一種用mdck細胞獲得流感病毒高產毒株的方法

2023-07-07 16:49:26

專利名稱：一種用mdck細胞獲得流感病毒高產毒株的方法
技術領域：
本發明涉及一種用哺乳動物細胞獲得流感病毒疫苗毒株製備方法，特別涉及一種用MDCK細胞獲得流感病毒毒株的方法。
背景技術：
流感病毒是威脅人類健康的重大傳染病之一，主要通過呼吸道傳播，具有傳播速度快，致死率高及快速變異的特點，在人類歷史上多次發生過多次全球範圍的流感大流行。 流感病毒分為A，B，C(又稱甲、乙、丙)三型。其中A型病毒容易發生變異，依其兩種主要抗原(HA，NA)的不同，區分為不同的亞型。現發現一共有15種HA(H1-H15)及9種NA(N1_N9) 亞型。B型病毒的變異比較緩慢，C型病毒甚少對人類造成威脅。疫苗免疫仍是目前預防控制流感流行的行之有效的手段，臨床上應用的是用雞胚生產的三價滅活疫苗。早在20世紀30年代，流感的滅活疫苗就開展了動物實驗研究。1941 年雞胚培養的流感疫苗在美國首次獲得批准。目前應用的流感疫苗為三價滅活疫苗包括 Hmi、H3N2、B型。但是經過多年的臨床應用表明，滅活的流感病毒疫苗的效果基本上是肯定的，但也有不理想的地方，主要由於1、疫苗株與當前流行的毒株不匹配，因為疫苗的生產需要經過疫苗株的篩選和製備階段，耗時的特點限制了它的合理時效；2、雞胚供應和生長活性的限制，導致流感病毒的低產值；3、部分接種者對雞胚蛋白過敏，甚至危及到生命。近年來流感病毒全球流行有愈演愈烈之勢，對流感病毒疫苗的需求日趨增加。在研發的非雞胚培養的新型流感疫苗中利用哺乳動物細胞(主要是MDCK細胞) 代替雞胚培養病毒，可以達到降低成本，減少過敏反應，培養後的病毒株更接近自然分離的病毒(即病毒的抗原性保持不變)的特點。而且經過試驗表明，MDCK被連續傳代100代， 每代均做鼠的成瘤性實驗結果陰性，證明該細胞系不具備致瘤性，用於疫苗生產也是安全可靠的。傳統上利用哺乳動物細胞培養新型流感疫苗毒株是利用弱毒株與當前流行的毒株進行基因重配獲得，而弱毒株疫苗的生產要有冷適應毒株與流行毒株重配的步驟，通過免疫壓力篩選大約需要1-2個月的時間才能獲得重組毒株，而在疫苗的生產過程中，疫苗生產周期的長短決定了對流感病毒變異的反應能力，也直接決定了疫苗的質量，因此能否在較短的周期內製備高產的毒株成為疫苗生產過程中亟需解決的問題。

發明內容
有鑑於此，本發明提供了一種製備周期短，只需一周左右時間，具有高產特性的流感病毒疫苗毒株的製備方法。本發明的解決方案是一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，包括以下步驟步驟一對流感病毒毒株進行篩選，選取5 50株原始毒株行10-3-10-4稀釋，取 200 μ L-1000 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細胞上，放置在(X)2培養箱中1 2個小時，等到病毒完全吸附後取出，在M 72小時之間加入濃度為1 y g/ml-4 U g/ml TPCK胰酶顯 微鏡下觀察細胞病變(〔？幻，當細胞病變(cpm呈「冊」時，收穫病毒；步驟ニ 用50%組織細胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落監測方法(PFU 法)來檢測和計算病毒株的毒ヵ；步驟三提取流感病毒基因組RNA ；步驟四RT-PCR擴增流感病毒各基因節段；步驟五對PCR產物進行純化；步驟六用氯化韓法製備感受態宿主菌；步驟七製備質粒DNA限制性內切酶體系，此體系包括IOX限制性內切酶緩衝液 1 y 1-2 U 1lOX乙醯化BSA(lmg/ml) Iu l-2u 1質粒0嫩0.2ug-1.0ug限制性內切酶2U-4U滅菌去離子水10ia-20iU;步驟八0嫩片段回收；步驟九製備以下體系進行連接反應，5XT4DNA Ligase Buffer 2u l-4u 1PGEM-3ZF 載體(50ng/ U 1) 1 U 1-2 U 1PCR 產物(經純化)2 U 1-5 U 1T4DNA Ligase0. 5 U 1-1 U 1去離子水5 U 1-8 U 1步驟十提取質粒小量；步驟^^一將PCR擴增的片段克隆到pGEM-3zf 載體的Sma 1酶切位點中，採用八81 PRISMTM 377XL DNA %9じ61106『進行測序，從而確定高產毒株的基因序列；步驟十ニ 利用Vector NTI軟體進行核酸和蛋白質序列的對比，利用DNASTAR軟 件進行蛋白質翻譯分析。所述步驟ー中優選10株原始毒株行10_3-10_4稀釋，取500 U L稀釋液接種在成片 生長的1 0(細胞上，放置在0^培養箱中1個小時，等到病毒完全吸附後取出，在48小時之 間加入濃度為2 U g/mlTPCK胰酶顯微鏡下觀察細胞病變(CPm，當細胞病變(CP^呈「冊」 時，收穫病毒。所述步驟ニ中優選用50%組織細胞感染量(TCID50)方法來檢測和計算病毒株的 母カ。所述50%組織細胞感染量(TCID50)方法是將病毒株行倍比稀釋，接種對孔板，鋒 稀釋度設置平行4個復孔，鋒孔加入200 Uし稀釋液，35"C CO2培養箱孵育1小時後用Hank』 s 液洗ー遍，然後加入含終濃度2 U g/mlTPCK胰酶的維持液3ml後置35でCO^培養箱培養，並 於感染後M，48，72小時再分別加入終濃度2ilg/mlTPCK胰酶，促進病毒增埴，在感染後的 72小時收穫病毒。所述步驟三中提取流感病毒基因組8離方法為取10011し病毒液，加入 l 5mLEppendorf管中，然後加入 500ilL Lysis BufferRLT、0-巰基乙醇、60011し 70%乙醇，混勻，吸出600 μ L混合液進行離心，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。所述步驟四中RT-PCR擴增流感病毒各基因節段，選用病毒反轉錄試劑盒RT-PCR System對模板RNA進行反轉錄或Pfu DNAPolymerase進行PCR擴增。所述步驟五中對PCR產物進行純化的方法是通過PCR產物純化試劑盒，把純化柱放置在2mL收集管上，將PCR產物混同5倍體積的PB Buffer,進行離心收集，然後加40 μ L 雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。所述步驟六中用氯化鈣法製備感受態宿主菌的方法為取DH5CI單菌落，接種無抗菌素LB培養液，振搖培養，當至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養，於冰上預冷10 分鐘，離心後加入滅菌甘油，混勻，分裝於Eppendorf管中，貯於低溫冰箱中。所述步驟八中DNA片段回收的方法為採用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產生的線形化載體DNA進行回收。所述步驟十中提取質粒小量的方法為取單菌落於5ml含氨苄青黴素(IOOg/ ml)的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜，離心後將沉澱懸浮於150μ 1溶液I(50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，lOmmol/LEDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配製 20 μ 1 溶液 II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴 10 分鐘；加入 150 μ 1 預冷的溶液 III (3. Omol/L KCl，ρΗ4. 8)，混勻，冰浴10分鐘，再次離心，用70%乙醇洗滌沉澱一次，乾燥後加入50 μ 1含 RNA 酶 Οθμ /ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，ρΗ8· 0)，37°C 水浴 30 分鐘。本發明的流感疫苗毒株製備方法是建立在流感病毒反向遺傳學技術基礎上的，方便體外對病毒基因的操作，在無輔助病毒存在的情況下，完全由質粒轉染的形式獲得疫苗病毒株，達到周期短，產量高的效果。流感病毒MDCK細胞高產株反向遺傳技術平臺的建立，其方法步驟如下1、流感病毒真核表達載體的構建以質粒pHH21為模板，擴增出一段全長27^pDNA產物。該序列含有225bp人源RNA polymerase I啟動子和33bp鼠源RNApolymerase I終止子。PCR產物兩端引入Avr II和 HindIII酶切位點。引物設計如下AAG CTTPl :5』 -GTG-----CGG AGT ACT GGT CGA CCT CCG AAG-3』HindIIICCT AGGP2 5' -ATC-----GGC GGC CGG GAG GGC GT-3'Avr IIPCR反應條件94°C預變性5分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72 "C 200秒，共30個循環；72°C延伸7分鐘。PCR產物瓊脂糖電泳檢測，與目的片段大小相符，純化PCR產物備用。將上述PCR產物用Avr II和HindIII雙酶切，質粒載體pcDNA3. 1 (+)用Xba I和 HindIII雙酶切，純化回收相應片段；體外連接質粒載體與目的基因，轉化大腸桿菌。挑選陽性克隆，酶切鑑定正確後送測序；測序結果與目的基因相符，命名載體為PIVV II ；2、流感病毒反向遺傳8質粒及6+2質粒系統的構建將構建成功的PIVV II質粒載體用BSMBl酶切線性化，然後用Qiagen回收試劑盒回收線性化的PIVV II片段。同樣，將連接到PGEM-T載體的目的基因片段用BSMBI酶切，回收目的片段。將A/CNIC/246/00(Hmi)的1-8節段分別連接到PIVV II載體上，體系為 3 μ 1目標片段，1 μ 1載體，1 μ 1T4DNA連接酶15 μ lddH20,從而得到連接產物PIVV II-AX 系列8質粒。另外將甲1亞型流行代表株A/滬防/7/99的HA，NA基因片段擴增，依上述方法克隆入PIW II。替代pIVV II-AX系列中的HA，NA質粒，構成6+2系列。3、轉化將得到的連接產物轉化到感受態菌(Sure菌)中，42°C熱休克60秒，冰浴5分鐘， 37°C震蕩(轉速小於200轉/分鐘)45分鐘，離心，取沉澱塗布抗性平板，37°C孵育過夜，次日挑單菌落接種於5ml含抗菌素的LB培養基中，37°C震蕩過夜後小提質粒。4、酶切鑑定用內切酶鑑定目標序列是否與載體相連，實驗條件參照相關酶的使用說明。5、質粒的大量製備(聚乙二醇沉澱法)挑取單菌落接種5ml含氨苄青黴素(lOOug/ml)的LB培養基中，37°C震蕩培養過夜。將培養物轉接200ml含氨苄青黴素(lOOug/ml)的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養12-16小時，5000rpm離心15分鐘，棄上清；重懸細菌於IOOml冰預冷STE (0. Imol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA PH8. 0)。5000rpm 離心 15 分鐘，收集細菌；IOml 溶液 1 (50mmol/ L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCL, IOmmo 1/L EDTAPH8. 0)重懸細菌，混勻，冰浴10分鐘；加入20ml新配置的溶液2(0. 2mol/L NaOH 1 % SDS)，混勻，冰浴10分鐘；加入15ml預冷的溶液3 (3. Omol/L KCL, PH4. 8)，混勻，冰浴10分鐘；IOOOOrpm離心15分鐘，棄沉澱；加入等體積的預冷異丙醇，混勻，-20°C沉澱1小時；IOOOOrpm離心15分鐘，棄上清，乾燥； 3ml TE(10mmol/L Tris-HCL, lmmol/L EDTA, PH8. 0)溶解沉澱，再加入 3ml 冰預冷的 5mol/ L LiCl溶液，充分混勻，IOOOOrpm離心15分鐘，棄沉澱；上清中加入等體積冰預冷的異丙醇，充分混勻，IOOOOrpm離心15分鐘，棄上清，乾燥沉澱；用500 μ 1含RNA酶(20 μ g/ml) 的TE(10mmol/L EDTA, ρΗ8· 0)溶解沉澱，轉移到Eppendorf管中，室溫放置30分鐘；加入 500μ 1含13%聚乙二醇8000的1.6mol/L NaCl，充分混勻，_20°C沉澱2小時，於臺式離心機上12000rpm離心10分鐘，棄上清；400 μ 1 ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解沉澱，用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次；轉移水相於新的Eppendorf管，加100 μ 1 10Μ乙酸銨，充分混勻，加2倍體積乙醇，-20°C沉澱1小時，12000rpm離心10分鐘。70%冰預冷乙醇洗滌沉澱一次，晾乾；50 μ 1 ΤΕ(ρΗ8. 0)溶解沉澱，儲存於_20°C冰箱備用。6、轉染將四31~細胞培養在六孔細胞培養板中。80%成片後，將8個質粒DNA各取Iyg 共8 μ g與20 μ 1LF2000混合在室溫放置45分鐘，然後加入到培養板內。6小時後，用 optim-MEM維持液在33°C孵箱中繼續孵育，分別收穫M小時，48小時和72小時的細胞培養上清接種MDCK細胞，維持液中含TPCK-Trypsin至終濃度1 μ g/ml。7、重配病毒單向血凝抑制實驗鑑定首先RDE處理標準參照血清，然後製備用於血凝抑制試驗的4個血凝單位的抗原。 具體實施單向血凝抑制實驗的步驟加PBS或生理鹽水25 μ 1於96孔板的第B行至H行的每一孔。加1 10稀釋的經受體破壞酶處理過的標準血清50 μ 1於A行的每一孔。用多通道移液器從A行各孔取25 μ 1血清，倍比稀釋至H排各孔，最後25 μ 1棄去。取25 μ 1被檢病毒的4個血凝單位抗原加至相應一排各孔，混勻，室溫靜置15-30min，所有孔中加50 μ 1的紅血球(0. 5%雞紅細胞或0. 75%豚鼠紅細胞)，室溫靜置30-60min(雞血球30min ；豚鼠血球60min)後觀察結果。結果判定血凝被完全抑制的血清最大稀釋度的倒數為血凝抑制試驗的終點，該孔稀釋度即為HI實驗的效價。8,6+2重配病毒的基因型鑑定收穫重配病毒，依第一章實驗方法所述提取病毒核酸，應用甲1亞型特異性引物作RT-PCR，用QIAGEN公司的試劑盒回收PCR產物，然後測定DNA序列，結果提交NCBI比對。
具體實施例方式結合具體實施列進行說明。實施例1通過以下步驟用MDCK細胞獲得流感病毒高產Hmi毒株1、高產Hmi毒株的篩選將10株備選毒株Hmi (經MDCK細胞分離，病毒滴度彡1 160的原始毒株)行 10_3，10_4稀釋。取500 μ L病毒稀釋液接種成片生長的MDCK細胞05cm2培養瓶)，細胞記數約3-4X 106，接種前細胞用Hank，s液洗兩遍。正常MDCK細胞，細胞計數密度為3-4X106， 病毒的接種量MOI為1X10_4TCID50/細胞和X10_5TCID50/細胞。維持液中含有TPCK胰酶，並於感染後的對，48小時分別加入，使TPCK胰酶的終濃度達到1 μ g/ml。置於35°C CO2 培養箱培養，於感染後72小時或96小時收穫病毒，測定病毒血凝滴度。置35°C CO2培養箱1小時，待病毒完全吸附後，棄感染液，用Hank's液洗一遍。每瓶細胞加入含終濃度2 μ g/ml TPCK胰酶的細胞維持液:3ml，置35°C CO2培養箱培養。並於感染後M，48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶，促進病毒增殖。細胞感染後48 小時，鏡下觀察細胞病變(CPE)。當CPE呈冊時，收穫病毒。病毒滴度測定，採用紅細胞凝集實驗，計算血凝單位。2、Hmi毒株的毒力檢測TCID50檢測和計算將Hmi毒株行倍比稀釋，接種M孔板，每稀釋度設置平行4 個復孔。每孔加入200 μ L稀釋液，35°C CO2培養箱孵育1小時後用Hank』 S液洗一遍。然後加入含終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶的維持液3ml後置35°C CO2培養箱培養。並於感染後24， 48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶，促進病毒增殖。在感染後的72小時收穫病毒。-80°C冰箱凍存，待血凝滴度的測定。PFU檢測將Hmi毒株進行倍比稀釋，接種於小方瓶，每小方瓶加入500 μ L病毒稀釋液，33°C孵育1小時後，用HANKS液衝洗，然後加入第一層覆蓋液，33°C孵育72小時後加入第二層覆蓋液，24小時後計數空斑。3、HlNl病毒基因組RNA的提取取10(^1^病毒液，加入1.51111^ 611(10什管中，然後加入50(^1^ Lysis Buffer RLT、β -巰基乙醇、600 μ L 70%乙醇，混勻，吸出600微升混合液轉入帶吸附柱的離心管中，12000rmp離心15秒，棄離心液。將上部剩餘的其它液體再此上柱離心。12000rmp離心 15秒,棄離心液。向柱內力口入700yL Washing Buffer冊1，12000rmp離心15秒，棄離心液。將柱子移到新的收集管上，加入500 μ L WashingBuffer RPE，12000rmp離心15秒，棄離心液。再於柱子上加入500 μ L Washing Buffer RPE，13000_14000rmp離心2分鐘。將柱子移到一無^ia se汙染的Eppendorf管上，加入40 μ LDEPC處理的水，室溫放置1_3分鐘，12000rmp離心1分鐘，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。4、RT-PCR擴增流感病毒各基因節段使用GIBCO BRL公司的病毒反轉錄試劑盒THERMOSCRIPT RT-PCRSystem對模板 RNA進行反轉錄。取一隻無Rnase，無Dnase的Eppendorf管，依次加入RNA 模板5 μ L引物 F QOpM) 1 μ LddH204 μ L混勻後，在90°C水浴中加熱3分鐘，置於冰浴3分鐘使之迅速冷卻。然後加入cDNA Buffer 4 μ LDEPC-water 1 μ L0. IM DTT1 μ LRnase OUT1 μ LdNTPs2 μ LRT1 μ L60°C作用1小時，85°C 5分鐘，然後置冰上。加foiaseH 1 μ L 37°C作用30分。即為反轉錄好的cDNA。此步反應由通用引物完成全部8個基因節段的反轉錄。使用STRATAGENE 公司 Pfu DNA Polymerase 進行 PCR 擴增 PCR 反應體系10XPCR Buffer 5μ LdNTPs1 μ LPrimer F(20pM) 1 μ LPrimer R(20pM) 1 μ LPfu 酶(5U/ μ L) 1 μ LcDNA2 μ LddH2040 μ LTotal50 μ LPCR反應條件94 °C預變性5分鐘94°C30 秒55°C30 秒72 "C 420 秒；共 30 個循環72 °C延伸5分鐘5、PCR產物的純化採用PCR產物純化試劑盒，具體步驟如下把純化柱放置在aiiL收集管上，將PCR 產物混同5倍體積的PB Buffer，上柱，13000rmp離心45秒，棄離心液。向純化柱中加 750 μ L的PE Buffer, 13000rmp離心45秒，棄離心液。以同樣的速度再離心1分鐘充分去除洗液。將柱子放在一支幹淨的Eppendorf管上，加40 μ L雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。 13000rmp離心1分鐘收集離心液，_20°C保存。
6、用氯化鈣法感受態宿主菌的製備取DH5ci單菌落，接種無抗菌素LB培養液，37°C振搖培養過夜，次日按1 100轉入新的LB中繼續培養2小時左右，至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養。於冰上預冷10分鐘，4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；以IOml冰預冷的0. lmol/L CaCl2重懸細胞，放置於冰浴中20分鐘；4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；按每50ml培養物加入2ml 冰預冷的0. lmol/L CaCl2的比例重懸細胞沉澱，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，分裝於 Eppendorf管中，貯於_70°C低溫冰箱中備用。7、質粒DNA限制性內切酶消化取一滅菌Eppendorf管，依次加入限制性內切酶緩衝液、乙醯化BSA、質粒DNA、限制性內切酶，並以滅菌的去離子水補充至所需體積。以20 μ 1總反應體系為例IOX限制性內切酶緩衝液2μ1IOX 乙醯化 BSA(lmg/ml) 2μ 1質粒DNAΙ.ΟμΙ限制性內切酶4U滅菌去離子水補充至20 μ 1混勻，於離心機上快速離心5秒，將反應管至於37°C水浴保溫1-4小時。8、DNA片段回收採用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產生的線形化載體DNA進行回收，方法如下將待回收的DNA片段經電泳分離後，在長波紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA 片段，轉移到1. 5mlEppendorf管中，於天平上稱量，然後用1個吸頭搗碎，動作輕柔；加入60 μ 1 Ll Buffer,在50°C水浴中加熱15min，每!Bmin搖動1次，使瓊脂糖完全融化。將液體轉入吸附柱中，放在套管上，13000rpm離lmin;倒掉套管中的液體，向吸附柱中加入 500 μ 1 Ll Buffer，，室溫下放置lmin，1300rpm離Imin ；棄去套管中的液體，向吸附柱中加入700μ1 L2 Buffer，室溫下放置5min，13000rpm離Imin ；棄去管中的液體，再以1300rpm 離Imin ；將吸附柱放於1. 5mlEppendorf管中，加入30μ 1去離子水(或TE溶液，IOmmol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA，ph8. 0)，室溫下放置 lmin，13000rpm 離心 2min，所得液體中即含有回收的DNA片段，置於-20°C保存。9、連接反應體系的製備與轉化按下列體系進行連接反應5XT4DNA Ligase Buffer4μ 1PGEM-3ZF 載體(50ng/ μ 1)2 μ 1PCR產物(經純化)5 μ 1T4DNA Ligase1 μ 1去離子水8μ1 混合均勻後，於4°C連接過夜。取上述連接產物5 μ 1，加入到100 μ 1 DH5a感受態細菌中，置冰浴上45min後，42°C熱休克2min，再置於冰浴上2min，加入無抗生素的LB培養液400 μ 1，37°C搖床振搖Ih後，取100 μ 1菌液，向其中加入40 μ 1 120mg/ml 5，-溴-4 氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4μ 120mg/ml異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混勻後塗布含氨苄青黴素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養12_16h，挑取白色菌落，培養後提取質粒進行酶切鑑定。10、提取質粒小量取單菌落於5ml含氨苄青黴素(100g/ml)的LB培養基中，37 ！振蕩培養過夜， 取1. 5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，棄上清，沉澱懸浮於150 μ 1溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配製20 μ 1溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴10分鐘；加入150 μ 1預冷的溶液 III (3. Omol/L KCl, ρΗ4· 8)，混勻，冰浴10分鐘· 12000rpm5分鐘，轉移上清至新的離心管， 加等體積酚/氯仿抽提；轉移上層相至新的離心管，再用等體積氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，_20°C沉澱30分鐘，12000離心5分鐘。70%乙醇洗滌沉澱一次， 乾燥後加入 50 μ 1 含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，pH8.0)， 37°C水浴30分鐘，_20°C保存備用。11、將PCR擴增的片段以平端連接的方式克隆到pGEM-3zf載體的Sma I酶切位點中，採用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer進行測序。為了保證病毒基因組中的點突變是高產毒株所特有的，而不是PCR過程中發生的變異，我們對每一個基因節段至少測定3個克隆，並且各克隆序列符合率> 99%，從而確定高產毒株的基因序列。12、利用Vector NTI軟體進行核酸和蛋白質序列的對比，利用DNASTAR軟體進行蛋白質翻譯分析。製備好毒株後，將10株流感病毒MDCK分離株血凝滴定，再進行10-3，10-4稀釋接種細胞，兩代後血凝滴度仍保持> 1 160有四株，四代後血凝滴度仍保持> 1 160有兩株，五代以上仍保持高產特性的有一株，命名為A/CNIC/246/00 (Hmi)。

圖1為高產Hmi毒株細胞傳代記錄圖。由上圖可知，HlNl病毒株在傳代5代以後滴度> 1 640，高產性狀穩定下來。再對上述高產毒株做血凝抑制實驗，試驗結論如下
^^^^Antiseram virusesA/SH/7/99 (HlNl)A/BJ/1/86 (HlNl)Pl1:12801:160PlO1:12801:160P151:12801:160由上表可知高產毒株A/CNIC/246/2000(Hmi)Pl，P10, Ρ15代之間針對兩種標準血清的血凝抑制效價沒有差別，初步證實高產毒株的抗原性保持不變。高產毒株針對當前流行毒株A/SH/7/99 (HlNl)的血凝抑制效價比A/BJ/1/86 (Hmi)的血凝抑制效價要高。實施例2通過以下步驟用MDCK細胞獲得流感病毒高產Η2Ν2毒株1、高產Η2Ν2毒株的篩選將5株備選毒株Η2Ν2(經MDCK細胞分離，病毒滴度彡1 160的原始毒株)行10_3，10_4稀釋。取200 μ L病毒稀釋液接種成片生長的MDCK細胞Q5cm2培養瓶)，細胞記數約3-4X 106，接種前細胞用Hank』 s液洗兩遍。維持液中含有TPCK胰酶，並於感染後的 24，48小時分別加入，使TPCK胰酶的終濃度達到1 μ g/ml。置於35°C CO2培養箱培養，於感染後96小時收穫病毒，測定病毒血凝滴度。置35°C CO2培養箱1. 5小時，待病毒完全吸附後，棄感染液，用Hank』 s液洗一遍。每瓶細胞加入含終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶的細胞維持液:3ml，置35°C CO2培養箱培養。並於感染後對，48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK 胰酶，促進病毒增殖。細胞感染後48小時，鏡下觀察細胞病變(CPE)。當CPE呈冊時，收穫病毒。病毒滴度測定，採用紅細胞凝集實驗，計算血凝單位。2、H2N2毒株的毒力檢測PFU檢測將H2N2毒株進行倍比稀釋，接種於小方瓶，每小方瓶加入500 μ L病毒稀釋液，33°C孵育1小時後，用HANKS液衝洗，然後加入第一層覆蓋液，33°C孵育72小時後加入第二層覆蓋液，24小時後計數空斑。3、H2N2病毒基因組RNA的提取取10(^1^病毒液，加入1.51111^口口611(10什管中，然後加入50(^1^ Lysis Buffer RLT、β -巰基乙醇、600 μ L 70%乙醇，混勻，吸出600微升混合液轉入帶吸附柱的離心管中，12000rmp離心15秒，棄離心液。將上部剩餘的其它液體再此上柱離心。12000rmp離心 15秒，棄離心液。向柱內力口入700yL Washing Buffer冊1，12000rmp離心15秒，棄離心液。將柱子移到新的收集管上，加入500 μ L Washing Buffer RPE，12000rmp離心15秒，棄離心液。再於柱子上加入500 μ L Washing Buffer RPE，13000_14000rmp離心2分鐘。將柱子移到一無toase汙染的Eppendorf管上，加入40 μ LDEPC處理的水，室溫放置1_3分鐘， 12000rmp離心1分鐘，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。4、RT-PCR擴增流感病毒各基因節段使用GIBCO BRL公司的病毒反轉錄試劑盒THERMOSCRIPT RT-PCRSystem對模板 RNA進行反轉錄。取一隻無Rnase，無Dnase的Eppendorf管，依次加入RNA 模板5yL引物 F QOpM) 1 μ LddH204μ L混勻後，在90°C水浴中加熱3分鐘，置於冰浴3分鐘使之迅速冷卻。然後加入cDNA Buffer 4μ LDEPC-water 1 μ L0. IM DTT1 μ LRnase OUT1 μ LdNTPs2μ LRT1 μ L60°C作用1小時，85°C 5分鐘，然後置冰上。加foiaseH 1 μ L 37°C作用30分。即為反轉錄好的cDNA。此步反應由通用引物完成全部8個基因節段的反轉錄。使用STRATAGENE 公司 Pfu DNA Polymerase 進行 PCR 擴增PCR反應體系0161]10XPCR Buffer5 μ L0162]dNTPs1 μ L0163]Primer F(20pM)1 μ L0164]Primer R(20pM)1 μ L0165]Pfu 酶(5U/ μ L)1 μ L0166]cDNA2μ L0167]ddH2040 μ L0168]Total50 μ L0169]PCR反應條件0170]94°C預變性5分鐘0171]94 °C 30 秒0172]55 °C 30 秒0173]72 °C 420秒；共30個循環0174]72°C延伸5分鐘0175]5、PCR產物的純化0176]採用PCR產物純化試劑盒，具體步驟如下把純化柱放置在2mL收集管上，將PCR
產物混同5倍體積的PB Buffer，上柱，13000rmp離心45秒，棄離心液。向純化柱中加 750 μ L的PE Buffer, 13000rmp離心45秒，棄離心液。以同樣的速度再離心1分鐘充分去除洗液。將柱子放在一支幹淨的Eppendorf管上，加40 μ L雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。 13000rmp離心1分鐘收集離心液，_20°C保存。6、用氯化鈣法感受態宿主菌的製備取DH5ci單菌落，接種無抗菌素LB培養液，37°C振搖培養過夜，次日按1 100轉入新的LB中繼續培養2小時左右，至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養。於冰上預冷10分鐘，4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；以IOml冰預冷的0. lmol/L CaCl2重懸細胞，放置於冰浴中20分鐘；4°C、5000rpm離心10分鐘，棄上清；按每50ml培養物加入2ml 冰預冷的0. lmol/L CaCl2的比例重懸細胞沉澱，再加入15%體積滅菌甘油，混勻，分裝於 Eppendorf管中，貯於_70°C低溫冰箱中備用。7、質粒DNA限制性內切酶消化取一滅菌Eppendorf管，依次加入限制性內切酶緩衝液、乙醯化BSA、質粒DNA、限制性內切酶，並以滅菌的去離子水補充至所需體積。以20 μ 1總反應體系為例IOX限制性內切酶緩衝液 Ιμ IOX 乙醯化 BSA(lmg/ml) 1 μ 1質粒DNA0. 2μ 1限制性內切酶2U滅菌去離子水補充至10 μ 1混勻，於離心機上快速離心5秒，將反應管至於37°C水浴保溫1-4小時。8、DNA片段回收採用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產生的線形化載體DNA進行回收，方法如下將待回收的DNA片段經電泳分離後，在長波紫外光下從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段，轉移到1.5mlEppendorf管中，於天平上稱量，然後用1個吸頭搗碎，動作輕柔；加入 60 μ 1 Ll Buffer，在50°C水浴中加熱15min，每;3min搖動1次，使瓊脂糖完全融化。將液體轉入吸附柱中，放在套管上，13000rpm離Imin ；倒掉套管中的液體，向吸附柱中加入500 μ 1 Ll Buffer，，室溫下放置lmin，1300rpm離心Imin ；棄去套管中的液體，向吸附柱中加入 700 μ 1 L2 Buffer，室溫下放置5min，13000rpm離心Imin ；棄去管中的液體，再以1300rpm 離Imin ；將吸附柱放於1. 5mlEppendorf管中，加入30 μ 1去離子水(或TE溶液，IOmmol/ LTris-HCL, lmmol/L EDTA，ph8. 0)，室溫下放置 lmin，13000rpm 離心 2min，所得液體中即含有回收的DNA片段，置於-20°C保存。9、連接反應體系的製備與轉化按下列體系進行連接反應5XT4DNA Ligase Buffer 2μ 1PGEM-3ZF 載體(50ng/ μ 1) 1 μ 1PCR產物(經純化)2 μ 1T4DNA Ligase0. 5 μ 1去離子水5μ1混合均勻後，於4°C連接過夜。取上述連接產物5 μ 1，加入到100 μ 1 DH5a感受態細菌中，置冰浴上45min後，42°C熱休克2min，再置於冰浴上2min，加入無抗生素的LB培養液400 μ 1，37°C搖床振搖Ih後，取100 μ 1菌液，向其中加入40 μ 1 120mg/ml 5，-溴-4 氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)及4 μ 1 20mg/ml異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，混勻後塗布含氨苄青黴素(100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養12_16h，挑取白色菌落，培養後提取質粒進行酶切鑑定。10、提取質粒小量取單菌落於5ml含氨苄青黴素(100g/ml)的LB培養基中，37°C振蕩培養過夜， 取1. 5ml菌液加入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，棄上清，沉澱懸浮於150μ 1溶液 I (50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配製20 μ 1溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴10分鐘；加入150 μ 1預冷的溶液 III (3. Omol/L KCl, ρΗ4· 8)，混勻，冰浴10分鐘· 12000rpm5分鐘，轉移上清至新的離心管， 加等體積酚/氯仿抽提；轉移上層相至新的離心管，再用等體積氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積無水乙醇，混勻，_20°C沉澱30分鐘，12000離心5分鐘。70%乙醇洗滌沉澱一次， 乾燥後加入 50 μ 1 含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE(10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA，pH8.0)， 37°C水浴30分鐘，_20°C保存備用。11、將PCR擴增的片段以平端連接的方式克隆到pGEM-3zf載體的Sma I酶切位點中，採用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer進行測序。為了保證病毒基因組中的點突變是高產毒株所特有的，而不是PCR過程中發生的變異，我們對每一個基因節段至少測定3個克隆，並且各克隆序列符合率> 99%，從而確定高產毒株的基因序列。12、利用Vector NTI軟體進行核酸和蛋白質序列的對比，利用DNASTAR軟體進行蛋白質翻譯分析。所測高產H2N2毒株細胞傳代記錄與圖1大體一致。實施例3
通過以下步驟用MDCK細胞獲得流感病毒高產H3N2毒株與實施例1的不同之處在於，在第一步驟中篩選50株原始毒株H3N2行10_4稀釋， 取1000 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細胞上，放置在(X)2培養箱中2個小時，等到病毒完全吸附後取出，在72小時之間加入濃度為4 μ g/ml TPCK胰酶顯微鏡下觀察細胞病變 (CPE)，當細胞病變(CPE)呈「冊」時，收穫病毒；其它步驟相同。所測高產H3N2毒株細胞傳代記錄與圖1大體一致。
權利要求
1. 一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於包括以下步驟 步驟一對流感病毒毒株進行篩選，選取5 50株原始毒株行KT3-IO-4稀釋，取 200 μ L-1000 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細胞上，放置在(X)2培養箱中1 2個小時， 等到病毒完全吸附後取出，在M 72小時之間加入濃度為1 μ g/ml-4 μ g/ml TPCK胰酶顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)，當細胞病變(CPE)呈「冊」時，收穫病毒；步驟二 用50%組織細胞感染量(TCID50)方法或微型生物群落監測方法(PFU法)來檢測和計算病毒株的毒力；步驟三提取流感病毒基因組RNA ；步驟四=RT-PCR擴增流感病毒各基因節段；步驟五對PCR產物進行純化；步驟六用氯化鈣法製備感受態宿主菌；步驟七製備質粒DNA限制性內切酶體系，此體系包括IOX限制性內切酶緩衝液 IOX 乙醯化 BSA(lmg/ml) 質粒DNA 限制性內切酶滅菌去離子水1 μ 1-2 μ 1 1 μ 1-2 μ 1 0. 2μ g-1. 0μ g2U-4U10 μ 1-20 μ 1 ；步驟八DNA片段回收；步驟九製備以下體系進行連接反應，5XT4DNA Ligase Buffer PGEM-3ZF 載體(50ng/ μ 1) PCR產物(經純化) T4DNA Ligase 去離子水2 μ 1-4 μ 1 1 μ 1-2 μ 1 2 μ 1-5 μ 1 0. 5 μ 1-1 μ 1 5 μ 1-8 μ 1步驟十提取質粒小量；步驟i^一 將PCR擴增的片段克隆到pGEM-3zf載體的Sma I酶切位點中，採用ABI PRISMTM 377XL DNA kquencer進行測序，從而確定高產毒株的基因序列；步驟十二 利用Vector NTI軟體進行核酸和蛋白質序列的對比，利用DNASTAR軟體進行蛋白質翻譯分析。
2.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟一中優選10株原始毒株行10_3-10-4稀釋，取500 μ L稀釋液接種在成片生長的MDCK細胞上，放置在CO2培養箱中1個小時，等到病毒完全吸附後取出，在48小時之間加入濃度為2 μ g/ml TPCK胰酶顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)，當細胞病變(CPE)呈「冊」時，收穫病毒。
3.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟二中優選用50%組織細胞感染量(TCID50)方法來檢測和計算病毒株的毒力。
4.根據權利要求3所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述50%組織細胞感染量(TCID50)方法是將病毒株行倍比稀釋，接種M孔板，每稀釋度設置平行4個復孔，每孔加入200 μ L稀釋液，350C CO2培養箱孵育1小時後用Hank』 s液洗一遍，然後加入含終濃度2μ g/mlTPCK胰酶的維持液3ml後置35°C CO2培養箱培養，並於感染後M，48，72小時再分別加入終濃度2 μ g/mlTPCK胰酶，促進病毒增殖，在感染後的72 小時收穫病毒。
5.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟三中提取流感病毒基因組RNA方法為取IOOyL病毒液，加入 1. 5mLEppendorf 管中，然後加入 500μ L Lysis Buffer RLT、β -巰基乙醇、600 μ L 70% 乙醇，混勻，吸出600 μ L混合液進行離心，收集離心液，即為純化提取的病毒RNA。
6.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟四中RT-PCR擴增流感病毒各基因節段，選用病毒反轉錄試劑盒RT-PCR System對模板RNA進行反轉錄或Pfu DNA Polymerase進行PCR擴增。
7.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟五中對PCR產物進行純化的方法是通過PCR產物純化試劑盒，把純化柱放置在 2mL收集管上，將PCR產物混同5倍體積的PB Buffer,進行離心收集，然後加40 μ L雙蒸水靜置充分溶解洗脫DNA。
8.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟六中用氯化鈣法製備感受態宿主菌的方法為取DH5ci單菌落，接種無抗菌素 LB培養液，振搖培養，當至菌液0D600nm值為0. 4-0. 6時停止培養，於冰上預冷10分鐘，離心後加入滅菌甘油，混勻，分裝於Eppendorf管中，貯於低溫冰箱中。
9.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟八中DNA片段回收的方法為採用Gibco-BRL DNA凝膠回收試劑盒對酶切產生的線形化載體DNA進行回收。
10.根據權利要求1所述的一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，其特徵在於所述步驟十中提取質粒小量的方法為取單菌落於5ml含氨苄青黴素(100g/ml) 的LB培養基中，37 °C振蕩培養過夜，離心後將沉澱懸浮於150μ 1溶液I (50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl, lOmmol/LEDTA, PH8. 0)，冰浴 5 分鐘；加新鮮配製 20 μ 1 溶液 II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，混勻，冰浴 10 分鐘；加入 150 μ 1 預冷的溶液 III (3. Omol/L KCl，ρΗ4. 8)，混勻，冰浴10分鐘，再次離心，用70%乙醇洗滌沉澱一次，乾燥後加入50 μ 1含 RNA 酶(20 μ 1/ml)的 TE (10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)，37°C水浴 30 分鐘。
全文摘要
本發明提供一種用MDCK細胞獲得流感病毒高產毒株的方法，通過以下步驟進行製備對流感病毒毒株的篩選；對流感病毒株的毒力檢驗；流感病毒基因組RNA的提取；RT-PCR擴增流感病毒各基因節段；PCR產物的純化；用氯化鈣法製備感受態宿主菌；製備質粒DNA限制性內切酶；DNA片段回收；用體系驚醒連接與轉化；提取質粒小量；進行序列測定和與病毒原始序列對比；用此方法生產的流感病毒毒株製備周期短(一周左右時間)，具有高產特性。
文檔編號C12N7/00GK102191225SQ20101012595
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月17日 優先權日2010年3月17日
發明者李福勝 申請人:李福勝