一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應用的製作方法

2023-08-06 11:08:31 1

一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種針對宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白及其應用，本發明的針對宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白，為含有人乳頭瘤病毒16亞型E7原癌蛋白的融合蛋白，本發明還進一步公開了一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中整合有密碼子優化的HPV16E7的編碼基因。本發明的融合蛋白或其編碼基因或重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌可用於製備宮頸癌疫苗。
【專利說明】一種針對宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程【技術領域】，尤其涉及一種針對宮頸癌具有免疫原性的融合蛋 白及其應用。

【背景技術】
[0002] 宮頸癌居於全球女性癌症發病率的第二位，是重要的公共健康問題。全球每年新 發宮頸癌病例約50萬，有27. 3萬人死於宮頸癌，其中約85%死亡病例發生在發展中國家， 中國每年新增宮頸癌病例約有13. 5萬，佔全球新發病例的1/3,因此中國也是宮頸癌高發 國之一。當前，人乳頭瘤病毒（HPV)已被證實是引起宮頸癌的主要病原，至少在99%宮頸癌 患者組織內檢測到HPV DNA。
[0003] 依據HPV的致癌危險性，分類為低危型和高危型。高度致癌危險的病毒主要包括 HPV16、18、26、31、33、35、45、51、52、56、66等亞型，通常在高度鱗狀上皮內病變（CIN2?3) 中發現。其中HPV16、18可在絕大多數宮頸癌中發現，並且50%以上的宮頸癌患者由HPV16 引起。2008年6月，歷時5年的《中國婦女人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌流行病學調查》結果 顯示，HPV16和HPV18是導致中國婦女患子宮頸癌的最主要類型。
[0004] E7蛋白可以抑制Rb (retinoblastoma gene)的抑癌功能，從而以多種方式擾亂正 常細胞周期，引起細胞周期的失控，導致細胞的過度增殖，細胞轉化及惡變。E7是維持細胞 轉化和惡性癌變所必需的，因此E7常作為HPV血清學診斷抗原和宮頸癌治療性疫苗研究的 革巴抗原。
[0005] 單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM)是一種宿主譜廣泛的兼 性胞內菌。LM被巨噬細胞和其它吞噬細胞吞噬後，既能存在於吞噬體內，又能定居在細胞胞 漿中，使LM運送的外源抗原可以同時進入MHC I類和MHC II類抗原提呈途徑，從而誘導強 烈的CD4+T細胞和CD8+T細胞免疫應答。這種獨特的胞內生活史，使單增李斯特菌成為研究 宿主和細菌相互作用及宿主免疫應答的模式細菌，尤其誘導強烈的CD8+T細胞免疫應答，其 作為傳染性疾病和腫瘤疾病疫苗載體具有廣闊應用前景。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在於克服現有技術中的缺陷，提供一種具有宮頸癌免疫原性的融合 蛋白及其應用。
[0007] 本發明提供了一種針對宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白，為在減毒重組李斯特菌 中分泌表達的HPV16 E7的融合蛋白。
[0008] 所述融合蛋白具體為單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與HPV16 E7的融 合蛋白。
[0009] 所述HPV16 E7蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 所述單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所 /Jn 〇
[0011] 所述減毒重組李斯特菌包含編碼HPV16 E7蛋白的多核苷酸，所述編碼HPV16 E7 蛋白的多核苷酸序列為SEQ ID NO. 6。
[0012] 所述融合蛋白中，密碼子優化的HPV16 E7蛋白插入於前述單核細胞增生性李斯特 菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位胺基酸殘基之間。
[0013] 進一步的，所述融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 所述融合蛋白針對宮頸癌具有較強的免疫原性。
[0015] 本發明第二方面提供了 一種多核苷酸，其編碼所述融合蛋白。
[0016] 本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。
[0017] 進一步的，所述多核苷酸中，編碼HPV16 E7的基因序列為SEQ ID NO. 6。
[0018] 所述多核苷酸可用於構建HPV16 E7的表達載體，並進一步構建表達HPV16 E7的 宿主細胞。
[0019] 本發明第三方面提供了一種載體，其含有所述多核苷酸。
[0020] 本領域的技術人員熟知的方法能用於構建所述載體。這些方法包括重組DNA技 術、DNA合成技術等。可將編碼所述融合蛋白的DNA有效連接到載體中的多克隆位點上，以 指導mRNA合成進而表達蛋白，或者用於同源重組。
[0021] 較佳的，所述載體為原核載體或穿梭質粒，如原核載體PMD-20T、穿梭質粒PKSV7 等。
[0022] 本發明第四方面提供了 一種宿主細胞，其被所述載體所轉化。
[0023] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門菌、李斯特 細菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO, COs. 293細胞、或Bowes 黑素瘤細胞的動物細胞等。
[0024] 其中，特別優選單核細胞增生性李斯特細菌（Listeria monocytogenes,以下簡寫 為 LM)。。
[0025] 進一步優選的，所述單核細胞增生性李斯特細菌的血清型為l/2a。如yzuLM4等。
[0026] 本發明第五方面提供了一種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒 單核細胞增生性李斯特細菌的基因組中，整合有HPV16 E7基因，所述HPV16 E7基因的序列 為SEQID NO. 6,所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌能融合表達單核細胞增生性李斯 特菌溶血素蛋白LLO與HPV16 E7的融合蛋白。
[0027] 進一步優選的，所述單核細胞增生性李斯特細菌的血清型為l/2a。如yzuLM4等。
[0028] 進一步的，所述編碼HPV16 E7蛋白的基因重組整合於野生型單核細胞增生李斯特 菌基因組DNA中hly基因的111位與154位鹼基之間。
[0029] 進一步的，相比野生型單核細胞增生李斯特菌，本發明將野生型單核細胞增生李 斯特菌hly基因的第112-153位鹼基替換為HPV16 E7基因 SEQ ID. 6。亦即，本發明的重組 減毒單核細胞增生李斯特菌中，野生型的hly編碼基因被替換成了 SEQ ID NO. 3的融合蛋 白的編碼基因。
[0030] 本發明第六方面公開了所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的構建方法，包 括下列步驟：
[0031] 1)合成密碼子優化的HPV16 E7蛋白編碼基因片段；從單核細胞增生李斯特菌株 中擴增出待插入位點的上遊同源臂片段hlya和下遊同源臂片段hlyb ;
[0032] 2)將步驟1)獲得的密碼子優化的HPV16 E7編碼基因及上下遊同源臂片段拼接成 hlya_HPV16 E7_hlyb融合片段並連接入穿梭質粒獲得重組穿梭質粒；
[0033] 3)將步驟2)獲得的重組穿梭質粒轉化單核細胞增生性李斯特細菌，經過抗性和 溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減毒單核細胞增生性李斯特細 菌。
[0034] 進一步的，步驟1)中，擴增獲得的上遊同源臂片段hlya的序列為SEQ ID NO. 4,下 遊同源臂片段hlyb的序列為SEQ ID NO. 5, HPV16 E7基因為SEQ ID NO. 6。
[0035] 進一步的，步驟1)和3)中所述單核細胞增生李斯特菌株的血清型為l/2a。如為 單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4等。
[0036] 進一步的，步驟2)可採用重疊衍生PCR技術（SOEing PCR)拼接各片段，再利用酶 切位點將拼接片段插入穿梭載體中。
[0037] 進一步的，步驟2)中，穿梭質粒可為pKSV7。拼接成的hlya-E7_hlyb融合片段的 序列為 SEQ ID NO. 7。
[0038] 本發明第六方面，提供了所述的融合蛋白或其編碼基因或所述重組減毒單核細胞 增生性李斯特細菌在製備宮頸癌疾病疫苗上的用途。
[0039] 進一步的，所述重組細菌疫苗為針對宮頸癌疾病的治療性疫苗。
[0040] 本發明第七方面，提供了一種疫苗，包括所述融合蛋白或所述重組減毒單核細胞 增生性李斯特細菌。
[0041] 所述疫苗中還可進一步包括佐劑。
[0042] 本發明利用單核細胞增生李斯特菌能在細胞吞噬體內存活，同時也能從細胞吞噬 體中"逃逸"出來，進入細胞質繁殖，誘發機體產生強烈的CD8+T細胞免疫應答的特性。利用 同源重組技術，將外源融合蛋白基因定點插入到載體生物基因組中。本發明驚奇的發現，通 過對HPV16 E7編碼基因經過特定的優化，獲得的融合表達HPV16 E7抗原的疫苗相比未優 化的融合表達HPV16 E7抗原的疫苗更能有效提高宿主對宮頸癌疾病的免疫保護效應，其預 防及治療效果獲得了進一步的提高，為宮頸癌疫苗提供了新的思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖 1 是 pKSV7-hlya-E7_hlyb 的 Xba I 與 Kpn I 雙酶切及 PCR 電泳圖；
[0044] Μ: λ -HMarker
[0045] L：DL2000Marker
[0046] I :PCR 結果
[0047] 2:pKSV7-E7_hly 雙酶切結果。
[0048] 圖2是重組細菌的鑑定結果；
[0049] I:DL2000Marker
[0050] 2:LM4Ahly : : E7-1 PCR 產物。
[0051] 圖3是蛋白水平檢測目的基因的表達
[0052] M:預染 marker
[0053] 123:LM4Ahly : : E7-1 的分泌蛋白
[0054] 4:LM4的分泌蛋白。
[0055] 圖4是分泌融合蛋白LL0-HPV16 E7的溶血活性檢驗
[0056] PBS = PBS 對照組
[0057] LM4 Λ hly:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0058] LM4 Λ hly: :E7-1 :E7密碼子優化的重組減毒菌組。
[0059] LM4 Λ hly: :E7 :表達HPV16 E7抗原的重組李斯特菌 [0060] 圖5是重組菌對C57BL/6小鼠誘導產生的細胞因子的結果。
[0061] PBS = PBS 對照組
[0062] LM4 Λ hly:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0063] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優化的重組減毒菌組。
[0064] LM4 Λ hly: :E7 :表達HPV16 E7抗原的重組李斯特菌
[0065] 圖6淋巴細胞增殖實驗
[0066] PBS: PBS 對照組
[0067] LM4 Λ hly:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0068] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優化的重組減毒菌組。
[0069] LM4 Λ hly: :E7 :表達HPV16 E7抗原的重組李斯特菌
[0070] 圖7細胞毒性T淋巴細胞實驗
[0071] PBS = PBS 對照組
[0072] LM4 Λ hly:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0073] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優化的重組減毒菌組。
[0074] LM4 Λ hly: :E7 :表達HPV16 E7抗原的重組李斯特菌
[0075] 圖8免疫治療效力評價：治療36天時各免疫組小鼠腫瘤大小的測定
[0076] PBS = PBS 對照組
[0077] LM4 Λ hly:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0078] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優化的重組減毒菌組。
[0079] LM4 Λ hly: :E7 :表達HPV16 E7抗原的重組李斯特菌 [0080] 圖9免疫治療效力評價：各免疫組小鼠腫瘤大小的動態測定
[0081] PBS = PBS 對照組
[0082] LM4 Λ hly:單核細胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0083] LM4 Λ hly: :E7-1 :E7密碼子優化的重組減毒菌組。
[0084] LM4 Λ hly: :E7 :表達HPV16 E7抗原的重組李斯特菌

【具體實施方式】
[0085] 本發明實施例採用了下列技術方案：
[0086] 首先，從公司合成密碼子優化的HPV16 E7基因序列命名為E7-1，序列如下（SEQ ID NO:6)：
[0087] Catggtgatacaccaacattacatgaatatatgttagatttacaaccagaaacaacagatttatattgt tatgaacaattaaatgatagtagtgaagaagaagatgaaattgatggtccagcaggtcaagcagaaccagatcgtgc acattataatattgttacattttgttgtaaatgtgatagtacattacgtttatgtgttcaaagtacacatgttgata ttcgtacattagaagatttattaatgggtacattaggtattgtttgtccaatttgtagtcaaaaacca
[0088] 從單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4中擴增出hly上遊片段和下遊片段，經膠回收 後得到的hlya_HPV16 E7_hlyb融合片段與pMD_20T(TaKaRa公司）載體連接，轉化至大腸杆 菌DH5a感受態細胞中，經PCR與雙酶切驗證正確的陽性克隆送至南京金斯瑞公司並測序； 將測序正確的陽性克隆進行提取質粒，進而雙酶切，回收目的片段，再與穿梭載體PKSV7連 接，轉化至大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，經PCR與雙酶切驗證正確，將陽性質粒電轉化至 yzuLM4感受態細胞，通過抗性和溫度雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的同 源重組單核細胞增生李斯特菌。該菌為一種重組減毒菌LM4 Ahly:: E7-1。該菌可在正常 生活情況下表達E7-LL0蛋白。
[0089] 構建重組減毒菌具體方法主要包括下列步驟：
[0090] 1.用PCR技術擴增出目的基因 E7-1以及hly基因待插入位點的上下遊同源片段 hlya、hlyb。所用到的引物如下：
[0091] 正義 E7F :5'-AAAGAAAATTCAATTTCACATGGTGATACACCAACATT-3'（SEQ ID NO. 8)反 義E7R:5'-GTGTTTCTTTTCGATTGGTGGTTTTTGACTACAAATTG-3'（SEQIDN0·9)回收長為 327bp 的E7-1基因。
[0092] 正義 hlyaF :5'-CACGGGTACCAGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGC-3'（SEQ ID NO. 10)反義 hlyaR :5'-TGTTGGTGTATCACCATGTGAAATTGAATTTTCTTTAT-3'（SEQ ID NO. 11)回收長為 543bp 的hlya片段。
[0093] 正義 hlybF :5, -ATTTGTAGTCAAAAACCACCAATCGAAAAGAAACACGC-3,（SEQ ID NO. 12) 反義hlybR:5'-CTAGTCTAGAACTTGAGATATATGCAGGAGG-3'（SEQIDN0·13)回收長為 750bp 的hlyb片段。
[0094] 2.然後利用SOEing PCR技術將三者拼接起來，再利用酶切位點將拼接片段插入 穿梭載體PKSV7中。
[0095] hlya 片段和 E7-1 基因 SOEing PCR 拼接為 hlya-E7-l 的方法：採用 hlyaF、E7-1R 引物對純化的hlya片段、E7-1基因進行SOEing PCR拼接。回收長為816bp的hlya-E7片 段。
[0096] hlya-E7 片段和 hlyb 片段 SOEing PCR 拼接為 hlya-E7-l-hlyb 的方法：採用 hlyaF、hlybR引物對純化的hlya-E7片段、hlyb進行SOEing PCR拼接。回收長為1548bp 的 hlya-E7-l_hlyb 片段。
[0097] hlya-E7-l_hlyb片段插入穿梭載體pKSV7的方法：將回收的hlya-E7-l_hlyb 片段用Xba I、KpnI酶雙酶切，同時用Xba I、Kpn I雙酶切穿梭載體pKSV7,然後將 hlya-E7-l_hlyb片段與載體進行連接。
[0098] 3.經電轉化將重組質粒pKSV7-hlya-E7-l_hlyb導入單核細胞增生李斯特菌，在 抗生素和溫度雙重選擇壓力下實現同源重組，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減 毒單核細胞增生性李斯特細菌。
[0099] 其次，將獲得的重組減毒菌LM4 Ahly : : E7-1分泌蛋白進行Western-blotting實 驗。一抗為鼠免蛋白E7陽性血清，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，顯色劑為DAB 和ECL，結果顯示LM4Ahly :: E7-1分泌的蛋白與E7陽性血清發生特異性的免疫學反應。
[0100] 同時，對獲得的重組減毒菌LM4 Λ hly :: E7-1的安全性進行初步評價，結果表明所 獲得的重組減毒菌LM4Ahly :: E7-1與yzuLM4菌株相比較，其毒性明顯下降，表明其在安 全性方面是可靠的。
[0101] 進一步的，對獲得的重組減毒菌LM4 Ahly : : E7-1的免疫保護性方面進行了評價， 結果表明所獲得的重組減毒菌LM4 Ahly :: E7-1能夠誘導荷瘤小鼠產生較強的免疫保護效 應，且更傾向於Thl型的免疫應答；與對照組PBS組、LM4Ahly :: E及LM4Ahly組相比較， 重組減毒菌LM4 Λ hly :: E7-1可顯著抑制腫瘤生長。
[0102] 實施例1基因工程菌的構建
[0103] I. 1引物的設計
[0104] 根據公司合成的密碼子優化的HPV16 E7基因序列（SEQ ID.6)分別設計一對特異 性的引物E7F、E7R，引物由北京六合華大基因合成。
[0105] 根據單核細胞增生李斯特菌yzuLM4的基因組DNA的LLO上下遊序列分別設計一 對特異性的引物，引物由北京六合華大基因合成，採用引物為hlyaF、hlyaR ;hlybF、hlybR。
[0106] 1.2目的基因的PCR擴增、產物回收以及克隆載體的構建
[0107] 採用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4基 因組DNA，並從公司合成密碼子優化的E7基因序列，分別以其為模板，以E7F、E7R ;hlyaF、 hlyaR，hlybF、hlybR為引物進行PCR擴增。PCR反應體系為25yL:
[0108] 滅菌超純水： 17.35 μ? l〇x高保真酶 BulTbr: 2.5 μ?
[0109] 上遊引物（ΙΟΟμιηοΙ/L): 下遊引物（ΙΟΟμηιοΙ/L): 高保真DNA聚合酶（51Ι/μυ: 0.15pL dNTP C2.5mmol/L)： 2 μ? 細菌基因組模板或質粒： 1 μ?
[0110] PCR 反應條件為：94°C預變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s， 111^11，11^11，30個循環，721：再延伸1〇1^11。？0?產物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離， 用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收327bp，543bp，750bp的DNA片段後，以E7、hlya 回收片段為模板，hlyaF、E7R作為引物進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μ L:
[0111] 滅菌超純水： 15.35pL IOx高保真酶 Buffer: 2.5 μ? 上遊引物（ΙΟΟμηιοΙ/L): IpL 下遊引物（ΙΟΟμπιοΙ/L): 高保真DNA聚合酶（5U4iL): 0.15pL dNTP (2.5mmol/L)： 2 pL 回收片段模板： 各1.5pL
[0112] PCR 反應條件為：94°C預變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30個循環，72°C再延伸lOmin。PCR產物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多 功能DNA純化回收試劑盒回收816bp的DNA片段後以hlyb、hlya-E7-l回收片段為模板， hlyaF、hlyaR作為引物進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μ L:
[0113] 滅菌超純水： 15 35μ【 IOx高保真酶 Buffer: 2.5 pL 上遊引物（1 ΟΟμηιοΙ/L ): Ιμ? 下遊引物（1 ΟΟμιηοΙ/L): 1 μι 高保真DNA聚合酶（5U>L): 0.15pL dNTP (2.5mmol/L)： 2 pL 回收片段模板： 各1.5 μ?^
[0114] PCR 反應條件為：94°C預變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 2min， 30個循環，72°C再延伸lOmin。PCR產物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多 功能DNA純化回收試劑盒回收1548bp的DNA片段分別與pMD-20T載體在16°C金屬浴條件 下連接過夜，轉化DH5a感受態細胞，通過PCR與雙酶切驗證來篩選陽性克隆。將得到的陽 性克隆送至南京金斯瑞測序，測序正確的質粒命名為pMD-20T-hlya-E7-l-hlyb。
[0115] 其中，pMD-20T-hlya-E7_hlyb的測序結果如SEQ ID NO. 14,均符合預期。
[0116] 1. 3穿梭載體pKSV7-hlya-E7-l_hlyb的構建與鑑定
[0117] pMD-20T-hlya-E7-l_hlyb經Xba I與Kpn I雙酶切後，酶切產物用濃度為1%的 瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收1548bp的DNA片段後，與 PKSV7載體在16°C金屬浴條件下連接過夜，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，通過PCR與雙 酶切驗證來篩選陽性克隆，結果見圖1。驗證正確的質粒命名為pKSV7-hlya-E7-l-hlyb。
[0118] 1. 4 重組菌 LM4 Λ hly : : E7-1 的構建
[0119] 採用電轉化的方法（2200v、5ms)將重組穿梭質粒pKSV7-hlya-E7-l_hlyb轉化感 受態yzuLM4。接種於BHI培養基，在溫度（42°C )和紅黴素（10μ g/ml)雙重選擇壓力下連 續傳過8代以實現同源重組，使目的基因定點整合進細菌基因組DNA中。再在無選擇壓力 條件下傳12代以脫去穿梭質粒。將菌液稀釋後塗布到BHI平板上30°C培養長出單菌落， 再將單菌落轉種至含有紅黴素（10 μ g/ml)的BHI平板上30°C培養。挑取在BHI平板上生 長、轉種後不再生長的單菌落，提取基因組後進行PCR鑑定，鑑定為陽性的克隆即為重組菌 LM4Ahly :: E7-1。
[0120] PCR反應的引物為：
[0121] hlya+：5-CCGTATTCCTGCTTCTAGTTGTTGG-3(SEQ ID NO. 15)
[0122] hlyb+：5-ACCTCCGTAAATTACGGCTTTGAAG-3(SEQ ID NO. 16)
[0123] PCR 反應體系（25 μ 1)為：
[0124] 滅菌超純水： 17 μ-- IOxPCR BuITen 2.5 μ? 上遊引物（I ΟΟμιηοΙ/L ): 下遊引物（1 ΟΟμηιοΙ/L): Ιμ? Taq 酶（3U4iL): 0.5pL dNTP (2.5mmol/L)； 2 \\L 細菌基因組模板： I pL
[0125] PCR 反應條件為：94 °C 5min ;94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 2min，28 個循環； 72°C lOmin。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測大小應為1548bp，見圖2。
[0126] 由圖2結果可知，目的基因片段成功的定點整合到單核細胞增生李斯特菌 yzuLM4基因組中，且在無抗壓力傳代下，成功脫去了質粒，得到了無抗性的重組減毒菌 LM4Ahly :: E7-1。
[0127] 重組減毒菌LM4 Λ hly : : E7的構建：
[0128] 合成HPV16 E7基因序列及其特異引物：
[0129] HPV16 E7 的基因序列（SEQ ID NO. 17):
[0130] atgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctac tgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacag agcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtag acattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataa
[0131] PCR擴增目的基因 HPV16 E7的引物為：
[0132] 正義：5' -AAAGAAAATTCAATTTCAcatggagatacacctacatt-3'（SEQ ID NO. 18)反義： 5' -GTGTTTCTTTTCGATTGGTGGTGGTTTCTGAGAACAGA-3'（SEQ ID NO. 19)其餘步驟及所用體系 均同LM4Ahly :: E7-1的構建，最終獲得重組減毒菌LM4Ahly :: E7。減毒菌yzuLM4Ahly 的構建（參考 Yuelan Yin, Chenju Zhang, Hui Dong, Zhongwei Niu，Zhiming Pan, Jinlin Huang,Xinan Jiao*. Protective immunity induced by a LL〇-deficient Listeria monocytogenes. Microbio· 54 (4) : 175-183, 2010 文獻的記載構建）
[0133] 實施例2蛋白水平檢測目的基因的表達
[0134] 接種實施案例1中所構建的LM4Ahly : : E7-1至BHI液體培養基，37°C搖床培養 15小時後取Iml菌液，離心去除菌體、收集培養上清液。用TCA沉澱法得到的分泌的蛋白並 進行SDS-PAGE電泳，電泳結束後，取出凝膠，量出長與寬，並剪出比膠的長與寬各短0. 5cm 的NC膜，剪出比膠的長與寬各短Icm的濾紙，將它們浸泡於轉移緩衝液中，按濾紙一濾紙一 凝膠一NC膜一濾紙一濾紙的結構，轉移到電轉儀中，轉印結束後，取出NC膜，置於1 % BSA- PBS封閉液中，封閉過夜。用含0. 05% Tween20的PBS(PBST)室溫振蕩洗3次，用封閉液按 1:500稀釋鼠免蛋白E7陽性血清作為一抗，室溫振搖3h ;用PBST洗5次，每次5min ;用封 閉液按1:3000稀釋辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG作為二抗，室溫振搖Ih ;用PBST洗 5次，每次5min ;最後將NC膜分別浸於DAB (3, 3-二氨基聯苯胺）溶液中顯色和ECL (化學 發光底物）顯色，用蒸餾水衝洗終止反應，結果見圖3。
[0135] 由圖3結果可以看出，用鼠免蛋白E7陽性血清作為一抗有66kDa左右的目的條 帶，表明目的片段E7得到了正確的表達。
[0136] 實施例3重組菌安全性評價
[0137] 3. 1分泌融合蛋白LL0-E7的溶血活性檢驗
[0138] 分別接種實施案例 1 中所構建的 LM4Ahly : : E7-1、LM4Ahly : : E7、yzLM4Ahly 至定量體積的BHI液體培養基，37°C搖床培養15小時後取Iml菌液，離心去除菌體、收集培 養上清液。調整上清液0D600至相同大小後，取60 μ 1上清液用PBS (pH 6. 0)從原液到27 等倍梯度稀釋後加入到加入到V形96孔血凝板中，再向各孔中加入20 μ L 1%山羊紅細胞 懸液，混勻，置於37°C溫箱作用1小時後觀察溶血情況，以50%紅細胞發生溶血的孔的稀釋 度判為溶血效價。以PBS作為對照組。結果見圖4。
[0139] 結果表明，單核細胞增生李斯特菌yzuLM4組的溶血活性在25左右，具有較強的溶 血活性，而重組減毒菌LM4 Ahly :: E7-1溶血效價在23左右，溶血活性大大降低。使其在 安全性上得到了保障。為該重組減毒菌後續的發展提供了安全基礎。
[0140] 實施例4重組菌的免疫保護效應的評價
[0141] 4.1小鼠免疫
[0142] 按照實施例3. 1中方法製備細菌，腹腔免疫6-8周齡雌性C57BL/6荷瘤小鼠， LM4 Λ hly :: E7-1和對照菌株LM4 Λ hly :: E7的免疫劑量為5 X IO8CFU/只，每組6隻，同時 設定PBS磷酸緩衝液（100 μ L/只），免疫陰性對照組，LM4 Λ hly組，劑量為2. 15 X IO8CFU/ 只。第一次免疫一周後進行第二次免疫,二免7天後撲殺小鼠,進行相關免疫學試驗。
[0143] 4. 2小鼠脾臟淋巴細胞的製備
[0144] 將各小鼠摘取眼球採血後脫頸處死，生物安全櫃內無菌取出小鼠脾臟，置於盛有 3-5mL冰浴培養基（CM)的平皿中，用磨砂玻片鈍端充分擠壓、研磨脾細胞，使其分散成單 細胞懸液；經200目銅網過濾後，4°C，1000rpm離心lOmin，棄掉上清，用2-3mL紅細胞裂解 液重懸沉澱以裂解紅細胞，37°C作用3-5min，加入2倍體積的PBS終止；4°C，IOOOrpm離心 lOmin，去上清，用新鮮的CM重懸並離心洗滌細胞兩次，最終將細胞重懸於CM中，臺盼蘭染 色後計數，調整細胞濃度至IX IO7個細胞/mL，冰浴備用。
[0145] 4. 3夾心ELISA定量檢測特異性IFN- γ和IL-4細胞因子
[0146] 4. 3. 1細胞培養上清製備
[0147] 將上述製備的各組小鼠脾臟細胞懸液調整至IX IO6個/50 μ L加至96孔細胞板 中，再分別加入50 μ L用CM稀釋的Ε749_57多肽（10 μ g/mL)進行刺激，同時設立陰性對照 (未刺激細胞），試驗中各種處理均設3個復孔，37°C，5% CO2培養箱培養48h。4°C，IOOOrpm 離心5min，收集細胞培養上清備用。
[0148] 4. 3. 2 夾心 ELISA 試驗
[0149] 於試驗前一天取ELISA板分別包被抗小鼠 IFN- γ mAb及IL-4mAb，2 μ g/mL， 100 μ L/孔，4°C過夜；次日PBST (磷酸鹽吐溫緩衝液）洗5遍，加入含I % BSA的PBS於 37°C封閉2h ;PBST洗5遍，加入各待檢測細胞上清，100 μ L/孔，同時加入商品化標準品重 組鼠 IFN- γ、IL-4分別從2000和4000pg/mL開始做系列倍比稀釋作為標準曲線對照，室 溫靜置反應3小時；PBST洗5遍，分別加入對應的生物素化檢測抗體IFN- γ -biotin mAb、 IL-4-biotin mAb，1 μ g/mL，IOOuL/ 孔，室溫放置 Ih ;PBST 洗 5 遍，用含 I % BSA 的 PBS 1:1000稀釋鏈親和素標記的辣根過氧化物酶（streptavidin HRP)，100 μ L/孔，室溫放置 30min ;PBST洗7遍，加入TMB底物顯色，2Μ H2SCM終止，酶聯免疫閱讀儀讀取OD45tl值，根據 繪製的標準曲線計算各組細胞上清中IFN-Y和IL-4細胞因子的含量（pg/mL)。
[0150] 結果如圖5所示：
[0151] 在對PBS陰性對照組、缺失株LM4Ahly、表達E7的重組菌株LM4Ahly::E7-l 和LM4 Λ hly: :E7小鼠進行兩次免疫後，取出相應免疫組小鼠的脾臟細胞,在體外分別 用E749_57多肽進行刺激和孵育培養後，對脾臟細胞分泌產生的IFN-γ和IL-4含量測 定結果顯示：1)PBS陰性對照組和缺失株LM4 Λ hly分泌的這兩種細胞因子的含量極 低，而表達E7的重組菌株LM4Ahly::E7-l分泌上述兩種細胞因子的水平極高，這說明 LM4 Λ hly: :E7-1免疫小鼠後誘導小鼠產生了針對原癌蛋白E7的特異性免疫應答。2)重 組減毒菌LM4Ahly :: E7-1組的IFN-r分泌水平（lOOOpg/mL)顯著高於IL-4的分泌水平 (250pg/mL)，這表明重組菌所誘導的免疫應答類型更傾向於Thl型的免疫應答，即細胞免 疫應答。3)LM4Ahly :: E7-1免疫組的IFN-r分泌水平與LM4 Λ hly: :E7免疫組呈現顯著 性差異。總上所述，LM4 Λ hly: :E7-1免疫小鼠後具有誘導小鼠產生針對原癌蛋白E7的Thl 型細胞免疫應答，誘導E7多肽特異性的細胞應答的強度顯著高於LM4 Λ hly :: E7,該重組疫 苗對於宮頸癌疾病的治療具有潛在的應用價值。
[0152] 4. 4淋巴細胞增殖實驗
[0153] 將製備的各實驗組小鼠脾臟單細胞懸液用培養基調整濃度至5X IO4個/50 μ L， 加入96孔細胞板中，相應孔中加入50 μ L Ε749_57多肽（終濃度為10 μ g/mL)進行刺激，同 時設立陰性對照（未刺激細胞）。每組均設置3個復孔，然後將細胞板置37°C、5% CO2培 養箱中培養48h。48h後向各試驗孔中加入IOul BrdU標記液，37°C、5%C02培養箱中培養 12h。4°C、1000rpm、8min離心，去除標記液，60°C恆溫箱中放置lh，徹底去除孔中剩餘水分。 200 μ L/孔加入 fixdenat，37°C孵育 30min 後去除 fixdenat。100 μ L/孔加入 anti-BrdU-POD 工作液，37°C孵育90min後去除工作液。PBS洗滌3次，100 μ L/孔加入底物，37°C顯色，顯 色完畢後25 μ L/孔加入IM的H2SO4終止反應，OD45tl檢測吸光度。
[0154] 圖6結果顯示，在Ε749_57多肽刺激下，LM4Ahly: :Ε7-1免疫組與LM4Ahly: :Ε7免 疫組相比，能夠誘導小鼠淋巴細胞顯著性增殖（Ρ < 0. 05)，說明重組菌LM4 Ahly: :Ε7-1誘 導小鼠細胞毒性T淋巴細胞殺傷活性顯著好於LM4 Ahly: :Ε7。
[0155] 4. 5細胞毒性T淋巴細胞（CTL)實驗
[0156] 無菌取各實驗組小鼠脾臟製備單細胞懸液，將其分為A和B兩等份；A組細胞 (CFSE high)用10μ g/mL Ε749_57多肽刺激，37°C 5% CO2培養箱中培養45min ;離心棄上清後用 含5yMCFSE的PBS緩衝液重懸細胞，37°C、5% CO2培養箱中培養15min進行染色。此時， B組細胞（CFSE1?)用含0. 5 μ M CFSE的PBS緩衝液進行染色，37°C、5% CO2培養箱中培養 15min進行染色。15min後，A、B兩組分別加入5倍體積的預冷培養基終止反應，室溫作用 5min。將A組細胞及B組細胞1:1比例混合，以I X IO7細胞尾靜脈注射各實驗組小鼠。15h 後，取各實驗組小鼠的脾臟製備單細胞懸液，用適量的1% BSA的PBS重懸細胞，FACS分析 A組細胞（CFSEhigh)和B組細胞（CFSEltw)的細胞數量變化。細胞毒性T淋巴細胞的特異性 殺傷率計算：特異性殺傷率=100 - (100X (% CFSEhigh immunized/% CFSE1? immunized)/ (% CFSEhigh control/% CFSEltw control))。
[0157] 圖7結果顯示，LM4 Λ hly: : E7-1組和LM4 Λ hly: : E7組荷瘤小鼠體內的CFSEhigh峰 均要顯著低於CFSElw峰，說明重組菌均能誘導荷瘤小鼠產生較強的E7特異性的CTL活性， LM4Ahly: :E7-1免疫組產生的E7特異性的CTL效應高於LM4Ahly: :E7組，而PBS組和 LM4 Λ hly組小鼠體內沒有產生特異性的CTL活性。通過殺傷率公式計算，LM4 Λ hly: :E7-1 產生的E7特異性殺傷效率為68. 73 %，LM4 Λ hly: :E7產生的E7特異性殺傷效率為 58. 96%，LM4Ahly: :E7-1 殺傷效率比 LM4Ahly: :E7 提高 9. 77%。
[0158] 4. 6二次免疫後小鼠腫瘤大小
[0159] 各組實驗小鼠第一次免疫一周後進行第二次免疫,二免7天後撲殺小鼠,解剖小 鼠，取每隻小鼠腫瘤，進行拍照。結果如圖8所示。
[0160] LM4Ahly組及PBS組的小鼠，隨時間的推移腫瘤逐漸生長，至第36天時，兩組中 所有小鼠因腫瘤過大而死亡；而免疫組小鼠經過疫苗LM4Ahly: :E7-1及LM4Ahly: :E7免 疫治療後，部分小鼠體內腫瘤完全消除，剩餘小鼠則腫瘤生長緩慢（圖9)，LM4Ahly::E7-l 免疫組與LM4Ahly: :E7免疫組相比，表現出更顯著的治療性作用。
[0161] 以上的實施例是為了說明本發明公開的實施方案，並不能理解為對本發明的限 制。此外，本文所列出的各種修改以及發明中方法、組合物的變化，在不脫離本發明的範圍 和精神的前提下對本領域內的技術人員來說是顯而易見的。雖然已結合本發明的多種具體 優選實施例對本發明進行了具體的描述，但應當理解，本發明不應僅限於這些具體實施例。 事實上，各種如上所述的對本領域內的技術人員來說顯而易見的修改來獲取發明都應包括 在本發明的範圍內。
【權利要求】
1. 一種針對宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白，為在減毒重組李斯特菌中分泌表達的 HPV16E7的融合蛋白。
2. 如權利要求1所述融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白為單核細胞增生性李斯特 菌溶血素蛋白LLO與HPV16E7的融合蛋白。
3. 如權利要求2所述融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 如權利要求1-3任一所述融合蛋白，其特徵在於，所述減毒重組李斯特菌包含編碼 HPV16E7蛋白的多核苷酸，所述編碼HPV16E7蛋白的多核苷酸序列為SEQ ID N0.6。
5. -種多核苷酸，其編碼權利要求1-4任一所述融合蛋白，所述融合蛋白中編碼 HPV16E7的基因序列為SEQ ID NO. 6。
6. -種載體，其含有權利要求5所述多核苷酸。
7. -種宿主細胞，其被權利要求6所述載體轉化。
8. 如權利要求7所述宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為單核細胞增生性李斯特 細菌。
9. 如權利要求8所述宿主細胞，其特徵在於，所述單核細胞增生性李斯特細菌的血清 型為l/2a。
10. -種重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，所述重組減毒單核細胞增生性李斯特 細菌的基因組中，整合有HPV16E7基因，所述HPV16E7基因的序列為SEQ ID NO. 6,所述重組 減毒單核細胞增生性李斯特細菌能融合表達單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LL0與 HPV16E7的融合蛋白。
11. 如權利要求10所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特徵在於，所述單核 細胞增生性李斯特細菌的血清型為l/2a。
12. 如權利要求10所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特徵在於，所述單核 細胞增生性李斯特細菌為單核細胞增生李斯特菌株yzuLM4。
13. 如權利要求10所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌，其特徵在於，所述編碼 HPV16E7蛋白的基因重組整合於野生型單核細胞增生李斯特菌基因組DNA中hly基因的 111位與154位鹼基之間。
14. 如權利要求10-13任一所述重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌的構建方法，包 括下列步驟： 1) 合成HPV16E7蛋白編碼基因片段；從單核細胞增生李斯特菌株中擴增出待插入位點 的上遊同源臂片段hlya和下遊同源臂片段hlyb ; 2) 將步驟1)獲得的HPV16E7編碼基因及上下遊同源臂片段拼接成 hlya-HPV16E7_hlyb融合片段並連接入穿梭質粒獲得重組穿梭質粒； 3) 將步驟2)獲得的重組穿梭質粒轉化單核細胞增生性李斯特細菌，經過抗性和溫度 雙壓力篩選，再通過無抗性傳代得到無抗性基因的重組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
15. 如權利要求1-4任一所述的融合蛋白或其編碼基因或權利要求11-14任一所述重 組減毒單核細胞增生性李斯特細菌在製備宮頸癌疾病疫苗上的用途。
16. -種疫苗，包括如權利要求1-4任一所述的融合蛋白或權利要求11-14任一所述重 組減毒單核細胞增生性李斯特細菌。
【文檔編號】A61K48/00GK104371025SQ201410666087
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年1月15日
【發明者】焦新安, 殷月蘭, 段斐斐, 潘志明, 陳祥, 孫林, 黃金林 申請人:揚州大學