一種微生物基因克隆的方法
2023-07-08 03:52:16 1
專利名稱：一種微生物基因克隆的方法
技術領域：
本發明屬於遺傳學領域，公開了一種微生物基因克隆方法。
背景技術：
自然界微生物種類極其複雜，有細菌、真菌、病毒等各種種類，寄主也包括人、動物、植物等。對人類而言，微生物基因功能豐富多樣，有好有壞，比如，根瘤菌與豆科植物共生形成根瘤，在固氮酶基因的幫助下固定空氣中的氮氣供植物營養，可減少化肥的施用、保護環境。然而，由Magnaporthe grisea中的毒性基因引起的稻痕病是水稻上最嚴重的真菌病菌病害之一，可造成水稻減產30 %左右，甚至絕收，嚴重威脅國家糧食安全。因此，克隆微生物的毒性基因、耐藥性基因等，對了解並利用微生物的這些特性為人類服務至關重要。克隆微生物基因的方法較多，但主要還是按照經典的連鎖標記定位，然後克隆的 方式進行。分子標記連鎖定位策略源於摩爾根的連鎖理論，即染色體上相鄰基因(即基因連鎖)不能自由分離，而是傾向於整體向後代傳遞，它們所控制的性狀也傾向於同時出現。二者相鄰越近，性狀同時出現的可能性越大，重組性狀越少。因此，由重組性狀(配子)的比例可以度量二者間的距離。若已知道其中一個基因在染色體上的位置(稱這樣的基因為標記基因)，就可以根據重組率推斷另一個基因的位置。例如，黃色圓粒豌豆品種(基因型分別為YYRR)與綠色皺粒品種(基因型為yyrr)雜交產生F1 (基因型YyRr)，F1自交可能產生YR、Yr、yR和yr 4種配子，根據F2代的性狀表現可以得知它們的比例，進而計算交換率。若交換率為I %，且已知控制顏色的Y基因位於第3染色體上，就可以推測，控制豌豆籽粒形狀的R基因位於第3染色體且與Y基因相距1CM。從以上的分析可以看出，經典連鎖標記定位的實質是找到與目標性狀連鎖的已知分子標記，並計算二者的交換率，進而推斷目標基因的位置。分離群體分池是基因定位的實際操作策略，仍以上述實例進行說明。以籽粒形狀為標準，將F2群體劃分為兩個部分(池)顯性池(隨機抽取的圓粒單株)和隱性池(隨機抽取的皺粒單株)，比較豌豆基因組上已知了 1000個SSR標記(SSR1-SSR1000)擴增產物在這兩個池間的差異。若標記SSR17與籽粒形狀R/r連鎖，那麼對籽粒形狀分池，也就相當於對SSR17分池，因此，SSR17在兩個池間的擴增產物是有差異的，相反就沒有差異，由此確定目標基因與SSR17處於同一染色體。再分析F2各個單株的表現，計算R/r與SSR17的遺傳距離，即可進一步定位R/r在該染色體上的具體位置。分子標記連鎖定位並克隆基因經過幾十年的發展，已成為基因克隆的經典方法，但該方法依舊存在明顯缺陷，主要表現如下(I)微生物個體小，觀察與鑑定工作十分困難且主觀性強。然而，連鎖標記定位要求鑑定分離群體中每一菌株的表現型，工作量十分繁雜且難度大。(2)目前針對微生物所開發的分子標記有限，使其應用受到很大限制；精細定位時，可用標記越來越少，甚至無標記可用，使工作無法進行，即使存在標記，由於交換率低，需分離與鑑定大量菌株才能準確獲得的遺傳距離，工作量呈幾何級數增加；僅找到包含目標基因的區段，還需要進行基因預測，無法避免基因預測的假陽性或假陰性。
發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供了一種能夠準確、快速、輕鬆克隆微生物目標基因的新方法。為了實現上述目的本發明採取的技術方案是一種微生物基因克隆方法，包括以下步驟用目標性狀(如毒性、耐藥性、溫度敏感性等)有差異的菌株做親本，通過雜交構建分離群體，通過抗性植株、農藥、溫度、營養元素等條件對分離群體設置選擇壓進行自動篩選，獲得篩選後群體；對兩個親本、篩選前和篩選後群體進行基因組高通量測序；通過初步de novo (直接)組裝並比對，獲得親本間差異位點，並將親本間差異位點與篩選前和篩選後的群體基因組按完全匹配的方式進行比對，尋找在親本與篩選前群體中存在、但在篩選後群體中消失的位點，該位點為控制目標性狀的基因；通過與親本基因組比對獲得目標基因的全長序列，並利用PCR擴增克隆目標基因，按遺傳互補實驗驗證所克隆目標基因的功能。 本發明更具體的技術方案是一種微生物基因克隆方法，包括以下步驟(I)構建分離群體利用分別含有相對性狀(如毒性、耐藥性、溫度敏感性等)的親本雜交後分離構建分離群體；(2)分離群體自動篩選按目標性狀的特點，選擇適合類型的選擇壓(如抗性植株、藥物、高溫等)，對分離群體進行自動篩選，獲得篩選後群體；(3)DNA提取提取2個親本、篩選前和篩選後2個混合群體的基因組DNA ；(4)目標位點的確定按高通量測序流程分別構建親本、篩選前和篩選後基因組DNA文庫，PCR並高通量測序。按de novo組裝，初步構建2個親本的全基因組序列，通過比對，獲得親本間差異位點。按完全匹配的方式，將差異位點與篩選前和篩選後的混合基因組進行比對，獲得在親本和篩選前群體中存在但在篩選後群體中消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點，可分為兩種情況，若測序深度足夠，則只出現一個候選位點，則可直接獲得目標座位(因為微生物基因組一般較小，因此，這種情況容易出現)；若測序深度不夠，那麼和目標位點緊密連鎖的位點可能無法與目標座位區分開，出現多個候選基因；這時，可採用PCR或雜交(如安捷倫的SureSelect平臺)的方式富集候選位點後高通量測序，由於不再檢測全基因組，此時測序深度已不再是問題，可將連鎖位點與目標基因區分開，從而獲得目標座位。(5)目標基因克隆與功能驗證通過比對親本基因組的方式獲得目標基因的全長序列，PCR擴增克隆目標基因，按通用的遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。本發明實施例的有益效果是(I)傳統定位、克隆方法需要分離、鑑定大量的菌株，工作十分繁雜且對鑑定者經驗要求很高，常耗時數年。本發明群體構建完成後，只需要一次條件篩選，提取4份DNA，一次高通量測序即可完成實驗，避免了大量的菌株分離與鑑定工作，可在2-6個月內完成。(2)本方案依賴於測序而非分子標記，可用於任何微生物物種，極大地拓寬了微生物基因克隆與利用範圍。直接克隆目標基因本身，而非包含目標基因的區段，結果明確，也不存在無標記可用的問題。大部分步驟有概率保證，具有判斷標準，風險大為降低。
圖I是本發明實施例I提供的微生物基因克隆通用方法流程示意圖；圖2是本發明實施例2提供的水稻稻瘟病菌毒性基因克隆方法流程示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，但不作為對本發明的限定。實施例I一種微生物基因克隆方法，包括以下步驟(參見圖I)
(I)構建分離群體利用目標性狀(如毒性、耐藥性、溫度敏感性等)具有差異的親本I和親本2雜交。若該微生物為單倍體，則F1即為分離群體，若為二倍體，則至F2代成為分離群體，該分離群體即為篩選前群體。(2)分離群體自動篩選按目標性狀的特點，選擇針對目標性狀的選擇壓(如抗性植株、藥物、高溫等)，對分離群體進行自動篩選，獲得篩選後群體；(3)DNA提取提取2個親本、篩選前和篩選後2個混合群體基因組DNA ；(4)目標位點的確定按高通量測序流程分別構建親本、篩選前和篩選後基因組DNA文庫，PCR並高通量測序。按de novo組裝，初步構建2個親本的全基因組序列，通過比對，獲得親本間差異位點。按完全匹配的方式，將這些差異位點與篩選前和篩選後的混合基因組進行比對，獲得在親本和篩選前群體中存在但在篩選後群體中消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點，可分為兩種情況，若測序深度足夠，則只出現一個候選位點，則可直接獲得目標位點(因為微生物基因組一般較小，因此，這種情況容易出現)；若測序深度不夠，那麼和目標位點緊密連鎖的位點可能無法與目標座位區分開，出現多個候選基因，即獲得目標位點候選位點；這時，可採用PCR或雜交(如安捷倫的SureSelect平臺)的方式在篩選前和篩選後群體中富集候選位點後高通量測序，由於不再檢測全基因組，此時測序深度已不再是問題，可將連鎖位點與目標基因區分開，從而獲得目標位點。(5)目標基因克隆與功能驗證通過比對親本基因組的方式獲得目標基因的全長序列，PCR擴增克隆目標基因，按通用的遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。實施例2一種稻瘟病無毒基因克隆方法(參見圖2)(I)有毒性與無毒性的稻瘟病小種的鑑定。從湖北恩施的麗江新團黑谷水稻感染稻瘟病的病葉上分離培養稻瘟病生理小種,利用這些生理小種接種水稻材料IRBL 12，發現接小種S223後，出現典型的稻瘟病梭形病斑，表明S223小種對IRBL 12具有毒性。接種S12後，IRBL 12幾乎沒有病斑，表明S12小種對IRBL 12沒有毒性。(2) F1雜交子囊孢子的獲得與培養。將稻瘟病菌S223與S12親本菌株於燕麥片培養基(燕麥片30g，蔗糖10g，瓊脂18g，水1000ml)上25°C作對峙培養至菌絲相遇，20°C光照繼續培養至菌絲交界處出現黑色子囊殼。挑10個以上的子囊殼至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培基(即PDA培養基，其對菌的選擇性低。配製方法如下稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切成小塊，加水煮爛，用四層紗布過濾，加30g葡萄糖和15g瓊脂，繼續加熱至葡萄糖和瓊脂融化，攪拌混勻，稍冷卻後再補足水分至1000毫升，攪拌混勻，分裝試管，加塞、包紮，121°C滅菌20分鐘後取出試管擺斜面，冷卻後貯存備用)的表面，用接種針擠破子囊殼(或O. 5mg/ml的Molyase酶酶解子囊壁)並輕輕拖拉使子囊中的子囊孢子分離後繼續培養備用。通過以上方法，獲得了雜交F1子囊孢子混合群體，即為篩選前群體。(3)毒性子囊孢子混合群體的獲得。將IRBL 12稻穀用75%酒精消毒，於潔淨的組織培養室中生長。待IRBL 12秧苗生長到5葉期時，用濃度為IO4 IO5個/ml的F1子囊孢子混合群體噴霧接種。接種後的秧苗置於26°C、100%相對溫度、黑暗條件下培養36小時，然後，光照培養5 7天至葉片發病。將病葉用75%的酒精消毒後，置於PDA培養基中培養，若存在明顯雜菌(如細菌等)，則挑稻瘟病菌絲再次培養一次。通過以上方法，獲得對IRBL 12具有毒性的子囊孢子混合群體，即為篩選後群體。(4) DNA提取。按照真菌DNA提取試劑盒(Andybio，貨號M090090)操作手冊提取和純化親本S223和S12、F1子囊孢子混合群體(篩選前群體)和毒性子囊孢子混合群體(篩選後群體)DNA。通過分光光度計測定並計算A260/A280比值，以判斷DNA質量與含量。 (5)毒性基因克隆。按Illumina HiSeq 1000操作流程構建S223和S12、F1子囊孢子混合群體和毒性子囊孢子混合群體基因組文庫、PCR和高通量測序。其中，建庫方式按Fragment的方式進行，4個樣本利用條形碼標籤進行區分。在這4個樣本中，S223和S12的測序通量(Clean Data)為O. 98G和I. STG7F1子囊孢子混合群體和毒性子的囊孢子混合群體的測序通量(Clean Data)分別為152. 43G和133. 45G。稻瘟病菌基因組大約為47M，因此，4個樣本的測序平均覆蓋稻瘟病基因組基因組21. 3,29. 8,3321. I和2907. 5倍。用基因組組裝程序 ABySS (http ://www. bcgsc. ca/pIatform/bioinfo/software/abyss)對兩個親本S23和S12基因組進行初步組裝。比較兩親本基因組間的差異，共發現1316個差異位點。將這些差異位點按完全匹配的方式與F1子囊孢子混合群體和毒性子囊孢子混合群體比較，發現所有等位位點序列都在F1子囊孢子混合群體中存在，但在5%的顯著性水平下，有14個等位位點的兩種序列間比例偏離了 I : I，其餘位點符合I : I的分離比例。將所有1316個位點在F1子囊孢子混合群體中的分離比與毒性子囊孢子混合群體中的分離比進行比較，發現在5%的顯著性水平下，有1212個位點的分離比在兩個群體間沒有差異，另有104個位點的分離比存在顯著差異。進一步將這104個位點在毒性子囊孢子混合群體中的分離比與O : I進行比較，發現其中一個位點的分離比在5%的顯著性水平下，與O : I不存在顯著差異。該位點中，絕大部分毒性親本S223的序列(共2982條)在毒性子囊孢子混合群體中存在，而無毒親本S12的序列在毒性子囊孢子混合群體中只出現了 3次。考慮到在5%的顯著性水平下，2982:3是符合I : O的統計假設的，而且抗性壓力篩選也不太可能完全徹底，因此，接受該位點為對IRBL 12具有毒(無毒)性基因位點的假設。其中，S223中的序列應為毒性座位，其序列為序列表中的SEQ ID NO. I ATTGGCACCTTTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAAGGCGGGCATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTGCCGCGCTAAAAAGGTAAATTGAAACTCTTTAAAACAAATTCGGAAAACAA, S12中的序列應為無毒座位，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 2 ATTGGCACCTTTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAAGGCGGGCTTATATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTGCCGCGCTAAAAAGGTAAATTGAAACTCTTTAAAACAAATTCGGAAAACAA,與前者比較，後者從第78個鹼基的位置插入了4個鹼基TTAT。將以上S12中的序列與組裝的S12基因組序列進行比對，選擇位點前後各20k 的喊基利用 GeneScan 軟體(http://genes, mit. edu/GENSCAN. html)進行基因預測，預測參數採用真菌基因預測的默認參數。包含了 SEQ ID NO. 2序列的基因即為無毒基因，從而獲得無毒基因的全長序列。分別根據無毒基因上遊500bp和下遊500bp鹼基序列，利用Primer5 (Version 5. 00)軟體,設計PCR引物，引物設計的參數選用軟體的默認參數。上遊序列為序列表中的SEQ ID NO. 3 TAGTCGTTAGATAAAAATATATTACCTTTTACCTAATTTTTAATCTCAGGGTTTATCCCTGAAGCCCGCAGTTCCGCAATTGAACCGCGTCGCCGTGGTTCAATTGCGGCTGTATATTATACCTGTGGGTCCAAATACAAATCGCTTCGGTTCAGGTTTGAAACCATTTTGTCGTTTTTCGCCGTTCGCGGGGATGTTAATATATATTAAATAATTAAACAGAAATTTCACTCCCTTATAATAAATTGAATAAAAATCGTAAAAATATACGGTTTGTATATTGGATATAATACTTAGTGTGACATTTGGACCATGAGATCACCAGACCCTAACCCTGACCCTGGACCAACGACCCACCAGGGTGATACCTTTATCGACGTCGCGTCAAGCTCAGAACTTTGTTTGTTTCCTTTCTTCTCCTCAGAGTAGAATCTTCATCGATAGGCGCCAATAGACTAGCTTCCGTGCTATGCTTACCCTGGCCGTGACACGATCCCTGG,下遊序列為序列表中的 SEQ IDNO. 4 ·ATAACGTTAGTGTTGGAATGGAGGGAATCGCGGTCAATTTAACAATAGAGGGATAAATTACGTGTAATGCCGCACAAGCCAGTTGCACGTGACTCACCCGTCCAATTGCGGGTATAAGAAGCAGAGACGTTTAGAAACTCACCTTTAAACGGTTTAATAAACGAAATGTAATAAATACCTTTATATCCGTATAATAACGTTTTGTTAATGGATCGACATTACAAAAGGCCTATAAACTTGAGCTAATGCTATTTAAACAATACAAAAAAGCAAAGCAAATAAATTAAACGTTAATATTATTACGGCCAGGCATAGATTGGAGAACCTCAATATATTAGCCGCTATCGACGAAAATTCTAAACTGAAAAAAAAGAGAAATTACAATTAACGGCGCATTGGAAAACGCGTTTAAATCCGGGGTCAGTGGACCCCTTTGTCCAATCTTTAATTTAATTTGGTTGGTAAAACCGAATCGTAATTTTAAAGGTGGGTTGTTACGA ;其中正向引物為序列表中的 SEQ IDNO. 5 ATCACCAGACCCTAACCC ;反向引物為序列表中的 SEQ ID NO. 6 TCCCTCCATTCCAACACT,於S12親本中擴增全長基因序列。PCR擴增體系按試劑盒DreamTaq Green PCR MasterMix(2X) (K1081, fermentas)推薦體系進行，即含PCR混合物50 μ 1，S12模板15ng，引物
2μ I (濃度0. 5 μ M/ μ L)，加純水至總體積為100 μ I。擴增程序如下94°C預變性4分鐘；940C，I分鐘，520C，3分鐘，720C，3分鐘，循環44次；72°C延伸8分鐘。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠檢測。PCR產物按瓊脂糖凝膠回收試劑盒(K0691 ,Fermentas)操作手冊回收並純化擴增片段並測序，獲得控制S12親本中對IRBL 12具有無毒性的基因的序列為序列表中的 SEQ ID NO. 7 ATGCTTTTTTATTCATTGTTATTTTTTTTTCACACCGTTGCGATTTCGGCCTTCACCAACATTGGCACCTTTTCACACCCAGTTTACGATTACAATCCAATTCCAAACCATATCCACGGAGATTTAAAAAGGCGGGCTTATATTGAACGCTATTCCCAATGTTCAGATTCGCAGGCCTCCGAAATTCGTGCCGCGCTAAAAAGGTAAATTGAAACTCTTTAAAACAAATTCGGAAAACAATGTTAAATATTTTGTTTAGTTGCGCCGAGCTCGCCTCGTGGGGCTATCACGCCGTTAAAAGTAACAATCGGTTATTTAAATTAATCTTTAAAACTGACAGCACAGATATTCAAAACTGGGTTCAAAATAATTTTAACGAAATTTACAAGGAATGTAACAGGGACGCGGACGAAATTTCTCTAACCTGCCACGATAAAAATGTTTATACGTGCGTCCGAGAAGGAGTTCATAATTTGGCGTATGCACTTATTAACGAAAAAGAAATTGTTATATGCCCTCCTTTCTTCAACAACCCCGTAAACAGCAGGGAAATTACTGCCGGTAACCAAGATACAATTATATTACATGAAATGGTGCATATAATTTTAAGTAAGTTTGCTTTTACAAATTGATAAAACATTTACAAAAGTTTATTTATAAAAATTTTCAAAAACTAAAAATTCAAATTTTTATTTAGAAGAGTGGAAAGATTATGGTTGCGAATGGGATGGGATTCACAAGTAAGTTGTCGAAAAACAAAAT
GCTGAATGTTGTTTTATATTGATAAATTCTAATTAATATTAAGATTGGATAGTACAGAAAGTATTAAAAACCCCGAC
AGTTATGCTATTTTTGCACAATGTGCACGTTATAAATATTGTTAA(6)功能互補驗證將上述基因連接進入根癌農桿菌Ti質粒載體，與S223親本共培養，篩選陽性菌株，接種IRBL 12，植株表現為不感病，表明所克隆的基因控制了 S12親本對IRBL 12的無毒性。本發明以測序為基礎，可用於任何微生物物種，直接克隆基因本身，避免了大量的微生物小種分離與鑑定工作。採用本發明的方法，工作量大為減少，速度大為加快，而且降低了風險。 以上所述的實施例，只是本發明較優選的具體實施方式
的一種，本領域的技術人員在本發明技術方案範圍內進行的通常變化和替換都應包含在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種微生物基因克隆方法，其特徵在於，包括以下步驟用目標性狀有差異的菌株做親本，通過雜交構建分離群體；通過抗性植株、農藥、溫度、營養元素對分離群體設置選擇壓進行自動篩選，獲得篩選後群體；對兩個親本、篩選前和篩選後群體進行基因組高通量測序；通過初步直接組裝並比對，獲得親本間差異位點，並將親本間差異位點與篩選前和篩選後的群體基因組按完全匹配的方式進行比對，尋找在親本與篩選前存在、但在篩選後消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點；通過與親本基因組比對獲得基因的全長序列，並利用PCR擴增克隆目標基因，按遺傳互補實驗驗證所克隆目標基因的功能。
2.根據權利要求I所述的微生物基因克隆方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)構建分離群體利用分別含有相對性狀的親本雜交後分離構建分離群體； (2)群體自動篩選按目標性狀的特點，選擇適合類型的選擇壓，對分離群體進行自動篩選，獲得篩選後群體； (3)DNA提取提取2個親本、篩選前和篩選後2個混合群體的基因組DNA； (4)目標位點的確定按高通量測序流程分別構建親本、篩選前和篩選後基因組DNA文庫，PCR並高通量測序；按直接組裝，初步構建2個親本全基因組，通過比對，獲得親本間差異位點；按完全匹配的方式，將差異位點與篩選前和篩選後的混合基因組進行比對，獲得在親本和篩選前群體中存在、但在篩選後群體中消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點，若候選基因位點為多個，採用PCR或雜交方式在篩選前和篩選後的群體DNA中富集候選位點，對候選位點重測序，最終確定目標基因； (5)目標基因克隆與功能驗證通過比對親本基因組的方式獲得基因的全長序列，PCR擴增克隆目標基因，按通用的遺傳互補實驗驗證所克隆基因的功能。
全文摘要
本發明公開了一種微生物基因克隆方法，該方法包括用目標性狀有差異的菌株做親本，雜交構建分離群體；對分離群體設置選擇壓進行自動篩選，獲得篩選後群體；對兩個親本、篩選前和篩選後群體進行基因組高通量測序；通過初步直接組裝並比對，獲得親本特異位點，將親本特異位點與篩選前、篩選後的群體基因組按完全匹配的方式進行比對，尋找在親本與篩選前存在、在篩選後消失的位點，該位點為控制目標性狀的候選基因位點，通過與親本基因組比對獲得基因的全長序列，並利用PCR擴增克隆目標基因，按遺傳互補實驗驗證所克隆目標基因的功能。本發明直接克隆基因本身，避免了大量的微生物小種分離與鑑定工作。本發明的方法工作量小，速度快，而且風險低。
文檔編號C12N15/10GK102899313SQ20111021642
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者彭海, 張靜, 章偉雄 申請人:江漢大學