Mpo奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒的製作方法

2023-08-06 22:42:11

專利名稱：Mpo奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及醫學檢測領域，具體涉及一種奶牛乳房炎檢測試劑盒。
背景技術：
奶牛乳房炎是由病原微生物感染而引起乳房組織及乳頭髮炎的一種疾病，它是世 界奶牛養殖業中發病率最高、流行廣泛、造成損失最大的疾病之一。乳房炎分為臨床乳房炎 (Clinicalmastitis)、隱性乳房炎(mastitis)及慢性乳房炎(chronic mastitis)，其中 隱性乳房炎乳汁無肉眼可見變化，臨床症狀不明顯，常不易被發現和重視。據報導，全世界 約有22億頭奶牛，其中有1/3的奶牛患有乳房炎，臨床型乳房炎發病率僅為10% 20%， 而絕大部分是更為普遍的隱性乳房炎，在我國隱性乳房炎的發病率更高[3_4]。隱性乳房炎 使泌乳奶牛每年的產奶量下降10% 11% [5]，且降低牛奶的品質，增加奶牛淘汰和後備奶 牛的成本、藥物開支、獸醫服務費用和額外勞力費用，還延長產後發情和妊娠時間，給奶牛 產業帶來巨大經濟損失。可見，隱性乳房炎的早期診斷對減少奶牛業經濟損失具有重要意 義。對於奶牛隱性乳房炎的診斷方法國內外都做了長期、大量的研究，但是我國目前 尚缺乏用於臨床上奶牛隱性乳房炎檢測的經濟、簡便、準確度高而又適於廣泛應用的早期 診斷方法，目前，國內外奶牛隱性乳房炎的檢測方法有體細胞計數(SCC)檢測法、手握式導 電儀檢測法、凝固酶試驗(TCT)、單克隆抗體的免疫方法、DNA指紋圖技術檢測法、PCR檢測 法等，這些方法要求專業化程度高、設備昂貴，在我國小型養殖場均很難得到廣泛的應用， 且許多方法需在專業實驗室才能完成，不利於推廣，有些方法在臨床應用時不能夠快速、簡 便地做出診斷。

發明內容本實用新型的目的在於公開一種以髓過氧化物酶(MPO)為檢測指標，運用雙抗體 夾心BA-ELISA法為檢測方法，更符合快速、簡便、高靈敏度、高特異性的現代診斷方法要 求，適合工業化生產，保存期更長的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒。本實用新型的目的是這樣實現的ΜΡ0奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒由酶標包被 板，A號液1瓶，B號液1瓶，C號液1組，D號液1瓶，E號液1瓶，F號液1瓶，兩片封板膜 組成。本實用新型還有這樣一些技術特徵1、所述的酶標包被板為兔抗MPO多抗包被並封閉的8X12孔酶標板，分為標準品 孔、樣品孔及空白對照孔，是將兔抗MPO多抗包被聚苯乙烯酶標板，在4°C過夜後用封閉液 封閉，在37°C溫育Ih JnMPO懸液，37°C溫育Ih而成；2、所述的A號液為生物素標記的鼠抗MPO單抗，即二抗，在檢測操作過程中添加本 液體後需在37°C溫育Ih ；3、所述的B號液為辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素，在檢測操作過程中添加本液體後需在37°C溫育Ih ；4、所述的C號液為MPO標準品，分為含量為Ong/ml的Cl號液，含量為2. 5ng/ml 的C2號液，含量為5. Ong/ml的C3號液，含量為lOng/ml的C4號液，含量為25ng/ml的C5 號液，含量為50ng/ml的C6號液6瓶；5、所述的D號液為底物溶液TMB，在檢測操作過程中添加本液體後需在37°C溫育 30min ；6、所述的E號液為2mol/L的H2SO4終止液；7、所述的F號液為濃縮洗滌液PBST，用於洗滌溫浴後的酶標板，每次需三次重複 洗滌；8、所述的封板膜為96孔，用於酶標板加樣和加酶的溫育，以及顯色。本實用新型為一種專用於奶牛隱性乳房炎診斷的試劑盒，研發人員在比較 了多種奶牛乳房炎檢測方法後，設計了本檢測試劑盒。其原理是牛髓過氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO)是多形核粒細胞、單核細胞、巨噬細胞釋放的嗜天青顆粒的主要成 份，並在炎症過程中扮演了吞噬和溶菌的重要角色。研究報導奶牛發生乳腺炎時乳汁中MPO 作為指示物含量增高，奶樣中的體細胞數(SCC)和MPO濃度的相關係數值為0.91，奶樣中 隨著SCC的增高，MPO的水平也增高達到2000ng/mL，同時也可分離到大量細菌。免疫學分 析MPO單克隆抗體與奶液中成分乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、牛血清白蛋白、ΜΡ0、淋巴細胞、 少量體細胞的乳樣之間ELISA反應沒有交叉性，表明MPO分子在乳房炎中具有很高的特異 性。通過對牛奶中MPO的檢測來判斷乳房內中性粒細胞(PMN)的活性狀態，可對奶牛隱性乳 房炎做出早期診斷。本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中MPO水平。通過 ELISA方法，製備的MPO抗體同MPO的特異性反映，從而能夠準確的檢測到標本中的MPO含 量。通過MPO含量和體細胞數SCC之間的換算，達到檢測奶牛隱性乳房炎的目的。用純化 的抗體包被酶標板，製成固相抗體，往包被多抗的酶標板中依次加入待檢奶樣、生物素標記 的鼠抗MPO單抗、辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素，經過徹底洗滌後用底物TMB顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在終止液2M H2SO4的作用下轉化成最終的黃色。顏 色的深淺和樣品中的MPO呈正相關。在終止反應後30min內，用酶標儀在450nm波長下測 定吸光度(0D值)，繪製標準曲線，計算樣品濃度。

圖1為實施例酶標板結構示意圖。
具體實施方式
以下結合附圖和具體實施例對本實用新型做進一步的說明實施例結合圖1，本實施例包括兔抗MPO多抗包被並封閉的8 X 12孔酶標板1 一塊，生物 素標記的鼠抗MPO單抗A號液一瓶，辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素B號液一瓶，標準品含 量為Ong/ml的Cl號液，含量為2. 5ng/ml的C2號液，含量為5. Ong/ml的C3號液，含量為 10ng/ml的C4號液，含量為25ng/ml的C5號液，含量為50ng/ml的C6號液各一瓶共六瓶，D 號液底物溶液TMB —瓶，2mol/L的H2SO4終止液E號液一瓶，F號液濃縮洗滌液PBST —瓶，
496孔封板膜兩片。各試劑在使用前平衡至室溫，操作步驟如下(1)根據待測樣品數量取出所需酶標板並標記標準品孔、樣品孔及空白對照孔，標 準品孔按照標準品次序C1-C6加入，各50ul ；樣品孔加入50ul待測樣品；空白對照孔加入 50ul蒸餾水，室溫孵育lh，洗滌3次，甩幹。(2)除空白對照孔外，標準品孔、樣品孔均加入A號液100yL，37°C孵育，洗滌3 次，甩幹；(3)除空白對照孔外，標準品孔、樣品孔，均加入B號液100μ L，37°C孵育，lh，洗滌 3-5次，甩幹；(4)除空白對照孔外，標準品孔、樣品孔均加入D號液，37°C孵育，15min ；(5)各孔均加入E號液，各50 μ L，終止反應；(6) 30min內，用酶標儀測定在450nm波長下各孔的OD值；(7)繪製標準曲線標準曲線的縱坐標為不同濃度MPO標準品相對應的0D450nm 值，橫坐標為MPO標準品濃度，連接各點，繪製曲線；然後作圖得標準曲線，並建立回歸方 程；(8)結果判斷根據各樣品的0D450nm值在標準曲線上求出其對應的濃度範圍。
權利要求MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於它是由酶標包被板，A號液1瓶，B號液1瓶，C號液1組，D號液1瓶，E號液1瓶，F號液1瓶，兩片封板膜組成。
2.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的酶標包 被板為兔抗MPO多抗包被並封閉的8X12孔酶標板，分為標準品孔、樣品孔及空白對照孔， 是將兔抗MPO多抗包被聚苯乙烯酶標板。
3.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的A號液 為生物素標記的鼠抗MPO單抗，即二抗。
4.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的B號液 為辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素。
5.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的C號液 為MPO標準品，分為含量為Ong/ml的Cl號液，含量為2. 5ng/ml的C2號液，含量為5. Ong/ ml的C3號液，含量為lOng/ml的C4號液，含量為25ng/ml的C5號液，含量為50ng/ml的 C6號液6瓶。
6.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的D號液 為底物溶液TMB。
7.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的E號液 為2mol/L的H2SO4終止液。
8.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的F號液 為濃縮洗滌液PBST。
9.根據權利要求1所述的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒，其特徵在於所述的封板膜 為96孔。專利摘要本實用新型的目的在於公開一種以髓過氧化物酶MPO為檢測指標，運用雙抗體夾心BA-ELISA法為檢測方法，更符合快速、簡便、高靈敏度、高特異性的現代診斷方法要求，適合工業化生產，保存期更長的MPO奶牛隱性乳房炎檢測試劑盒。用純化的抗體包被酶標板，製成固相抗體，往包被多抗的酶標板中依次加入待測奶樣、生物素標記的鼠抗MPO單抗、辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素，經過徹底洗滌後用底物TMB顯色。
文檔編號G01N33/535GK201654036SQ20092024439
公開日2010年11月24日 申請日期2009年12月21日 優先權日2009年12月21日
發明者呂英, 李慶章, 楊宇, 石晶, 邊豔傑, 高學軍 申請人:東北農業大學