一種醬香型白酒大曲的鑑定方法

2023-07-08 04:11:21

專利名稱：一種醬香型白酒大曲的鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種白酒大曲中微生物的提取方法，特別是醬香型白酒大曲中真菌 DNA和細菌DNA的提取方法以及用該方法在鑑定白酒方面的應用。
背景技術：
大曲是指含有大量能發酵的活微生物或酶類的糖化發酵劑。制曲技術是我國特有 的一份民族遺產，在曲與酒的關係上，曲是佔先導地位的。俗語說「有美酒必備佳曲」，「曲為 酒骨」。而且更重要的是關係到香型風味的重要成因。曲中的微生物不同，香型就不同，選 育優良菌種應用於白酒釀造一直是行業技術工作的重點。目前醬香白酒大曲中微生物的研究，主要是應用傳統微生物分離、純化、鑑定等方 法。傳統的研究方法是首先從特定自然環境(如大曲房)中取樣，採用模擬自然環境的各 種培養基和條件進行分離培養，通過純培養獲得菌株後，再對其表型特徵、細胞的性質(形 態學、生理生化反應和細胞組成成分結構的觀察)進行觀察收集，同時進行一系列繁雜的 形態特徵和生理生化實驗，才能對其特性進行描述，這種方法又被稱作經典方法。應用傳統方法可以分離培養的微生物不一定是優勢菌群，只是它們適合併能夠在 人工培養條件下被分離純化，不能動態反映大曲微生物菌群的生長狀態。在實驗技術上，大 曲研究仍停留在細胞水平，主要研究細菌、黴菌、酵母和放線菌單一的菌落形態和純種的生 長特性。在實驗結果上，不能反映分離物間的系統發育關係，不能獲得微生物多樣性的真正 概貌。因此傳統的依靠培養的方法制約了人們對微生物生態的客觀認識，對於人們正確認 識微生物群落結構與功能，正確認識微生物資源，正確開發並利用這些資源造成了嚴重的 障礙。變性梯度凝膠電泳(DGGE)最初被用於基因的突變檢測，任意位點的單鹼基突變 的DNA片段和原始的DNA片段能被分開，經過序列測定和比較就可以找出突變的位點。變 性梯度凝膠電泳對不同DNA片段的分離原理是變性梯度凝膠電泳(DGGE)中同樣長度但具 有不同序列的DNA片段能夠被分離，因為在含有呈線形增加梯度變性劑(尿素和甲醯胺) 的混合物的聚丙烯醯胺凝膠電泳中部分解鏈的雙鏈DNA分子的電泳遷移率降低。具有不 同序列的DNA分子有不同的解鏈行為，將在凝膠的不同位置停止遷移。變性梯度凝膠電泳 (DGGE)自1993年以來被用於環境微生物領域來研究環境樣品中微生物的群落結構，它是 建立在PCR反應對環境樣品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核 生物)等保守基因區間的DNA片斷的擴增的基礎上，這些被擴增出的DNA片斷可以代表所 有不同微生物的信息，這些使用同一引物對擴增出的不同微生物的DNA片斷具有相同的鹼 基數，因此一般的電泳無法將它們分離開，這就為後續的進一步研究提出了新的問題。由 於變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以將不同鹼基順序的相同大小的DNA片段予以分離，所以 PCR-DGGE可以對環境樣品中的微生物群落進行研究。目前，國內外尚無關於運用PCR-DGGE技術進行醬香白酒大曲微生物群落構成研 究的相關報導。然而醬香大曲與城市汙水廠汙泥和農田土壤的化學、物理性質高度異質，微生物數量和種群分布也明顯不同，這就決定了不同環境下的樣品在進行微生物群落構成分 析時存在差異。由於醬香高溫大曲樣品中所含的成分複雜，含有多量的蛋白質、胺基酸和多 糖等成分，微生物種類繁多，從中提取出高質量的微生物總DNA的難度較大。經過多次的實 驗最終找到一種適合醬香高溫大曲的總DNA的提取方法，為了除去蛋白，以及多糖等雜質， 本發明的方法只用氯仿抽提即可，用70%冷乙醇衝洗所得沉澱，節省時間，成本低，可以對 醬香大曲中的各種菌的總DNA無偏好的進行提取。找到了利用PCR-DGGE技術對醬香白酒 大曲進行鑑定的方法。本發明通過DNA的提取發現了醬香型白酒大曲中的優勢菌群，包括真菌優勢菌群 和細菌優勢菌群。本發明的發現可以用於白酒的鑑定，如將待測白酒樣品通過提取總DNA確定優勢 菌群，和已經確定的白酒優勢菌群(材料裡有)進行比對，以判斷待測白酒的種類。

發明內容
本發明提供一種白酒大曲的鑑定方法，其特徵在於，包括以下步驟1)取已知類型的大曲樣品；用方法1進行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜 進行聚類及半定量分析；用方法2進行總DNA序列測定，確定優勢真菌和細菌菌群結構。2)取已知類型的大曲樣品；用方法1進行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜 進行聚類及半定量分析；用方法2進行總DNA序列測定，確定優勢真菌和細菌菌群結構。3)將待測樣品與已知類型的大曲的優勢菌群比對，兩者相符為同類型。其中所述方法1包括以下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA;以總DNA為模板， 進行PCR擴增；進行變性梯度凝膠電泳，EB染色後得到DGGE指紋圖譜；其中所述方法2包括以下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA ；以總DNA為模板， 進行PCR擴增；進行變性梯度凝膠電泳，根據方法1的指紋圖譜聚類及半定量分析結果，回 收優勢條帶，並以此為模板，進行PCR擴增，對目的片段進行序列測定；經過以上測定方法測定，醬香白酒大曲中細菌的優勢菌群是 Unculturedbacterium, Virgibacillus sp. , Bacillus sp.禾口 Thermoactinomyces sp.。 醬香白酒大曲中真菌的優勢菌群是Saccharomyces sp. , Saccharomycopsis fibuligera strain和Mucor sp.。四個優勢細菌的菌量比例是2 :1:1: 2 ；優勢真菌菌量比例是 1:1: 4;優勢細菌優勢真菌的菌量比是4 1.5。本發明特別適合醬香白酒大曲的鑑定。本發明的方法，其中所述總DNA可以使樣品中真菌的總DNA，也可以是細菌的總 DNA，真菌DNA提取方法是提取緩衝液提取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉澱過夜 』離 心。其中提取緩衝液的加量是樣品量的3-6倍，所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙 醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍。細菌DNA提取方法是提取緩衝液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提兩 次；異丙醇沉澱過夜。其中提取緩衝液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和 25mg/mL溶菌酶的加量分別是50-100 μ 1和0. 5_lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量 是上清液體積的0. 6-0. 7倍。
本發明的方法中，方法1中所述擴增包括，以樣品的真菌的總DNA或細菌的總DNA 為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增，擴增結束後，對目的片段進行回收及純化。對於真菌總DNA的PCR擴增，其專用引物為(ie0A2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 『和 Geoll :5 『 -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 『。PCR 擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增18S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增； PCR反應條件為94°C預變性4min，然後在94°C變性45s, 50°C _55°C引物復性45s，72°C引 物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋後作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然後在94°C變性45s， 50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸IOmin0對於細菌總DNA 的 PCR 擴增，其專用引物為 8-27F 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和1378-1401R 5，-TACCTTGTTACGACTT-3，。PCR擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應體系進行擴增；PCR反應條件為94°C預變性％iin，然後在94°C變 性45s，50°C _55°C引物復性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取 其產物進行100倍稀釋後作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件 為94°C預變性4min，然後在94°C變性45s，50_55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循 環 30-35 次，72°C終延伸 IOmin0本發明所述序列測定，是對純化的目的片段進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，其點 樣量為600-1000ng，用E.B(溴化乙錠)染色後得到測序用指紋圖譜。為避免條帶缺失，可 先通過預試得到DGGE適宜的丙烯醯胺濃度梯度範圍及所用時間。製備聚丙烯醯胺變性梯度凝膠的變性梯度為20^,40^,60%,80%，使用的 電泳緩衝液為0. 5XTAE，上樣量為200ng，電壓80-120V，60°C，電泳10h，溴化乙錠染色 20-30min，可得出清晰準確的DGGE圖譜(見圖1)。得出製備聚丙烯醯胺變性梯度凝膠的變 性梯度為35% 60%。將電泳時間分別確定為4hJh，8h，10h, 12h，14h，16h，每隔4h進樣一次，上樣量為 200ng，電壓80V，溫度60°C，得到DGGE譜圖(見圖2)。可以確定所用時間可以為8_12h。本發明所述對真菌DNA進行的DGGE指紋圖譜聚類及半定量分析，可確定醬香白酒 大曲不同生產時期細菌菌群結構的關係及各個條帶所代表的真菌在全部優勢真菌菌群中 的比例，即相對豐度。對細菌DNA進行的DGGE指紋圖譜聚類及半定量分析，可確定醬香白 酒大曲不同生產時期細菌菌群結構的關係及各個條帶所代表的細菌在全部優勢菌群中的 比例，即相對豐度；兩種微生物均可用Bio-ID++軟體進行半定量分析，計算公式為相對豐度Pi ) =lOOXODi/OD，其中ODi為選定條帶i的光密度，OD為全部條帶的光密度之和。本發明方法2中，根據DGGE指紋圖譜聚類及半定量分析結果，回收相對豐度高於 的優勢條帶，並以此為模板，在不含GC夾子的專用引物的引導下進行PCR擴增，擴增結
束後，對目的片段進行回收、純化及測序。其中對於真菌DNA的PCR擴增，其專用引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3'Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3『。為獲得更好的檢測效果，所述第二步的上 遊引物的5，端還添加有40個GC夾子，添加有40個GC夾子的上遊引物序NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3'。其中對於細菌DNA的PCR擴增，其專用引物為968FGC :5，-CGC CCG GGG CGCGCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3'禾P R1041 5』 -CGGTGTGTACAAGACCC-3』。為獲得更好的檢測效果，所述第二步的上遊引物的5』端還添 加有40個GC夾子，添加有40個GC夾子的上遊引物序968TOC :5，-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3，。本發明所述比較可採用Blast程序在線(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ blast/)對測序結果進行序列比對分析，確定大曲優勢菌群結構。本發明的鑑定方法適用於所有釀造用曲，如釀酒用的高溫大曲，中溫大曲，低溫大 曲，小曲等及其醬油，醋等釀造過程中所有微生物的菌群分析和優勢菌群的確定。優選適用 於釀醬香高溫大曲，濃香高溫曲，中溫曲等。進一步優選適用於醬香型的白酒大曲，最優選 適用於醬香型白酒高溫大曲。本發明的優點在於採用本發明直接提取醬香大曲樣品中的總DNA進行鑑定，避免了在傳統培養過程 中的篩選和富集作用，能更直接真實地反應大曲樣品中的微生物多樣性及種群分布情況， 較傳統培養、分離和鑑定也更為簡易、準確，尤其在大曲的鑑定上利用優勢微生物的確定就 可以對大曲進行鑑定。針對大曲有機物質含量比環境中的多且成分複雜，在DNA提取過程中酚-氯 仿-異戊醇(體積比，25 24 1)抽提，異丙醇沉澱過夜，就能很好的提取總DNA，不經試 劑盒純化直接用於後續的分子生物學分析。可以對醬香大曲中的各種細菌的總DNA無偏好 的進行提取。大曲微生物中的數量一般在IO6-IO7,比環境中土壤和汙泥中的數量相對少一些， 因此進行兩次PCR擴增；通過梯度凝膠電泳技術，可在適宜條件下對不同菌群實施分離。用 快速銀染法獲得DGGE指紋圖譜，通過E. B染色獲取測序用指紋圖譜，在一定程度上克服了 可恢復性銀染技術的不確定性；結合Bio-ID++軟體對優勢菌群進行半定量分析，以及通過測序比對完成的菌群 定性分析，結果準確、可靠，逐步克服了常規的人工培養法對大曲菌群結構進行分析的不 足。此方法除了可以醬香白酒大曲進行鑑定外，還可以對不同區域不同大曲種類進行 微生物群系分析。克服了需要感官和各種理化指標來進行模糊判斷的大曲鑑定方法。


圖1不同變性濃度的DGGE譜2不同時間下的DGGE譜3醬香高溫大曲生產過程及不同質量成品曲中細優勢真菌菌群及PCR-DGGE譜 圖E—出倉曲B—黑曲 Y—黃曲 W-白曲 S— 二次翻曲 0— —次翻曲I—入倉曲 M-母曲圖4醬香高溫大曲生產過程中細菌的優勢菌群及PCR-DGGE譜圖
圖5醬香成品曲的PCR-DGGE譜圖Y-黃曲 M-母曲 B-黑曲 W-白曲圖6不同大曲樣品的PCR-DGGE譜圖
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1一、真菌 DNA1、準備樣品對貴州茅臺鎮金士酒業有限公司醬香白酒大曲生產車間生產的大曲進行取樣，在 制曲過程中按一個周期中的不同時間取樣，本實驗用的醬香高溫大曲樣品是在貴州茅臺鎮 金士酒業有限公司大曲生產車間取樣。2、總DNA的提取及純化取3-6g 大曲 +25mL 磷酸緩衝液(ρΗ8· 0) +0. 1 % PVPP，+ImL 土 溫(80 或 60)搖 床30min,超聲6-7min,靜置2_5min，，沉澱低速(IOOOrpm)離心5min，取出上清，混合， 高速(9000rpm)離心8min，去除上清，再加入磷酸緩衝液(PVPP)，25mL，打散後高速離心 (9000rpm) 8min，去上清。加10-15mL提取液(提取液成分是100mM Tris-HCl (三(羥甲基)氨基甲烷鹽 酸鹽)ρΗ8· 0，IOOmM sodium EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)ρΗ8· 0，200mM NaCl,l% PVP,2% CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)pH8.0)，搖勻。在180run/min，37°C條件下振蕩30min，加 2mL 20% SDS繼續振蕩lOmin。65°C水浴Ih後6000g離心15min，收集上清液，加0. 5倍體 積PEG (聚乙二醇)(30% ) -NaCl (1. 6mol/L)，混勻後室溫下靜止2h，在IOOOOg離心20min, 加4MNaAC(pH5.4)至終濃度0. 3mol/L，用酚-氯仿-異戊醇(體積比，25 24 1)抽提一 次，0. 6倍體積異丙醇沉澱過夜，12000g離心20min，沉澱乾燥後，20-200 μ L TE溶解，-20V 冰箱中保存備用。基因組DNA的純化方法為採用美國OMEGA BIO-TEK公司生產的PCR產物純化試劑 盒，按照用戶使用說明來進行。3、PCR擴增及產物回收、純化對純化後的DNA進行PCR擴增，第一步擴增採用的引物為GeoA2 5 『 -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3『和 Geo11 5 『 -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3『第二步擴增採用的引物為NS31_GC 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3 『 Glo 1:5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3『。以上引物全部由上海生工生物工程技術有限公司合成。先加入擴增18S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增，50 μ 1的PCR反 應體系組成如下=IOng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每種引物、1 μ 1 dNTPs、5 μ 1的 10 X PCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2U. 5-3U 的 Taq DNA 聚合酶，適量的雙蒸水補足 50 μ 1。 PCR反應條件為94°C預變性％iin，然後在94°C變性45s，50°C引物復性45s，72°C引物延伸 1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋後作為模板，以18S rDNA為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然後在94°C變性45s，55°C引物復 性45s，72°C引物延伸lmin，循環35次，72°C終延伸IOmin, 16S rDNA全長序列擴增產物用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；取其產物進行100倍稀釋後作為模板，以18S rDNA為目標進行 擴增，PCR反應條件為94°C預變性4min，然後在94°C變性45s，55°C引物復性45s，72°C引 物延伸lmin，循環35次，72°C終延伸lOmin，目的產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩 衝液為IXTAE緩衝液。取全部樣品進行2%瓊脂糖凝膠電泳(80V，50min)，在紫外燈下切膠回收230bp的 目的條帶，用CyCle-Pure DNA純化試劑盒並按照試劑盒說明書對目的片段進行純化，純化 後取3ul純化產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果表明獲得了純度較高的目的 片段。4、變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析採用DCODE 系統(BIO-RAD)構建DGGE指紋圖譜，具體方法為將等量的步驟三獲 得的樣品的18S擴增純化產物(約230bp)混合，取200ng用10%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳 進行分離(丙烯酞胺濃度0-100%，電泳緩衝液0.5 χ TAE，80V，Wh)，然後切下目的泳道區 域，用E. B對變性聚丙烯酞胺凝膠染色，用Vilber凝膠成像掃描系統對銀染條帶進行照像， 結果如圖1所示，對圖1進行分析，確定適宜的DGGE丙烯醯胺濃度範圍為35% -60%。再 取混合DNA樣品，按IOOng點樣量、200ng點樣量(3個平行)及300ng點樣量在上述丙烯醯 胺適宜的濃度範圍內用10%變性聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，其餘操作同上。在Vilber 凝膠成像掃描系統中對銀染條帶進行照像，結果顯示IOOng點樣量的泳道損失2條條帶， 200ng點樣量與300ng點樣量所得到的指紋圖譜一致，並且200ng點樣量3個平行樣的指紋 圖譜完全一樣，表明DGGE技術具有可重複性。取相同的點樣量200ng，做DGGE譜圖，找出最 佳電泳時間，見圖2，圖中可以看出IOh時，條帶最清晰，因此選用DGGE時間為10h。上述預試結果表明，將各樣品18S擴增純化產物在10%聚丙烯變性膠中分離(丙 烯酞胺濃度35% -60%，電泳緩衝液0. 5-1 χ TAE)，100V, 12h，樣品點樣量200ngDNA(重複 I)、另設一組點樣量IOOOng DNA(重複II)。將重複I所在泳道區域切下，用快E. B染法對其進行染色。在vilber凝膠成像掃 描系統中對染色條帶進行照像，照相結果及其模式圖見附圖3所示，用BiO-ID++軟體對該 DGG E指紋圖譜進行半定量分析，確定醬香高溫大曲生產過程中菌群結構的關係及各個條 帶所代表真菌群在全部優勢菌群的比例，即相對豐度，相對豐度？「％) = 100 X0D./0D其中ODi為選定條帶i的光密度，OD為全部條帶光密度之和。表1 ISSrDNA擴增純化產物DGGE指紋圖譜中醬香高溫大曲在生產過程中及不同 質量成品曲真菌優勢菌群相對豐度(％ )條帶位置E B Y W S 0 I M1———————5. 02———9. 5——9. 5—3——————4. 5—49. 0——9. 5—9. 59. 5—5—————5. 0——6————9. 0 ———
7— — 6. 5 — — — — —將重複II所在泳道區域切下，按E. B染色。5、優勢條帶的回收、測序與序列比對分析在紫外燈下將重複II所在泳道的明顯條帶用無菌手術刀小心割下，並在銀染 圖譜中標記相應位置，經無菌水衝洗3遍後放入1. 5mLEP管中，用菌槍頭搗碎，加入30ul ddH20浸泡5小時。將EP管12000rpm離心5min，取上清作為PCR模板，在不帶GC夾子的 針對18S rDNA片段設計的特異引物NS31 5 『-TGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3，；下遊引物Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3 』的引導下，進行PCR擴增，50ul PCR反應體系為10ng的 DNA 模板(一般用 1 μ 1)、50pmol 每種引物、1 μ 1 dNTPs、5y 1 的 10 X PCRbuffer、2. 5mmol/L 的MgCl2、3U的Taq DNA聚合酶，適量的雙蒸水補足50 μ 1。採用巢式PCR反應程序94°C預 變性4min,然後在94°C變性45s, 50°C引物復性45s, 72°C引物延伸1. 5min,循環30次，72°C 終延伸IOmin ；反應結束後取3ul反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用CyCle-Pure DNA試劑盒對目的片段進行回收及純化，並進行測序。測序由天津生物晶片公司進行。採用Blast 程序在線(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進行序列比對分 析，分析結果見表2表2醬香大曲生產過程中及不同質量成品曲的DGGE指紋圖譜對應單個條帶的序 列比對分析
權利要求
1.一種白酒大曲的鑑定方法，其特徵在於，包括以下步驟1)取已知類型的大曲樣品；用方法1進行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜進行 聚類及半定量分析；用方法2進行總DNA序列測定，確定優勢真菌和細菌菌群結構；2)取已知類型的大曲樣品；用方法1進行DGGE指紋圖譜測定，對DGGE指紋圖譜進行 聚類及半定量分析；用方法2進行總DNA序列測定，確定優勢真菌和細菌菌群結構；3)將待測樣品與已知類型的大曲的優勢菌群比對，兩者相符為同類型；其中所述方法1包括以下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA ；以總DNA為模板，進行 PCR擴增；進行變性梯度凝膠電泳，EB染色後得到DGGE指紋圖譜；其中所述方法2包括以 下步驟取大曲樣品，提取樣品的總DNA ；以總DNA為模板，進行PCR擴增；進行變性梯度凝 膠電泳，根據方法1的指紋圖譜聚類及半定量分析結果，回收優勢條帶，並以此為模板，進 行PCR擴增，對目的片段進行序列測定。
2.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中所述總DNA包括樣品中真菌和細菌的總DNA。
3.權利要求2的鑑定方法，其特徵在於，其中所述真菌總DNA提取方法是提取緩衝液 提取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉澱過夜；離心。其中提取緩衝液的加量是樣品量的3-6 倍，所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍；細菌總DNA提取方法是提取緩衝液提取一次，加蛋白酶K和溶菌酶，氯仿抽提兩次，異 丙醇沉澱過夜；其中提取緩衝液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/mL 溶菌酶的加量分別是50-100 μ 1和0. 5-lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量是上清液 體積的0. 6-0. 7倍。
4.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中所述方法1中所述擴增包括，以樣品的真 菌的總DNA或細菌的總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增，擴增結束後，對目 的片段進行回收及純化；對於真菌總DNA的PCR擴增，其專用引物為GeoA2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3『 和Geoll 5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3『 ；PCR擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增 18S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增；PCR反應條件為94°C預變性％iin，然後 在94 V變性45s，50 V -55 V引物復性45s，72 °C引物延伸1. 5min,循環30次，72 V終延伸 IOmin ；取其產物進行100倍稀釋後作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR 反應條件為94°C預變性％iin，然後在94°C變性45s，50_55°C引物復性45s，72°C引物延伸 lmin，循環 30-35 次，72°C終延伸 IOmin ；對於細菌總DNA的PCR擴增，其專用引物為8-27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1378-1401R 5' -TACCTTGTTACGACTT-3，。PCR 擴增條件為巢式 PCR 擴增先加入擴增 16S rDNA全長的引物和反應體系進行擴增；PCR反應條件為94°C預變性％iin，然後在94°C變 性45s，50°C _55°C引物復性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取 其產物進行100倍稀釋後作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件 為94°C預變性4min，然後在94°C變性45s，50_55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循 環 30-35 次，72°C終延伸 IOmin0
5.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中所述序列測定，是對純化的目的片段進行 變性梯度凝膠電泳(DGGE)，其點樣量為600-1000ng，用Ε. B (溴化乙錠)染色後得到測序用指紋圖譜；為避免條帶缺失，可先通過預試得到DGGE適宜的丙烯醯胺濃度梯度範圍及所用 時間。製備聚丙烯醯胺變性梯度凝膠的變性梯度為20 %，40 %，60 %，80 %，使用的電泳緩衝 液為0. 5XTAE，上樣量為200ng，電壓80-120V，60°C，電泳10h，溴化乙錠染色20_30min，可 得出清晰準確的DGGE圖譜，得出製備聚丙烯醯胺變性梯度凝膠的變性梯度為35% 60%;將電泳時間分別確定為4h，6h，8h，10h，12h，14h，16h，每隔4h進樣一次，上樣量為 200ng,電壓80V，溫度60°C，得到DGGE譜圖，可以確定所用時間可以為8_12h。
6.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中所述對真菌DNA進行的DGGE指紋圖譜聚 類及半定量分析，可確定醬香白酒大曲不同生產時期細菌菌群結構的關係及各個條帶所代 表的真菌在全部優勢真菌菌群中的比例，即相對豐度；對細菌DNA進行的DGGE指紋圖譜聚 類及半定量分析，可確定醬香白酒大曲不同生產時期細菌菌群結構的關係及各個條帶所代 表的細菌在全部優勢菌群中的比例，即相對豐度；兩種微生物均可用Bio-ID++軟體進行半定量分析，計算公式為相對豐度卩^^ )= lOOXODi/OD，其中ODi為選定條帶i的光密度，OD為全部條帶的光密度之和。
7.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中方法2中，根據DGGE指紋圖譜聚類及半定 量分析結果，回收相對豐度高於的優勢條帶，並以此為模板，在不含GC夾子的專用引物 的引導下進行PCR擴增，擴增結束後，對目的片段進行回收、純化及測序；其中對於真菌DNA的PCR擴增，其專用引物為NS31-GC 5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCMGTCTGGTGCC-3' Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3『。為 獲得更好的檢測效果，所述第二步的上遊引物的5』端還添加有40個GC夾子，添加有40個 GC 夾子的上遊引物序 NS31-GC 5 『 -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGG GCAAGTCTGGTGCC-3『；其中對於細菌DNA的PCR擴增，其專用引物為968FGC 5，-CGC CCG GGG CGCGCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3'禾Π R1041 5』 -CGGTGTGTACAAGACCC-3』 ；為獲得更好的檢測效果，所述第二步的上遊引物的5』端還添 加有40個GC夾子，添加有40個GC夾子的上遊引物序968TOC :5，-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCT TAC-3，。
8.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中所述比較可採用Blast程序在線 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)對測序結果進行序列比對分析，確定大曲優勢菌 群結構。
9.權利要求1的鑑定方法，其特徵在於，其中所述鑑定方法適用於所有釀造用曲，如釀 酒用的高溫大曲，中溫大曲，低溫大曲，小曲等及其醬油，醋等釀造過程中所有微生物的菌 群分析和優勢菌群的確定；優選適用於釀醬香高溫大曲，濃香高溫曲，中溫曲等；進一步優 選適用於醬香型的白酒大曲，最優選適用於醬香型白酒高溫大曲。
10.權利要求1所述的鑑定方法，其特徵在於醬香白酒大曲中細菌的優勢菌群是: Uncultured bacterium，Virgibacillus sp.，Bacillus sp.禾口 Thermoactinomyces sp. 0 醬香白酒大曲中真菌的優勢菌群是Saccharomyces sp.，Saccharomycopsis fibuligera strain 禾口 Mucor sp.。
11.權利要求1所述的鑑定方法，其特徵在於醬香白酒大曲中細菌的優勢菌群中，四個優勢細菌的菌量比例是2 :1:1: 2;優勢真菌菌量比例是1 1 4;優勢細菌優勢 真菌的菌量比是4 1.5。
12. 一種白酒大曲總DNA DGGE指紋圖譜的測定方法，該方法包括以下步驟1)取大曲樣品，2)提取樣品的總DNA；3)以總DNA為模板，進行PCR擴增；4)進行變性梯度凝膠電泳，EB染色後得到DGGE指紋圖譜。
全文摘要
本發明涉及一種白酒大曲中微生物的提取方法，特別是醬香型白酒大曲中真菌DNA和細菌DNA的提取方法以及用該方法在鑑定白酒方面的應用。
文檔編號C12R1/85GK102071249SQ20091022870
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月25日 優先權日2009年11月25日
發明者張春輝, 李季, 李長文, 梁慧珍, 閆希軍 申請人:貴州仁懷茅臺鎮金士酒業有限公司