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一種高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法

2023-07-08 02:18:51 5

專利名稱:一種高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法
技術領域:
本發明屬於生物再生醫學領域,具體涉及一種基於明膠(Gelatin)、改性殼聚糖 (chitosan)為原料的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法。
背景技術:
因外傷或疾病引起的軟骨缺損或者病變是臨床骨科的常見疾病。尤其是關節軟 骨,由於體內關節軟骨的自身修復能力極其有限,一旦發生損傷或者病變,很難自愈,甚至 導致關節損壞,多需要外源性修復或啟動內源性因素修復[1]。隨著生命科學和工程學的發 展,組織工程應運而生,人們利用工程學方法和手段構建和再生各種組織和器官來替代病 損組織,並取得了巨大的成就。構建生物特性與正常關節軟骨相似的組織工程軟骨是目前 組織工程研究的熱點之一。關節軟骨位於活動關節的表面,是一種複雜的複合生物材料,在 負荷的傳導和吸收上發揮著重要作用。成熟的關節軟骨根據細胞和基質形態變化可分為4 層,即表層、移行層、中層和鈣化層,其結構的層次變化與關節軟骨的力學特性相適應[2]。盡 管軟骨組織工程發展迅速,研究應用領域不斷擴大,但是仍然有許多問題亟待解決,如形成 的軟骨組織在後期容易退化;形成的軟骨組織力學性能不太滿意等問題。尤其在軟骨基質 材料方面,如何構建一種具有良好的生物相容性,可降解,具有足夠的孔隙結構,且具備承 載生長因子,不易從缺損處脫落,具有一定彈性和分層功能結構的軟骨基質材料一直是目 前研究的熱點和難點。 20世紀60年代以來陸續進行了異體骨關節移植術、骨膜軟骨移植、帶蒂筋膜瓣移 植、軟骨細胞移植以及人工假體移植等手術方法來修復和重建關節軟骨,這些方法在短期 內均取得了一定的手術效果,但是其移植體來源的局限性,以及多次手術等問題一直使其 難以大規模推廣。20世紀80年代以來,組織工程學科概念的提出和興起為關節軟骨修復 提供了新的選擇,其基本原理是體外培養擴增的細胞結合基質材料構建出新的軟骨組織以 供移植。軟骨組織工程的目標是將軟骨細胞和細胞外基質重新合成為類正常軟骨且有功能 的組織。目前,國際上已經有很多學者開展了相關領域的研究工作,並取得了積極的進展。 Roehlecke等[3]用I型膠原包鈦合金為支架,發現種子細胞表現出較高的黏附性和生長活 性,提示I型膠原可作為黏附分子和特異性生長因子的良好載體。Ma等[4]在三維多孔材 料聚羥基乙酸/聚乳酸複合物表面採用"嫁接"(grafting)技術複合聚甲基丙烯酸,很好 地促進了細胞的生長和分化。Song等[5]將明膠與骨基質材料複合,形成多孔骨基質明膠 支架,與軟骨細胞在體外混合培養12天後植入關節軟骨缺損處,24周後成功修復了軟骨缺 損。Frondoza先對人膝關節軟骨細胞進行3個月的單層培養,細胞出現了去分化現象,然後 將此細胞加I型膠原微載體培養,細胞數量在2周內增加了 20倍,且細胞重新表達軟骨細 胞表型[6]。 Lee等將轉化生長因子13 1用乳交聯方法製成球囊,複合在膠原_殼聚糖_黏 多糖複合材料中與軟骨細胞混合培養,3周後用ELISA法檢測,發現軟骨細胞的表型及黏多 糖的產生均優於對照組[7]。以上這種基於經典組織工程概念構建的細胞外基質複合種子細 胞體外擴增培養後,然後進行軟骨缺損修復的治療模式,雖然在臨床上取得了一定的效果,
3但仍存在不少局限性。例如,部分患者對細胞體外擴增階段過程中使用的抗生素及牛類來源製劑會產生敏感不良反應[8]。另外,在提取患者骨髓間充質幹細胞(MSCs)時會導致患者二次損傷,最為重要的是,採用此種方式形成的纖維狀軟骨細胞機械性能很差,並且在體內機械性能下降非常迅速,只能形成臨時性的修復,並不能生成持久耐用的透明軟骨[9"°]。由此可見,無論擴增與否簡單的細胞移植在軟骨缺損修復中並不能產生盡如人意的療效。
如何激活內源性SM-MSCs,並誘導其向軟骨缺損部位遷移、增殖和分化將是最終形成耐久透明質軟骨從而達到軟骨缺損修復重建目點的重點。我們製備的免細胞移植型促軟骨自修復基質具有高度聯通的三維多孔結構,利於營養物質的擴散,新遷移、補充幹細胞的粘附,增殖和成軟骨細胞分化。我們近期工作中所構建的高彈性明膠/殼聚糖多孔支架顯示了非常好的軟骨再生應用發展潛力[11]。明膠是一種天然生物大分子聚合物,它具有促進MSCs粘附和向軟骨細胞分化的作用[12a3a4]。殼聚糖是一種線型聚多糖,具有與細胞外基質粘多糖類似的結構[15]。其具有良好的生物相容性,無免疫原性,生物降解性,等優點[16]。
綜上所述,現有文獻的報導中,尚未有關於本發明中所述的高彈性促軟骨原位再生支架的相關研究報導。
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發明內容
本發明的目的在於提供一種高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法。
本發明提出的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,將明膠(Gelatin)和改性殼聚糖(chitosan)溶於非質子極性溶劑中,並在該溶液中加入光固化引發劑,在紫外光輻照下進行固化交聯,得到由明膠和改性殼聚糖交聯而成的凝膠類材料;將所得凝膠類材料在去離子水作用下洗滌、浸泡,除去其中的非質子極性溶劑,在形成凝膠的過程中,由於相分離作用,在洗脫非質子溶劑後得到基於明膠和改性殼聚糖的多孔的三維基質材料;然後採用超分子層層納米自組裝技術,將對SM-MSCs具有激活、遷移誘導、分化誘導作用的多種生長因子負載於前面製備的多孔三維基質材料上,經滅菌處理,封裝後即得產品;其中明膠和改性殼聚糖的質量比為1 : 10-10 : 1。 本發明中,所述非質子極性溶劑為二甲亞碸(DMS0) 、二甲基甲醯胺(DMF) 、N_N_ 二甲基乙醯胺(DMA)或六甲基磷醯三胺(HMPA)中任一種。非質子極性溶劑的加入量為70-95wt% (以明膠質量計)。 本發明中,所述光固化引發劑為2-羥基-2-甲基-l-苯基丙酮;l-羥基環己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-嗎啉基)-l-[4-(甲硫基)苯基]-l-丙酮、l-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2',2'-二甲基乙酮、2,4,6-三甲基苯甲醯基-二苯基氧化膦;2,4,6-三甲基苯甲醯基苯基膦酸乙酯、2- 二甲氨基-2-節基-1-[4-(4-嗎啉基)苯基]-l- 丁酮、2-羥基-2-甲基-l-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-l-丙酮或苯甲醯甲酸甲酯中一種或幾種的組合,光固化引發劑的加入量為改性殼聚糖質量的0. 1-3. 0%。
本發明中,所述紫外光輻照條件為光源波長為150-450nm,照射強度為3_20w/cm、照射時長為5-30分鐘。 本發明中,所述改性殼聚糖採用苯甲醯氯和丙烯醯氯(或其衍生物),與殼聚糖進行反應後的產物。 本發明中,所述超分子層層納米自組裝技術指靜電層層自組裝方法,該方法是基於大分子間的弱相互作用力(靜電吸引力、範德化力、氫鍵等),對生物大分子和聚電解質進行有序交替沉積的一種高效而簡捷方法,採用此種方法可以方便的將各種聚電解質組裝成納米厚度的超薄膜,並保持該生物大分子的生物活性和空間結構,可在具有複雜空間構型的裝置上實現。 本發明中,所述生長因子為對SM-MSCs遷移、增殖、分化具有誘導作用的生長因子或生長因子組合,如肝細胞生長因子、骨成型蛋白-2、胰島素樣生長因子-I、胰島素樣生長因子結合蛋白_3等,但並不僅僅限於此處所舉示例。 本發明的有益效果在於利用本發明方法所獲得三維多孔支架材料具有優良的力學性能和高度連通的孔腔,可為軟骨再生提供有利的物理環境,同時因其高彈性的特質,使其可通過關節鏡微創手術操作植入軟骨缺損部位。與此同時支架上所負載的生長因子對缺損部位周圍的骨滑膜幹細胞具有誘導作用,可促進軟骨的再生。


圖1為實施例1和實施例2所得支架的宏觀形貌和掃描電鏡(SEM)照片,其中A、B、 C分別為實施例1,明膠改性殼聚糖=1 : 1 (質量比)時支架的宏觀形貌和掃描電鏡(SEM)照片。D、 E、 F為實施例2,明膠改性殼聚糖=1 : 3(質量比)時支架的宏觀形貌和掃描電鏡(SEM)照片。 圖2為兔股骨軟骨缺損動物模型實驗中的空白對照組的病理組織染色放大圖和對兔股骨軟骨缺損動物模型的修復實驗病理組織染色放大圖。其中A為兔股骨軟骨缺損模型,B為6星期後,未經支架修復的軟骨缺損部位病理組織染色觀察,缺損部位未見有效修復; C為經實施例1中明膠改性殼聚糖=1 : l(質量比)時的支架對兔股骨軟骨缺
損模型修復4星期後的情況,d為經實施例i中明膠改性殼聚糖=i : i(質量比)時的
支架對兔股骨軟骨缺損模型修復6星期後的情況病理組織染色放大圖,軟骨缺損部位得到
有效的修復。
具體實施例方式
下面通過實施例進一步說明本發明。
實施例1 將明膠(Gelatin)和改性殼聚糖(chitosan)按1 : 1 (wt : wt)配比,溶於二甲亞碸(DMSO)中,並在該溶液中加入O. 5% (wt)2-甲基-2-(4-嗎啉基)-l-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮作為光固化引發劑,在365nm, 10w/cm2紫外光下輻照20分鐘,得到凝膠材料。將所得凝膠在去離子水作用下洗滌、浸泡,除去其中的匿SO得到多孔三維基質支架。然後將此支架浸入聚乙烯亞胺(PEI, l-5mg/ml)溶液中,浸泡5_10分鐘後再用pH = 7. 0的去離子
6水洗滌。將BMP-2和HGF製成0. 1-10 y g/ml濃度的溶液,把支架置於此溶液中浸泡10-30分鐘進行吸附,然後用pH = 7. 0的去離子水洗滌。然後依次浸入聚烯丙基胺(PAH,3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA,3mg/ml)溶液中,循環3_4次,每次沉積後均用去離子水洗脫。接下來,將前面經過處理的支架用乙醇洗脫隨後用氮氣氣流乾燥。即得到產品。 從圖1中可以看出,明膠改性殼聚糖(1 : l,質量比)通過光固化交聯,形成彈性多孔支架,經SEM放大後(B, C),可以看到其表面和內部由密布的連通孔洞構成,該結構
對細胞的黏附生長有利。
實施例2 將明膠(Gelatin)和改性殼聚糖(chitosan)按1 : 3 (wt : wt)配比,溶於N-N-二甲基乙醯胺(DMA)中,並在該溶液中加入1.5% (wt)l-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2',2' -二甲基乙酮作為光固化引發劑,在20011111,5界/(^2紫外光下輻照15分鐘,得到凝膠材料。將所得凝膠在去離子水作用下洗滌、浸泡,除去其中的DMA得到多孔三維基質支架。然後將此支架浸入聚乙烯亞胺(PEI,l-5mg/ml)溶液中,浸泡5_10分鐘後再用pH =7. 0的去離子水洗滌。將BMP-2和IGF-I製成0. 1_10 y g/ml濃度的溶液,把支架置於此溶液中浸泡10-20分鐘進行吸附,然後用pH = 7. 0的去離子水洗滌。然後依次浸入聚烯丙基胺(PAH,3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA,3mg/ml)溶液中,循環3-4次,每次沉積後均用去離子水洗脫。接下來,將前面經過處理的支架用乙醇洗脫隨後用氮氣氣流乾燥。即得到產品。
從圖1中可以看出,明膠改性殼聚糖(1 : 3,質量比)通過光固化交聯,形成彈性多孔支架,經SEM放大後(E, F),可以看到其表面和內部由密布的相互連通孔洞構成,和
明膠形成的顆粒狀結構,該結構利於細胞的黏附生長。
實施例3 將明膠(Gelatin)和改性殼聚糖(chitosan)按5 : 1 (wt : wt)配比,溶於二甲基甲醯胺(DMF)中,並在該溶液中加入1.0% (wt)2-二甲氨基-2-苄基-l-[4-(4-嗎啉基)苯基]-1-丁酮作為光固化引發劑,在400nm, 10w/cm2紫外光下輻照30分鐘,得到凝膠材料。將所得凝膠在去離子水作用下洗滌、浸泡,除去其中的DMF得到多孔三維基質支架。然後將此支架浸入聚乙烯亞胺(PEI, l-5mg/ml)溶液中,浸泡5_10分鐘後再用pH = 7. 0的去離子水洗滌。將BMP-2, IGF-I和IGFBP-3製成0. 1_10 y g/ml濃度的溶液,把支架置於此溶液中浸泡10-20分鐘進行吸附,然後用pH = 7. 0的去離子水洗滌。然後依次浸入聚烯丙基胺(PAH,3mg/ml)和聚丙烯酸(PAA,3mg/ml)溶液中,循環3_4次,每次沉積後均用去離子水洗脫。接下來,將前面經過處理的支架用乙醇洗脫隨後用氮氣氣流乾燥。即得到產品。
權利要求
一種高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於以明膠和改性殼聚糖為主要原料,溶於非質子極性溶劑中,並在該溶液中加入光固化引發劑,在紫外光輻照下進行固化交聯,得到由明膠和改性殼聚糖交聯而成的凝膠類材料。將所得凝膠類材料在去離子水作用下洗滌、浸泡,除去其中的非質子極性溶劑,在形成凝膠的過程中,由於相分離作用,在洗脫非質子溶劑後得到基於明膠和改性殼聚糖的多孔的三維基質材料,然後採用超分子層層納米自組裝技術,將對SM-MSCs具有激活、遷移誘導、分化誘導作用的多種生長因子負載於前面製備的多孔三維基質材料上,經滅菌處理,封裝後即得產品;其中明膠和改性殼聚糖的質量比為1∶10-10∶1。
2. 根據權利要求i所述的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於所述非質子極性溶劑為二甲亞碸、二甲基甲醯胺、N-N-二甲基乙醯胺或六甲基磷醯三胺中的一種,非質子極性溶劑的加入量為明膠質量的70-95wt%。
3. 根據權利要求1所述的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於所述光固化引發劑為2-羥基-2-甲基-l-苯基丙酮、l-羥基環己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-嗎啉基)-l-[4-(甲硫基)苯基]-l-丙酮、l-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2',2'-二甲基乙酮、2,4,6-三甲基苯甲醯基-二苯基氧化膦、2,4,6-三甲基苯甲醯基苯基膦酸乙酯、2_ 二甲氨基-2-苄基-1-[4-(4-嗎啉基)苯基]-l- 丁酮、2-羥基-2-甲基-1-[4-(2-羥基乙氧基)苯基]-l-丙酮或苯甲醯甲酸甲酯中一種或幾種的組合,光固化引發劑的加入量為改性殼聚糖質量的0. 1-3. 0%。
4. 根據權利要求1所述的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於所述紫外光輻照條件為光源波長為150-450nm,照射強度為3-20w/cm2,照射時長為5_30分鐘。
5. 根據權利要求1所述的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於所述改性殼聚糖為採用苯甲醯氯和丙烯醯氯或其衍生物,與殼聚糖進行反應後的產物。
6. 根據權利要求1所述的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於所述超分子層層納米自組裝技術是指靜電層層自組裝方法。
7. 根據權利要求1所述的高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法,其特徵在於所述生長因子為對SM-MSCs遷移、增殖、分化具有誘導作用的生長因子或生長因子組合,採用HGF、BMP-2、IGF-I或IGFBP-3。
全文摘要
本發明屬於生物再生醫學領域,具體涉及一種高彈性促軟骨原位再生支架的製備方法。本發明以明膠、改性殼聚糖為主要原料,通過光固化和相分離技術製備具有高彈性,多孔的三維基質材料,然後採用超分子層層納米自組裝技術,在納米尺度上精確控制自組裝膜的結構,並在此基質材料中負載HGF、BMP-2、IGF-I、IGFBP-3等多種生長因子。通過對生長因子的控釋,實現對軟骨缺損部位周圍內源性骨滑膜幹細胞(SM-MSCs)的激活,促使其向缺損部位遷移,增殖和分化,最終在體內實現軟骨缺損部位的原位誘導自修復。
文檔編號A61L27/22GK101773685SQ20101010564
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月4日 優先權日2010年2月4日
發明者文學軍, 時東陸, 趙鵬 申請人:同濟大學

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