雙重可變結構域免疫球蛋白及其用途的製作方法

2023-08-06 12:32:46 2

專利名稱：雙重可變結構域免疫球蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及多價和多特異性結合蛋白、製備方法、和具體而言涉及其在診斷、預防 和/或治療急性和慢性炎性疾病、癌症及其他疾病中的用途。
背景技術：
工程改造的蛋白，例如能夠結合2種或更多抗原的多特異性抗體是本領域已知 的。此種多特異性結合蛋白可以使用細胞融合、化學綴合、或重組DNA技術來產生。基於2種不同雜交瘤細胞系的體細胞融合，已使用四源雜交瘤(quadroma)技術 (參見 Milstein，C.和 Α. C. Cuello (1983)Nature，305 (5934)第 537-40 頁)生產了雙特異 性抗體，所述雜交瘤細胞系表達具有雙特異性抗體的所需特異性的鼠單克隆抗體(mAbs)。 因為2種不同免疫球蛋白(Ig)重和輕鏈在所得到的雜種_雜交瘤(或四源雜交瘤)細胞 系內隨機配對，所以產生最高達10種不同Ig種類，其中只有一種是功能性雙特異性抗體。 錯配對副產品的存在和顯著減少的生產得率意味著需要複雜的純化程序。雙特異性抗體也可以通過2種不同mAbs的化學綴合來生產(參見，Staerz，U.D.， 等人(1985), Nature 314(6012)第628-31頁)。這種方法不產生均質製劑。其他方法已 使用2種不同mAbs或較小抗體片段的化學綴合(參見Brennan，Μ.，等人(1985)，Science 229(4708)第 81-3 頁)。用於產生雙特異性抗體的另一種方法是用異雙功能交聯劑偶聯2種親本抗體，但 所得到的雙特異性抗體經受顯著的分子異質性，因為交聯劑與親本抗體的反應不是定點 的。為了獲得更均質的雙特異性抗體製劑，2種不同Fab片段已以定點方式在其鉸鏈半胱氨 酸殘基上進行化學交聯(參見Glermie，M. J.，等人(1987)，J Immunol 139(7)第2367-75 頁)。但這種方法產生Fab』 2片段，而不是全IgG分子。已開發了廣泛多樣的其他重組雙特異性抗體形式(參見Kriangkum，J.，等 人(2001)，Biomol Eng 18 (2)第31-40頁)。在它們當中，串聯單鏈Fv分子和雙抗體 (diabody)、及其各種衍生物是最廣泛使用的。常規地，這些分子的構建從識別不同抗原的2 個單鏈 Fv(scFv)片段開始(參見 Economides，A.N.，等人(2003)，Nat Med 9(1)第 47-52 頁)。串聯scFv分子(taFv)代表用另外的肽接頭簡單連接2個scFv分子的簡單形式。這 些串聯scFv分子中存在的2個scFv片段形成分開的摺疊實體。各種接頭可以用於連接2 個scFv片段和接頭具有最高達63個殘基的長度(參見Nakanishi，K.，等人(2001)，Annu Rev Immunol 19 第423-74頁)。儘管親本scFv片段可以以可溶形式在細菌中正常表達， 然而，常常觀察到串聯scFv分子在細菌中形成不溶性聚集體。因此，重摺疊規程或哺乳動 物表達系統的使用常規應用於生產可溶性串聯scFv分子。在近期研究中，報導了通過轉基因兔和牛體內表達針對⑶28的串聯scFv和黑素瘤相關蛋白聚糖(參見Gracie，J. Α.，等人 (1999)，J Clin Invest. 104(10)第 1393-401 頁)。在這個構建體中，2 個 scFv 分子通過 CHl接頭進行連接，且得到最高達100mg/L的雙特異性抗體血清濃度。使用各種策略包括 結構域順序變化或使用具有變化長度或柔性的中間接頭，以允許在細菌中可溶性表達。少 數研究現在已報導了使用非常短的Ala3接頭或長的富甘氨酸/絲氨酸接頭，在細菌中表達 可溶性串聯 scFv 分子(參見 Leung, B. P.，等人(2000)，J Immunol 164(12)第 6495-502 頁；Ito，A.，等人(2003)，J Immunol 170 (9)第 4802-9 頁；Karni，A.，等人(2002)，J Neuroimmunol 125(1-2)第134-40頁)。在另一個近期研究中，包含長度為3或6個殘基 的隨機化中間接頭的串聯scFv譜(repertoire)噬菌體展示，用於富集以可溶和活性形式 在細菌中生產的那些分子。這種方法導致分離具有6個胺基酸殘基接頭的串聯scFv分子 (參見 Arndt，M.和 J. Krauss (2003) ,Methods Mol Biol 207 第 305-21 頁)。這種接頭序 列是否代表串聯scFv分子可溶性表達的一般解決方案仍不清楚。然而，這項研究證明串聯 scFv分子的噬菌體展示與定向誘變組合是富集這些分子的有力工具，所述分子可以以活性 形式在細菌中表達。雙特異性雙抗體(Db)利用雙抗體形式用於進行表達。通過使連接VH和VL 結構域的接頭長度減少至約5個殘基，由scFv片段生產雙抗體(參見Peipp，Μ.和 Τ. Valerius (2002), Biochem Soc Trans 30(4)第 507-11 頁)。接頭尺寸的這種減少通過 使VH和VL結構域交叉配對促進2條多肽鏈的二聚化。雙特異性雙抗體通過在相同細胞 內表達2條多肽鏈來生產，所述2條多肽鏈具有結構VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL構型)、或 VLA-VHB和VLB-VHA (VL-VH構型)。在過去已生產了大量品種繁多的不同雙特異性雙抗體， 並且它們中的大多數以可溶形式在細菌中表達。然而，近期的比較研究證明可變結構域的 方向可以影響活性結合位點的表達和形成(參見Mack，Μ.，等人(1995)，Proc Natl Acad Sci U S A 92(15)第7021-5頁)。然而，在細菌中的可溶性表達代表超過串聯scFv分子 的重要優點。然而，因為2條不同多肽鏈在單個細胞內表達，所以可以生產無活性同二聚體 連同活性異二聚體。這使另外純化步驟的執行成為必需，以獲得雙特異性雙抗體的均質制 劑。促使雙特異性雙抗體產生的一種方法是結進孔(knob-into-hole)雙抗體的生產(參 見 Holliger，P.，T. Prospero 和 G. Winter (1993)，Proc Natl Acad Sci U S A 90(14)第 6444-8. 18頁)。該方法對於針對HER2和⑶3的雙特異性雙抗體進行了證明。通過用Phe 交換Val37和用Trp交換Leu45將大結引入VH結構域內，且在抗HER2或抗CD3可變結構 域中，通過使Phe98突變為Met和使Tyr87突變為Ala在VL結構域中產生互補孔。通過使 用這種方法，雙特異性雙抗體的生產可以從經由親本雙抗體的72%增至經由結進孔雙抗體 的超過90%。重要的是，作為這些突變的結果生產得率只有輕微減少。然而，對於幾種構建 體觀察到抗原結合活性的減少。因此，這種相當精細的方法需要分析各種構建體，以鑑定產 生具有不變結合活性的異二聚分子的那些突變。此外，此種方法需要免疫球蛋白序列在恆 定區的突變修飾，因此生成非天然和非自然形式的抗體序列，這可以導致免疫原性增加、體 內穩定性差、以及不希望有的藥物代謝動力學。單鏈雙抗體(SCDb)代表改善雙特異性雙抗體樣分子形成的可替代策略(參見 Holliger, P.禾口 G. Winter (1997)，Cancer Immunol Immunother 45(3—4)第 128—30 頁； ffu, Α. M.，等人(1"6)，Immunotechnology 2(1)第21_36頁)。雙特異性單鏈雙抗體通過用另外的中間接頭連接2條雙抗體形成多肽鏈來產生，所述另外的中間接頭長度為約 15個胺基酸殘基。因此，分子量對應於單體單鏈雙抗體(50-60kDa)的所有分子都是雙 特異性的。幾項研究已證明雙特異性單鏈雙抗體在細菌中以可溶和活性形式表達，其中 大多數純化的分子呈現為單體(參見Holliger，P.和G. Winter (1997)，Cancer Immunol Immunother 45(3-4)第 128-30 頁；ffu, A.M.，等人(1996) Immunotechnol. 2 (1)第 21-36 頁；Pluckthun, A.禾口 P. Pack (1997) Immunotechno 1. 3 (2)第 83—105 頁；Ridgway, J. B.，等 人(1996)，Protein Engin. 9 (7)第617-21頁)。因此，單鏈雙抗體組合了串聯scFvs (所 有單體都是雙特異性的)和雙抗體(在細菌中可溶性表達)的優點。更近地，雙抗體已與Fc融合以產生更Ig樣的分子，稱為雙-雙抗體 (di-diabodies)(參見 Lu，D.，等人(2004)，J Biol Chem 279(4)第 2856-65 頁)。此外， 已描述了在IgG重鏈中包含2個Fab重複且能夠結合4個抗原分子的多價抗體構建體(參 見 WO 0177342A1，和 Miller，K.，等人(2003)，J Immunol 170(9)第 4854-61 頁)。本領域需要能夠結合2種或更多抗原的改良的多價結合蛋白。美國專利申請系列 號11/507，050提供了能夠以高親和力結合2種或更多抗原的結合蛋白新家族，其被稱為雙 重可變結構域免疫球蛋白(DVD-Ig )。本發明提供能夠結合2種或更多抗原的另外的新結 合蛋白ο發明概述本發明涉及能夠結合2種或更多抗原的多價結合蛋白。本發明提供了能夠以高親 和力結合2種或更多抗原的結合蛋白新家族。在一個實施方案中，本發明提供了包含多肽鏈的結合蛋白，其中多肽鏈包含 VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個可變結構域，VD2是第二個可變結構域，C是恆 定結構域，Xl代表胺基酸或多肽，X2代表Fc區和η是O或1。在一個實施方案中，結合蛋白 中的VDl和VD2是重鏈可變結構域。在另一個實施方案中，重鏈可變結構域選自鼠重鏈可變 結構域、人重鏈可變結構域、CDR嫁接的重鏈可變結構域、和人源化重鏈可變結構域。在另一 個實施方案中，VDl和VD2能夠結合相同抗原。在另一個實施方案中，VDl和VD2能夠結合不 同抗原。在另一個實施方案中，C是重鏈恆定結構域。例如，Xl是接頭，條件是Xl不是CH1。 例如，Xl 是選自下述的接頭AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO 1) ；AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO 2) ；AKTTPKLGG(SEQ ID NO 3) ；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO 4) ；SAKTTP(SEQ ID N0: 5) ；RADAAP(SEQ ID NO 6) ；RADAAPTVS(SEQ ID NO 7) ；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO 8)； RADAAAA (G4S) 4 (SEQ ID NO 9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID N0:10) ；ADAAP (SEQ ID NO: 11) ；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO 12) ； TVAAP (SEQ ID NO 13) ；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) ；QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ；AKTTPP(SEQ ID NO: 17)； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18) ；AKTTAP(SEQ ID NO 19) ；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO 20) ；ASTKGP(SEQ ID NO 21) ；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO :22)，GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO 23) ；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO 24) ；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO 25)；以及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO :26)。在一個實施方案中，X2是Fc區。在另一個實施方案中， X2是變體Fc區。在一個實施方案中，此處公開的結合蛋白包含多肽鏈，其中多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個重鏈可變結構域，VD2是第二個重鏈可變結構域，C是重鏈恆定結構域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fc區。在一個實施方案中，結合蛋白中的VDl和VD2是輕鏈可變結構域。在一個實施方 案中，輕鏈可變結構域選自鼠輕鏈可變結構域、人輕鏈可變結構域、CDR嫁接的輕鏈可變結 構域、和人源化輕鏈可變結構域。在一個實施方案中，VDl和VD2能夠結合相同抗原。在 另一個實施方案中，VDl和VD2能夠結合不同抗原。在一個實施方案中，C是輕鏈恆定結 構域。在另一個實施方案中，Xl是接頭，條件是Xl不是CLl。在一個實施方案中，Xl是選 自下述的接頭AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO 1) ；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO 2)； AKTTPKLGG(SEQ ID NO 3) ；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO 4) ；SAKTTP(SEQ ID NO 5) ；RADAAP(SEQ ID NO 6) ；RADMPTVS(SEQ ID NO 7) ；RADAMAGGPGS (SEQ ID NO 8) ；RADAMA (G4S)4 (SEQ ID NO 9) ； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ；ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP (SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO 14) ； QPKAAP (SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO 16) ；AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18) ；AKTTAP(SEQ ID NO 19) ；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO 20) ；ASTKGP(SEQ ID NO 21)； ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO 22) ；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO 23) ；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO 24) ；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO 25)；以及GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO :26)。在 一個實施方案中，結合蛋白不包含X2。在一個實施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含相同接頭。在另一個實施方案中， 可變重鏈和可變輕鏈包含不同接頭。在另一個實施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含短 (約6個胺基酸)接頭。在另一個實施方案中，可變重鏈和可變輕鏈均包含長(多於6個氨 基酸)接頭。在另一個實施方案中，可變重鏈包含短接頭而可變輕鏈包含長接頭。在另一 個實施方案中，可變重鏈包含長接頭而可變輕鏈包含短接頭。在一個實施方案中，此處公開的結合蛋白包含多肽鏈，其中所述多肽鏈包含 VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個輕鏈可變結構域，VD2是第二個輕鏈可變結構 域，C是輕鏈恆定結構域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含Fc區。在另一個實施方案中，本發明提供了包含2條多肽鏈的結合蛋白，其中所述第一 條多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個重鏈可變結構域，VD2是第二個 重鏈可變結構域，C是重鏈恆定結構域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fc區；且所 述第二條多肽鏈包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個輕鏈可變結構域，VD2是 第二個輕鏈可變結構域，C是輕鏈恆定結構域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包含 Fc區。在具體實施方案中，雙重可變結構域(DVD)結合蛋白包含4條多肽鏈，其中首先2條 多肽鏈分別包含VDl-(Xl) n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一個重鏈可變結構域，VD2是第二 個重鏈可變結構域，C是重鏈恆定結構域，Xl是接頭，條件是它不是CHl，且X2是Fc區；且 其次2條多肽鏈分別包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是第一個輕鏈可變結構域，VD2 是第二個輕鏈可變結構域，C是輕鏈恆定結構域，Xl是接頭，條件是它不是CH1，且X2不包 含Fc區。此種雙重可變結構域(DVD)蛋白具有4個抗原結合部位。在另一個實施方案中，此處公開的結合蛋白能夠結合一種或多種靶。在一個實施 方案中，靶選自細胞因子、細胞表面蛋白、酶和受體。在另一個實施方案中，結合蛋白能夠調 節一種或多種靶的生物學功能。在另一個實施方案中，結合蛋白能夠中和一種或多種靶。 本發明的結合蛋白能夠結合選自淋巴因子、單核因子、多肽激素、受體或腫瘤標記的細胞因子。例如，本發明的DVD-Ig能夠結合下述的兩種或更多種腫瘤壞死因子(TNF)、核因子 κ B受體激活物配體(RANKL)、血管內皮生長因子(VEGF)、神經生長因子(NGF)、硬化蛋白 (Sclerostin) (SOST)、Dickkopf■相關蛋白(DKK)、CD-20、α νβ 3、白細胞介素 13(IL_13)、 白細胞介素4(IL-4)、白細胞介素9(IL-9)、白細胞介素17A(IL_17A)、白細胞介素 la (IL-la)、白細胞介素1β (IL_1 β )、白細胞介素23，亞基pl9 (IL_23pl9)、白細胞介素 6 (IL-6)、免疫球蛋白E (IgE)、白細胞介素6受體(IL-6R)和白細胞介素9 (IL-9)。(也見表 2)。在具體實施方案中，結合蛋白能夠結合選自下述的靶對TNF和IL-17A ；TNF和RANKL ； TNF 禾口 VEGF ；TNF 禾口 SOST (seq. 1) ；TNF 禾口 DKK ；TNF 禾口 a VB3 ；TNF 禾口 NGF ；TNF 禾口 IL_23pl9 ； TNF 和 IL-6 ；TNF 和 SOST (seq. 2) ；TNF 和 IL-6R ；TNF 和 CD-20 ；IgE 和 IL_13(seq. 1)； IL-13(seq. 1)和 IL_23pl9 ；IgE 和 IL-4 ；IgE 和 IL_9(seq. 1) ；IgE 和 IL_9(seq. 2) ；IgE 和 IL_13(seq. 2) ；IL-13 (seq. 1)和 IL_9(seq. 1) ；IL-13 (seq. 1)和 IL-4 ;IL_13 (seq. 1) 和 IL-9 (seq. 2) ； IL-13 (seq. 2)和 IL-9 (seq. 1) ； IL-13 (seq. 2)和 IL-4 ； IL-13 (seq. 2) 和 IL-23p 19 ； IL-13 (seq. 2)和 IL-9 (seq. 2) ； IL-6R 和 VEGF ； IL-6R 和 IL-17A ； IL-6R 和 RANKL ； IL-17A 禾口 IL—1 β (seq. 1) ； IL-I β (seq. 1)禾口 RANKL ； IL-I β (seq. 1)禾口 VEGF ；RANKL 和 CD-20 ； IL-I α 和 IL-I β (seq. 1) ； IL-I α 和 IL-I β (seq. 2)。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-17A的結合蛋白包含選自SEQ ID NO 76 和SEQ ID NO 78的DVD重鏈胺基酸序列；以及選自SEQ ID NO 77和SEQ ID NO 79的DVD 輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-17A的結合蛋白包含SEQ ID NO 76的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 77的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合TNF和IL-17A的結合蛋白具有反向方向(reverse orientation)，並包含SEQ ID NO 78的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 79的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和RANKL的結合蛋白包含選自SEQ ID N0:80和 SEQ ID NO 82的DVD重鏈胺基酸序列；以及選自SEQ ID NO 81和SEQ ID NO 83的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和RANKL的結合蛋白包含SEQ ID NO 80 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 81的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能 夠結合TNF和RANKL的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO 82的DVD重鏈胺基酸序 列和SEQ ID NO 83的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和VEGF的結合蛋白包含選自SEQ ID NO :84和 SEQ ID NO 86的DVD重鏈胺基酸序列；以及選自SEQ ID NO 85和SEQ ID NO 87的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和VEGF的結合蛋白包含SEQ ID NO 84 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 85的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能 夠結合TNF和VEGF的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO 86的DVD重鏈胺基酸序 列和SEQ ID NO 87的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和S0ST(seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID NO 88和SEQ ID NO 90的DVD重鏈胺基酸序歹丨J ；以及選自SEQ ID NO 89和SEQ ID NO 91 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和SOST(seq. 1)的結合蛋白包 含SEQ ID NO 88的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 89的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一 個實施方案中，能夠結合TNF和SOST (seq. 1)的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO 90的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 91的DVD輕鏈胺基酸序列。
在一個實施方案中，能夠結合TNF和DKK的結合蛋白包含選自SEQ ID NO :92和 SEQ ID NO 94的DVD重鏈胺基酸序列；以及選自SEQ ID NO 93和SEQ ID NO 95的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和DKK的結合蛋白包含SEQ ID NO :92的 DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 93的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能夠 結合TNF和DKK的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO :94的DVD重鏈胺基酸序列和 SEQ ID NO 95的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和α νβ 3的結合蛋白包含選自SEQ ID NO 96 和SEQ ID NO 98的DVD重鏈胺基酸序列；以及選自SEQ ID NO 97和SEQ ID NO 99的DVD 輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和α νβ 3的結合蛋白包含SEQ ID NO 96的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO 97的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合TNF和α νβ 3的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO 98的DVD重鏈氨基 酸序列和SEQ ID NO 99的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和NGF的結合蛋白包含選自SEQ ID NO. 100和 SEQ ID NO. 102的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID NO. 101和SEQ ID NO. 103的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和NGF的結合蛋白包含SEQ ID N0. 100 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 101的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合TNF和NGF的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 102的DVD重鏈胺基酸 序列和SEQ ID N0. 103的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL_23pl9的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 104 和 SEQ ID N0. 106 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 105 和 SEQ ID N0. 107 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-23p 19的結合蛋白包含 SEQ ID N0. 104的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 105的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個 實施方案中，能夠結合TNF和IL-23p 19的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 106 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 107的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-6的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 108和 SEQ ID N0. 110的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 109和SEQ ID NO. Ill的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-6的結合蛋白包含SEQ ID N0. 108 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 109的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合TNF和IL-6的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 110的DVD重鏈胺基酸 序列和SEQ ID NO. Ill的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和S0ST(seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 112 和 SEQ ID N0. 114 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 113 和 SEQ ID N0. 115 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和SOST (seq. 2)的結合蛋白包 含SEQ ID N0. 112的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 113的DVD輕鏈胺基酸序列。在另 一個實施方案中，能夠結合TNF和SOST(seq. 2)的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 114的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 115的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-6R的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 116和 SEQ ID N0. 118的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 117和SEQ ID N0. 119的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和IL-6R的結合蛋白包含SEQ ID N0. 116的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 117的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合TNF和IL-6R的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO. 118的DVD重鏈氨基 酸序列和SEQ ID NO. 119的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和⑶-20的結合蛋白包含選自SEQ ID NO. 120和 SEQ ID NO. 122的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 121禾口 SEQ ID N0. 123的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合TNF和⑶-20的結合蛋白包含SEQ ID N0. 120 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 121的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合TNF和⑶-20的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 122的DVD重鏈氨基 酸序列和SEQ ID N0. 123的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-13(seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 124 和 SEQ ID N0. 126 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 125 和 SEQ ID N0. 127 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-13(seq. 1)的結合蛋白包 含SEQ ID N0. 124的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 125的DVD輕鏈胺基酸序列。在另 一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-13(seq. 1)的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 126的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 127的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL23pl9的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 128和SEQ ID N0. 130的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 129和SEQ ID N0. 131的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL23pl9的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 128的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 129的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL23pl9的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 130的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 131的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-4的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 132和 SEQ ID N0. 134的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 133和SEQ ID N0. 135的DVD輕 鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-4的結合蛋白包含SEQ ID N0. 132 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 133的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中， 能夠結合IgE和IL-4的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 134的DVD重鏈胺基酸 序列和SEQ ID N0. 135的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-9(seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 136 和 SEQ ID N0. 138 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 137 和 SEQ ID N0. 139 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-9(seq. 1)的結合蛋白包 含SEQ ID N0. 136的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 137的DVD輕鏈胺基酸序列。在另 一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-9(seq. 1)的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 138的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 139的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-9(seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 140 和 SEQ ID N0. 142 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 141 禾口 SEQ ID N0. 143 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-9(seq.2)的結合蛋白包 含SEQ ID N0. 140的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 141的DVD輕鏈胺基酸序列。在另 一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-9(seq.2)的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 142的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 143的DVD輕鏈胺基酸序列。
在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-13(seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID NO. 144 和 SEQ ID NO. 146 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID NO. 145 和 SEQ ID NO. 147 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-13(seq.2)的結合蛋白包 含SEQ ID NO. 144的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 145的DVD輕鏈胺基酸序列。在另 一個實施方案中，能夠結合IgE和IL-13(seq.2)的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO. 146的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 147的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 1)的結合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 148和SEQ ID N0. 150的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 149和 SEQ ID N0. 151的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 1)和 IL-9(seq. 1)的結合蛋白包含SEQ ID N0. 148的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 149的 DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 1)的結 合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 150的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 151的 DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-3(seq. 1)和IL-4的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 152 和 SEQ ID N0. 154 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 153 和 SEQ ID N0. 155 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-3 (seq. 1)和IL_4的結合蛋白包 含SEQ ID N0. 152的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 153的DVD輕鏈胺基酸序列。在另 一個實施方案中，能夠結合IL-3 (seq. 1)和IL_4的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 154的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 155的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 2)的結合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 156和SEQ ID N0. 158的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 157和 SEQ ID N0. 159的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和 IL-9(seq. 2)的結合蛋白包含SEQ ID N0. 156的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 157的 DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 1)和IL_9(Seq. 2)的結 合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 158的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 159的 DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 1)的結合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 160和SEQ ID N0. 162的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 161和 SEQ ID N0. 163的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 2)和 IL-9(seq. 1)的結合蛋白包含SEQ ID N0. 160的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 161的 DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 1)的結 合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 162的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 163的 DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 2)和IL-4的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 164 和 SEQ ID N0. 166 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 165 和 SEQ ID N0. 167 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 2)和IL_4的結合蛋白 包含SEQ ID N0. 164的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 165的DVD輕鏈胺基酸序列。在 另一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 2)和IL_4的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 166的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 167的DVD輕鏈胺基酸序列。
在一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 2)和IL_23pl9的結合蛋白包含選自SEQ ID NO. 168和SEQ ID NO. 170的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID NO. 169和SEQ ID NO. 171的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 2)和IL_23pl9 的結合蛋白包含SEQ ID NO. 168的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 169的DVD輕鏈氨基 酸序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 2)和IL_23pl9的結合蛋白具有反向 方向，並包含SEQ ID NO. 170的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 171的DVD輕鏈胺基酸 序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 2)的結合蛋白包含選 自SEQ ID N0. 172和SEQ ID N0. 174的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 173和 SEQ ID N0. 175的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-13 (seq. 2)和 IL-9(seq. 2)的結合蛋白包含SEQ ID N0. 172的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 173的 DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-13(seq. 2)和IL_9(Seq. 2)的結 合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 174的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 175的 DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-6R和VEGF的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 176 和SEQ ID N0. 178的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 177和SEQ ID N0. 179的 DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-6R和VEGF的結合蛋白包含SEQ ID N0. 176的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 177的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方 案中，能夠結合IL-6R和VEGF的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 178的DVD重 鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 179的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-6R和IL-17A的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 180 和 SEQ ID N0. 182 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID N0. 181 禾口 SEQ ID N0. 183 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-6R和IL-17A的結合蛋白包含 SEQ ID N0. 180的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 181的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一 個實施方案中，能夠結合IL-6R和IL-17A的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 182 的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 183的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-6R和RANKL的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 184 和SEQ ID N0. 186的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 185和SEQ ID N0. 187的DVD 輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-6R和RANKL的結合蛋白包含SEQ ID N0. 184的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 185的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方 案中，能夠結合IL-6R和RANKL的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 186的DVD重 鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 187的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-17A和IL-I β (seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 188和SEQ ID N0. 190的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 189和SEQ ID N0. 191的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-17A和IL-I β (seq. 1)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 188的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 189的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-17A和IL-I β (seq. 1)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 190的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 191的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I β (seq. 1)和RANKL的結合蛋白包含選自SEQID NO. 192和SEQ ID NO. 194的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID NO. 193和SEQ ID NO. 195的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I β (seq. 1)和RANKL的 結合蛋白包含SEQ ID NO. 192的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 193的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I β (seq. 1)和RANKL的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID NO. 194的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 195的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I β (seq. 1)和VEGF的結合蛋白包含選自SEQ ID NO. 196 和 SEQ ID NO. 198 的 DVD 重鏈胺基酸序列；和選自 SEQ ID NO. 197 和 SEQ ID NO. 199 的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I β (seq. 1)和VEGF的結合蛋白 包含SEQ ID NO. 196的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 197的DVD輕鏈胺基酸序列。在 另一個實施方案中，能夠結合IL-I β (seq. 1)和VEGF的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID NO. 198的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 199的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合RANKL和⑶-20的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 200 和SEQ ID N0. 202的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 201和SEQ ID N0. 203的DVD 輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合RANKL和⑶-20的結合蛋白包含SEQ ID N0. 200的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 201的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方 案中，能夠結合RANKL和⑶-20的結合蛋白具有反向方向，並包含SEQ ID N0. 202的DVD重 鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 203的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 204和SEQ ID N0. 206的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 205和SEQ ID N0. 207的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 204的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 205的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 206的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 207的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 208和SEQ ID N0. 210的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 209和SEQ ID N0. 211的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 208的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 209的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 210的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 211的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 212和SEQ ID N0. 214的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 213和SEQ ID N0. 215的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 212的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 213的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 214的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 215的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL_1 β (seq. 1)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 216和SEQ ID N0. 218的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 217和SEQ ID N0. 219的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 1)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 216的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 217的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 1)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID NO. 218的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO. 219的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID NO. 220和SEQ ID NO. 222的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID NO. 221和SEQ ID NO. 223的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-1 α和IL-1 β (seq. 2)的 結合蛋白包含SEQ ID NO. 220的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 221的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 222的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 223的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 224和SEQ ID N0. 226的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 225和SEQ ID N0. 227的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 224的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 225的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 226的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 227的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 228和SEQ ID N0. 230的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 229和SEQ ID N0. 231的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 228的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 229的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 230的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 231的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-1 β (seq. 2)的結合蛋白包含選自SEQ ID N0. 232和SEQ ID N0. 234的DVD重鏈胺基酸序列；和選自SEQ ID N0. 233和SEQ ID N0. 235的DVD輕鏈胺基酸序列。在一個實施方案中，能夠結合IL-1 α和IL-1 β (seq. 2)的 結合蛋白包含SEQ ID N0. 232的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 233的DVD輕鏈胺基酸 序列。在另一個實施方案中，能夠結合IL-I α和IL-I β (seq. 2)的結合蛋白具有反向方向， 並包含SEQ ID N0. 234的DVD重鏈胺基酸序列和SEQ ID N0. 235的DVD輕鏈胺基酸序列。在另一個實施方案中，本發明提供包含多肽鏈的結合蛋白，其中所述多肽鏈包含 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個 重鏈可變結構域；VD2是從第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第二個重鏈可變結構 域；C是重鏈恆定結構域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2)η是Fc區，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在一個實施方案中，Fc區不存在於結合 蛋白中。在另一個實施方案中，本發明提供包含多肽鏈的結合蛋白，其中所述多肽鏈包含 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個 輕鏈可變結構域；VD2是從第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第二個輕鏈可變結構 域；C是輕鏈恆定結構域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2)η不包含Fc區，其中所述(Χ2)η存在或不存在。在一個實施方案中，(Χ2)η不存在 於結合蛋白中。在另一個實施方案中，本發明的結合蛋白包含第一個和第二個多肽鏈，其中所述第一個多肽鏈包含第一個VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個親本抗體或其抗 原結合部分獲得的第一個重鏈可變結構域；VD2是從第二個親本抗體或其抗原結合部分獲 得的第二個重鏈可變結構域；C是重鏈恆定結構域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中 所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fc區，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第 二個多肽鏈包含第二個VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一個親本抗體或其抗原 結合部分獲得的第一個輕鏈可變結構域；VD2是從第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得 的第二個輕鏈可變結構域；C是輕鏈恆定結構域；(XDn是接頭，條件是它不是CHl，其中所 述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc區，其中所述(X2)n存在或不存在。在另一個 實施方案中，結合蛋白包含兩個第一個多肽鏈和兩個第二個多肽鏈。在另一個實施方案中， (X2) η不存在於第二個多肽中。在另一個實施方案中，Fc區如果存在於第一個多肽中，則其 選自天然序列Fc區和變體序列Fc區。在另一個實施方案中，Fc區選自來自IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 和 IgD 的 Fc 區。在另一個實施方案中，本發明的結合蛋白是能夠結合兩個抗原、包含四個多肽鏈 的DVD-Ig，其中，第一個和第三個多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是從第一 個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個重鏈可變結構域；VD2是從第二個親本抗體或 其抗原結合部分獲得的第二個重鏈可變結構域；C是重鏈恆定結構域；(XDn是接頭，條件 是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n是Fc區，其中所述(X2)n存在或不 存在；且其中所述第二個和第四個多肽鏈包含VDl- (Xl) n-VD2-C- (X2) n，其中VDl是從第一 個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個輕鏈可變結構域；VD2是從第二個親本抗體或 其抗原結合部分獲得的第二個輕鏈可變結構域；C是輕鏈恆定結構域；(XDn是接頭，條件 是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc區，其中所述(X2)n存在 或不存在。本發明提供通過預選擇親本抗體製備DVD-Ig結合蛋白的方法。在一個實施方案 中，製備能夠結合兩個抗原的雙重可變結構域免疫球蛋白的方法包含步驟a)獲得能夠結 合第一個抗原的第一個親本抗體或其抗原結合部分；b)獲得能夠結合第二個抗原的第二 個親本抗體或其抗原結合部分；c)構建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第一個和第三個 多肽鏈，其中VDl是從所述第一個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個重鏈可變結構 域；VD2是從所述第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第二個重鏈可變結構域；C是重 鏈恆定結構域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fc區，其中所述(Χ2)η存在或不存在；d)構建包含VDl-(Xl)n-VD2-C_(X2)η的第二個 和第四個多肽鏈，其中VDl是從所述第一個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個輕鏈 可變結構域；VD2是從所述第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第二個輕鏈可變結構 域；C是輕鏈恆定結構域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2) η不包含Fc區，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表達所述第一個、第二個、第三個 和第四個多肽鏈；從而生成能夠結合所述第一個和所述第二個抗原的雙重可變結構域免疫 球蛋白。在另一個實施方案中，本發明提供生成具有所需特性的能夠結合兩個抗原的雙重 可變結構域免疫球蛋白的方法，包含步驟a)獲得第一個親本抗體或其抗原結合部分，其能 夠結合第一個抗原且具有至少一個由雙重可變結構域免疫球蛋白表現的所需特性；b)獲
23得第二個親本抗體或其抗原結合部分，其能夠結合第二個抗原且具有至少一個由雙重可變 結構域免疫球蛋白表現的所需特性；c)構建包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n的第一個和第三 個多肽鏈，其中VDl是從所述第一個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個重鏈可變結 構域；VD2是從所述第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第二個重鏈可變結構域；C是 重鏈恆定結構域；(Xl)n是接頭，條件是它不是CH1，其中所述(Xl)n存在或不存在；且(X2) η是Fc區，其中所述(Χ2)η存在或不存在；d)構建包含VDl-(Xl)n-VD2-C_(X2)η的第二個 和第四個多肽鏈，其中VDl是從所述第一個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第一個輕鏈 可變結構域；VD2是從所述第二個親本抗體或其抗原結合部分獲得的第二個輕鏈可變結構 域；C是輕鏈恆定結構域；(Xl) η是接頭，條件是它不是CHl，其中所述(Xl) η存在或不存在； 且(Χ2) η不包含Fc區，其中所述(Χ2) η存在或不存在；e)表達所述第一個、第二個、第三個 和第四個多肽鏈；從而生成具有所需特性的能夠結合所述第一個和所述第二個抗原的雙重 可變結構域免疫球蛋白。在一個實施方案中，在此公開的第一個和第二個多肽鏈的VDl是從相同親本抗體 或其抗原結合部分獲得的。在另一個實施方案中，在此公開的第一個和第二個多肽鏈的VDl 是從不同親本抗體或其抗原結合部分獲得的。在另一個實施方案中，在此公開的第一個和 第二個多肽鏈的VD2是從相同親本抗體或其抗原結合部分獲得的。在另一個實施方案中， 在此公開的第一個和第二個多肽鏈的VD2是從不同親本抗體或其抗原結合部分獲得的。在一個實施方案中，第一個親本抗體或其抗原結合部分與第二個親本抗體或其抗 原結合部分是相同抗體。在另一個實施方案中，第一個親本抗體或其抗原結合部分與第二 個親本抗體或其抗原結合部分是不同抗體。在一個實施方案中，第一個親本抗體或其抗原結合部分結合第一個抗原，而第二 個親本抗體或其抗原結合部分結合第二個抗原。在具體實施方案中，第一個和第二個抗原 是相同抗原。在另一個實施方案中，親本抗體結合相同抗原上的不同表位。在另一個實施 方案中，第一個和第二個抗原是不同抗原。在另一個實施方案中，第一個親本抗體或其抗原 結合部分結合第一個抗原，其結合能力不同於第二個親本抗體或其抗原結合部分結合第二 個抗原的能力。在另一個實施方案中，第一個親本抗體或其抗原結合部分結合第一個抗原， 其結合親和力不同於第二個親本抗體或其抗原結合部分結合第二個抗原的親和力。在另一個實施方案中，第一個親本抗體或其抗原結合部分和第二個親本抗體或其 抗原結合部分選自人抗體、⑶R嫁接的抗體(⑶R grafted antibody)和人源化抗體。在一 個實施方案中，抗原結合部分選自Fab片段、F(ab' )2片段、包含由鉸鏈區的二硫鍵連接的 2個Fab片段的二價片段；由VH和CHl結構域組成的Fd片段；由抗體單臂的VL和VH結構 域組成的Fv片段、dAb片段、分離的互補性決定區(CDR)、單鏈抗體和雙抗體。在另一個實施方案中，本發明的結合蛋白具有至少一個由第一個親本抗體或其抗 原結合部分、或第二個親本抗體或其抗原結合部分表現的所需特性。可替代的，第一個親 本抗體或其抗原結合部分和第二個親本抗體或其抗原結合部分具有至少一個由雙重可變 結構域免疫球蛋白表現的所需特性。在一個實施方案中，所需特性選自一個或多個抗體參 數。在另一個實施方案中，抗體參數選自抗原特異性、對抗原的親和力、能力、生物學功能、 表位識別、穩定性、可溶性、生產效率、免疫原性、藥物代謝動力學、生物利用率、組織交叉反 應性、以及直向同源抗原結合。在一個實施方案中，結合蛋白是多價的。在另一個實施方案中，結合蛋白是多特異性的。此處所述的多價和或多特異性結合蛋白具有特別從治療觀點 來看需要的特性。例如，多價和或多特異性結合蛋白可以(1)經由細胞比二價抗體更快速 內在化(和/或發生分解代謝)，所述細胞表達抗體與之結合的抗原；(2)是激動劑抗體；和 /或(3)誘導表達多價抗體能夠與之結合的抗原的細胞的細胞死亡和/或細胞凋亡。提供 多價和或多特異性結合蛋白的至少一種抗原結合特異性的「親本抗體」可以是，經由表達抗 體與之結合的抗原的細胞內在化(和/或發生分解代謝)的抗體；和/或可以是激動劑、細 胞死亡誘導、和/或細胞凋亡誘導性抗體，且如本文所述的多價和或多特異性結合蛋白可 以展示這些特性中的一種或多種中的改善。此外，親本抗體可以缺乏這些特性中的一種或 多種，但如此處所述構建為多價結合蛋白時可以賦予這些特性。在另一個實施方案中，如通過表面等離振子共振測量的，本發明的結合蛋白具 有的對於一種或多種靶的結合速率(on rate)常數(Kon)選自至少約IO2M4iT1 ；至少 約ΙΟ、-、—1 ；至少約ΙΟ 1 ；至少約IO5M-1S-1 ；和至少約IO6M"1 S^10在一個實施方案中，如 通過表面等離振子共振測量的，本發明的結合蛋白對於一種或多種靶具有的結合速率常 數(Kon)為 ΙΟ 1 至 IO3M-1S-1 ； IO3M"1 s"1 至 lOVs"1 ；lOVs—1 至 IO5M^1s"1 ；或 ΙΟ Υ1 至 IO6M-1S-1 之間。在另一個實施方案中，如通過表面等離振子共振測量的，結合蛋白具有的對於 一種或多種靶的解離速率(off rate)常數(Koff)選自至多約ΙΟ、—1 ；至多約ΙΟ、—1 ； 至多約ΙΟ、—1 ；和至多約ΙΟ、—1。在一個實施方案中，如通過表面等離振子共振測量的， 本發明的結合蛋白具有的對於一種或多種靶的解離速率常數(Koff)為ioAtio^r1 ； IO-4S-LlO-5S-1 ；或 IO-VU。在另一個實施方案中，結合蛋白具有的對於一種或多種靶的解離常數(Kd)選自 至多約ICT7M ；至多約ICT8M ；至多約ICT9M ；至多約IiT10M ；至多約IiT11M ；至多約ICT12M ；和 至多10_13M。在一個實施方案中，本發明的結合蛋白具有的對於其靶的解離常數(Kd)為 1 (T7M-ICT8M ； 1(Γ8Μ-1(Γ9Μ ;1(T9M-1(T1CIM ； KTici-Iir11M ； KT11M-Iir12M ；或 ICT12-M IO-13Mo在另一個實施方案中，此處所述的結合蛋白是進一步包含選自下述的試劑的綴合 物免疫粘附分子、顯像劑、治療劑和細胞毒性劑。在一個實施方案中，顯像劑選自放射性標 記、酶、螢光標記、發光標記、生物發光標記、磁性標記、和生物素。在另一個實施方案中，顯 像劑是選自下述的放射性標記3H、14C、35S、9°Y、99Tc、mIn、125I、131I、177LU、166H0、和 153Sm0 在另 一個實施方案中，治療或細胞毒性劑選自抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、 抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環類、毒素、和細胞凋亡劑。在另一個實施方案中，此處所述的結合蛋白是結晶結合蛋白且作為晶體存在。在 一個實施方案中，晶體是無載體的藥學控釋晶體。在另一個實施方案中，結晶結合蛋白具有 比所述結合蛋白的可溶性配對物更長的體內半衰期。在另一個實施方案中，結晶結合蛋白 保留生物學活性。在另一個實施方案中，此處所述的結合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化 模式。本發明的一個方面涉及編碼此處公開的任何一種結合蛋白的分離的核酸。進 一步的實施方案提供包含此處公開的分離的核酸的載體，其中所述載體選自pcDNA; pTT (Durocher 等人，Nucleic Acids Research 2002，第 30 卷，No. 2) ；pTT3(具有另外的多克隆位點的 PTT ；pEFBOS(Mizushima, S.和 Nagata，S.，(1990)Nucleic acids Research 第 18 卷，No. 17) ；pBV ；pJV ；pcDNA3. 1 TOPO, pEF6 TOPO 和 pBJ。在一個實施方案中，該載體是 在美國專利申請系列號61/021，282中公開的載體。在另一個方面，宿主細胞用此處公開的載體轉化。在一個實施方案中，宿主細胞是 原核細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)。在相關實施方案中，宿 主細胞是真核細胞。在另一個實施方案中，真核細胞選自原生生物細胞、動物細胞、植物細 胞和真菌細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，包括但不限於，CH0, COS ； NSO、SP2、PER. C6或真菌細胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆蟲細胞 例如Sf9 ο在一個實施方案中，在單個重組宿主細胞中生產例如具有不同特異性的兩個或更 多個DVD-Ig。例如，已將抗體混合物的表達稱為Oligoclonics Merus B. V.，荷蘭)美國 專利號 7，262，028 ；7，429，486。本發明的另一個方面提供了生產此處公開的結合蛋白的方法，所述方法包括在足 以生產結合蛋白的條件下，在培養基中培養同樣在此處公開的任何一種宿主細胞。在一個 實施方案中，通過這種方法生產的50% -75%的結合蛋白是雙重特異性四價結合蛋白。在 具體實施方案中，通過這種方法生產的75%-90%的結合蛋白是雙重特異性四價結合蛋 白。在具體實施方案中，生產的90% -95%的結合蛋白是雙重特異性四價結合蛋白。一個實施方案提供了用於釋放結合蛋白的組合物，其中所述組合物包含製劑， 所述製劑又包含如此處公開的結晶結合蛋白和成分，以及至少一種聚合載體。例如，聚 合載體是選自下述的一種或多種的聚合物聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚胺基酸、聚酐、 聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羥基丁酸酯、聚己內酯、聚二氧 雜環己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羥丙基)甲基丙烯醯胺、聚有機磷腈、聚原 酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、馬來酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清 蛋白、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原、血纖蛋白、明膠、透明質酸、寡糖、糖胺聚糖 (glycaminoglycans)、硫酸化多糖、摻合物及其共聚物。例如，成分選自清蛋白、蔗糖、海藻 糖、乳糖醇(lactitol)、明膠、羥丙基-β-環糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一個實 施方案提供了用於治療哺乳動物的方法，所述方法包括給哺乳動物施用有效量的此處公開 的組合物的步驟。本發明還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含如此處公開的結合蛋白和藥學 可接受的載體。在進一步的實施方案中，藥物組合物包含用於治療病症的至少一種另外的 治療劑。例如，另外的試劑選自治療劑，顯像劑，細胞毒性劑，血管發生抑制劑(包括但不 限於抗VEGF抗體或VEGF-trap)；激酶抑制劑(包括但不限於KDR和TIE-2抑制劑)；共刺 激分子阻斷劑(包括但不限於抗B7. 1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗⑶20)；粘附分子阻斷劑(包 括但不限於抗LFA-I抗體、抗E/L選擇蛋白抗體、小分子抑制劑)；抗細胞因子抗體或其功 能片段(包括但不限於抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/細胞因子受體抗體)；氨甲蝶呤；環孢 菌素；雷帕黴素疋K506 ；可檢測標記或報導分子；TNF拮抗劑；抗風溼劑；肌肉弛緩劑，麻醉 藥，非類固醇消炎藥(NSAID)，止痛劑，麻醉劑，鎮靜劑，局部麻醉劑，神經肌肉阻斷劑；抗微 生物劑，抗牛皮癬劑，皮質類固醇，促蛋白合成類固醇，促紅細胞生成素，免疫接種，免疫球 蛋白，免疫抑制劑，生長激素，激素替代藥物，放射性藥物，抗抑鬱藥，抗精神病藥，刺激劑，哮喘藥物治療，β激動劑，吸入類固醇，腎上腺素或類似物，細胞因子，和細胞因子拮抗劑。
在另一個方面，本發明提供了用於治療患有病症的人受試者的方法，在所述病症 中能夠由此處公開的結合蛋白結合的一種或多種靶是有害的，所述方法包括給人受試者施 用此處公開的結合蛋白，從而使得人受試者中的一種或多種靶的活性被抑制，並且多種症 狀之一減輕或達到治療。例如，病症選自關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、膿毒性關 節炎、萊姆關節炎、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、Crohn氏 病、潰瘍性結腸炎、炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、變應性疾病、牛皮癬、 皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、與器官移植相關的急性或慢性免疫性疾病、 肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、彌散性血管內凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、腎病症候群、慢 性疲乏症候群、韋格納氏肉芽腫病、過敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微血 管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、膿毒性休克、中毒性休克症候群、膿毒病症候群、惡病質、 傳染病、寄生蟲病、獲得性免疫缺陷症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏 病、阿爾茨海默氏病、中風、原發性膽汁性肝硬變、溶血性貧血、惡性腫瘤、心力衰竭、心肌梗 死、Addison氏病、散發性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏症候群、成人(急 性)呼吸窘迫症候群、禿頭、斑禿(alopecia areata)、血清反應陰性關節病(arthopathy)、 關節病、Reiter氏病、牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸炎性關節病、腸病性滑膜炎、衣原體、耶 爾森氏菌和沙門氏菌相關性關節病、脊椎關節病(spondyloarthopathy)、動脈粥樣化疾病 /動脈硬化、特應性變態反應、自身免疫性大皰性疾病、尋常天皰瘡、落葉狀天皰瘡、類天皰 瘡、線性IgA疾病、自身免疫性溶血性貧血、Coombs陽性溶血性貧血、獲得性惡性貧血、青 少年性惡性貧血、肌痛腦炎/Royal Free疾病、慢性黏膜皮膚念珠菌病、巨細胞性動脈炎、 原發性硬化性肝炎、隱原性自身免疫性肝炎、獲得性免疫缺陷病症候群、獲得性免疫缺陷相 關病、B型肝炎、C型肝炎、常見的各種免疫缺陷(常見的可變低丙種球蛋白血症)、擴張型 心肌病、女性不育、卵巢衰竭、過早卵巢衰竭、纖維化肺疾病、隱原性纖維化肺泡炎、炎症後 間質性肺病、間質性肺炎、結締組織病相關性間質性肺病、混合型結締組織病相關性肺病、 全身性硬皮病相關性間質性肺病、類風溼性關節炎相關性間質性肺病、全身性紅斑狼瘡相 關性肺病、皮肌炎/多肌炎相關性肺病、Sj5gren氏病相關性肺病、強直性脊柱炎相關性肺 病、脈管炎性彌散性肺病、含鐵血黃素沉著病相關性肺病、藥物誘導的間質性肺病、纖維化、 放射性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴細胞性浸潤性肺病、傳染後間質 性肺病、痛風性關節炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(傳統自身免疫性或狼瘡樣 肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自身免疫介導的低血糖、具有黑棘皮症 的B型胰島素耐受性、甲狀旁腺機能減退、與器官移植相關的急性免疫性疾病、與器官移 植相關的慢性免疫性疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮癬、2型牛皮癬、特發 性白細胞減少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白細胞減少症、腎臟病N0S、腎小球腎炎 (glomerulon印hritides)、腎顯微血管炎(vasulitis)、萊姆病、盤狀紅斑狼瘡、特發性男性 不育症或N0S、精子自身免疫性、多發性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、結締組織病繼發的 肺動脈高壓、Goodpasture氏症候群、結節性多動脈炎的肺表現、急性風溼熱、類風溼性脊椎 炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sj0rgren氏症候群、Takayasu氏病/動脈炎、自身免疫性 血小板減少症、特發性血小板減少症、自身免疫性甲狀腺病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺腫性 (goitrous)自身免疫性甲狀腺功能減退(Hashimoto氏病)、萎縮性自身免疫性甲狀腺功能減退、原發性粘液性水腫、晶狀體性(phacogenic)葡萄膜炎、原發性血管炎、白癜風急性 肝病、慢性肝病、酒精性肝硬變、酒精誘導的肝損傷、膽汁鬱積(choleosatatis)、特應性肝 病、藥物誘導的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、變態反應和哮喘、B群鏈球菌(GBS)感染、精神 障礙(例如，抑鬱和精神分裂症)、Th2型和Thl型介導的疾病、急性和慢性痛(不同形式的 疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、結腸、胰、卵巢、前列腺和直腸癌以及造血惡性腫瘤 (白血病和淋巴瘤)、無β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)、手足發紺、急性和慢性寄生 或感染過程、急性白血病、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、急 性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎功能衰竭、腺癌、心房(aerial)異位搏動、AIDS痴 呆復徵、酒精誘導的肝炎、變應性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、變應性鼻炎、同種異體移植物 排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞(horn cell)變 性、抗cd3治療、抗磷脂症候群、抗受體超敏反應、主動脈和周圍性動脈瘤(aneuryisms)、主 動脈壁夾層形成、高動脈壓、動脈硬化、動靜脈瘻、共濟失調、心房纖維顫動(持續性或陣發 性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支傳 導阻滯、Burkitt氏淋巴瘤、燒傷、心律失常、心臟震暈症候群、心臟腫瘤、心肌病、心肺分流 術炎症應答、軟骨移植排斥、小腦皮質變性、小腦病症、紊亂性或多源性房性心動過速、化學 療法相關病症、慢性髓細胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理學、慢性淋巴細胞 性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結腸直腸癌、充血性心 力衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺源性心臟病、冠狀動脈疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培養物 陰性膿毒病、囊性纖維化、細胞因子療法相關病症、拳擊員痴呆(Dementia pugilistica)、 脫髓鞘病、登革出血熱、皮炎、皮膚病學狀況、多尿症(diabetes)、糖尿病、糖尿病性動脈硬 化性(ateriosclerotic)疾病、瀰漫性Lewy小體病、擴張性充血性心肌病、基底神經節病 症、中年唐氏症候群、由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘導的藥物誘導的運動障礙、藥物敏感 性、溼疹、腦脊髓炎、心內膜炎、內分泌病、會厭炎、EB病毒感染、紅斑性肢痛病、錐體外束和 小腦病症、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴組織細胞增多症、胎兒胸腺移植排斥、 Friedreich氏共濟失調、功能性外周性動脈病症、真菌性膿毒病、氣性壞疽病、胃潰瘍、腎 小球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽性膿毒病、由於細 胞內生物的肉芽腫、毛細胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲狀腺炎、枯 草熱、心臟移植排斥、血色素沉著症、血液透析、溶血性尿毒性症候群/血栓溶解性血小板 減少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神經病、何杰 金氏病、運動過度性運動障礙、超敏反應、超敏感性肺炎、高血壓、運動機能減退性運動障 礙、下丘腦_垂體_腎上腺軸評價、特發性Addison氏病、特發性肺纖維化、抗體介導的細 胞毒性、虛弱、嬰兒型脊髓性肌萎縮、主動脈炎症、流行性感冒a、電離輻射照射、虹膜睫狀 體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血性再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風溼性關節炎、青 少年脊髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤、腎移植排斥、軍團桿菌、利什曼病、麻風病、皮層脊髓系 統損傷、脂肪水腫、肝移植排斥、淋巴水腫(lymphederma)、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細 胞增多症、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、線粒體多 系統病症、混合型結締組織病、單克隆丙種球蛋白病、多發性骨髓瘤、多系統變性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Jos印h)、重症肌無力、鳥胞內分支桿菌、結核分 支桿菌、骨髓異常增生症候群、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎變病、神經變性疾病、神經原性I肌萎縮、嗜中性粒細胞減少性發燒、非何杰金淋巴瘤、 腹主動脈及其分支閉塞、閉塞性動脈病症、okt3治療、睪丸炎/附睪炎(印idydimitis)、 睪丸炎/輸精管切除術逆轉操作、器官巨大症、骨質疏鬆症、胰移植排斥、胰癌、惡性腫瘤 的腫瘤相關症候群/高鈣血症、甲狀旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾 病、外周性動脈粥樣硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病症、腹膜炎、惡性貧血、卡 氏肺囊蟲性肺炎、肺炎、POEMS症候群(多發性神經病、器官巨大症、內分泌病、單克隆丙種 球蛋白病、和皮膚變化症候群)、灌注後症候群、泵後症候群、MI心切開術後症候群、先兆 子癇、進行性核上(supranucleo)麻痺、原發性肺動脈高壓、放射治療、Raynaud氏現象和 疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常規狹窄QRS心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、 限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小體型老年性痴呆、血清反應陰性關節 病、中風、鐮狀細胞貧血、皮膚同種異體移植物排斥、皮膚變化症候群、小腸移植排斥、實體 瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共濟失調、脊髓小腦變性、鏈球菌肌炎、小腦結構 損傷、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統梅毒、全身性過敏反應(anaphalaxis)、全身 炎症反應症候群、全身發作性青少年類風溼性關節炎、T細胞或FAB ALL、毛細血管擴張、血 栓閉塞性脈管炎、血小板減少症、毒性、移植物、創傷/出血、III型超敏反應、IV型超敏反 應、不穩定心絞痛、尿毒症、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、 靜脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒和真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關 性噬紅細胞(hemaphagocytic)症候群、Wernicke-Korsakoff症候群、Wilson氏病、任何器 官或組織的異種移植排斥、急性冠狀動脈症候群、急性特發性多神經炎、急性炎性脫髓鞘性 多發性神經根性神經病、急性缺血、成人Still氏病、斑禿、過敏反應、抗磷脂抗體症候群、 再生障礙性貧血、動脈硬化、特應性溼疹、特應性皮炎、自身免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關 的自身免疫性病症、自身免疫性腸病、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性淋巴細胞增生綜合 徵(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性過早卵巢衰竭、瞼炎、支氣管擴張、大皰性類天皰 瘡、心血管病、災變性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節強硬、慢性缺血、疤痕性類天皰瘡、具 有多發性硬化風險的臨床孤立症候群(clinically isolated syndrome) (cis)、結膜炎、 兒童期發病性精神病(childhood onset psychiatric disorder)、慢性阻塞性肺部疾病 (COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病、糖尿病、椎間盤突出(disk herniation)、盤脫 垂(disk prolaps)、藥物誘導的免疫性溶血性貧血、心內膜炎、子宮內膜異位、眼內炎、鞏膜 外層炎、多形性紅斑、重型多形性紅斑、妊娠期類天皰瘡、Guillain-Barre症候群(GBS)、枯 草熱、Hughes症候群、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導的變態反應、免疫 性溶血性貧血、內含體肌炎、傳染性眼炎性疾病、炎性脫髓鞘疾病、炎性心臟病、炎性腎病、 IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎(keratojuntivitis sicca)、Kussmaul病或 Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痺、朗格漢斯(Langerhan，s)細胞組織細胞增多症、網狀 青斑、黃斑變性、顯微鏡下多脈管炎、morbus bechterev、運動神經元病症、黏膜類天皰瘡、 多器官衰竭、重症肌無力、脊髓異常增生症候群、心肌炎、神經根障礙、神經病、非甲非乙型 肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節的JRA、周圍動脈閉塞性疾病(PAOD)、周圍血管 疾病(PVD)、外周動脈疾病(PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎(或結節性動脈外膜炎)、多軟 骨炎、風溼性多肌病、白髮症、多關節的JRA、多發性內分泌缺陷症候群、多肌炎、風溼性多肌 病(PMR)、泵後症候群(post-pump syndrome)、原發性帕金森症候群、前列腺和直腸癌以及
29造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、單純紅細胞再生障礙、原發性腎上腺機能不 足、復髮型視神經脊髓炎、再狹窄、風溼性心臟病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨 炎)、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不足、聚 矽氧烷相關的結締組織病、sneddon-wilkinson皮膚病、關節強硬性脊椎炎(spondilitis ankylosans)、Stevens-Johnson症候群(SJS)、全身性炎症應答症候群、顳動脈炎、弓形 體視網膜炎、中毒性表皮壞死松解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體，I型變態 反應，II型糖尿病、蕁麻疹、普通型間質性肺炎(UIP)、脈管炎、春季結膜炎、病毒性視網 膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada症候群(VKH症候群)、溼黃斑變性、傷口癒合、耶爾森氏菌 (yersinia)和沙門氏菌(salmonella)相關的關節病。在一個實施方案中，可以用本發明的組合物和方法治療或診斷的疾病包括但不限 於原發性和轉移性癌症，包括乳腺、結腸、直腸、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、膽囊和膽 管、小腸、尿道(包括腎、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宮頸、子宮和卵巢，以及絨 毛膜癌和妊娠性滋養層細胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睪丸和生殖細胞腫瘤)、 內分泌腺(包括甲狀腺、腎上腺和腦下垂體)和皮膚的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括 從骨和軟組織產生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，腦、神經、眼和腦膜(包括星形細胞瘤、神經 膠質瘤、成膠質細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、成神經細胞瘤、神經鞘瘤(Schwannomas) 和腦膜瘤)的腫瘤，從造血惡性腫瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金與非何杰金淋巴瘤)產 生的實體瘤。本發明的DVD-Igs也可以治療一種或多種下列疾病急性冠狀動脈症候群、急性 特發性多神經炎、急性炎性脫髓鞘性多發性神經根性神經病、急性缺血、成人still氏病、 斑禿、過敏反應、抗磷脂抗體症候群、再生障礙性貧血、動脈硬化、特應性溼疹、特應性皮炎、 自身免疫性皮炎、與鏈球菌感染相關的自身免疫性病症、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性 淋巴細胞增生症候群(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性血小板減少症(AITP)、瞼炎、 支氣管擴張、大皰性類天皰瘡、心血管病、災變性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節強硬、慢 性缺血、疤痕性類天皰瘡、具有多發性硬化風險的臨床孤立症候群(CIS)、結膜炎、兒童期發 病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病、糖尿病、椎 間盤突出、盤脫垂、藥物誘導的免疫性溶血性貧血、心內膜炎、子宮內膜異位、眼內炎、鞏膜 外層炎、多形性紅斑、重型多形性紅斑、妊娠期類天皰瘡、Guillain-Barre症候群(GBS)、枯 草熱、Hughes症候群、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導的變態反應、免疫 性溶血性貧血、內含體肌炎、傳染性眼炎性疾病、炎性脫髓鞘疾病、炎性心臟病、炎性腎病、 IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏 麻痺、朗格漢斯細胞組織細胞增多症、網狀青斑、黃斑變性、惡性腫瘤、顯微鏡下多脈管炎、 Morbus Bechterev、運動神經元病症、黏膜類天皰瘡、多器官衰竭、重症肌無力、脊髓異常增 生症候群、心肌炎、神經根障礙、神經病、非甲非B型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少 關節的JRA、周圍動脈閉塞性疾病(PAOD)、周圍血管疾病(PVD)、外周動脈疾病(PAD)、靜脈 炎、結節性多動脈炎(或結節性動脈外膜炎)、多軟骨炎、風溼性多肌病、白髮症、多關節的 JRA、多發性內分泌缺陷症候群、多肌炎、風溼性多肌病(PMR)、泵後症候群、原發性帕金森綜 合徵、前列腺和直腸癌以及造血惡性腫瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、單純紅細胞再生 障礙、原發性腎上腺機能不足、復髮型視神經脊髓炎、再狹窄、風溼性心臟病、SAPHO(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、繼發性澱粉樣變性、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經 痛、繼發性腎上腺機能不足、聚矽氧烷相關的結締組織病、Sneddon-Wilkinson皮膚病、關 節強硬性脊椎炎、Stevens-Johnson症候群(SJS)、全身性炎症應答症候群、顳動脈炎、弓形 體視網膜炎、中毒性表皮壞死松解、橫貫性脊髓炎、TRAPS (腫瘤壞死因子受體，I型變態反 應，II型糖尿病、蕁麻疹、普通型間質性肺炎(UIP)、脈管炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、 Vogt-Koyanagi-Harada症候群(VKH症候群)、溼黃斑變性和傷口癒合。在一個實施方案中，將本發明的抗體或其抗原結合部分在單獨地或與放射治療和 /或其他化療劑組合地使用時，用於治療癌症或預防此處所述腫瘤的轉移。在另一個方面，本發明提供了治療患有病症的患者的方法，所述方法包括在如此 處討論的第二種試劑施用之前、同時或之後，施用此處公開的任何一種結合蛋白的步驟。在 具體實施方案中，第二種試劑選自布地萘德，表皮生長因子，皮質類固醇，環孢菌素，柳氮磺 吡啶，氨基水楊酸鹽，6-巰基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制劑，美沙拉秦，奧沙拉 嗪，巴柳氮，抗氧化劑，血栓烷抑制劑，IL-I受體拮抗劑，抗IL-I β mAbs，抗IL-6或IL-6受 體mAbs，生長因子，彈性蛋白酶抑制劑，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-U IL_2、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II, GM-CSF、FGF 和 PDGF 抗 體或激動劑，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90 或其配 體的抗體，氨甲蝶呤，環孢菌素，Π(506，雷帕黴素，黴酚酸酯，來氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮 質類固醇，強的松龍，磷酸二酯酶抑制劑，腺苷激動劑，抗凝劑，補體抑制劑，腎上腺素能藥， IRAK, NIK, IKK, p38，MAP激酶抑制劑，IL-I β轉換酶抑制劑，TNF α轉換酶抑制劑，T細胞發 信號抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，柳氮磺吡唆，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，血管緊張素轉換酶抑 製劑，可溶性細胞因子受體，可溶性P55TNF受體，可溶性p75TNF受體，sIL_lRI、sIL_lRII、 sIL-6R，抗炎細胞因子，IL-4、IL-10、IL-IU IL-13 和 TGFβ。在具體實施方案中，此處公開的藥物組合物經由選自下述的至少一種模式給患 者施用腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節內(intrarticular)、支氣管內、腹內、囊內、軟骨 內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、 腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀 胱內、快速灌注(bolus)、陰道、直腸、口腔含化、舌下、鼻內、和經皮。本發明的一個方面提供針對本發明的至少一種結合蛋白的至少一種抗獨特型抗 體。抗獨特型抗體包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子， 例如但不限於，重或輕鏈的至少一個互補性決定區(CDR)或其配體結合部分，重鏈或輕鏈 可變區，重鏈或輕鏈恆定區，構架區，或其可以摻入本發明的結合蛋白內的任何部分。附圖簡述圖IA是雙重可變結構域(DVD)-Ig構建體的示意圖示，且顯示了從2種親本抗體 產生DVD-Ig的策略；

圖18是構建體0￥01-18、0￥02-18，以及來自雜交瘤克隆2013丄3(抗-11^-10)和 13F5. G5 (抗-IL-I β )的2種嵌合單特異性抗體的示意圖示。發明詳述本發明涉及能夠結合2種或更多抗原的多價和/或多特異性結合蛋白。具體而 言，本發明涉及雙重可變結構域免疫球蛋白(DVD-Ig)、及其藥物組合物、以及用於製備此種DVD-Igs的核酸、重組表達載體和宿主細胞。本發明還包含了使用本發明的DVD-Igs在體外 或體內檢測特異性抗原的方法。除非本文另有定義，連同本發明使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術人 員通常理解的含義。術語的含義和範圍應當清晰，然而，在任何潛在不明確性的情況下，本 文提供的定義優先於任何字典或外來定義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括復 數，且複數術語應包括單數。在本申請中，除非另有說明，「或」的使用意味著「和/或」。此 外，術語「包括」及其他形式的使用是非限制性的。同樣，除非另有具體說明，術語例如「元 件」或「組分」涵蓋包含一個單位的元件和組分以及包含超過一個亞單位的元件和組分。一般地，連同本文描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學 以及蛋白和核酸化學和雜交使用的命名法和其技術是本領域眾所周知和通常使用的那些。 除非另有說明，本發明的方法和技術一般根據本領域眾所周知，且如各種一般和更具體的 參考文獻中所述的常規方法來進行，所述參考文獻在本說明書自始至終引用和討論。酶促 反應和純化技術根據製造商的說明書、如本領域通常實現的或如本文所述來進行。連同本 文描述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學使用的命名法、以及其實驗室程序 和技術是本領域眾所周知和通常使用的那些。使用標準技術用於化學合成、化學分析、藥物 製備、配製、和遞送、以及患者治療。為了本發明可以更容易地理解，選擇的術語在下文定義。 如本文使用的，術語「多肽」指胺基酸的任何聚合鏈。術語「肽」和「蛋白，，可與術 語多肽互換使用，且同樣指胺基酸的聚合鏈。術語「多肽」包含天然或人工蛋白、蛋白片段 和蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。除非另外與上下文矛盾，此處使用 「多肽」意在包含多肽和其片段及變體(包括變體的片段)。對於抗原多肽，多肽片段任選 含有至少一個連續或非線性多肽表位。可以使用本領域普通方法確定至少一個表位片段的 精確邊界。該片段包含至少約5個鄰接胺基酸，例如至少約10個鄰接胺基酸、至少約15個 鄰接胺基酸、或至少約20個鄰接胺基酸。多肽變體如此處所述。術語「分離的蛋白」或「分離的多肽」是這樣的蛋白或多肽，其由於其衍生起源或來 源不與天然結合的組分結合，所述天然結合的組分在其天然狀態下與其伴隨；基本上不合 來自相同物種的其他蛋白；由來自不同物種的細胞表達；或在自然界中不存在。因此，化學 合成或在不同於其天然起源的細胞的細胞系統中合成的多肽將是與其天然結合的組分「分 離的」。還可以通過分離，使用本領域眾所周知的蛋白純化技術，使得蛋白基本上不含天然 結合的組分。如本文使用的，術語「回收」指通過分離，例如使用本領域眾所周知的蛋白純化技 術，使得化學種類例如多肽基本上不含天然結合的組分的過程。如本文使用的，「生物學活性」指分子的任一項或多項固有生物學特性(無論是如 體內發現的那樣天然存在的，還是通過重組方法提供或使成為可能的)。生物學特性包括但 不限於結合受體；誘導細胞增殖，抑制細胞生長，誘導其他細胞因子，誘導細胞凋亡，和酶促 活性。生物學活性也包括Ig分子的活性。如本文使用的，關於抗體、蛋白、或肽與第二種化學種類相互作用的術語「特異性 結合」或「特異地結合」，意指相互作用取決於化學種類上特定結構(例如，抗原決定簇或表 位)的存在；例如，抗體識別且與特定蛋白結構結合而不是一般地與蛋白結合。如果抗體對表位「A」特異，那麼在包含標記的「A」和抗體的反應中，包含表位A的分子(或游離的，未 標記的A)的存在將減少與抗體結合的標記的A的量。如本文使用的，術語「抗體」廣泛地指包含4條多肽鏈-2條重(H)鏈和2條輕(L) 鏈的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位結合特徵的任何功能片段、突 變體、變體或衍生。此種突變體、變體或衍生抗體形式是本領域已知的。其非限制性實施方 案在下文討論。在全長抗體中，每條重鏈包含重鏈可變區(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆 定區。重鏈恆定區包含3個結構域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(在本文中 縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含1個結構域CL。VH和VL區可以進一 步細分成稱為互補性決定區(CDR)的高變區，用稱為構架區(FR)的較保守區域點綴。每個 VH和VL由3個⑶Rs和4個FRs組成，以下列順序從氨基末端到羧基末端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，I gG、I gE、I gM、I gD、I gA 和 IgY)、種類(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類。術語「Fe區」用於定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域，它可以通過完整抗體的木瓜 蛋白酶消化來產生。Fc區可以是天然序列Fc區或變體Fc區。免疫球蛋白的Fc區一般包 含2個恆定結構域-CH2結構域和CH3結構域，且任選包含CH4結構域。Fc部分中改變抗 體效應子功能的胺基酸殘基替換是本領域已知的(Winter等人，美國專利號5，648，260和 5，624，821)。抗體的Fc部分介導幾種重要的效應子功能，例如細胞因子誘導、ADCC、吞噬作 用、依賴補體的細胞毒性(CDC)以及抗體和抗原-抗體複合物的半衰期/清除率。取決於 治療目的，在一些情況下這些效應子功能對於治療抗體是所需的，但在其他情況下可能是 不必要的或甚至有害的。某些人IgG同種型，特別是IgGl和IgG3，經由分別與Fc YRs和 補體Clq結合介導ADCC和⑶C。新生Fc受體(Fcfoi)是決定抗體循環半衰期的關鍵組分。 在另外一個實施方案中，至少一個胺基酸殘基在抗體恆定區例如抗體Fc區中進行替換，從 而使得抗體的效應子功能被改變。免疫球蛋白的2條相同重鏈的二聚化由CH3結構域的二 聚化來介導，且通過鉸鏈區內的二硫鍵來穩定(Huber等人，Nature ；264 :415-20 ；Thies等 人，1999 J Mol Biol ；293 :67-79.)。鉸鏈區內的半胱氨酸殘基突變以阻止重鏈-重鏈二硫 鍵將使CH3結構域的二聚化不穩定。負責CH3 二聚化的殘基已得到鑑定(Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37 :擬66_73.)。因此，可能產生單價半_Ig。有趣的是，已在自然界中發現 關於 IgG 和 IgA 亞類的這些單價半 Ig 分子(Seligman 1978 Ann Immunol 129 :855-70 ； Biewenga等人，1983 Clin Exp Immunol 51 :395-400)。FcRn Ig Fc 區的化學計量已測定 為 2 1 (West 等人，2000 Biochemistry 39 :9698-708)，且半 Fc 足以介導 FcRn 結合(Kim 等人，1994 Eur J Immunol ；M :542-548.)。破壞CH3結構域二聚化的突變可能對其Fcfoi 結合沒有更大的不利作用，因為對於CH3 二聚化重要的殘基位於CH3 b摺疊結構的內界面 上，而負責Fcfoi結合的區域位於CH2-CH3結構域的外界面上。然而，由於其比常規抗體的 那種更小的尺寸，半Ig分子可以在組織穿透中具有某些優點。在一個實施方案中，至少一 個胺基酸殘基在本發明的結合蛋白的恆定區例如Fc區中進行替換，從而使得重鏈的二聚 化被破壞，從而產生半DVD Ig分子。IgG的抗炎症活性完全取決於IgG Fc片段N-聯聚糖 的唾液酸化作用。已經確定了對抗炎症活性準確的聚糖要求，這樣就可以生成合適的IgGl Fc片段，從而生成具有大大增強的能力的完全重組的唾液酸化IgGl Fc (Anthony, R. Μ.，等人(2008)Science 320 :373-376)。如本文使用的，術語抗體的「抗原結合部分」(或簡單地「抗體部分」)，指保留與 抗原特異性結合的能力的一種或多種抗體片段。已顯示抗體的抗原結合功能可以由全長 抗體的片段來執行。此種抗體實施方案也可以是雙特異性、雙重特異性、或多特異性形式； 與2種或更多不同抗原特異性結合。包含在術語抗體的「抗原結合部分」內的結合片段的 例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段， 包含由鉸鏈區的二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結構域組成 的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人， (1989) Nature 341 :544-546, Winter 等人，PCT 公開 WO 90/05144 Al)，它包含單個可變結 構域；和(vi)分離的互補性決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的2個結構域VL和VH由分 開的基因編碼，但它們可以使用重組方法通過合成接頭來連接，所述合成接頭使得它們能 夠作為單條蛋白鏈製備，在所述單條蛋白鏈中VL和VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈 Fv(scFv)；參見，例如，Bird 等人，(1988) Science 242 :423-426 和 Huston 等人,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。此種單鏈抗體也預期包含在術語抗體的「抗原 結合部分」內。也包含其他形式的單鏈抗體例如雙抗體。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中 VH和VL結構域在單條多肽鏈上表達，但使用的接頭太短而不允許相同鏈上的2個結構域之 間的配對，從而促使結構域與另一條鏈的互補結構域配對且產生2個抗原結合部位(參見 例如，Holliger，P.等人，(1993)Proc. Natl. Acad. ki. USA 90 :6444-6448 ；Poljak,R. J.等 人，(1994) Structure 2 :1121-1123) 此種抗體結合部分是本領域已知的(Kontermann和 Dubel eds. , Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.第 790 頁(ISBN 3440-41354-5)。此外，單鏈抗體還包括包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)的「線 性抗體」，所述串聯Fv區段連同互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區域(Zapata等人， Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995)；和美國專利號 5，641，870)。術語「多價結合蛋白」在本說明書自始至終用於指包含2種或更多抗原結合部位 的結合蛋白。在一個實施方案中，多價結合蛋白經工程改造為具有3個或更多抗原結合部 位，且一般不是天然存在的抗體。術語「多特異性結合蛋白」指能夠結合2種或更多相關或 無關靶的結合蛋白。本發明的雙重可變結構域(DVD)結合蛋白包含2個或更多抗原結合部 位，且是四價或多價結合蛋白。DVDs可以是單特異性的，即能夠結合一種抗原，或多特異性 的，即能夠結合2種或更多抗原。包含2條重鏈DVD多肽和2條輕鏈DVD多肽的DVD結合 蛋白稱為DVD-Ig。每一半DVD-Ig包含重鏈DVD多肽，和輕鏈DVD多肽，和2個抗原結合部 位。每個結合部位包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，其中每個抗原結合部位總共6 個涉及抗原結合的CDRs。如本文使用的，術語「雙特異性抗體」指通過下述產生的全長抗體，四源雜交瘤技 術(參見 Milstein，C.和 A. C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934)第 537-40 頁)，2 種不同單 克隆抗體的化學綴合(參見Staerz, U. D.等人，Nature, 1985. 314(6012)第628-31頁)， 或結進孔或在Fc區中引入突變的類似方法(參見HolIiger，P.，T. Prospero和G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14)第 6444-8. 18 頁)，從而導致其中只有一種是功 能性雙特異性抗體的多種不同免疫球蛋白種類。通過分子功能，雙特異性抗體結合其2個 結合臂之一(1對HC/LC)上的一種抗原(或表位)，且結合其第二個臂(不同對的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通過這個定義，雙特異性抗體具有2個不同的抗原結合臂(在特 異性和CDR序列中)，且對於其結合的每種抗原是單價的。如本文使用的，術語「雙重特異性抗體」指可以在其2個結合臂的每一個中(一對 HC/LC)結合2種不同抗原(或表位)的全長抗體(參見PCT公開WO 02/02773)。因此，雙 重特異性結合蛋白具有2個相同的抗原結合臂，具有相同的特異性和相同的CDR序列，且對 於其結合的每種抗原是二價的。結合蛋白的「功能性抗原結合部位」是能夠結合靶抗原的結合部位。抗原結合部 位的抗原結合親和力不必與抗原結合部位由其衍生的親本抗體一樣強，但結合抗原的能力 必須是可使用已知用於評估與抗原結合的抗體的多種方法中的任何一種測量的。此外，本 文的多價抗體的每個抗原結合部位的抗原結合親和力無需在量上相同。術語「細胞因子」是由一種細胞群體釋放的蛋白的一般術語，所述蛋白作為細胞 間介質作用於另一種細胞群體。此種細胞因子的例子是淋巴因子、單核因子、和傳統的多 肽激素。在細胞因子中包括的是生長激素例如人生長激素、N-甲硫氨醯人生長激素、和牛 生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素例 如促卵胞激素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)，和黃體生成素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞 生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子α和β ；米勒抑制物質；小鼠促性腺激素 相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長 因子例如NGF-α ；血小板生長因子；胎盤生長因子；轉化生長因子(TGFs)例如TGF-α和 TGF-β ；胰島素樣生長因子-1和-11;促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子；幹擾素例如 幹擾素-α、-β和-γ集落刺激因子(CSFs)例如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞巨噬細 胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(ILs)例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、 IL-23、IL-33 ；腫瘤壞死因子例如TNF- α或TNF- β ；及其他多肽因子包括LIF和kit配體 (KL)。如本文使用的，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養的蛋白，以及天 然序列細胞因子的生物學活性等價物。術語「接頭」用於指包含通過肽鍵連接的2個或更多胺基酸殘基的多肽，且用於連 接一個或多個抗原結合部分。此種接頭多肽是本領域眾所周知的(參見例如，Holliger, P.等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 巡6444-6448 ;Poljak，R. J.等人，(1994) Structure 2 :1121-1123) 示例性接頭包括但不限於，AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 1) ；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO 2) ；AKTTPKLGG (SEQ ID NO 3) ；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO 4) ；SAKTTP(SEQ ID NO 5) ；RADAAP(SEQ ID NO 6) ；RADAAPTVS(SEQ ID NO 7)； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO 8) ；RADAAAA(G4S) 4(SEQ ID NO 9) ；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO 10) ；ADAAP(SEQ ID NO 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO :14) ；QPKAAP(SEQ ID NO 15) ；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ；AKTTPP(SEQ ID NO :17) ；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO 18) ；AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ；AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO 20) ；ASTKGP (SEQ ID NO 21) ；ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO 22), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO 23) ；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO 24)； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO 25)；以及 GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO :26)。免疫球蛋白恆定結構域指重或輕鏈恆定結構域。人IgG重鏈和輕鏈恆定結構域胺基酸序列是本領域已知的。如本文使用的，術語「單克隆抗體」或「mAb」指從基本上均質抗體群體中獲得的抗 體，即構成群體的個別抗體是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突變。單克隆抗 體是高度特異性的，針對單一抗原。此外，與一般包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體 的多克隆抗體製劑形成對照，每種mAb針對抗原上的單一決定簇。修飾語「單克隆」不應解 釋為需要通過任何具體方法生產抗體。如本文使用的，術語「人抗體」預期包括具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變 和恆定區的抗體。本發明的人抗體可以包括例如在CDRs且特別是CDR3中，不由人種系免 疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，在體外通過隨機或位點專一誘變或在體內通過體 細胞突變引入的突變)。然而，如本文使用的，術語「人抗體」不預期包括其中來源於另一種 哺乳動物物種例如小鼠種系的CDR序列已嫁接到人構架序列上的抗體。如本文使用的，術語「重組人抗體」預期包括通過重組方法製備、表達、產生或分 離的所有人抗體，例如使用轉染到宿主細胞內的重組表達載體表達的抗體(在下文部分 II C中進一步描述)，從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體(Hoogenboom H. R.，(1997) TIB Tech. 15 :62-70 ；Azzazy H.和 Highsmith W. E.，(2002)Clin. Biochem. 35 :425-445 ； Gavilondo J. V.和 Larrick J. W. (2002)Bio Techniques 29 :128-145 ；Hoogenboom H.和 Chames P. (2000) Immunology Today 21 :371-378)，從對於人免疫球蛋白基因是轉基因的 動物(例如小鼠)中分離的抗體(參見^Taylor，L. D.等人，(1992)Nucl. Acids Res. 20 6287-6295 ；Kellermann S-A.禾口 Green L. L. (2002)Current Opinion in Biotechnology 13 :593-597 ；Little Μ.等人，(2000) Immunology Today 21 :364-370)，或通過包括使人免 疫球蛋白基因序列與其他DNA序列剪接的任何其他方法製備、表達、產生或分離的抗體。此 種重組人抗體具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區。然而，在某些實施方案 中，對此種重組人抗體實施體外誘變(或，當使用對於人Ig序列轉基因的動物時，體內體細 胞誘變)，且因此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是，儘管來源於人種系VH和VL序列 且與人種系VH和VL序列相關，但可能在體內的人抗體種系譜內非天然存在的序列。「親和力成熟的」抗體是在其一個或多個CDRs中具有一種或多種改變的抗體， 與沒有這些改變的親本抗體相比較，所述改變導致抗體對抗原的親和力改善。示例性 的親和力成熟的抗體將對靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗 體通過本領域已知的程序來產生。Marks等人，BidlTechnology 10 :779-783 (1992)描 述了通過VH和VL結構域改組的親和力成熟。CDR和/或構架殘基的隨機誘變由下述 描述Barbas 等人，Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813(1994) ；Schier 等人，Gene 169 :147-155(1995) ；Yelton 等人，J. Immunol. 155 :1994-2004(1995) Jackson 等人， J. Immunol. 154(7) :3310-9(1995) ；Hawkins 等人，J. Mol. BioL 226 :889-896(1992)以及如 美國專利US6914U8B1中所述的由活性增強胺基酸殘基在選擇性誘變位置、接觸或高變位 置的選擇性突變。 術語「嵌合抗體，，指包含來自一個物種的重和輕鏈可變區序列以及來自另一個物 種的恆定區序列的抗體，例如具有與人恆定區連接的鼠重和輕鏈可變區的抗體。
術語「CDR嫁接的抗體」指包含來自一個物種的重和輕鏈可變區序列的抗體，但其 中VH和/或VL的一個或多個CDR區域的序列用另一個物種的CDR序列替換，例如具有鼠重和輕鏈可變區的抗體，其中一個或多個鼠⑶Rs (例如，⑶R3)已用人⑶R序列替換。術語「人源化抗體」指包含來自非人物種(例如，小鼠)的重和輕鏈可變區序列的 抗體，但其中至少部分VH和/或VL序列已改變成更「人樣」，即更類似於人種系可變序列。 一種類型的人源化抗體是CDR嫁接的抗體，其中將人CDR序列引入非人VH和VL序列以替 換相應的非人CDR序列。術語「人源化抗體」也是抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，其 與目的抗原免疫特異性結合，且包含基本上具有人抗體的胺基酸序列的構架(FR)區、和基 本上具有非人抗體的胺基酸序列的互補決定區(CDR)。如此處使用的，在CDR上下文中的 術語「基本上，，指具有的胺基酸序列至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 % 或至少99%等同於非人抗體⑶R的胺基酸序列的⑶R。人源化抗體包含基本上所有至少一 個、且一般為2個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab' )2、FabC, Fv)，其中所有或基本上所有 CDR區對應非人免疫球蛋白(即，供體抗體)的那些，且所有或基本上所有構架區是人免疫 球蛋白共有序列的那些。在一個實施方案中，人源化抗體也包含至少部分免疫球蛋白恆定 區(Fe)，一般為人免疫球蛋白的那種。在一些實施方案中，人源化抗體包含輕鏈以及至少重 鏈的可變結構域。抗體還可以包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3、和CH4區。在一些實施方案 中，人源化抗體只包含人源化輕鏈。在一些實施方案中，人源化抗體只包含人源化重鏈。在 具體實施方案中，人源化抗體只包含輕鏈的人源化可變結構域和/或人源化重鏈。術語「Kabat編號」、「Kabat定義」和「Kabat標記」在本文中可互換使用。本領 域公認的這些術語指胺基酸殘基編號系統，所述胺基酸殘基比抗體或其抗原結合部分的重 和輕鏈可變區中的其他胺基酸殘基更可變(即高變)(Kabat等人，(1971)Arm.NY Acad, Sci. 190 :382-391 禾口 Kabat, Ε· Α.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH
發明者C·A·庫夫, C·吳, H·J·艾倫, L·M·奧爾森, M·胡古寧, P·C·伊薩克森, R·V·卡馬思, T·哈於爾 申請人:雅培製藥有限公司