用於同時檢測多種突變類型的序列組合和探針的製作方法
2023-08-06 15:13:26
本發明屬於基因檢測領域，更具體而言本發明涉及人基因突變的檢測，特別是用於同時檢測多種突變類型的技術。
背景技術：
：癌症是危害公眾健康的一大難題。在中國，癌症是疾病死亡的第一殺手，並且其發病率和死亡率仍呈增長的趨勢。僅在2015年，我國共有429.2萬新發癌症病例和281.4萬癌症死亡病例，其中以肺癌的發病率最高，並且肺癌的死亡率也排在各種癌症類型之首。另外，胃癌、食管癌和肝癌也是常見診斷的癌症類型，排在高發癌症類型的行列(Chen,W.,etal.,CancerstatisticsinChina,2015.CACancerJClin,2016.66(2):p.115-32)。癌症是基因病，腫瘤基因學研究揭示了近140個驅動基因，這些驅動基因分布於12條信號通路中，分別調節細胞命運、細胞生存和基因組穩定(Vogelstein,B.,etal.,Cancergenomelandscapes.Science,2013.339(6127):p.1546-58)。驅動基因的發現推動了靶向藥物的開發。截至2016年6月，美國食品藥品監督管理局(FDA，U.S.FoodandDrugAdministration)已經批准了72個靶向抗腫瘤藥物。多項研究證實，肺癌的驅動基因主要包括EGFR、KRAS、EML4-ALK、BRAF、PI3KCA、AKT1、MEK1、MET、HER2、RET、NRAS、NTRK1等。EGFR是目前肺癌研究中研究最充分的分子靶點。PIONEER研究顯示，肺腺癌患者EGFR基因突變率在亞裔和中國人中分別為51.4％和50.2％(Shi,Y.,etal.,Aprospective,molecularepidemiologystudyofEGFRmutationsinAsianpatientswithadvancednon-small-celllungcancerofadenocarcinomahistology(PIONEER).JThoracOncol,2014.9(2):p.154-62；Shi,Y.,etal.,MolecularEpidemiologyofEGFRMutationsinAsianPatientswithAdvancedNon-Small-CellLungCancerofAdenocarcinomaHistology-MainlandChinaSubsetAnalysisofthePIONEERstudy.PLoSOne,2015.10(11):p.e0143515)。而KRAS和EML4-ALK的驅動突變率約佔肺腺癌患者的15-25％和3-7％(Lovly,C.,L.Horn,W.Pao.2016.MolecularProfilingofLungCancer.MyCancerGenome(UpdatedMarch28))。《美國國立癌症綜合網絡(NCCN，NationalComprehensiveCancerNetwork)臨床實踐指南》已經明確對於晚期非小細胞肺癌患者，應該先實施EGFR和ALK基因檢測。研究表明，對於存在驅動基因突變且接受對應的靶向治療的患者，相對於未根據基因檢測結果進行治療的患者，可獲得更好的治療效果和更長的生存期(KrisMG,JohnsonBE,BerryLD,etal.Usingmultiplexedassaysofoncogenicdriversinlungcancerstoselecttargeteddrugs.JAMA2014；311:1998-2006)。對於非小細胞肺癌，除了FDA批准的EGFR抑制劑和ALK抑制劑，NCCN指南還推薦威羅菲尼和達拉非尼，達拉非尼聯合曲美替尼適用於BRAFV600E突變患者；克唑替尼適用於MET高水平擴增或14號外顯子跳躍突變以及ROS1重排患者；卡博替尼適用於RET重排患者；曲妥珠單抗和阿法替尼適用於HER2突變患者。NCCN指南強烈支持更廣泛的基因檢測，以最大限度的確定現有藥物獲準臨床試驗期藥物相關的驅動突變。靶向藥物是精準治療的先鋒，其詮釋了標準化治療為基礎的個體化治療原則。而個體化治療的前提條件是存在個體差異而進行分子靶點檢測，但對於腫瘤分子靶點的檢測卻並非易事。一方面分子靶點涉及的類型複雜，包括點突變、短片斷插入缺失、拷貝數變異、融合基因等。另一方面，晚期腫瘤患者的組織樣本往往獲取困難，而ctDNA(Cell-freeCirculatingTumorDNA)檢測雖然無創，但是體液中除了ctDNA，也存在正常組織游離DNA，ctDNA通常佔比非常少，屬於超低頻突變。目前對於靶點基因的檢測，現有的ddPCR(微滴式數字PCR)等技術雖然可實現絕對定量，且靈敏度高，但是這類技術只能檢測已知的突變位點，無法檢測基因融合；RT-PCR(反轉錄PCR)技術雖然檢測的突變類型較為全面，但是也只能檢測已知的突變位點，並且存在靈敏度低、通量低等局限性。因此，本領域中需要一種高靈敏度、高特異性的可以同時檢測多個腫瘤基因的多種突變類型的新技術。技術實現要素：本發明的目的在於提供腫瘤用藥以及療效預測的指導方案。經過反覆試驗，發明人實現了對與FDA批准靶向藥物或NCCN指南推薦靶向藥物或臨床試驗靶向藥物正在開展的57個腫瘤驅動基因的敏感突變和耐藥突變的同時檢測。具體而言，本發明提供了用於高靈敏度、高特異性同時檢測57個腫瘤驅動基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異和融合基因的序列組合；針對所述序列組合的探針；用於檢測所述57個腫瘤驅動基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異和融合基因的方法、基因晶片和試劑盒。因此，在第一方面，本發明提供了一種用於同時檢測多種突變類型的序列組合，所述序列組合包括：1)如下腫瘤驅動基因的所有CDS區域：FGFR1、NTRK1、ALK、FGFR2、APC、PIK3CA、AR、PMS2、ATM、PTCH1、PTEN、BRAF、BRCA1、BRCA2、KIT、RB1、CCND1、KRAS、RET、CDK4、MAP2K1、ROS1、CDK6、SMARCA4、CDKN2A、MET、SMO、MLH1、DDR2、MSH2、STK11、EGFR、MSH6、TP53、ERBB2、TSC1、NF1、TSC2、FBXW7、NRAS；2)以下區域：AKT1外顯子3；ESR1外顯子4-8；CTNNB1外顯子3；FGFR3外顯子7,9,14-18；FLT3外顯子14,15,20；HRAS外顯子2,3；MAP2K2外顯子2-4,6,7；MTOR外顯子19,30,39,40,43-45,47,48,53,56；IDH1外顯子4；IDH2外顯子4；JAK2外顯子14；PDGFRA外顯子12-18；PTPN11外顯子3,13；RAF1外顯子3,4,6,7,10,14,15,17；SRC外顯子14；VHL外顯子1-3；序列SEQIDNO.8。在優選的實施方案中，本發明第一方面的序列組合還包括其中6個腫瘤驅動基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)的融合基因斷點以及腫瘤驅動基因MET外顯子14跳躍突變相關的區域，即3)SEQIDNO.9-SEQIDNO.20。在更優選的實施方案中，本發明第一方面的序列組合還包括EGFR基因19號外顯子缺失突變的序列，即4)SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。在第二方面中，本發明提供了用於同時檢測多種突變類型的探針，所述探針包括：針對本發明第一方面的序列組合1)-3)項中序列的探針；SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。優選地，所述探針覆蓋所述序列組合1)-3)項中全部序列。在一個實施方案中，所述探針長度為100nt-140nt，優選110nt-130n，最優選120nt。在一個實施方案中，所述探針包括針對本發明第一方面的序列組合第1)-3)項中除序列區間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外的序列的探針；序列SEQIDNO.28-SEQIDNO.40。優選地，所述探針覆蓋所述序列組合1)-3)項中除序列區間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外的全部序列。在優選的實施方案中，所述探針還包括：針對如下序列的探針：本發明的第一方面的序列組合中的1)-3)項中序列在染色體上前後小於150nt，優選小於120nt，更優選小於80nt的序列。在第三方面中，本發明提供了用於同時檢測多種突變類型的基因晶片，所述基因晶片上有根據本發明第二方面的探針。在第四方面中，本發明提供了用於同時檢測多種突變類型的試劑盒，所述試劑盒包括根據本發明第二方面的探針或者根據本發明第三方面的基因晶片。在一個實施方案中，所述試劑盒還包括文庫構建試劑、探針雜交洗脫試劑、引物和接頭以及核酸純化試劑。在第五方面中，本發明提供一種用於同時檢測多種突變類型的方法，所述方法包括以下步驟：1)探針設計，根據本發明第一方面涉及的序列組合成探針，例如提交IDT(IntegratedDeviceTechnology)或羅氏(Roche)合成探針；2)DNA提取，提取待檢測樣本中gDNA和/或cfDNA，例如石蠟包埋組織或石蠟切片、新鮮病理組織、血漿、胸水、腹水、腦脊液等體液樣本的DNA；3)文庫構建，將提取的DNA構建樣本文庫；4)雜交捕獲，將所述樣本文庫採用步驟1)中合成的探針進行雜交捕獲；5)上機測序，將步驟4)得到的捕獲序列測序產生測序數據，例如在Illumina測序平臺或BGI-seq500測序儀上機測序；6)信息分析，進行變異檢測和注釋，例如採用發明人自主開發的血漿ctDNA低頻突變富集測序技術——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中國專利公開號CN105063208A，公開日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeqPipeline)統計質控參數如目標區域覆蓋大小、平均測序深度、正反鏈互配率、低頻突變率等，並進行變異檢測和注釋。在優選的實施方案中，所述方法還包括以下步驟：7)結果解讀，根據檢測出來的變異判斷其與靶向藥物療效和預後的關係，例如通過與公共資料庫(如COSMIC)或建立的資料庫比對和文獻檢索，根據資料庫記載和文獻報導，判斷其與靶向藥物療效和預後的關係。本發明的序列組合、探針、基因晶片、試劑盒和方法可以用於同時檢測57個腫瘤驅動基因的點突變、短片段插入缺失和拷貝數變異的序列組合。本發明的有益效果是：本發明可以特異性地一次性檢測出多種腫瘤驅動基因的不同變異類型。本發明的探針可以對EGFR、KRAS、BRAF、EML4-ALK等57種驅動突變實現多重全方位檢測。本發明可以實現一次性同時檢測57種基因的多種變異類型，包括點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異和基因融合。本發明可以檢測探針覆蓋區域的已知突變，並同時可以發現新的未知變異。本發明檢測突變的靈敏度高，本發明可以實現0.5％以上變異的準確檢出。本發明可以精確識別融合基因的斷點。本發明適用於石蠟包埋組織或石蠟切片、新鮮病理組織、血漿、胸水、腹水、腦脊液等多種體液樣本。本發明檢測突變的通量高：能夠在短時間內同時進行多例樣本檢測，從而壓縮成本，有利於臨床的推廣。本發明對於融合基因的檢測可以準確識別斷點(精確到1bp)，並且可以發現與ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1相關的新的融合基因。附圖說明通過以下附圖對本發明進行說明：圖1為本發明的實施流程圖；圖2為實施例2的ALK基因c.3806G>C讀段圖，序列見SEQIDNO.3；圖3為實施例2的TP53基因c.455C>T(p.P152L)讀段圖，序列見SEQIDNO.4；圖4為實施例3的EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)讀段圖的部分截圖，序列見SEQIDNO:5；圖5為實施例3的TP53基因的c.578A>C(p.H193P)讀段圖的部分截圖，序列見SEQIDNO.6；圖6為實施例4的MET基因的14號外顯子跳躍突變c.3028_3028+17del18讀段圖的部分截圖，序列見SEQIDNO.7。具體實施方式本發明利用發明人自主開發的血漿ctDNA低頻突變富集測序技術——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中國專利申請公開號CN105063208A，公開日2015年11月18日)，提供了一種高靈敏度、高特異性的可以同時檢測多個基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異和融合基因的方法及試劑盒。在本發明中，採用本領域通用表示法表示基因突變和蛋白質突變。例如，c.3140A>G(p.H1047R)表示錯義突變，表示編碼區第3140位的A鹼基改變為G鹼基，從而導致1047位的胺基酸由組氨酸H突變為精氨酸R；c.464+1G>T表示剪切突變，表示編碼區第464位所在外顯子3端緊連內含子的第一個鹼基由G改變為T；c.2240_2254del15(p.L747_T751del)表示小片段缺失，表示編碼區第2240位到2254位的15bp鹼基缺失，從而導致第747位到751位的5個胺基酸缺失；c.548C>A(p.S183*)表示無義突變，編碼區第548位的C鹼基改變為A鹼基，從而導致第183位的絲氨酸S變為終止密碼子；c.3028_3028+17del18表示涉及到剪切區域的小片段缺失，表示表示編碼區第3028位到其所在外顯子3端緊連內含子的第17個鹼基(共18個鹼基)缺失。本領域技術人員根據上述示例可以解讀本發明中的其他突變的含義。不希望拘囿於理論，但發明人考慮，對基因序列進行捕獲進行檢測中使用的探針的效率受到多種因素的影響，例如探針之間的相似度、探針序列的複雜程度和GC含量差異、探針自身形成二級結構的傾向性、探針之間形成二級結構的可能性。因此，想要對多個基因的多個位點進行同時檢測，存在很大挑戰。需要檢測的基因越多、位點越多越分散，需要設計的探針越多，有可能遇到的問題越多，檢測的難度就越大。把多個基因的多個位點進行分開檢測，人工費用、儀器費用、試劑費用基本上與試驗份數成正比，如果不能做到高通量的批量檢測，那麼勢必造成資源的巨大浪費，靶向藥物是精準治療的成本會居高不下，限制其在普通患者中的推廣和應用。在本發明中，對57個腫瘤驅動基因(表1)、突變位點或相關區域的選擇經過了發明人的反覆論證，對這些區域進行探針設計可以很好地實現相關突變的高通量檢測，有效地減少探針自身、探針之間的幹擾。在本發明中，突變位點或相關區域的選擇考慮了檢測的全面性與檢測的效率、靈敏度和特異性的平衡，既儘可能多地檢測多種類型的突變，又保證了高靈敏度、高效率的精確檢測。本發明的目的在於提供一種同時檢測點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異和融合基因的探針，該探針包括57個腫瘤驅動基因(表1)。#號標記的基因探針設計區域除表1中指定的區域以外，另增加其中6個腫瘤驅動基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)的融合基因斷點和MET基因外顯子14跳躍突變相關的區域如下：chr1:156843751-156844362，chr2:29446394-29448326，chr4:1808661-1808842，chr4:55140698-55141007，chr6:117650609-117658334，chr6:117647577-117650491,chr6:117645578-117647386，chr6:117642557-117645494，chr6:117641193-117642421，chr7:116411702-116411902，chr7:116412043-116412283，chr10:43610184-43612031。另外，為了很好的捕獲EGFR基因常見的19號外顯子缺失突變，增加基於突變序列的探針：E1:TGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGG(SEQIDNO.1)；E2:ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACACTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAACCTCAGGCCCACC(SEQIDNO.2)。表1本發明的探針所覆蓋的腫瘤驅動基因及其範圍註：allCDSs：所有編碼區；Exon和Exons：外顯子。在本發明中，基因名稱均採用NCBI-Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)裡的官方命名(OfficialSymbol)。染色體序列的參考序列為GRCh37/hg19(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/)。本領域技術人員應理解，本發明並不限於具體公開的參考染色體序列，本領域技術人員簡單地通過對應，可以將本發明涉及的染色體序列在其他類型的基因組數據版本上確定。因此，本發明適用於其他類型的基因組數據版本，例如以後發布的版本。在本發明中，提及基因序列(包括DNA序列、RNA序列)意味著包括提及的序列本身，以及如果在生物學的角度理解合理的情況下也包括提及序列的互補序列。這是因為基因序列在染色體上是雙鏈形式存在的，提及一條鏈上的序列，另外一條鏈上的序列也必然存在，突變通常在兩條序列上對應出現。基於表1中列出的序列，通過對比待測樣品與基因組資料庫中的標準序列，本領域技術人員可以確定待測樣品是否含有點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異。本發明檢測的變異類型包括所有57個腫瘤驅動基因所覆蓋區域的已知或未知的點突變、短片段插入缺失和拷貝數變異；6個腫瘤驅動基因(ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1)所覆蓋區域的融合變異。需要說明的是，本發明也可以檢測MET基因的14號外顯子跳躍突變。以下是本發明的染色體區域用於檢測的突變情況：chr1:156843751-156844362(SEQIDNO.9，在NTRK1基因9號內含子發生的融合)，chr2:29446394-29448326(SEQIDNO.10，在ALK基因19號內含子發生的融合)，chr4:1808661-1808842(SEQIDNO.11，在FGFR3基因17號內含子發生的融合)，chr4:55140698-55141007(SEQIDNO.12，在PDGFRA基因11號內含子發生的融合)，chr6:117650609-117658334(SEQIDNO.13，在ROS1基因31號內含子發生的融合)，chr6:117647577-117650491(SEQIDNO.14，在ROS1基因32號內含子發生的融合),chr6:117645578-117647386(SEQIDNO.15，在ROS1基因33號內含子發生的融合)，chr6:117642557-117645494(SEQIDNO.16，在ROS1基因34號內含子發生的融合)，chr6:117641193-117642421(SEQIDNO.17，在ROS1基因35號內含子發生的融合)，chr7:116411702-116411902(SEQIDNO.18，MET基因14號外顯子跳躍突變)，chr7:116412043-116412283(SEQIDNO.19，MET基因14號外顯子跳躍突變)，chr10:43610184-43612031(SEQIDNO.20，在RET基因11號內含子發生的融合)。在本發明中，融合變異是指兩個基因的編碼區首尾相連置於同一套調控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等)控制之下，構成的嵌合基因。外顯子跳躍，實際上就是涉及到剪切區域的突變，包括點突變、缺失等，突變後會引起剪切錯誤，導致外顯子丟失。在另一實施方案中，本發明的用於檢測腫瘤驅動基因突變的試劑盒包括用於檢測EGFR、KRAS、BRAF和EML4-ALK突變的試劑，特別是包括DNA提取試劑、文庫構建試劑、探針雜交洗脫試劑、引物和接頭試劑、核酸純化試劑。在一個示例性實施方案中，所述試劑盒包括的試劑的組成如下：表2根據本發明一個實施方案的試劑盒的組成註：上述序號1-22的試劑中，有些未對應具體的廠商來源，但本領域技術人員根據其中提供的試劑名稱就可以自行獲知很多廠商提供用於實現所述環節的試劑，本領域技術人員也可以根據有關手冊配製實現所述環節的試劑。對於本發明中特別選擇的序列組合，可以選擇常規的方法對其設計探針。例如對於長度120nt的探針，(1)設定窗口在所述序列組合中的序列上滑動，得到覆蓋所有序列組合的探針；(2)為了避免探針的GC含量過低(低GC探針會導致覆蓋深度不佳)，在確保目標序列完全覆蓋的情況下，部分探針在GC正常的區域允許重疊。本領域技術人員已知，在基因探針檢測領域，隨著基因探針數量增多，在同一個反應體系中進行檢測會出現探針的相互影響或幹擾。本發明中突變位點或相關區域的選擇考慮了探針覆蓋的全面性與檢測的效率、靈敏度和特異性的平衡，既儘可能多地檢測所需類型的突變，又保證了高靈敏度、高效率的精確檢測。在本發明中，用於同時檢測多種突變類型的探針符合探針設計規範。例如，探針自身不能形成二級結構、探針之間互補序列不宜過長。這樣的探針設計規範是本領域技術人員可以確定的，探針設計軟體或者探針設計提供商也可以提供本領域通常的探針設計規範。在本發明的一個實施方案中，用於同時檢測57個腫瘤驅動基因的點突變、短片段插入缺失、拷貝數變異和融合基因的方法包括以下步驟：1)探針設計，根據NCCN指南、COSMIC、TCGA、ICGC資料庫和相關文獻確定基因集、突變位點或相關區域，確定探針的目標區域，設計並提交IDT或羅氏(Roche)合成探針；2)DNA提取，提取檢測樣本中gDNA和cfDNA，包括石蠟包埋組織或石蠟切片、新鮮病理組織、血漿、胸水、腹水、腦脊液等體液樣本的DNA；3)文庫構建，將步驟2)中提取的DNA按文庫構建試劑盒說明書構建樣本文庫；4)雜交捕獲，將所述樣本文庫採用步驟1)中合成的探針，參照探針製造商(例如IDT或羅氏)提供的說明書進行雜交捕獲；5)上機測序，將步驟4)中捕獲的樣品進入Illumina測序平臺或BGI-seq500測序儀上機測序，產生原始測序數據；6)信息分析，採用發明人自主開發的血漿ctDNA低頻突變富集測序技術——ER-seq(Enrichment&RaralleleSequence)(中國專利公開號CN105063208A，公開日2015年11月18日)的信息分析流程(RealSeqPipeline)對所述原始測序數據統計質控參數如目標區域覆蓋大小、平均測序深度、正反鏈互配率、低頻突變率等，並進行變異檢測和注釋；7)結果解讀，對於檢測出來的變異，進行公共資料庫(COSMIC)和已建立的資料庫比對和文獻檢索，根據資料庫記載和文獻報導，判斷其與靶向藥物療效和預後的關係。本發明的方法可通過檢測血液、胸水、腹水等體液以及腫瘤冰凍組織或石蠟切片獲得全面的腫瘤驅動基因突變信息，提高了腫瘤基因檢測的靈敏度和準確率，從而實現輔助臨床醫生制定個體化用藥方案，使精準治療達到最好效果。實施例下面通過具體的實施例，對本發明進行說明，需要說明的是這些實施例僅僅是為了說明目的，而不能以任何方式解釋成對本發明的限制。除非另有定義或說明，本專利所述的科學技術術語與本領域普通技術人員所理解具有相同的含義。本發明實施例中腫瘤基因的探針設計策略如下：探針設計的方法概括為根據NCCN指南、COSMIC、TCGA、ICGC資料庫和相關文獻確定基因集、突變位點或相關區域，確定探針的目標區域，設計並提交IDT(IntegratedDeviceTechnology)合成探針。(1)對於非複雜區域發生的變異，直接按照探針提供商的常規的設計方法即可。(2)融合基因檢測的探針設計：融合基因的斷點通常發生於內含子(intron)區域，本發明對於融合基因的檢測是基於DNA水平，並且可以精確到具體的斷點，因此探針需要覆蓋相關的內含子。根據NCCN指南確定本發明需要檢測的融合基因為ALK、FGFR3、NTRK1、PDGFRA、RET和ROS1，然後根據COSMIC、TCGA資料庫和文獻記錄的融合變異類型和斷點位置確定本發明探針需要覆蓋的區域。將預定的區域和全基因組參考序列進行比對，對於存在斷點的重複區域，再增加覆蓋配對基因的探針序列；(3)短片段插入缺失的探針設計：大於15bp鹼基的缺失可能會在探針捕獲時存在缺口，因此針對熱點該類型變異(EGFR19號外顯子缺失)，再增加基於突變後的序列設計探針。經過發明人反覆測試，對於本發明的用於同時檢測多種突變類型的序列組合1)-3)項中序列除序列區間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外，以105-135nt的窗口長度平鋪獲得的探針均可有效用於本發明的檢測中，序列區間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27的探針可以是下表中的SEQIDNO.28-SEQIDNO.40。在本發明實施例中，在序列組合1)-3)項中序列除以下表中的序列區間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27之外，使用的是以120nt的窗口長度平鋪獲得的探針；序列區間SEQIDNO.21-SEQIDNO.27的探針是下表中的SEQIDNO.28-SEQIDNO.40；短片段插入缺失的探針是SEQIDNO.9-SEQIDNO.20。實施例1：本實施例以涵蓋點突變、短片斷插入缺失、拷貝數變異和融合基因變異類型的3個Horizon標準品(HD-C755、HD200和HD664)、1個細胞系RT112和8個已知變異的臨床樣本為例來闡述本發明。本實施例的實施流程如圖1。1.DNA提取：本發明的樣品適用範圍包括手術切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病例組織、石蠟切片、全血、血漿、胸腔積液標本等。本實施例採用血細胞的gDNA的測序結果作為對照用於排除胚系突變。對於全血需要首先進行血漿/血細胞分離：採集10mL外周血，及時進行血漿/血細胞分離(EDTA抗凝管，4h內；Streck管72h內)。分離步驟如下：第1步：在4℃條件下1600g離心10min，離心後將上層血漿分裝到多個1.5mL或者2.0mL的離心管中，在吸取血漿過程中注意不要吸到中間層的白細胞。注意：在分離血漿後，中間層+底層血細胞留取備用，作為正常對照。第2步：在4℃條件下以16000g離心10min去除殘餘細胞，將上清轉入新的1.5mL或者2.0mL離心管中(注意不要吸到管底的白細胞)，即得到所需的血漿。DNA提取：血漿、胸腔積液等體液按照QIAampCirculatingNucleicAcidKit(Qiagen)提取試劑說明書，進行血漿cfDNA的提取。血細胞和組織等樣本按照QIAampDNAMiniKit提取試劑說明書，進行gDNA的提取。然後採用Qubit定量，要求血漿cfDNA大於30ng；血細胞gDNA大於300ng；組織DNA大於100ng。2.文庫構建：體液中提取的cfDNA按照NEBNextUltraII文庫構建試劑盒說明書構建樣本文庫，引物和接頭來自於Invitrogen。對於組織或者用於對照的血細胞提取的基因組DNA，應先打斷成200-250bp的片段，然後按照文庫構建試劑盒構建樣本文庫。2.1末端修復及加「A」：按照下表配置末端修復以及加「A」反應：組分單反應體積(μl)EndPrepReactionBuffer7EndPrepEnzymeMix3cfDNA或片段化的DNA50μl總體積60μl將以上混合物充分振蕩混勻並離心，然後按照以下步驟在恆溫混勻儀上孵育：首先20℃，孵育30min；然後65℃，孵育30min。孵育完成後，降至室溫，高速離心機短暫離心。2.2接頭連接：按照下表配置接頭連接反應Premix：組分單反應體積(μl)LigationMasterMix30LigationEnhancer1總體積31接頭加入量隨DNA起始量變化而變化，對應關係見下表：依次向反應管中加入31μl接頭連接反應Premix及對應體積的接頭，並用ddH2O補充體積至95μl，充分振蕩混勻後離心。恆溫混勻儀20℃孵育15min。孵育完成後，微量高速離心機短暫離心。連接反應結束後，使用磁珠對接頭連接產物進行純化，最後回溶至25μLTE(pH8.0)中。2.3捕獲前PCR(Non-C-PCR)引入標籤(index)按照下表順序在PCR管中加入反應組分，振蕩混勻並離心，並設置陰/陽性對照：2.3.1PCR上機樣本循環數對應關係見下表：2.3.2PCR上機程序見下表：對Non-C-PCR產物進行純化，最終溶解在31μlTE(pH8.0)中。純化產物進行Qubit-BR定量和2100質控。3.靶序列富集與上機測序3.1擴增後文庫質控合格後並採用本發明實施例設計的探針，參照晶片製造商(IDT)提供的說明書進行雜交捕獲。最後洗脫回溶21μLddH2O帶雜交洗脫磁珠。3.2雜交捕獲產物的擴增。3.3先除去上一步磁珠，然後進行磁珠純化，最後回溶25μLddH2O，進行QC及上機。3.4採用Illumina測序平臺或BGI-seq500測序儀進行上機測序，測序實驗操作按照製造商提供的操作說明書進行上機測序操作。4.信息分析正反雙鏈糾錯低頻信息分析(RealSeqPipeline)具體方法為：4.1基於插入片段兩端的序列鹼基作為標籤，所述插入片段是文庫中與接頭引物相連接的DNA片段，經雙末端測序，每個片段形成一對成對測序序列；將成對測序序列的測序序列1的前12bp鹼基和測序序列2的前12bp鹼基作為標籤，字母序排列以較小的標籤在前連接成24bp的一條索引，並且以這24bp作為成對測序序列的索引，測序序列1的標籤在前就標記成正鏈；測序序列2的標籤在前就標記為反鏈；4.2對索引進行外部排序，以達到將同一個DNA模板的所有測序重複測序序列聚集到一起的目的；4.3對聚集起來的擁有相同索引的測序序列進行中心聚類，根據其序列之間的漢明距離(Hammingdistance)，將每個有相同索引的大簇聚集成若干個小簇，每個小簇中任意兩對成對測序序列的漢明距離不超過10，以達到區分開擁有相同索引卻來自不同DNA模板的測序序列的目的；4.4對步驟4.3中獲得的同一個DNA模板的重複簇進行篩選，若正鏈和反鏈的測序序列數都達到2對以上，則進行後續分析；4.5對滿足4.4中條件的簇進行糾錯，並產生一對無錯的新測序序列。對於DNA模板的每一個測序鹼基，若某種鹼基型在正鏈的測序序列中的一致率達到80％，且在反鏈測序序列中的一致率也達到80％，則記新測序序列的這個鹼基為此鹼基型，否則記為N，這樣便得到了代表原始DNA模板序列的新測序序列；4.6將新測序序列用bwamem算法重新比對到基因組上，篩除比對質量小於30的測序序列；4.7根據4.6中得到的測序序列進行統計，得到捕獲區域內每個位點的鹼基型分布，統計目標區域覆蓋大小、平均測序深度、正反鏈互配率、低頻突變率；4.8CallSNV/InDel/SV/CNV：根據患者樣品與對照樣品信息的比對，用mutect流程callsomaticSNV變異；用gatk流程callsomaticInDel變異；用contra.py流程callCNV；用somVar流程callSV；所使用的篩選參數為：對照位點變異率≤2％；糾錯後變異測序序列條數≥2；突變預測p值≤0.05；4.9變異注釋：注釋變異的功能、變異測序序列支持數、變異頻率、胺基酸變異及已有變異資料庫中的該變異的情況。5.檢測結果：5.1探針性能：以下將結合覆蓋度和目標區域序列佔比說明本發明的探針的性能。A.覆蓋度：在樣本的平均測序深度為～1000X(去除重複讀段(reads))的情況下；目標區域覆蓋深度大於500X的比例大於90％，表明覆蓋情況很好。B.目標區域序列佔比：本發明目標區域序列佔比均值是53％，說明本發明捕獲效率較高(表3)。表3本發明的探針的測試樣本覆蓋度和目標區域佔比分布5.2變異檢測結果本發明的方法檢測結果與已知的變異類型和頻率結果完全一致。對於點突變，本發明的方法可以準確識別0.5％以上的突變(表4)。表4實施例1變異檢測結果5.3融合基因靈敏度分析：將含有融合基因變異FGFR3-TACC3的細胞系DNA按照2％、1％、0.5％進行稀釋，並設置一個平行重複，然後進行檢測。結果表明本發明的靈敏度高，0.5％的融合基因變異即可檢出，檢測頻率與理論頻率相比，具有高度的一致性和重複性(表5)。表5融合基因靈敏度分析檢測結果實施例2：取待檢測的臨床肺癌血液樣本1例。受檢者既往接受克唑替尼治療，治療10個月後，效果不明顯，疾病繼續發展。按照實施例1所述檢測之試劑盒和方法對血液樣本進行血漿/血細胞分析，DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。參考實施例1進行文庫構建，雜交捕獲，上機測序及信息分析。結果表明所檢測的基因中，存在以下基因變異，其他基因為野生型。EML4-ALK融合基因的斷點分別為chr2:42503274和chr2:29447354；前者位於EML4基因6號內含子(NM_019063)，後者位於ALK基因19號內含子(NM_004304)。圖2為ALK基因c.3806G>C讀段圖；圖3為TP53基因c.455C>T(p.P152L)讀段圖。在圖2中，參考序列的C鹼基突變成了G鹼基(由於ALK基因的編碼鏈為負鏈，因此編碼序列的改變為G突變為C)。在圖3中，參考序列的G鹼基突變成了A鹼基(由於TP53基因的編碼鏈為負鏈，因此編碼序列的改變為C突變為T)。檢測結果解讀：儘管受檢者依然存在ALK基因融合，但是ALK基因激酶區的G1269A突變會導致克唑替尼發生耐藥。目前FDA批准的ALK抑制色瑞替尼和艾樂替尼均能解決G1269A突變導致的耐藥問題。TP53基因的c.455C>T(p.P152L)與腫瘤的發生發展和預後相關，目前尚無相關的靶向藥物。基於上述基因突變的檢測結果，該肺癌患者選擇第二代ALK抑制劑色瑞替尼或艾樂替尼為宜。實施例3：取待檢測的臨床肺癌石蠟切片組織樣本1例。按照實施例1所述檢測之試劑盒和方法進行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。參考實施例1進行文庫構建，雜交捕獲，上機測序及信息分析。結果表明所檢測的基因中，存在以下基因變異，其他基因為野生型。圖4為的EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)讀段圖的部分截圖；圖5為TP53基因的c.578A>C(p.H193P)讀段圖的部分截圖。在圖4中，參考序列的15個鹼基GGAATTAAGAGAAGC存在缺失。在圖5中參考序列的T鹼基突變成了G鹼基(由於TP53基因的編碼鏈為負鏈，因此編碼序列的改變為A突變為C)。檢測結果解讀：受檢者存在EGFR基因的c.2235_2249del15(p.E746_A750del)突變，宜採用EGFR抑制劑，如易瑞沙或特羅凱進行治療為宜。TP53基因的c.455C>T(p.P152L)與腫瘤的發生發展和預後相關，目前尚無相關的靶向藥物。實施例4：取待檢測的臨床肺癌胸水1例，同步採集外周血，以血細胞提取的基因組DNA作為對照。受檢者為肺腺癌IV期患者，發生骨轉移。按照實施例1所述檢測之試劑盒和方法對胸水樣本進行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書操作步驟進行操作。參考實施例1進行文庫構建，雜交捕獲，上機測序及信息分析。結果表明所檢測的基因中，存在以下基因變異，其他基因為野生型。圖6為MET基因的14號外顯子跳躍突變c.3028_3028+17del18讀段圖的部分截圖。在圖6中，參考序列的18個鹼基GGTATATTTCAGTTTATT存在缺失。檢測結果解讀：受檢者同時存在MET基因擴增和14號外顯子跳躍突變。因此該肺癌患者宜選擇MET抑制劑，如克唑替尼和卡博替尼，進行治療為宜。序列表北京吉因加科技有限公司蘇州吉因加生物醫學工程有限公司用於同時檢測多種突變類型的序列組合和探針CP2016043540PatentInversion3.31120DNA人工序列1tgtcatag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