一種用於dna與蛋白質相互作用研究的新技術方法
2023-08-06 07:50:31
專利名稱：一種用於dna與蛋白質相互作用研究的新技術方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學研究領域，特別是指在DNA結合蛋白與相關生物探針相互作用研究實驗技術創新。在細胞的生命活動過程中，DNA的複製與重組、RNA的轉錄與修飾，以及病毒的感染與增殖等等，都 是涉及到特定的DNA區段與特殊蛋白質結合因子之間的相互作用。因此，長期以來人們就一直關注DNA結 合蛋白的研究。尤其是在重組DNA技術發展以來，已經相繼分離到了大量具有生物學意義的基因，在這一 背景支撐下，人們開始探索揭示外環境因子及發育信號是如何影響或調控基因的轉錄活性這一類課題。凝 膠阻滯試驗(gel retardation assay)是用於研究DNA或RNA與蛋白質相互作用的重要實驗技術之一。在 凝膠實驗中，傳統的方法是用放射性同位素或其他生物素標記待檢測的DNA片段(又稱探針DNA， probe) 然後與細胞蛋白質提取物一道溫育，於是便形成了 DNA蛋白質複合物。將其移入非變性的聚丙醯胺凝膠中， 控制蛋白質與探針保持結合狀態，電泳。最後藉助放射性自顯影技術(或其它適當技術)顯現DNA條帶位 置。如果細胞蛋白質中不存在與探針結合的蛋白質，那麼，所有DNA條帶都將集中出現在凝膠底部；反之， 將會形成DM-蛋白質複合物，由於凝膠阻滯的緣故，其特有的的探針-蛋白質複合物條帶就將滯後出現在 較靠後位置。凝膠阻滯試驗不僅可以用來鑑定在特殊類型細胞提取物中是否存在著能夠同某一特定咖A片 段結合的蛋白質分子(比如特異的轉錄因子等)，用來研究此種結合作用的DNA序列的特異性，而且還可 以用於捕捉在特定條件幹預下，雙方結合的變化及外界幹預對其變化的影響等生物信息。不過，傳統的試驗方案中常常因為DNA探針需要標記而使實驗過程變得比較繁瑣，同時，也存在某種 程度的放射性核素汙染和傷害。本發明提出了一種新技術方案，其目地是要克服傳統方法的上述缺陷。為了彌補傳統技術的上述不足，本發明提出了如下技術方案細胞蛋白質提取物先和相應抗體分子結 合為複合物，之後再與裸探針(null probe)結合,形成抗體-蛋白-裸探針三聯複合物，再後將其移入非 變性的聚丙醯胺凝膠中，電泳，最後應用ECL法於暗室中發光檢測。本發明方案雖然沒有使用放射性核素或其它生物素標記探針，卻同樣捕捉到研究目地特異蛋白結合情 況的必要生物信息，達到了實驗目的。由於抗體分子的加入使得蛋白質-探針二聯複合物的分子量加大， 電泳後，在非變性的聚丙醯胺中形成的條帶更加滯後，從而更加突出的顯現了相關蛋白質結合的特異性。 這種方法同樣可以用於鑑定未知蛋白，如加入蛋白無明顯滯後的條帶出現，說明該蛋白與抗體無關，反之, 亦然。本發明方法對疾病診斷和生物醫學領域研究有重要實際意義。本發明技術方案是通過如下技術操作實現的。 1.試劑配製(1) Tris-SDS-甘氨酸電泳緩衝液背景技術發明內容3.03 g 1 g18.77 gTris base 5.8 gSDS0.37 g甘氨酸 2.98 g甲醇200 ml先用ddftO溶解甘氨酸，Tris base和SDS，然後加入200nd甲醇，最後定容至1000ml, (3) 5 XBanding Buffer20%甘油5mMMgCl22.5 mMEDTA2.5 mMDTT250.0 mMNaCl50 mMTris-HCL0.25vg/vlPolyDI-DC(4) TBS配製l咖l/LTris-HCLph7.5 10ml NaCL 8.8g 用ddH20定容至1000ml,配TBST時，每100ml TBS加入0.24ml的20%的Tween20混勻後4。C保存c(5) Strippingbufer二巰基乙醇 700 vlTris (PH6.8) 12.5 ml10% SDS 20ml 去離子水 66.8ml 總體積100ml洗膜過程50t:搖床30min。 PBS洗5min。在用ddFfeO洗膜5min。 洗膜前注意要將用過的膜於TBST中浸泡至少30min。搖床速度要溫柔。2.電泳 (1)灌膠10%分離膠ddH20 4.0 ml30%Acr-Bis 3.3mlpH 8.8 Tris-HCL 2.5 ml10% SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.01ml 室溫下聚合50min或4t:過夜，膠聚合好後在電泳緩衝夜(Tris—SDS—甘氨酸)條件下以200V電壓 預電泳30min。(2)上樣體系15 vl核蛋白:DNA-lO:l5X結合緩衝液 3vl核蛋白 40 vgDNA 4 vgPolyDI-DC lvlddH20 Xvl於37度條件下撫育20—30min。孵育後加入3 vl的SDS上樣緩衝液，200v條件下跑電泳。待目的蛋 白跑至膠的2/3時停止電泳。3.轉膜及抗體結合3.1用轉移緩衝液(Tris—SDS—甘氨酸-甲醇)轉膜，轉膜前將膠。濾紙和準備好的膜(都要剪成同 等大小)於轉移緩衝液中浸泡5min。3.2轉膜條件為100mA ， 1.5h。轉膜產熱，注意在冰室中進行效果更加。 3.3 5%的脫脂奶粉封閉過夜，於4t中。3.4—定比例稀釋一抗，室溫下孵育lh用TBST洗3次，每次5min^最後用TBS洗l次，時間5min。 然後染適當比例稀釋的二抗，室溫孵育50min，用TBST洗3次，每次5min^最後用TBS洗1次，時間5min。 然後採用ECL法於暗室內發光檢測。如果覺得背景高可以用Stripping buffer洗膜，重新封閉染抗體，效果更加。實施例l，下面介紹的是在一個經過放射線千預後，以P53的5'端非翻譯區的DNA片段和Nucleolin 核蛋白的結合情況研究，使用本發明之技術方案，達到了預期的實驗目地。1. 材料與方法 1.1儀器和試劑l丄l細胞株MCF7人乳腺癌細胞株由基礎免疫實驗室獲得。 l丄2照射儀器國產X.S.S.205(FZ)型固定式X射線深部治療機。 l丄3試劑配製(1) Tris-SDS-甘氨酸電泳緩衝液(2) Tris-SDS-甘氨酸一甲醇轉移緩衝液(3) 5XBanding Buffer (Glycerol, MgCl2, EDTA， DTT , NaCl, Tris-HCL， PolyDI-DC) 1.2實驗部分1.2.1目的DNA片段的獲取根據p53 tumor suppressormRNA序列設計p53基因的PCR引物(由聯星生物公司合成IOD,OPC級。) 上遊引物Sense:5 ' -AAGGATCCTCTAGAGCCACCGTCCAG-3 '下遊引物Antisense:5 ' GGGAATTCCTCCTCCATGGCAGTGAC-3'利用PCR擴增目的片段。連入PCDNA3.1載體後拿去測序。 測序正確後轉化、大提質粒。然後酶切電泳。切膠回收目的片段，定量備用。1.2.2胞核蛋白的提取(1) 4Gy X射線照射MCF7細胞後，分別於2h、 4h、 8h、 16h、 24h、 48h。收取細胞，用凱基胞漿胞 核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白。(2) 不同劑量X射線照射MCF7細胞4小時後，收取細胞，用凱基胞漿胞核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白。(3) 考馬斯亮蘭法蛋白定量。蛋白保存一70'C備用。 1.2.4電泳灌膠10%分離膠(ddH20 4ml, 30%Acr-Bis3.3ml， pH 8.8 Tris-HCL 2.5 ml, 10% SDS 0.1ml, 10 %AP0.1ml， TEMED0.01ml)室溫下聚合，時間儘量長。膠聚合好後在電泳緩衝液(Tris—SDS—甘氨酸) 條件下以200V電壓預電泳20—30min。上樣體系15 vl:核蛋白:DNA-10:1(5X結合緩衝液3vl，核蛋白 40vg，蛋白4vg， Poly DI-DC 1 vl, ddH20 Xvl)。於37度條件下撫育20—30min。孵育後加入適量上樣 緩衝液，200v條件下跑電泳。待目的蛋白跑至膠的2/3時停止電泳。1.2.5轉膜及抗體結合用轉移緩衝液(Tris—SDS—甘氨酸一甲醇)轉膜，條件為100mA ， 1.5h。 5%的脫脂奶粉封閉過夜， 一定比例稀釋一抗和二抗，然後採用ECL法於暗室內發光檢測。2. 實驗結果2.1 X射線照射MCF7細胞後Nucleolin蛋白的DNA結合活性的時程變化採用蛋白滯後實驗方法檢測了 4Gy X射線照射MCF7細胞後，核內nucleolin蛋白同P53基因5'端非 翻譯區DNA片段結合活性的時程變化，附圖
l.為強度4 Gy的X射線照射MCF7細胞後Nucleolin蛋白的 DNA結合活性的時程變化電泳結果示意圖，附圖2.為強度4 Gy的X射線照射MCF7細胞後Nucleolin蛋 白的DNA結合活性的時程變化結果的線形示意圖，從附圖l.、表l和附圖2.可見4GyX射線照射後和假 照組(附圖l.中C組)相比2h, 4h， 8h和16h結合活性下降，4h結合活性最弱提示nucleolin對p53的控制減小。表1. 4Gy X射線照射MCF7細胞後Nucleolin蛋白的DNA結合活性的時程變化分組假照射組248162448絲A 口 未結合 結合/未結合2.53 0.76 3.332.47 0.85 2.912.59 0.91 2.851.07 0.81 1.321.89 0.93 2.031.76 0.97 1.811.98 1.01 1.962.2照射MCF7細胞後Nucleolin蛋白的DNA結合活性的量效變化採用蛋白滯後實驗方法檢測了不同劑量X射線照射MCF7細胞4h後核內nucleolin蛋白同p53基因5' 端非翻譯區DNA片段結合活性的量效變化,附圖3.為時間4h不同強度X射線照射MCF7細胞後對Nucleolin 蛋白的DNA結合活性的量效變化的電泳結果示意圖，附圖4.為時間4h不同強度X射線照射MCF7細胞 後對Nucleolin蛋白的DNA結合活性的量效變化的條形示意圖，從附圖3.、表2.和附圖4可見4h量效實 驗顯示不同劑量照射後和假照組相比隨著劑量增加而結合活性減弱。提示隨著劑量增加nucleolin對p53 的控制減弱。表2.不同劑量X-射線照射MCF7細胞4小時後Nucleolin蛋白的DNA結合活性的量效變化分組假照射組0.5124結合 *娃厶 木5q 口 結合/未結合2.38 0.68 3.502.26 0.76 2.972.41 0.85 2.842.25 0.73 3.082.45 0.73 2.95(全文止)
權利要求
1. 一種用於生物醫學檢驗、診斷、研究的技術方案，它的技術特徵是先將細胞蛋白質提取物與相應抗體分子結合為複合物，之後再與裸探針(null probe)結合,形成抗體-蛋白-裸探針三聯複合物，將其移 入非變性的聚丙醯胺凝膠中，電泳，最後應用ECL法於暗室中發光檢測。
全文摘要
本發明涉及一種用於生物學、醫學檢驗、診斷和研究的新技術方案，其技術特徵是將細胞蛋白質提取物先於相應抗體分子結合為複合物，之後再與裸探針(null probe)結合，形成抗體-蛋白-裸探針三聯複合物，同樣將其移入非變性的聚丙醯胺凝膠中，電泳，最後應用ECL法於暗室中發光檢測。與傳統方法比較，本技術操作簡便、可靠、無放射性核素汙染。
文檔編號G01N33/68GK101144821SQ20071005555
公開日2008年3月19日 申請日期2007年4月23日 優先權日2007年4月23日
發明者劉曉東, 李文興, 趙銀龍 申請人:吉林大學