Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製藥中的新應用的製作方法

2023-08-06 20:23:16 1

專利名稱：：Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製藥中的新應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於醫藥生物領域，具體地涉及Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製藥中的新應用。
背景技術：
：丹參是臨床最常用的活血化瘀中藥，其功效在《神龍本草經》記載它具有"破症除瘕"等功效，由於其特殊功效，丹參出現在很多的複方中藥中。現代藥理研究證實，丹參具有一定的抗腫瘤活性。具有以下結構式的環庚三烯酮類化合物Miltipolone最早也是從丹參中分離得到，文獻報導(Haro，G.;Mori，M.;Ishitsuka，M.0.;Kusumi，T.;Inouye，Y.;Kakisawa，H.Bull.Chem.Soc.Jpn.1991，64，3422-3426.)為具有對B16F10(鼠源黑色素瘤)和HCT-116(人結腸癌)的細胞毒作用的活性化合物。formulaseeoriginaldocumentpage3本領域的技術人員知道，不同的癌症的治療方法及所用藥物經常有很大差異，原因在於不同的癌症的基因水平和表觀遺傳水平的差異會很大，它們對同一種藥物的敏感程度可能會有很大差異，甚至是"有"活性和"無"活性的差別；另一方面，即使是同一類型的鼠類癌症與人類癌症的基因水平和表觀遺傳水平的差別也是很明顯的，對同一種藥物的敏感程度也會差別很大，雖現已有的公開文件介紹了Miltipolone對B16F10(鼠源黑色素瘤)和HCT-116(人結腸癌)的細胞毒作用(cytotoxicactivity)，但據此不能根據現有知識或其相似試驗，得出Miltipolone可用於其它人類癌症的治療。本發明需要解決的技術問題是提供Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製藥中的應用。解決上述技術問題的技術方案如下Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製備預防或治療與Fe"相關的疾病的藥物中的應用。特別地，F^+相關的疾病為人肺癌、人肝癌、人宮頸癌、人乳腺癌、白血病、成纖維肉瘤、或胃癌。本發明所述Miltipolone製備的藥物對癌細胞的抑制作用是通過抑制癌細胞增殖達到抗癌目的的，不是直接引起細胞死亡如誘導細胞凋亡等，例如現已有的公開文件，介紹了Miltipolone對B16F10(鼠源黑色素瘤)和HCT-116(人結腸癌)的作用是細胞毒作用(cytotoxicactivity)，這兩種作用機制是完全不同的。本發明提供了Miltipolone可以用於製備治療除B16F10(鼠源黑色素瘤)和HCT-116(人結腸癌)外的癌症的藥物，其為Fe2+相關的疾病的預防或治療提供了新的藥物，特別的為臨床上對人類的肺癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、成纖維肉瘤、胃癌及其他人類癌症治療提供了新的治療方案。圖1是Miltipolone的互變體結構的示意圖；圖2是丹參或其它中藥如滇丹參、藏丹參等提取物HPLC分離純化的示意圖3是Miltipolone晶體結構的示意圖；圖4是NMR純度的Miltipolone正相(normalphase)HPLC分析示意圖5是NMR純度的Miltipolone反相(reversephase)HPLC分析的示意圖6是Miltipolone與Fe2+、Fe3+、Co2+、Mn2+和Zn2+紫外/可見光譜(UV/Vis)的示意圖；圖7是離子對Miltipolone的抑制活性的影響的示意圖8是Miltipolone作用與凋亡信號通路無關的示意圖。具體實施例方式本發明化合物為弱酸性的，則適當的"藥學上可接受的鹽"指通過藥學上可接受的無毒鹼包括無機鹼及有機鹼製備的鹽。得自無機鹼的鹽包括鋁鹽、銨鹽、f丐鹽、銅鹽、鐵鹽、亞鐵鹽、鋰鹽、鎂鹽、錳鹽、亞錳鹽、鉀鹽、鈉鹽、鋅鹽等。得自藥學上可接受的有機無毒鹼的鹽，所述鹼包括伯胺、仲胺和叔胺的鹽，取代的胺包括天然存在的取代胺、環狀胺及鹼性離子交換樹脂。例如精氨酸、甜菜鹼、咖啡因、膽鹼、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、^乙基嗎啉，N-乙基哌啶、葡萄糖胺、氨基葡萄糖、組氨酸、異丙基胺、賴氨酸、甲基葡萄糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可鹼、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇、甘氨酸等。實施例1本發明通過在藥理活性指導下的逐級有效分離從丹參中發現了具有很好且廣泛抗腫瘤細胞活性的環庚三烯酮類化合物Miltipolone(見圖1)。丹參或其它中藥如滇丹參、藏丹參等經過粉碎後用8倍體積量石油醚(包括其它烷烴類)、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲醇或乙醇室溫浸提3-8次(至提取液顏色很淡為止)，24h/次，室溫減壓回收溶劑或凍幹得浸膏樣品。浸膏樣品溶解在乙酸乙酯中經過正相製備高效液相色譜(HPLC)分割成六個部分，圖2a中的第四部分檢測具有最好抗腫瘤細胞增殖活性，再使用正相製備HPLC多次分離純化可得到Miltipolone。附圖2給出的石油醚提取的浸膏樣品的HPLC製備Miltipolone過程包括HPLC的條件。Miltipolone的結構特點是多互變結構(tautomer)，我們的晶體結構結果(見圖3)顯示互變體I(tautomerI)為晶體結構所代表的互變體，而互變體II(tautomerII)為文獻矛艮道(Haro，G.;Mori，M.;Ishitsuka，M.0.;Kusumi，T.;Inouye，Y.;Kakisawa，H.Bull.Chem.Soc.Jpn.1991，64，3422-3426.)的結構。核磁共振(NMR)純度的Miltipolone4在正相(normalphase)HPLC上表現為單-峰(見圖4)，但在反相(reversephase)HPLC上表現出的多個峰且不同紫外下出現不同峰(見圖5)。Miltipolone對癌細胞增殖的抑制作用可能是Miltiplone的互變結構的一種或多種結構起作用的結果。實施例2:癌細胞按表1的數量接種於96孔板，待細胞貼壁或穩定後加入Miltipolone藥物(藥物Miltipolone先用匿S0溶解，加藥前用PBS稀釋)，溶劑對照組和加藥組(包括陽性藥物)的細胞培養液中匿SO終濃度均為O.1%，每個濃度有3個復孔。加藥後再繼續培養96小時後，每孔加入20iUMTT(5.0mg/ml)，再在37。C，5XC02條件下繼續孵育4小時，然後吸去細胞培養液，每孔加入100ii1匿S0分析純試劑溶解MTT被還原的產物-藍紫色Formazan結晶，並於超級酶標儀570nm下讀數。超級酶標儀讀數是Formazan的吸光度值(0057。)，其反映活細胞的還原酶活力與細胞的活力成正比，因此基於溶劑對照組和加藥組吸光度值可以計算出各個提取物的IC5。(見表1)。表1.Miltipolone對癌細胞的抑制活性IC5。值及篩選條件和陽性藥的活性數據.tableseeoriginaldocumentpage5藥理活性研究結果表明，Miltipolone是較強的、廣譜的抑制癌細胞增殖活性的抑制劑。實施例3紫外/可見光(UV/Vis)掃描和測定在Lambda35紫外/可見分光光度計(PerkinElmer)上進行，掃描狹縫為2納米，50微升比色皿的光程為1釐米。所有實驗的匿SO濃度為0.2%並使用0.2%的匿S0水溶液調零。掃描範圍200到800納米(圖6給出範圍200-550納米)，Miltipolone及FeCl2、Fe(N03)3、CoCl2、MnS04和ZnCl2的終濃度均為IOO微摩爾濃度。紫外/可見光譜(UV/Vis)研究(見圖6)表明，Miltipolone與Fe2+能夠發生明顯的絡合作用，加入Fe"後UV/Vis的最大吸收峰的位置及吸收峰形均發生明顯改變；Fe"與Miltipolone絡合後UV/Vis吸收強度發生了明顯增加，其基本峰形和最大吸收位置在244nm左右沒有明顯變化但在300-400nm位置的峰形明顯發生了改變；其它的可能與生理作用相關的重要離子Zn"、Co2+、Mn"等與Miltipolone有一定的絡合作用，這些離子引起UV/Vis吸收強度明顯增加但吸收峰形基本上沒有變化。所以Miltipolone可以用於與這些離子相關的疾病的直接治療和輔助治療。實施例4基本實驗操作同實施例2。對Jurkat-FADD—細胞，除DMS0對照組外，其它均含有終濃度為6微摩爾濃度的Miltipolone,然後加入濃度梯度的各種離子(C02+、Fe2+、Fe3+、Mn2+和Zn2+)(圖7A);對A549、Bel-7402、H印G2、Jurkat和MCF-7細胞，除DMS0對照組外，其它均含有終濃度為2微摩爾濃度的Miltipolone,然後加入濃度梯度的Fe2+(圖7B)。生理作用重要的離子對Miltipolone抑制癌細胞活性的影響研究表明(見圖7)，只有Fe2+能夠抵消Miltipolone的作用，其它離子沒有影響，所以Miltipolone特別可以用於與F^+相關的疾病的直接治療和預防以及輔助治療。圖7A表示6種離子對Jurkat-FADD—的抑制作用，其中只有加入Fe2+能夠恢復Jurkat-FADD—細胞的功能；而圖7A表示加入Fe2+能夠恢復所用的5種癌細胞的功能。實施例5基本實驗操作同實施例2。對Jurkat-FADD—細胞，一組含有終濃度為50微摩爾濃度的凋亡抑制劑z-VAD.fmk，另一組沒有凋亡抑制劑z-VAD.fmk，然後加入濃度梯度的Miltipolone(圖8A);對A549、Bel-7402、H印G2、Jurkat和MCF-7細胞，除DMS0對照組外，其它均含有2微摩爾濃度的Miltipolone,然後加入濃度梯度的凋亡抑制劑z-VAD.fmk(圖8B)。文獻(Haro，G.;Mori，M.;Ishitsuka，M.0.;Kusumi，T.;Inouye，Y.;Kakisawa，H.Bull.Chem.Soc.Jpn.1991，64，3422-3426.)報導Miltipolone對B16F10(鼠源黑色素瘤)和HCT-116(人結腸癌)的作用是細胞毒作用(cytotoxicactivity)，我們的研究(見圖8)表明Miltipolone對我們研究的癌細胞的抑制作用不是直接引起細胞死亡如誘導細胞凋亡等而是通過抑制癌細胞增殖達到抗癌目的的。圖8A表示Militipolone對Jurkat-FADD的抑制作用不受凋亡抑制劑z_VAD.fmk的影B向，圖8B表示加入凋亡抑制劑z-VAD.fmk不改變Militipolone對所用的5種癌細胞的抑制作用。權利要求Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製備預防或治療與Fe2+相關的疾病的藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特徵是，所述Fe2+相關的疾病為人肺癌、人肝癌、人宮頸癌、人乳腺癌、白血病、成纖維肉瘤、或胃癌。全文摘要本發明公開了Miltipolone或其藥學上可接受的鹽在製備預防或治療與Fe2+相關的疾病的藥物中的應用。本發明所述Miltipolone或其藥學上可接受的鹽製備的藥物對癌細胞的抑制作用是通過抑制癌細胞增殖達到抗癌目的的，特別地，為治療或預防人肺癌、人肝癌、人宮頸癌、人乳腺癌、白血病、成纖維肉瘤、或胃癌的藥物提供了新的選擇。文檔編號A61K31/352GK101716172SQ200910194170公開日2010年6月2日申請日期2009年11月26日優先權日2009年11月26日發明者劉勁松,劉英學,周國春,楊俊芸,陳少鵬申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院