leu Thr Cys35 40 45Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Trp Thr50 55 60Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Asp Arg Asp Leu65 70 75 80Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys Ala Glu Pro85 90 95Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser100 105 110Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg115 120 125Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn130 135 140Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp145 150 155 160Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys165 170 175Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr180 185 190Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys195 200 205Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala210 215 220Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro Thr His Val225 230 235 240Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp245 250
權利要求
1.一種結合域-免疫球蛋白融合蛋白，包含(a)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合域多肽，其中所述鉸鏈區多肽選自(i)不含半胱氨酸殘基並且來源於具有一個或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽，(ii)含有一個半胱氨酸殘基並且來源於具有兩個或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽，(iii)野生型人IgA鉸鏈區多肽，(iv)不含半胱氨酸殘基並且來源於野生型人IgA區多肽的突變的人IgA鉸鏈區多肽和(v)含有一個半胱氨酸殘基並且來源於野生型人IgA區多肽的突變的人IgA鉸鏈區多肽；(b)與鉸鏈區多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區；和(c)與CH2恆定區多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽，其中(1)結合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一種選自抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和補體固定的免疫活性，並且(2)結合域多肽能夠特異性結合於抗原。
2.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白鉸鏈區多肽是一種突變的鉸鏈區多肽，並且相對於野生型人免疫球蛋白G鉸鏈區多肽，表現出二聚化的能力降低。
3.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結合域多肽包括至少一種選自免疫球蛋白輕鏈可變區多肽和免疫球蛋白重鏈可變區多肽的免疫球蛋白可變區多肽。
4.權利要求3的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白可變區多肽來源於人免疫球蛋白。
5.權利要求1的結合域Fv-免疫球蛋白融合蛋白，其中結合域多肽包含(a)至少一種免疫球蛋白輕鏈可變區多肽；(b)至少一種免疫球蛋白重鏈可變區多肽；和(c)至少一種與(a)的多肽和與(b)的多肽融合的接頭肽。
6.權利要求5的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白輕鏈可變區和重鏈可變區多肽來源於人免疫球蛋白。
7.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中至少一種免疫球蛋白重鏈CH2恆定區多肽和免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽來源於人免疫球蛋白重鏈。
8.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈恆定區CH2和CH3多肽屬於選自人IgG和人IgA的同種型。
9.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中抗原選自CD19，CD20，CD37，CD40和L6。
10.權利要求5的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中接頭多肽包括至少一種具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO21]的多肽。
11.權利要求5的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中接頭多肽包括具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser[SEQ ID NO21]的多肽的至少三次重複。
12.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中免疫球蛋白鉸鏈區多肽包括人IgA鉸鏈區多肽。
13.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結合域多肽包括CD154胞外域。
14.權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中結合域多肽包括CD154胞外域和至少一種免疫球蛋白可變區多肽。
15.一種編碼結合域-免疫球蛋白融合蛋白的分離的多核苷酸，所述蛋白包含(a)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合域多肽，其中所述鉸鏈區多肽選自(i)不含半胱氨酸殘基並且來源於具有一個或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽，(ii)含有一個半胱氨酸殘基並且來源於具有兩個或更多半胱氨酸殘基的野生型免疫球蛋白鉸鏈區多肽的突變的鉸鏈區多肽，(iii)野生型人IgA鉸鏈區多肽，(iv)不含半胱氨酸殘基並且來源於野生型人IgA區多肽的突變的人IgA鉸鏈區多肽和(v)含有一個半胱氨酸殘基並且來源於野生型人IgA區多肽的突變的人IgA鉸鏈區多肽；(b)與鉸鏈區多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區；和(c)與CH2恆定區多肽融合的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區多肽，其中(1)結合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一種選自抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和補體固定的免疫活性，並且(2)結合域多肽能夠特異性結合於抗原。
16.一種包含與啟動子可操作性連接的權利要求15的多核苷酸的重組表達構建體。
17.用權利要求16的重組表達構建體轉化或轉染的宿主細胞。
18.生產結合域-免疫球蛋白融合蛋白的方法，包括以下步驟(a)在允許結合域-免疫球蛋白融合蛋白表達的條件下培養權利要求17的宿主細胞；和(b)從宿主細胞培養物中分離結合域-免疫球蛋白融合蛋白。
19.含有與生理可接受載體組合的權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白的藥物組合物。
20.治療具有或懷疑具有惡性狀況或B細胞疾病的受試者的方法，包括給予患者治療有效量的權利要求1的結合域-免疫球蛋白融合蛋白。
21.權利要求20的方法，其中惡性狀況或B細胞疾病選自B細胞淋巴瘤和以自身抗體產生為特徵的疾病。
22.權利要求20的方法，其中惡性狀況或B細胞疾病選自類風溼性關節炎、重症肌無力、格雷夫斯病、I型糖尿病、多發性硬化和自身免疫病。
全文摘要
本發明涉及新的結合域－免疫球蛋白融合蛋白，其特徵在於對相關結構，如抗原、反受體等的結合域、具有0或1個半胱氨酸殘基的鉸鏈區多肽、以及免疫球蛋白CH2和CH3結構域。儘管主要作為單體多肽存在，該融合蛋白能夠ADCC和/或CDC。該融合蛋白可以高表達水平重組產生。也提供了相關的組合物和方法，包括免疫治療應用。
文檔編號C07K19/00GK1486192SQ02803820
公開日2004年3月31日 申請日期2002年1月17日 優先權日2001年1月17日
發明者J·A·勒貝特爾, M·海登-勒貝特爾, J A 勒貝特爾, 勒貝特爾 申請人:特魯比昂藥品公司