中期因子蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置的製作方法

2023-07-08 01:24:41 1

專利名稱：：中期因子蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物
技術領域：
的蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置，具體是一種中期因子蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置。
背景技術：
：軟骨是一種無血管的連接組織，分布在全身的各個部位。它由軟骨細胞和細胞外基質構成，軟骨基質由軟骨細胞分泌並由其維持。根據形態學的標準及膠原蛋白和彈性蛋白的含量，可將軟骨組織分為三類透明軟骨，彈性軟骨和纖維軟骨。透明軟骨如鼻隔，關節軟骨，氣管和支氣管；彈性軟骨如耳和會厭；纖維軟骨如半月板，椎間盤。Naumann，A等在《JournalofHistochemistryandCytochemistry》(組織化學與細胞化學雜誌)2002年第50期10491058頁發表了題為《Immunochemicalandmechanicalcharacterizationofcartilagesubtypesinrabbit》(兔軟骨幾禾中組織的免疫組織化學和機械特徵研究)一文中，文中評述，透明軟骨主要含有II型膠原，彈性軟骨則含有彈性蛋白，而纖維軟骨主要含有I型膠原。上述軟骨組織中關節軟骨和椎間盤在全身運動中發揮重要的作用。關節軟骨和椎間盤的細胞外基質平衡依賴於關節軟骨細胞和椎間盤細胞的合成代謝和分解代謝。當軟骨基質平衡打破時，軟骨組織失去軟骨基質並逐漸失去正常的生理功能，最終導致關節和椎間盤疾病，例如骨關節炎和椎間盤退變。由於軟骨自身修復能力十分有限，目前多種用於改善軟骨再生的臨床方法和實驗手段還不能有效滿足修復受損傷軟骨的臨床治療需要。對受損傷軟骨組織的生物學治療方法在將來有可能成為慢性傳統治療方法和主要重建外科手術方法的有效替代。但這些生物治療方法都依賴於生長因子的使用。目前，很多細胞因子被深入地研究，主要研究其對軟骨細胞的生長、分化和對軟骨基質的合成等方面的作用，例如成纖維細胞生長因子(FGFs)，胰島素樣生長因子-l(IGF-1)，轉化生長因子-e(TGF-e)，4軟骨源形態發生蛋白(CDMPs)，骨形態發生蛋白(BMPs)和連接組織生長因子(CCN2/CTGF)。Shida，J等在《JournalofOrthopaedicResearch》(整形外科研究雜誌)2002年第277期74937500頁發表了題為《Regulationofosteoblast,chondrocyte,andosteoclastfunctionsbyfibroblastgrowthfactor(FGF)-18incomparisonwithFGF-2andFGF-IO》(成纖維生長因子-18與成纖維生長因子-2和成纖維生長因子-10對成骨細胞，軟骨細胞和破骨細胞的功能調節的比較)一文，文中評述，如FGF-2和FGF-18通過關節腔注射給藥，FGF-2可以促進年輕大鼠的關節軟骨增大，但同時也能促進間充質細胞的增殖，並覆蓋在關節軟骨表面。Ellsworth,J.L等在《OsteoarthritisandCartilage》(骨關節炎與軟骨)2002年第10期308320頁發表了題為《Fibroblastgrowthfactor-18isatrophicfactorformaturechondrocyteandtheirprogenitors》(成纖維生長因子18是成熟軟骨細胞及其祖細胞的營養因子)一文，文中評述，通過腺病毒表達的FGF-18可以促進注射病毒部位周圍軟骨細胞的表層形成，但對周圍的小鼠耳彈性軟骨無影響。因此，尚待發現一種生長因子可以促進體內軟骨組織的生長，而不促進其他類型細胞的增殖。軟骨組織工程是一種針對軟骨疾病和損傷所出現的技術。軟骨細胞自體移植(ACT)技術已用於臨床上治療顱面部和關節軟骨損傷。迄今為止，ACT技術在全球範圍內已治療了超過12，000例全層軟骨缺陷的病人。對於軟骨組織工程來說，主要面臨的挑戰是要獲取足夠數量的軟骨細胞以填充相應的軟骨缺陷部位。由於體內軟骨細胞數量較少，只佔軟骨組織的510%，因此在臨床使用前需要對其進行體外擴增。Brittberg，M等在《NewEnglandJournalofMedicine》(新英格蘭醫學雜誌)1994年第331期889895頁發表了題為《Treatmentofdeepcartilagedefectsinthekneewithautologouschondrocytetransplantation》(軟骨細胞自體移植治療膝關節深度損傷)一文，文中評述，目前大多數軟骨細胞主要從關節處的透明軟骨和耳組織的彈性軟骨中的分離獲得，繼而進行體外培養。目前軟骨細胞體外培養主要是通過有限的單層傳代培養來進行，培養液中需添加血清。雖然這類方法對軟骨細胞的擴增很有效，但軟骨細胞在單層培養過程中會導致去分化而變為成纖維細胞，使其失去軟骨細胞的特徵。由單層傳代培養方式所產生的去分化軟骨細胞在第一代到第四代可在高密度培養方式和移植到動物體內後重新獲得軟骨細胞的特徵(這一過程稱之為再分化)。因此，在單層傳代培養中軟骨細胞的再分化能力與傳代次數密切相關。目前，已知道多種生長因子如FGF-2，TGF-e，BMP-2和IGF-1己應用於軟骨細胞的體外培養，以促使軟骨細胞擴增，降低去分化作用，促進再分化作用，這些研究成功的可行性較大。目前，尋找一個理想的軟骨細胞生長因子是軟骨細胞體外培養的重要目標。這個因子可以在有限的傳代培養過程中促進三種軟骨細胞的體外擴增，同時保持軟骨細胞特徵基因的表達，合成軟骨細胞所特有的軟骨基質。中期因子(midkine，MK)是多效因子(pleiotrophin，PTN)/中期因子家族中的一員，它最初被描述為視黃酸誘導所產生的因子，調節發育的因子，和肝素結合的神經營養因子。MK在妊娠中期的腦組織和其它組織中高度表達，出生後其表達量下降。在成年動物中，MK在小腸中以非常嚴格的高轉錄水平形式表達，而在其它組織中則低水平表達。Ohta，S等在《JournalofBoneandMineralResearch》(骨與礦物研究雜誌)1999年第14期11321144頁發表了題為《Midkineisexpressedduringrepairofbonefractureandpromoteschondrogenesis》(中期因子在骨折修復過程的表達及其促進軟骨形成)一文，文中評述，0hta等人發現，轉染MK基因的小鼠ATDC5細胞可以促進軟骨基質合成。但是研究同時指出，並不是所有可高表達MK的轉染細胞株都可產生軟骨基質；在培養ATDC5細胞時，添加MK蛋白不能促使其合成軟骨基質。Dreyfus,J等在《ExperimentalCellResearch》(實驗細胞研究)1998年第241期171180頁發表了題為《HB_GAM/pleiotrophinbutnotRIHB/midkineenhanceschondrogenesisinmicromass》(多效因子而不是中期因子可促進微球培養下的軟骨形成)一文，文中評述，與此相似的是，Dreyfus等人發現，在對來源於雞胚胎的間充質細胞進行微團培養時外源添加MK蛋白不能促進軟骨基質合成。這些結果表明在培養時外源MK不能促進具有成軟骨潛能的細胞向軟骨分化。本發明人卻發現MK可促進正常動物體內三種軟骨組織的生長；外源添加MK蛋白在單層培養過程中可刺激三種軟骨細胞的增殖，但不影響軟骨特徵基因的表達。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供了中期因子蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置。本發明完全不同於現有技術對MK類蛋白的認識，實驗表明MK對體內三種軟骨細胞都具有很好的增殖作用，能用於製備治療軟骨疾病的藥物，為今後臨床治療軟骨疾病提供新的選擇；同時，MK也可用於軟骨組織工程中軟骨細胞的體外擴增。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明一方面公開了一種如下(a)或(b)的蛋白在製備促軟骨組織生長藥物或治療軟骨組織疾病藥物中的用途(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60%同源性的蛋白。所述軟骨組織為透明軟骨組織、彈性軟骨組織或纖維軟骨組織。所述軟骨組織疾病為外傷性軟骨損傷、骨關節炎、椎間盤退變、軟骨發育異常、軟骨發育不全症、肋軟骨炎或復發性多軟骨炎。所述外傷性軟骨損傷為關節軟骨損傷、穿透關節軟骨下骨的關節軟骨損傷或外傷導致的椎間盤軟骨損傷。一種如下(a)或(b)的蛋白作為促軟骨細胞生長因子的用途(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60%同源性的蛋白。所述促軟骨細胞生長因子為體外擴增軟骨細胞數量的生長因子。所述軟骨細胞為關節軟骨細胞、彈性軟骨細胞或纖維軟骨細胞。在一具體實施方式中，本發明所述用途是指胺基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白在製備促軟骨細胞生長因子藥物中的用途。另一方面，本發明公開了一種藥物組合物，包含如下(a)或(b)的蛋白作為活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60%同源性的蛋白。另一方面，本發明還提供了一種包含如下(a)或(b)的蛋白的醫用裝置(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60%同源性的蛋白。所述醫用裝置可為支架。另一方面，本發明公開了所述蛋白作為活性成分可以促進軟骨形成而緩解的疾病或臨床症狀的方法，該方法包括給予有效劑量的本發明所述蛋白。本發明再一方面提供一種治療可通過促進軟骨形成而緩解的疾病或臨床症狀的方法，該方法包括給予一種支架這一步驟，該支架包含有效量的本發明所述蛋白。本發明再一方面提供一種預防可通過促進軟骨形成而緩解的疾病或臨床症狀的方法，該方法包括給予一種支架這一步驟，該支架負載有包含治療有效量的本發明所述蛋白的膠原蛋白IIa。本發明再一方面提供一種促進軟骨形成的方法，該方法包括給予一種支架這一步驟，該支架負載包含治療有效量的本發明所述蛋白的膠原蛋白IIa。本發明具有如下的有益效果本發明完全不同於現有技術對MK類蛋白的認識，實驗表明MK對體內三種軟骨細胞都具有很好的增殖作用，能用於製備治療軟骨疾病的藥物，為今後臨床治療軟骨疾病提供新的選擇；同時，MK也可用於軟骨組織工程中軟骨細胞的體外擴增。圖1rhMK對術後四周兔膝關節軟骨全層缺損修復的切片圖2rhMK在術後不同時間對兔膝關節軟骨全層缺損修復的切片圖3rh服對術後四周兔膝關節軟骨部分損傷修復的切片圖4rhMK對術後九周兔關節軟骨部分損傷修復的切片圖5rhMK對術後十八周大鼠膝關節軟骨損傷修復的切片圖6rhMK對術後十八周大鼠膝關節軟骨損傷修復的切片圖7rhMK對大鼠軟骨細胞去分化和再分化作用的示意圖。具體實施例方式以下實例將結合附圖對本發明作進一步說明。本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。在本文，術語軟骨指動物或人體的任何軟骨，包括但不限於關節軟骨、透明軟骨、半月板軟骨和耳彈性軟骨。本發明的所述蛋白質指一種如下(a)或(b)的蛋白-(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60%同源性的蛋白。本發明的所述蛋白質是有著上述SEQIDNO.1的胺基酸序列的物質，優選該物質是rhMK蛋白質及其突變體；其功能性活性片段或其類似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQIDNO.l描述的胺基酸序列的蛋白質的載體例如DNA載體(質粒或病毒)。功能性活性片段或類似物可通過添加、插入、修飾、取代或缺失以上所列的胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基而形成。術語"類似物"也包括嵌合蛋白質、融合蛋白、抗獨特型抗體、上述化合物的前體和其它功能等效物或模擬物。也包括模擬MK結合蛋白活性的合成體。術語"突變體"是指胺基酸序列如SEQIDNO.1所述rhMK的突變體。相比於天然的MK蛋白，該突變體與它們野生型相比，具有增強的活性和/或改變了的立體專一性。天然蛋白的胺基酸序列突變體可通過向本發明的核苷酸中引入適當的核苷酸變化、或通過體外合成所需多肽來製備。這些突變體包括，例如缺失、插入或替換該胺基酸序列中的殘基。可以通過缺失、插入和替換的組合以得到最終的構建體，提供最終的蛋白產品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)確定，其中參數gapcreationpenalty=5,gapextensionpenalty=0.3。被分析的序列長度至少為15個胺基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為15個胺基酸的區域進行測試。更優選地，被分析的序列長度至少為50個胺基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為50個胺基酸的區域進行測試。更優選地，被分析的序列長度至少為IOO個胺基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為100個，被分析的序列長度至少為250個胺基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為250個胺基酸的區域進行測試。甚至更優選地，被分析的序列長度至少為500個胺基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為500個胺基酸的區域進行測試。本發明涉及的方面還包括MK蛋白類似物，在它們合成期間或合成後進行了不同的修飾，例如，通過生物素化、苄基化、糖基化、乙醯化、磷酸化、由已知保護/封閉基團的衍生作用、蛋白水解的切割作用、連接到抗體分子或其它細胞配體上等。這些修飾可以用來增加本發明MK蛋白的穩定性和/或生物活性。蛋白的表達本發明包括編碼本發明的MK蛋白的DNA以及含有這些DNA的載體、轉化體。本發明中，使用的術語"轉化體"(transformant)，即帶有異源DNA分子的宿主細胞。本發明還包括通過合成和重組技術生產本發明所述蛋白的方法。通過本領域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉化體和生物體。用於本發明的載體可以是如噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉錄病毒載體。可用於克隆和/或表達本發明的多核苷酸的載體是能在需複製和/或表達多核苷酸的宿主細胞中複製和/或表達多核苷酸的載體。一般說來，多核苷酸和/或載體可用於任何真核或原核細胞，包括哺乳動物細胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網織紅細胞)、大鼠、倉鼠(如CH0、NSO和幼倉鼠腎細胞)或小鼠細胞(如L細胞))、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或細菌細胞(如大腸桿菌)。有關適用於多種類型宿主細胞的適當載體的例子可參見例如F.Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology.GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience(1992)和Sambrooketal.(1989)。可以使用含有這些多核苷酸的宿主細胞來大量表達可用於例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質。10已開發出多種方法用於經由互補的粘性末端使多核苷酸與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內的DNA區段添加互補的同聚體序列片段。然後通過互補同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區段以形成重組DNA分子。含有一或多種限制性位點的合成接頭提供了另一種連接DNA區段與載體的方法。用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過內切核酸酶限制性消化產生的DNA區段，所述的兩種聚合酶用其3',5'-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，並用其聚合活性補平3'-凹端。因此，這些活性的聯合產生了平端DNA區段。然後在能催化平端DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區段與大摩爾過量的接頭分子一起保溫。因此，反應產物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區段。然後用適當的限制性酶裂解這些DNA區段，並連接至已用酶裂解的表達載體中，所述酶能產生與所述DNA區段相容的末端。從多個商家可以買到含有多個限制性內切核酸酶位點的合成接頭。多核苷酸插入物應該可操作地連接於同表達多核苷酸的宿主細胞相容的適當啟動子上。啟動子可以是強啟動子和/或誘導型啟動子。列舉的一些啟動子的例子包括噬菌體XPL啟動子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子以及逆轉錄病毒LTR啟動子。其它適當啟動子是本領域技術人員已知的。表達重組載體進一步含有轉錄起始、終止位點，並在轉錄區含有用於翻譯的核糖體結合位點。重組載體表達的轉錄物的編碼部分可包括位於起點處的翻譯起始密碼子和適當地位於被翻譯多肽的末端的終止密碼子(UAA,UGA或UAG)。如上所述，表達載體可包括至少一個選擇標記。所述標記包括對真核細胞培養物而言的二氫葉酸還原酶、G418、穀氨醯胺合酶或新黴素抗性；以及用於大腸桿菌和其它細菌培養的四環素、卡那黴素或氨卞青黴素抗性基因。適當宿主的代表性例子包括但不限於細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞，如酵母細胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細胞；動物細胞，如CHO，COS，NSO，293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。上述宿主細胞的適當培養基和培養條件是本領域己知的。為了有效地分離純化或分泌目標蛋白，常常還可利用便於分離純化的標籤蛋白或標籤多肽(Tag)。常用的有穀胱甘肽-S-轉移酶(glutathioneS-transferase,GST)、六聚組氨酸肽(His.Tag)、蛋白質A(proteinA)和纖維素結合位點(cellulosebindingdomain)等。通過特殊性蛋白或多肽與目標蛋白構成融合蛋白的形式，表達後利用所述的標籤蛋白或標籤多肽的特殊性質可對目標蛋白進行分離和純化。如His.Tag與Ni-ChelatingS印harose柱特異性結合。所述的標籤蛋白或標籤多肽可以在純化後用位點特異性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、腸激酶和Xa因子等，以獲得目標蛋白。本發明還包括含有本發明的核苷酸序列的宿主細胞，所述核苷酸序列經本領域己知的技術與一或多種異源控制區(如啟動子和/或增強子)可操作相連。可以選擇能調節插入的基因序列的表達，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產物的宿主菌株。在某些誘導物的存在下，某些啟動子啟動的表達會升高；因此，可以控制經基因改造的多肽的表達。另外，不同宿主細胞具有特徵性的和特殊的翻譯、翻譯後加工和修飾(如磷酸化、裂解)蛋白質的機制。可以選擇適當的細胞系以確保對表達的外源蛋白質進行合乎需要的修飾和加工。通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其它方法，即可將本發明的核酸和核酸重組載體導入宿主細胞。所述方法描述於多個標準的實驗室手冊中，如Davisetal.，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)。編碼本發明的所述蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標記的載體連接以在宿主中增殖。一般說來，可在沉澱物，如磷酸鈣沉澱物或其與帶電脂質的複合物中導入質粒載體。如果載體是病毒，可使用適當的包裝細胞系在體外對其進行包裝，再轉導至宿主細胞。通過眾所周知的技術可以鑑定出被成功轉化的細胞，即含有本發明的DNA重組載體的細胞。例如，可培養導入表達重組載體所得的細胞以產生所需多肽。收集並裂解細胞，使用如Southern(1975)J.Mol.Biol.95，12503或Berentetal(1985)Biotech.3，208所述的方法，檢測其DNA內容物中DNA的存在。或者，使用抗體檢測上清液中蛋白質的存在。通過眾所周知的方法從重組細胞培養物中回收和純化本發明的所述蛋白較為有利，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。在一些實施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進行純化。在一些實施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發明的所述蛋白。在其它實施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發明的所述融合蛋白，所述層析柱有Qs印haroseFF柱、SPs印haroseFF柱、QsepharoseHighPerformance柱、BluesepharoseFF柱、Blue柱、PhenylSepharoseFF柱、DEAESepharoseFF、Ni-ChelatingSepharoseFF柱或Methyl柱等。另外，可使用國際公開號WO00/44772(全文列入本文作為參考)中描述的方法純化本發明的蛋白。本領域技術人員可以容易地改動其中所述的方法以用於純化本發明的蛋白。可以從包括例如細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞的原核或真核宿主經重組技術產生的產物中回收本發明的蛋白。組合物用於本發明或者含有本發明所述蛋白的組合物。通常，當本發明組合物用於上述用途時，所述蛋白可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合製成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等。"藥學上可接受的"成分是適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)即有合理的效益/風險比的物質。"藥學上可接受的載體"是用於將本發明的融合體蛋白傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。本發明的蛋白可經過口服、靜脈內、肌內或皮下途徑給藥。上述劑型中可經口服給藥的劑型為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、醑劑。固態載體包括澱粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖、白陶土、微粉矽膠、滑石粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基澱粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮。而液態載體包括無菌水、乙醇、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在製備藥物組合物的過程中通常使用的佐劑包括調味劑、著色劑、防腐劑(如羥苯烷基丁酯、苯甲酸鈉、山梨酸)和抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉和二丁基羥基甲苯)。上述劑型中可用於注射途徑給藥的劑型包括注射劑、注射用無菌粉末，它們是將藥物與一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合製成以供注射給藥的形式。溶劑包括無菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，還需加入抑菌劑(如苯甲醇、羥苯丁酯、硫柳汞)、等滲調節劑(如氯化鈉、葡萄糖)、助懸劑(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素)、增溶劑(吐溫-80、卵磷酯)、抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉)和填充劑(如乳糖、甘露醇)。從易於製備和給藥的立場看，優選的藥物組合物是固態組合物，尤其是凍乾粉針劑。本發明的藥用組合物可根據熟知的及公認的製藥生產要求的方法製備。藥用組合物適宜包含本發明的蛋白質以及藥學上可接受的載體，並適宜為單位劑量形式。本發明的藥用組合物可包含前藥形式的本發明的蛋白質，該前藥可在接受者宿主體內代謝轉化成本發明物的活性形式。本發明的藥用組合物還可與其它療法(例如二膦酸鹽)聯合應用，如同時、序貫或分別應用。本發明的藥用組合物可包含有其它活性作用物，例如二膦酸鹽、PTH、維生素D、BMP和雌激素。另一方面，我們還提供一種包含本發明蛋白的醫用裝置。本發明蛋白質適宜以層面的形式存在，例如覆蓋在骨連接裝置的表面的層面形式。本發明的醫用裝置適於通過將本發明的蛋白質吸附於如氧化鈦或其它金屬或多聚物的表面，通過將本發明蛋白質與載體物質結合，然後將載體包附於該醫療裝置表面來製備。在本發明的另一個方面中，我們提供一種用於促進軟骨形成的人造支架材料，該支架能與本發明的蛋白質有效地結合。本發明的支架可以是三維基質或層面(例如連續的薄膜或凝膠)的形式。該基質結構可由纖維或適宜的材料製造，然後通過紡織處理(例如編織、針織、交織或非交織、熔融吹制、粘結、水纏)，並進一步製成所要求的三維形狀。該基質結構也可以為其它形式，例如海綿狀或泡沫狀形式。適宜的支架材料優選是生物可降解的，而且不會抑制細胞生長或增殖。該材料優選不應該引起患者身體的不良反應，並且應能通過例如環氧乙垸處理滅菌。該材料一般具有骨傳導性。因此，適宜的材料包括生物可降解的聚酯，例如聚乳酸(PLA)、聚乙二醇酸(PGA)、聚二噁酮、多羥基鏈垸酸酯(例如ICI)和透明質酸衍生物(如HYAFF)。更適合的材料包括在結合到本文中作為參考的專利申請W091/13638和W097/06835中公開的那些，例如親水性聚氨基甲酸酯、聚醚聚酯、聚環氧乙烷、聚醚聚醯胺、羧甲基纖維素、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚丁二烯、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段共聚物等。其它支架材料是以膠原蛋白為基質的物質，例如交聯膠原蛋白/彈性蛋白材料、由酸溶性I型牛膠原蛋白原料製備的交聯膠原蛋白、膠原蛋白凝膠(如那些商品名為COLLASTAT和C0LETICA的物質)。天然或重組來源的膠原蛋白(如膠原蛋白IIa)均可使用。本發明還提供了改良或嵌合重組性纖維狀膠原蛋白(在此稱為"改性膠原蛋白")，其與本發明蛋白質結合，並具有能增強其裝配性、穩定性和作為生物材料的用途的特徵。該改性膠原蛋白可以用作上述的支架材料。方法包括使用I型膠原蛋白的C末端球狀區域以促進三螺旋的形成；移出或改造該膠原酶裂解位點以抑制退化；摻雜其它的賴氨酸以促進交聯，並改造N末端球狀區域的裂解位點以促進成熟纖維的N末端區域的保留。例如，可將膠原蛋白IIa的chordin/S0G序列用蛋白質/多肽功能操控劑代替。可採用類似結構域改組方法使本發明的蛋白質結合入其它細胞外的基質組分中(例如纖連蛋白連接蛋白或膠原蛋白IV)或ECM結合分子或序列(例如肝素結合結構域)。參見例如W097/08311，其整個內容結合到本發15明中作為參考。在其它具體實施方案中，本發明還提供了一種含有一種合成材料的骨替代材料，該合成材料包含任意一種上述的支架材料和與本發明蛋白質結合的晶體相態(例如一種磷灰石，如羥基磷灰石)。在本發明的適當方面中，本發明的蛋白質作為支架以凝膠形式提供。該凝膠一般包括凝血酶、纖維蛋白原和因子XIII或其它與凝膠交聯的轉穀氨醯胺酶。在優選實施方式中，本發明還提供一種促進軟骨組織生成的支架，其中該支架包含膠原蛋白IIa;所述支架裝置適於完全或主要由膠原蛋白IIa製成，或者主要用膠原蛋白IIa包覆。本發明提供一種包含膠原蛋白IIa的支架，該支架能夠釋放本發明所述蛋白，並能控制本發明所述蛋白的釋放。因此，本發明所述蛋白的靶向性得到改善。在具體實施方案中，所結合的本發明所述蛋白可通過正常細胞活動和/或通過一種可以釋放MK的操控裝置或藥物釋放。本發明所述蛋白可通過所述支架的降解釋放。本發明適宜能使可溶性本發明所述蛋白與靶細胞(例如在缺損癒合部位)相互作用，在靶細胞能形成軟骨的實施方案中，誘發這些靶細胞表達和合成軟骨成分，從而使缺損部位復原。本發明還提供一種製備促進軟骨組織生長的支架的方法，該方法包括將支架用本發明所述蛋白包覆蓋這一步驟。在本發明該方面的一實施方案中，已將與軟骨接觸的表面衍生化或修飾，這樣易於通過共價鍵直接將本發明的膠原蛋白IIa或支架結合於所述表面上。用途本發明還公開了所述蛋白作為活性成分可以促進軟骨形成而緩解的疾病或臨床症狀的方法，該方法包括給予有效劑量的本發明所述蛋白。"有效劑量"或"治療量"均是指足以產生療效的量。有效量可分一或多次給藥。通常，有效量足以緩和、改善、穩定、減慢或延遲疾病的進一步發展。所用的活性成分的有效劑量可隨給藥模式和待治療疾病的嚴重程度而變化。對大部分大型哺乳動物而言，每天施以有效成分的總劑量約為0.011000mg。通常，成人臨床給藥量的範圍為0.01200mg/日，優選為0.05100mg/日。本發明另一方面提供一種治療可通過促進軟骨形成而緩解的疾病或臨床症狀的方法，該方法包括給予一種支架這一步驟，該支架包含有效量的MK蛋白。本發明再一方面提供一種預防可通過促進軟骨形成而緩解的疾病或臨床症狀的方法，該方法包括給予一種支架這一步驟，該支架負載有包含治療有效量的本發明所述蛋白的膠原蛋白IIa。本發明再一方面提供一種促進軟骨形成的方法，該方法包括給予一種支架這一步驟，該支架負載包含治療有效量的本發明所述蛋白的膠原蛋白IIa。儘管設想本發明有利於軟骨修復，但還可以用來治療其它臨床症狀和疾病。本發明促進軟骨形成而緩解的臨床症狀和疾病包括骨關節炎(OA)、branchypodism、Hunter-Thompson軟骨發育異常。也用於治療關節的軟骨病變，包括那些限於軟骨和那些穿透軟骨下骨的軟骨病變，也可以用於治療0A。設想在不需高濃度生長因子下，本發明可以用於治療軟骨修復或誘發軟骨生長。目前使用高濃度生長因子一直存在一個問題，即高濃度生長因子(如上所提)可引起生物平衡的偏離，從而可能導致該生長因子效能降低這一缺點。本發明膠原蛋白IIa或支架適宜以層面的形式存在，例如覆蓋在軟骨接觸的裝置表面上的層面形式。本發明的醫用裝置適於通過將本發明的膠原蛋白IIa或支架吸附於如軟骨固定凹銷的表面上，通過將本發明的膠原蛋白IIa或支架與載體物質結合，然後將載體包覆於該醫療裝置表面來製備。類似地，本發明的特定方面的膠原蛋白IIa或支架可以用於促進軟骨的再生。本發明還公開了所述蛋白作為促軟骨細胞生長因子的用途，可用於體內外軟骨細胞的增殖，也在軟骨組織工程中單獨或結合胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子及骨形態發生蛋白等用於人工軟骨的製備，具體可參見文獻《ChungC，BurdickJA.AdvDrugDelivRev.200814;60(2):243-62;陳昌紅，王宸國際骨科雜誌.2006(2)117119》。以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施方式中選用的實驗動物C57BL/6J小鼠和Sprague-Dawley(SD)大鼠(購自上海斯萊克實驗動物中心)飼養於空氣過濾系統的動物籠中，溫度和溼度分別保持在23±5°Cand55±5%。紐西蘭大白兔(購自上海醫科大學實驗動物中心)，體重在2.02.5kg。實施例1重組蛋白rhMK的製備參照文獻《ZhemgZ,DuL，XiangD,ZhuS，etal.JZheji肌gUnivSciB，2009，10:7986》編碼人MK成熟蛋白的DNA序列(GenBankNM—001012334)與pET30a十(Novagen，USA)載體連接，轉化到E.coli(本發明中所涉及的菌株大腸桿菌己在《ZhangZ，DuL，XiangD,ZhuS，etal.JZhejiangUnivSciB，2009，10:7986》文獻中公開)中表達。重組rhMK蛋白通過離子交換層析進行純化。純化後的蛋白經反向高效液相色譜檢測，其純度大於98%。重組rhMK蛋白中內毒素含量低於0.3EU/ug蛋白。重組rhMK蛋白的生物活性通過刺激NIH3T3細胞生長進行檢測。實施例2重組蛋白rhMK對正常小鼠、大鼠和兔子軟骨的作用步驟一所有動物都經皮下注射給藥，重組蛋白組和生理鹽水(NS組)的注射體積均為0.5ml，所用rhMK用生理鹽水稀釋至所需濃度進行注射。8周齡雄性C57BL/6J小鼠分六組注射NS組、rhMK組(10，33，100，300，900Pg/kg體重)，連續注射一周，每組3隻小鼠。3周齡SD大鼠分兩組NS組和rhMK組(注射175wg/kg體重重組蛋白)，連續注射一周，每組3隻大鼠。2月齡紐西蘭大白兔分兩組NS組和rhMK組(注射92.5ug/kg體重重組蛋白)，連續注射兩周，每組3隻兔子。步驟二組織學觀察及評價所有小鼠和大鼠軟骨組織樣本均置於體積分數為10%的中性甲醛溶液中固定1天，兔軟骨組織樣本固定2天。固定後，組織樣本在脫鈣液(含7%A1C13，6H20，5%甲酸，8.5%HC1，其中各百分數為體積分數)中脫鈣，小鼠和大鼠樣本脫鈣4天，兔樣本脫鈣10天。脫鈣後的組織樣本經乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟後，進行包埋。樣本使用萊卡切片機進行常規石蠟切片，並用蘇木精-伊紅或固綠-番紅o染色。切片樣本在顯微鏡下觀察，並分析結果。對三種軟骨組織厚度的測量使用光學顯微鏡上的標尺進行，每個樣本取三張切片分別進行測量並取平均值。在股骨髁部1/2處對軟骨組織表面至軟骨下潮線處的距離進行測量以表示膝關節軟骨的厚度；對動物耳中間部分的脂軟骨細胞區域厚度進行測量以表示耳彈性軟骨的厚度；胸椎間盤(T2-3)的外層部分厚度則用纖維環外層至髓核間的距離來表示。rhMK對正常動物軟骨組織的增殖作用為了研究重組蛋白rhMK對體內軟骨組織的生物學作用，我們表達並純化了重組蛋白rhMK。通過對rhMK注射小鼠後第15天的組織切片結果進行分析，發現該蛋白對小鼠的關節軟骨、耳彈性軟骨和椎間盤的纖維軟骨組織具有顯著的增殖作用，結果如表l所示。對小鼠三種軟骨組織都有增殖作用的有效劑量為300ug/kg體重/d，對重組蛋白作用最敏感的軟骨組織為關節軟骨和耳軟骨組織，其最低有效劑量為10ug/kg體重/d。所有劑量組的小鼠股骨周圍均未發現長出多餘的軟骨組織。因此，我們可以得出結論，注射一定劑量的重組蛋白rhMK可以致使小鼠體內三種軟骨組織增殖。重組蛋白注射劑量連續皮下注射一周重組蛋白，重組蛋白劑量見下表。每組3隻小鼠，分析其軟骨生長情況。下表所有數據表示為平均值士標準差。該實驗重複3次。*和**表示該劑量組與(0)劑量組的差異顯著性分析，使用Studentt檢驗。*為P〈0.05,**為P〈0.01。表lrhMK促進正常小鼠體內軟骨的生長tableseeoriginaldocumentpage20歩驟三為了驗證重組蛋白在小鼠體內的有效劑量，我們又在目前軟骨疾病模型中較為常用的實驗動物大鼠和兔子體內進行相同的實驗。對大鼠皮下注射重組蛋白175ug/kg體重/d，連續注射一周，對兔子皮下注射重組蛋白92.5ug/kg體重/d，連續注射兩周，通過對注射重組蛋白第15天後的組織切片結果進行分析，發現rhMK可以顯著增殖三種動物四種軟骨組織，關節軟骨、耳軟骨、氣管軟骨和椎間盤軟骨，詳見表2，表2rhMK促進不同的正常動物體內軟骨生長tableseeoriginaldocumentpage20重組蛋白rhMK注射劑量小鼠皮下連續注射一周300ug/kg體重重組蛋白，大鼠皮下連續注射一周175ixg/kg體重重組蛋白，紐西蘭兔連續注射兩周92.5ng/kg體重重組蛋白。每組3隻動物，分析軟骨的生長情況。下表所有數據表示為平均值士標準差。該實驗重複3次。*和**值表示該rhMK組與對照組的差異顯著性分析，使用Studentt檢驗。*為P<0.05,**為P<0.01。實施例3兔膝關節軟骨全層缺損模型的建立及rhMK對缺損部位的修復步驟一，取2月齡雄性紐西蘭大白兔，體重2.02.5kg，用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)經耳緣靜脈注射麻醉後，兔兩側膝關節備皮。手術範圍常規消毒，無菌條件下，取膝內側弧形切口，顯露股骨髁面，用電鑽鑽一直徑為3mm，深度為4mm的全層軟骨缺損，然後用4-0線逐層縫合關閉傷口。術後每天每隻兔子注射青黴素40萬單位，連續注射一周，以防止傷口部位感染。術後24h，開始注射生理鹽水和重組蛋白rhMK，採用關節腔內注射。兔子一側的缺損膝關節注射醫用生理鹽水0.5ml，另一側則注射重組蛋白rhMK0.5ml。每周注射3次，共注射2周。實驗兔放養於兔籠內，讓其自由活動，膝關節不固定。術後分別於2、4、6和12周處死兔子，取出關節軟骨組織進行常規組織切片、HE及固綠-番紅O染色，通過番紅O染色後，在光鏡下觀察新生組織的性質、表面特性以及與正常組織融合情況等。步驟二，試驗結果如圖1所示左列圖A,C，E,G和I為rhMK組；右列圖B,D,F,H和J為生理鹽水組。圖A，B，C，D，E，F,I和J為HE染色，圖G和H為固綠-番紅O染色。圖A中黑色矩形框部分被分別放大為圖C，E和G;圖D中黑色矩形框部分被分別放大為圖F和H。圖I和J中矩形框中所示部位為缺損部位附近殘餘的軟骨組織，而圓形框中所示部位為原有軟骨組織和新生組織的邊緣處。rhMK最顯著的效果在於填充在缺損部位的新生細胞特徵。術後4周，rhMK組和生理鹽水組處理的缺損部位均被新生組織完全填充(圖1A和1B)。在rhMK處理的一側缺損部位，新生的軟骨細胞排列整齊呈現柵欄狀(圖1C)，新生的軟骨細胞為肥大軟骨細胞並形成陷窩(圖1E)，呈典型的軟骨細胞特徵，且特殊染料番紅O染色呈陽性(該染料專一染軟骨基質的蛋白多糖)(圖1G)。但是，在生理鹽水一側，新生組織內的細胞排列不規則(圖1D)，呈分散狀，且這些類肥大軟骨細胞以單細胞形式存在，未形成陷窩(圖1F)，番紅O染色呈弱陽性(圖1F)。同時發現，rhMK治療的一側膝關節，其缺損部位周圍的殘餘軟骨組織內還存有大量活的軟骨細胞(圖II和1J矩形方框部分)，該軟骨細胞向缺損部位生長，並形成明顯的軟骨細胞串，而在對照生理鹽水治療側的膝關節則未發現該現象(圖1J圓形框部位)。因此，由此可得出結論在膝關節全層缺損的軟骨部位，局部使用rhMK可以促進新生軟骨組織形成，其細胞為關節軟骨細胞，而不是類軟骨細胞；新生軟骨細胞至少有一部分來自於缺損部位周圍的殘餘關節軟骨細胞。從對術後不同時間的修復組織進行切片分析，可進一步證明在膝關節全層缺損的軟骨部位rhMK對缺損部位周圍的軟骨細胞有顯著的剌激作用。如圖2rhMK在術後不同時間對兔膝關節軟骨全層缺損的修復。圖A和B為術後2周，圖C和D為術後4周，圖E和F為術後12周。圖A，C和E中黑色方框部分被分別放大為圖B，D和F。圖A和C中箭頭所指為損傷部位附近的軟骨細胞向缺損部位生長。術後2周，雖然缺損中心區域被纖維樣細胞所填充，但圓柱形缺損部位周圍出現不完全的透明軟骨層(圖2A),該軟骨層含有典型的軟骨細胞，並形成透明軟骨所特有的軟骨陷窩(圖2B)。術後4周，由陷窩內的軟骨細胞組成的新生軟骨組織覆蓋整個缺損表層，且呈現"U"型，與臨近的關節軟骨結合緊密，缺損中心區域被新生的軟骨部分填充(圖2C和2D)。術後12周，缺損處完全被關節軟骨所修復，新生的骨髓填充在新生組織的中心部位，並有髓竇形成，軟骨下骨形成，下潮線完全恢復(圖2E)。新生軟骨組織表面被排列規則的陷窩軟骨細胞所覆蓋(圖2F)。上述軟骨修復模式在rhMK治療側發生機率為72.2%(18個樣本中有13個出現該現象)，而對照組生理鹽水側則未出現該現象(P<0.01byFisher'sexacttest)。所有對照組生理鹽水側表現出相似的修復模式，即被類軟骨細胞形成的新生組織所填充(圖2B和2D)。因此，在兔膝關節全層缺損軟骨模型中，rhMK治療組中修復組織的細胞特徵完全不同於生理鹽水對照組，前者缺損處所填充的是關節軟骨細胞，而後者則填充類軟骨細胞。實施例4成年兔膝關節軟骨部分缺損模型的建立及rhMK對缺損部位的修復步驟一，取9-IO月齡雄性紐西蘭大白兔，體重3.03.5kg，用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)經耳緣靜脈注射麻醉後，兔兩側膝關節備皮。手術範圍常規消毒，無菌條件下，取膝內側弧形切口，顯露股骨髁面，用手動鑽一直徑為約3mm部分軟骨缺損，缺損部位以不見血為標準，然後用4-0線逐層縫合關閉傷口。術後每天每隻兔子注射青黴素40萬單位，連續注射一周，以防止傷口部位感染。術後24h，開始注射生理鹽水和重組蛋白rhMK，採用關節腔內注射。兔子一側的缺損膝關節注射醫用生理鹽水0.5ml，另一側則注射重組蛋白rhMK0.5ml。每周注射3次，共注射2周。實驗兔放養於兔籠內，讓其自由活動，膝關節不固定。術後分別於4和9周處死兔子，取出關節軟骨組織進行常規組織切片、HE及甲苯胺藍染色，通過甲苯胺藍染色後，在光鏡下觀察新生組織的性質、表面特性以及與正常組織融合情況等。步驟二，試驗結果圖3所示為術後4周rhMK對兔膝關節軟骨部分損傷的修復。左列圖A和B為生理鹽水組；右列圖C和D為rhMK組。圖A,B,C，和D均為甲苯胺藍染色。圖A和圖C為低倍鏡下觀察結果，圖B和圖D為高倍鏡下觀察結果，圖B和D中箭頭所指為缺損部位的軟骨組織及其細胞。圖4所示為術後9周rhMK對兔膝關節軟骨部分損傷的修復。左列圖A和B為生理鹽水組；右列圖C和D為rhMK組。圖A,B，C，和D均為甲苯胺藍染色。圖B和D中箭頭所指為損傷部位新生的軟骨組織和軟骨細胞。從對術後四周和九周的軟骨組織進行切片分析，可證明在成年兔膝關節部分缺損的軟骨部位，rhMK對缺損部位的軟骨細胞有顯著的刺激作用，並能修復受損的軟骨組織。術後四周，注射生理鹽水一側的缺損區域未能長出新生的軟骨組織，且缺損區域殘餘的軟骨組織中軟骨細胞並未出現增殖(圖3A和3B);而注射rhMK—側的軟骨組織中，軟骨組織中的存在大量的活細胞，且軟骨細胞出現增殖，但軟骨組織中的基質染色較淺(圖3C和3D)。術後九周，注射生理鹽水一側的缺損區域長出部分新生組織，但新生組織內的細胞較少，軟骨基質含量很少，甲苯胺藍染色呈弱陽性(圖4A和4B);而注射rhMK—側，軟骨組織中的軟骨細胞出現大量增殖，且覆蓋於受損傷的軟骨組織表面，軟骨基質染色與附近周圍正常軟骨組織基本一致(圖4C和4D)。因此，在成年兔膝關節軟骨部分缺損模型中，rhMK可修復受損傷的軟骨組織，而生理鹽水組則不能修復缺損區域。實施例5ACLT誘發大鼠骨關節炎模型的建立及rhMK對軟骨組織的修復步驟一，取7周齡齡雄性SD大鼠，體重250-330g，用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg體重)腹腔注射麻醉後，大鼠兩側膝關節備皮。手術範圍常規消毒，無菌條件下，膝前正中切口切開皮膚皮下組織，找到白色的髕腱，沿其內側切開關節囊，過伸膝關節致使髕骨外側脫位(通常都是往膝部的外側方向脫位)。屈曲膝關節，找到前交叉韌帶，用眼科剪剪斷。伸直膝關節，復位髕骨，逐層縫合關閉傷口。每隻大鼠注射丁胺卡納黴素(規格為100，000U/ml，注射濃度為10mg/kg，注射劑量為1p1/10g體重)連續注射四天，以防止傷口部位感染。術後14周，開始注射生理鹽水或重組蛋白rhMK，採用關節腔內注射。空白組大鼠左側膝關節未經手術處理，不注射任何溶液，右側注射重組蛋白rhMK100|il。對照組大鼠左側注射醫用生理鹽水100pl，右側則注射重組蛋白rhMK100|il。實驗組大鼠左側注射低劑量重組蛋白rhMK100pi(注射濃度為58.3網/kg)，右側注射高劑量重組蛋白rhMK100pl(注射濃度為525ng/kg)。每周注射3次，共注射2周。實驗大鼠放養於鼠籠內，讓其自由活動，膝關節不固定。術後分別於2和6周處死大鼠，取出關節軟骨組織進行常規組織切片，HE及ToluidineBlue染色，在光鏡下觀察軟骨生物力學及組織學特徵。步驟二，試驗結果圖5所示為對術後十八周大鼠膝關節軟骨損傷修復(HE染色)。A，B，C，D分別為sham組，ACLT/生理鹽水組，ACLT/低劑量組以及ACLT/高劑量組膝骨關節切片經HE染色後的照片，標尺為200(im。E，F，G和H為A，B，C以及D放大兩倍後的照片，標尺為100pm。其中圖B，F顯示骨關節炎軟骨未經修復，將會導致血管刺穿潮線，並出現軟骨下囊性變。圖6所示為對術後十八周大鼠膝關節軟骨損傷修復(ToluidineBlue染色)。A，B，C，D分別為sham組，ACLT/生理鹽水組，ACLT/低劑量組以及ACLT/高劑量組膝骨關節切片經ToluidineBlue染色後在IO倍光鏡下的照片，標尺為200pm。E，F，G和H為A，B，C和D放大兩倍後的照片，標尺為IOOpm。其中圖B,F顯示骨關節炎軟骨未經修復，將會導致血管刺穿潮線，並出現軟骨下囊性變。rhMK最顯著的效果在於遞補到外層軟骨的新生細胞特徵。關節炎軟骨層水分增加，蛋白多糖減少，著色較淺。術後18周，rhMK組較生理鹽水組軟骨層明顯加厚，壞死細胞大多被新生軟骨替代，新生的軟骨細胞排列整齊呈現柵欄狀(圖5C和5D)，新生的軟骨細胞為肥大軟骨細胞並形成陷窩，呈典型的軟骨細胞特徵，且特殊染料ToluidineBlue染色呈陽性(該染料專一染軟骨基質的蛋白多糖)。但是，在生理鹽水一側，細胞排列不規則(圖5B)，潮線明顯被血管破壞(圖5B和5F)，ToluidineBlue染色呈弱陽性(圖5F)。因此，由此可得出結論在手術方法誘發的骨關節炎軟骨部位，使用rhMK可以促進軟骨組織形成，其細胞為關節軟骨細胞。從對不同劑量rhMK修復的軟骨組織進行切片分析，可進一步證明在膝關節軟骨損傷的部位，rhMK對軟骨細胞有顯著的刺激作用。無任何處理的空白組軟骨表面規則，結構正常，無裂隙，細胞排列整(圖5A和5E及圖6A和6E);ACLT/生理鹽水組軟骨表面不規則，裂隙較多，軟骨細胞數量明顯減少，散在分布，排列紊亂，表層局部被纖維覆蓋，軟骨層纖維性成分增多，潮線被血管破壞，出現軟骨下囊性變(圖5B和5F及圖6B和6F);ACLT/高劑量組軟骨表面較規則，裂隙較多，軟骨細胞呈柱狀排列，軟骨層纖維性成分較多(圖5D和5H及圖6D及6H)。ACLT/低劑量組軟骨表面較規則，裂隙及纖維性成分均較生理鹽水組少，細胞排列較整齊，可見軟骨細胞增殖(圖5C和5G及圖6C和6G)。對病理切片進行評分，三組間的差異有統計學意義(P〈0.05，byKruskaliallisTest),使用重組蛋白rhMK後的修復效果要優於對照組，且低劑量的修復效果要優於高劑量組。實施例6rhMK對三種軟骨細胞的增殖作用步驟一，原代軟骨細胞的分離取8周齡雄性SD大鼠，斷頸處死後無菌條件下，用手術刀從股骨關節處、半月板和外耳分別分離關節軟骨組織、纖維軟骨組織和彈性軟骨組織。分離出的軟骨組織切成1mm的3小塊，PBS洗滌兩次，37。C胰酶工作液(0,25%(w/v)trypsin/0.02%(w/v)EDTA)消化30min後，PBS洗滌兩次;關節軟骨和彈性軟骨用0.2%II型膠原酶(DMEM培養液配製)消化16h，纖維軟骨用0.15%I型膠原酶(DMEM培養液配製)消化16h。待消化結束後，三種軟骨細胞消化液分別用孔徑為100iim濾器過濾(Falcon,USA)，細胞濾液放入15ml離心管內，室溫2000rpm離心5min，細胞沉澱重懸於含10%FBS的DMEM培養液中。取10iU細胞液，加入10yl0.4%臺盼藍溶液混勻後，光鏡下計活細胞數。每次消化後活細胞數大於95%時方可用於後續實驗。步驟二，MTT法測定重組蛋白rhMK對三種軟骨細胞的增殖作用用含10%FBS的DMEM培養液將三種原代軟骨細胞液濃度調整至5X104個細胞/ml，向96孔板的每個孔內加入IOOpl稀釋後的細胞懸液，37TV5呢C02培養箱內培養48h。吸出孔內培養液，用不含血清的DMEM培養液洗滌一次，每孔加入含不同濃度rhMK(0.5，1.0，3.0，5.0，9.0ug/ml)的DMEM(含O.5%FBS)培養液繼續培養48h。培養結束後，吸盡孔內培養液，每孔加入100u1不含血清的DMEM培養液和20u1MTT溶液(0.5mg/ml，PBS配製)，37°〇/5%0)2培養箱內培養4h。吸盡孔內液體，加入120u1DMS0以溶解MTT晶體，微板振蕩器上振蕩lmin，於酶標儀(BI0-TEK,USA)中測定每孔的吸光值，測定波長為490nm。(1)軟骨細胞的單層培養用含10%FBS的腿EM培養液將三種原代軟骨細胞液濃度調整至5X104個細胞/ml，向6孔板的每孔內加入2ml稀釋後的細胞懸液，即每孔細胞總數為1X15個，孔板置於37匸/5%(]02培養箱內培養。實驗分為兩組對照組和實驗組(添加rhMK，濃度為3yg/ml)。細胞每兩天換液一次。待細胞長至匯合度為8590%時，吸盡孔內培養液，用PBS洗滌一次，加入適量的胰酶工作液消化lmin，反覆吹打細胞，並將消化後的細胞液放入15ml離心管內，室溫2000rpm離心5min，細胞沉澱重懸於含10%FBS的DMEM培養液中。取10ul細胞液，加入10ul0.4%臺盼藍溶液混勻後，光鏡下計活細胞數。部分消化後的細胞用於細胞傳代，部分細胞用於RNA抽提，取lX105個細胞/100u1，製作細胞塗片，並保存於-80'C冰箱中。原代細胞(P0)培養時間為7天。消化後的細胞按上述培養方法和實驗分組重新接種於6孔板內，培養時間為3天，消化後得到的細胞為P1代，並計數。每代擴增倍數=消化後的活細胞總數/初始接種的細胞總數。剩餘的細胞液，取1X105個細胞/100yl，製作細胞塗片，並保存於-80。C冰箱中。無血清培養時，原代細胞用含10%FBS的DMEM培養液培養24h後，不含血清的DMEM培養液洗滌一次，加入含ITS+1(成分為insulin-transferrin-selenium,購自Sigma公司)的DMEM培養液，實驗分兩組對照組和實驗組(添加rhMK，濃度為3ug/ml)。細胞每兩天換液一次。細胞長至匯合度為8590%時，按照上述步驟消化計數，並傳代培養。(2)軟骨細胞的高密度培養傳代消化後的軟骨細胞，按照4X105個細胞/孔加入24孔板內，培養液為DEME培養液(含10%FBS)，實驗分兩組對照組和實驗組(添加rhMK，濃度為3wg/ml)。當孔板內的細胞長滿時，繼續培養14天。細胞每兩天換液一次。培養結束後，部分細胞用於RNA抽提，另一部分細胞經胰酶工作液和0.2。/。II型膠原酶37'C消化30min後，細胞懸液製成細胞塗片，保存於-8(TC冰箱中。(3)免疫組化染色細胞塗片樣本放入冰冷的丙酮溶液中固定10min，PBS浸泡5min，放入3%HA溶液中(ddH20配製)室溫孵育10min，ddH20孵育5min。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育20min。甩去多餘液體，不洗。滴加稀釋的兔抗大鼠n型膠原的抗體溶液(1:IOO倍稀釋)，37。C孵育lh。PBS洗漆3次，每次2min。滴加生物素化的山羊抗兔IgG溶液(1:IOO倍稀釋)，37°C孵育30min。PBS洗滌3次，每次2min。滴加SABC溶液，37。C孵育30min。PBS洗滌3次，每次2min。滴加DAB試劑，室溫顯色，(1朋20洗滌。蘇木精輕度復染30s，脫水，透明，封片。(4)RNA抽提及半定量PCR軟骨細胞樣本中的總RNA抽提使用TRIZOL試劑(Invitrogen,China)，具體操作按照試劑說明書進行。抽提後的總RNA進行逆轉錄反應，合成cDNA的第一鏈並以此為模板，進行目的基因的半定量PCR反應。表3為目的基因名稱，GenBank登錄號，引物序列，退火溫度，PCR循環數和目的片段的大小。擴增條件為95t:預變性2min，94。C變性30s,退火溫度下30s，72°(3延伸30s，循環數參見表3，72'C末端延伸5min。擴增後的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度為1.5%)，並用溴化乙錠染色，凝膠成像系統拍照分析。P-actin為看家基因。表3半定量PCR實驗中所用的引物序列tableseeoriginaldocumentpage28(4)免疫印跡大鼠原代軟骨細胞培養於24孔板內，接種細胞密度為2X105CellS/cm2，細胞培養液為含10%FBS的腿EM培養液，實驗分為兩組對照組和實驗組(添加rhMK，濃度為3pg/ml)。信號通路抑制劑PD98059和LY294002分別為MAPKK和PI3-激酶抑制劑，PD98059作用濃度為2.8、8.3和25yM，LY294002作用濃度為1.1、3.3和10wM。當細胞培養至一定時間時，吸盡孔內培養液，加入RIPA細胞裂解液(Beyotime，China)，每孔加入100pl，用移液器充分吹打以裂解細胞，將細胞裂解液放入1.5ml離心管內，4°C12000rpm離心5min。取上清按照BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime,China)，測定細胞裂解液中的蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。取蛋白含量相等的細胞裂解液(約15!ig)，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束後將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上。該膜用596脫脂牛奶溶液(10mMTris，150mMNaCl，0.1%Tween-20，pH7.6)室溫封閉lh。PBS洗滌3次，每次5min。加入一抗稀釋液(ERK，phospho-ERK,p38,phospho-p38,JNK,phosphor-JNK,Akt，andphosphor-Akt)(1:1000稀釋)，4。C孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5min。加入二抗稀釋液(1:1000稀釋)，室溫孵育lh。PBS洗滌3次，每次5min。用濾紙吸乾膜上多餘的液體，向膜上滴加ECL溶液(Pierce,USA)，室溫孵育1min。用濾紙吸去膜上多餘的液體，將膜置於保鮮膜內，放入暗盒中，並放入一張X光片(Kodak,USA)，壓片5min。將X光片放入顯影液中顯影2min，自來水衝洗片刻後，將X光片放入定影液中定影5min。自來水衝洗片刻，待X光片晾乾後掃描並分析實驗結果。(5)BrdU摻入法測定rhMK對原代軟骨細胞的增殖作用取新鮮分離的大鼠原代軟骨細胞，按照每孔1X104個細胞接種入96孔板內，培養液為含10%FBS的DMEM培養液，實驗分組對照組(control)，對照組+PD98059(作用濃度為25uM)，對照組+LY294002(作用濃度為10UM)，實驗組(rhMK，作用濃度為g/ml)，實驗組+PD98059(作用濃度為2.8、8.3和25yM)，實驗組+LY294002(作用濃度為1.1、3.3和10uM)。細胞培養48h後，加入稀釋後的BrdU試劑(Millipore，USA)，37。C/5。/。C02培養箱中孵育4h。吸出孔內液體，加入IOOu1固定液，室溫下固定30min。吸去固定液，用WashBuffer洗滌孔板3次(800u1洗滌濃縮液稀釋至40ml)，每孔加入100u1稀釋後的BrdU單抗(取22.5u1BrdU單抗，用抗體稀釋液稀釋至4.5ml)，室溫孵育lh。用WashBuffer洗滌孔板3次。每孔加入lOOu1稀釋後的二抗(取2.5ul二抗，用二抗稀釋液稀釋至5.0ml，稀釋後必須用0.22m濾器過濾以降低檢測背景並提高檢測準確度)，室溫下孵育30min。用WashBuffer洗滌孔板3次。用蒸餾水洗滌孔板一次。每孔加入100y1TMB溶液，黑暗中室溫孵育30min(陽性孔可以見到藍色)。每孔加入100ul酸性終止液，此時陽性孔內顏色由藍色變為亮黃色。在450nm處檢測吸收值。統計學分析，應用Studentt檢驗及方差分析對實驗結果進行差異顯著性分析。試驗結果(1)rhMK促進單層培養的軟骨細胞增殖為了驗證rhMK對動物體內軟骨組織增殖是直接通過軟骨細胞增殖起作用的，我們對來源於三種軟骨組織的軟骨細胞進行培養，通過在培養過程中添加或不添加rhMK來確定其增殖作用。首先，我們採用MTT法來測定rhMK對三種軟骨細胞的增殖作用。結果如表4所示，可以發現當r謹K工作濃度為3"g/ml時，可促進三種軟骨細胞的增殖。多次添加rhMK並不能進一步增殖細胞。然而三種軟骨細胞對rhMK的敏感度有所差別，對耳彈性軟骨細胞的最低有效劑量為0.5ug/ml，對關節軟骨細胞的最低有效劑量為1Wg/ral，而對纖維軟骨細胞的最低有效劑量則為3ng/ml。由此，我們可以得出結論，在單層培養條件下rhMK可以促進三種大鼠原代軟骨細胞的增殖，且呈劑量依賴關係。表4rhMK對單層培養的原代軟骨細胞增殖作用的量效研究tableseeoriginaldocumentpage30表所有數據表示為平均值士標準差，每組三個復孔。該實驗重複3次。*和林值表示該劑量組與(0)劑量組的差異顯著性分析，使用Studentt檢驗。*為P〈0.05，**為P〈0,01。為了進一步確認rhMK對軟骨細胞的增殖作用，我們研究了rhMK對傳代軟骨細胞的增殖。三種大鼠原代軟骨細胞均傳代培養三代，即PO、Pl和P2代，培養液為含10%FBS的DMEM培養液。細胞增殖倍數計算方法見"材料與方法"。結果如表5所示，可以發現rhMK可以促進PO、P1和P2代的三種軟骨細胞生長。有趣的是，在傳代培養過程中rhMK對纖維軟骨細胞增殖作用呈下降趨勢，且下降很快，增殖率從PO代的112%下降至P2代的351而rhMK對耳彈性軟骨細胞的增殖作用趨勢則能較好的保持，增殖率從P0代的65%下降至P2代的55%。但總體上看，隨著軟骨細胞的傳代培養，rhMK對軟骨細胞的增殖作用呈下降趨勢。事實上，rhMK對關節軟骨細胞P3代和P4代的增殖率分別為34%和16%，而對P5代和P6代的細胞則不起作用。我們進一步研究發現，r謹K可以在低血清濃度(1%)的培養條件下促進關節軟骨細胞的增殖，對Pl、P2、P3和P4代細胞增殖率分別為53%、63%，42%和諷，對P5和P6代細胞無增殖作用，其對傳代培養過程中軟骨細胞增殖作用能力下降的趨勢與高血清培養條件時一致。表5r固K促進單層培養的大鼠軟骨細胞生長tableseeoriginaldocumentpage31表所有數據表示為平均值士標準差，每組三個復孔。該實驗重複3次。*和料值表示為實驗組(+)與實驗組(-)的差異顯著性分析，使用Studentt檢驗。*為P<0.05，**為P<0.01。值得說明的是，三種軟骨細胞在不含血清的培養條件下進行培養，即DMEM(含ITS+1)，細胞結成團塊狀。添加rhMK(工作濃度為3yg/ml)不能使細胞貼壁和增殖。然而，當這些細胞在含10%FBS的DMEM培養液中預培養24h時，細胞可以貼壁生長。將培養液換成無血清培養液，添加rh服(工作濃度為3ug/ml)可以促進細胞增殖，對P1、P2和P3的增殖率分別為34%、51%和18%。綜上，這些數據表明rh區可以在單層培養條件下剌激三種軟骨細胞的增殖，其作用依賴於血清初次刺激和一定的傳代次數。軟骨細胞最終對rhMK失去響應有可能是因為軟骨細胞向成纖維細胞分化結果所導致。(2)rhMK對單層培養的軟骨細胞表型的影響軟骨細胞在單層培養過程中會由軟骨細胞型變為成纖維細胞型。確定rhMK在單層培養條件下可對三種軟骨細胞起增殖作用後，我們通過半定量PCR和免疫組化染色法檢測了rhMK對傳代培養過程中三種軟骨細胞表型變化的影響。利用Col2al，Collal和Sox9等基因相對於看家基因P-actin表達水平變化來衡量rhMK對關節軟骨細胞、耳軟骨細胞和纖維軟骨細胞傳代過程(P0、P1和P2代)中表型的影響。圖5rhMK對大鼠軟骨細胞去分化和再分化作用的影響。(A)rhMK對單層培養的軟骨細胞表型的影響。(B)對單層培養的耳彈性軟骨細胞II型膠原免疫組化染色分析。(C)rhMK高密度培養的軟骨細胞表型的影響。(D)對高密度培養的耳彈性軟骨細胞II型膠原免疫組化染色分析。MC和HDC分別指單層培養和高密度培養。結果發現，rhMK對纖維軟骨細胞和關節軟骨細胞的表型變化沒有顯著影響(見圖5A)。在培養過程中纖維軟骨細胞經過三代培養後，Col2al表達水平下降了3倍，rhMK沒有維持軟骨細胞的特徵。對纖維軟骨細胞和關節軟骨細胞的II型膠原免疫組化結果與半定量PCR結果一致。因此，可以說明r固K對傳代培養過程中的纖維軟骨細胞和關節軟骨細胞的表型變化沒有顯著影響，即不能阻止單層培養過程中兩種軟骨細胞的去分化作用。有意思的是，雖然耳彈性軟骨細胞僅傳了一代，但其Col2al的表達水平顯著下降，半定量PCR未能檢測到其表達，但培養時添加了rh服後，其下降趨勢可被抑制。通過免疫組化染色技術，發現P1代中未添加rhMK培養的細胞檢測不到II型膠原的表達，而添加rhMK的細胞組卻仍有約50%的細胞免疫組化結果呈陽性(見圖5B)。這些結果充分說明，r固K能夠阻止單層培養過程中一部分耳彈性軟骨細胞的去分化作用。(3)rhMK抑制高密度培養的軟骨細胞再分化作用眾所周知，高密度培養可以促使向軟骨細胞的分化即再分化過程。為了檢測使用rhMK擴增後的軟骨細胞其向軟骨細胞分化的潛力和rhMK對去分化的軟骨細胞的再分化能力的影響，我們採用高密度細胞培養方式來培養分化的軟骨細胞。在確認單層培養後的P6代關節軟骨細胞、P3代纖維軟骨細胞和耳彈性軟骨細胞已無法表達Col2al基因，II型膠原的免疫組化染色結果呈陰性後，用這些細胞在高密度培養條件下進行培養以評價這些細胞的軟骨表型變化。結果顯示(見圖5C)，單層培養後的P3代纖維軟骨細胞在高密度培養過程中，有無rhMK對Col2al表達均無影響，未檢測到其表達，II型膠原的免疫組化染色亦呈陰性。然而，單層培養過程中添加或未添加rhMK培養的P6代關節軟骨細胞和P3代耳彈性軟骨細胞在高密度培養後都能再次正常表達Col2al基因，但當高密度培養時添加rhMK後Col2al基因表達水平顯著受到抑制(見圖5C和5D)。因此，這些結果表明rhMK在單層培養時不能降低軟骨細胞的軟骨分化潛能，但在高密度培養時卻抑制軟骨細胞的再分化作用。本發明完全不同於現有技術對MK類蛋白的認識，實驗表明MK對體內三種軟骨細胞都具有很好的增殖作用，使其用於製備治療軟骨疾病的藥物，為今後臨床治療軟骨疾病提供新的選擇。同時，MK也可用於軟骨組織工程中軟骨細胞的體外擴增。本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明範圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的範圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。序歹U表〈110〉上海交通大學中期因子蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置〈160〉1Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>122PRT人(/fo/ff。s學'e/7s)1MetLysLysLysAspLysValLysLysGlyGlyProGlySerGluCys151015AlaGluTrpAlaTrpGlyProCysThrProSerSerLysAspCysGly202530ValGlyPheArgGluGlyThrCysGlyAlaGinThrGinArglieArg354045CysArgValProCysAsnTrpLysLysGluPheGlyAlaAspCysLys505560TyrLysPheGluAsnTrpGlyAlaCysAspGlyGlyThrGlyThrLys65707580ValArgGinGlyThrLeuLysLysAlaArgTyrAsnAlaGinCysGin859095GluThrlieArgValThrLysProCysThrProLysThrLysAlaLys100105110AlaLysAlaLysLysGlyLysGlyLysAsp115120權利要求1、一種如下(a)或(b)的蛋白在製備促軟骨組織生長藥物或治療軟骨組織疾病藥物中的用途(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.1所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列60％同源性的蛋白。2、根據權利要求l所述的用途，其特徵是，所述軟骨組織為透明軟骨組織、彈性軟骨組織或纖維軟骨組織。3、根據權利要求l所述的用途，其特徵是，所述軟骨組織疾病為外傷性軟骨損傷、骨關節炎、椎間盤退變、軟骨發育異常、軟骨發育不全症、肋軟骨炎或復發性多軟骨炎。4、根據權利要求3所述的用途，其特徵是，所述外傷性軟骨損傷為關節軟骨損傷、穿透關節軟骨下骨的關節軟骨損傷或外傷導致的椎間盤軟骨損傷。5、一種如下(a)或(b)的蛋白作為促軟骨細胞生長因子的用途(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60%同源性的蛋白。6、根據權利要求5所述的用途，其特徵是，所述促軟骨細胞生長因子為體外擴增軟骨細胞數量的生長因子。7、根據權利要求5所述的用途，其特徵是，所述用途是指胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白在製備促軟骨細胞生長因子藥物中的用途。8、根據權利要求5至7中任一項所述的用途，其特徵是，所述軟骨細胞為關節軟骨細胞、彈性軟骨細胞或纖維軟骨細胞。9、一種藥物組合物，包含如下(a)或(b)的蛋白作為活性成分和藥學上可接受的載體或賦形劑(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列6(^同源性的蛋白。10、一種包含如下(a)或(b)的蛋白的醫用裝置(a)其胺基酸序列如SEQIDNO.l所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列60%同源性的蛋白。11、根據權利要求IO所述的醫用裝置，其特徵是，所述蛋白以層面的形式存在於醫用裝置上。12、根據權利要求IO所述的醫用裝置，其特徵是，所述醫用裝置為支架形式。全文摘要一種生物
技術領域：
的中期因子蛋白的用途及含該蛋白的醫用裝置，本發明公開了一種如下(a)或(b)的蛋白在製備促軟骨組織生長藥物或治療軟骨組織疾病藥物中的用途，該蛋白作為促軟骨細胞生長因子的用途以及包含該蛋白的醫用裝置(a)其胺基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白；(b)至少與(a)中的胺基酸序列具有60％同源性的蛋白。本發明完全不同於現有技術對MK類蛋白的認識，實驗表明MK對體內三種軟骨細胞都具有很好的增殖作用，使其可用於製備治療軟骨疾病的藥物，為今後臨床治療軟骨疾病提供新的選擇，同時MK也可能會用於軟骨組織工程中軟骨細胞的體外擴增。文檔編號A61L27/54GK101601858SQ20091005213公開日2009年12月16日申請日期2009年5月27日優先權日2009年5月27日發明者張忠輝,偉韓申請人:上海交通大學