一種土黴素高產菌株及其高通量篩選方法
2023-07-24 11:39:31 1
一種土黴素高產菌株及其高通量篩選方法
【專利摘要】本發明屬於微生物菌種篩選【技術領域】，具體涉及一株土黴素高產菌株及其高通量篩選方法。本發明篩選出一株土黴素高產菌株，其分類名為龜裂鏈黴菌（Streptomyces?rimosus）DC473，保藏在CGMCC，保藏編號為6218，保藏日期為2012年06月14日。本發明所涉及高產菌株篩選方法如下：試管斜面培養；孢子懸液製備；孢子懸液預處理；理性化篩選；高產菌株篩選；菌株複試。本發明的有益效果是：本發明以龜裂鏈黴菌代謝特徵為依據，合理設計高通量篩選方法，可快速篩選高產菌株，簡單易行，所涉及的培養基原料來源廣、成本低，適合於工業生產。
【專利說明】一種土黴素高產菌株及其高通量篩選方法【技術領域】
[0001]本發明涉及工業生物技術、微生物菌種篩選【技術領域】，尤其是一種土黴素高產菌株及其高通量篩選方法。
【背景技術】
[0002]土黴素(Spectniomycni)是龜裂鏈黴菌(Streptomyces rimosus)有氧發酵後生成的次級代謝產物，為四環類廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強的抑制能力，對多種球菌和桿菌有抗菌作用，對立克次體和阿米巴病原蟲也有抑制作用，用來治療上呼吸道感染、胃腸道感染、斑疹傷寒、恙蟲病，支原體屬感染和衣原體屬感染等疾病。
[0003]土黴素主要用做畜禽用藥及飼料添加劑，此外，以土黴素為原料生產半合成抗生素的市場前景較好，比如用其合成的強力黴素(多西黴素)，其市場價格是土黴素的5-7倍，用其為原料生產的美他環素，臨床效果優於土黴素，很多企業將土黴素、維生素B1、維生素B6等組成複方土黴素，能使土黴素療效增加，還能降低消化道副反應，是良好的動物飼料添加劑。因此，對土黴素高產菌株的選育和研究具有很好的經濟效益和社會效益。
[0004]N-甲基-N』 -硝基-N-亞硝基胍(NTG)是一種超誘變劑，應用廣泛，在鹼性條件下，NTG會形成重氮甲烷(CH2N2 )，它是引起致死和突變的主要原因。它的效應很可能是CH2N2對DNA的烷化作用引起的誘變劑與一個或多個核酸鹼基發生化學變化，使DNA複製時鹼基置換而引起變異。如何從高豐度的基因突變庫中快速獲得目的突變子是誘變育種的關鍵。傳統的隨機篩選方法不僅費時 費力，還容易錯失目的突變菌株。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種土黴素高產菌株及其高通量篩選方法。
[0006]為了完成上述目的，本發明採用的技術方案是:
[0007]一種土黴素高產菌株，分類名為龜裂鏈黴菌(Streptomyces rimosus)DC473,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0008]所述的菌株單菌落為扁平梅花型、孢子白色，基內菌絲棕褐色。
[0009]一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，包括以下步驟:
[0010]A、試管斜面培養:砂土管保藏的出發株轉接試管斜面，於溫度37.0±0.5°C，溼度40%-60%恆溫室培養3-5天；
[0011]B、孢子懸液製備:向成熟的試管斜面中加入IOmL無菌水，將孢子刮下，混勻，製成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為IO12-1O14個/mL ；
[0012]C、孢子懸液預處理:取製備好的孢子懸液，加入0.5-1.5uL亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.1%-0.3%，漩渦振蕩器振蕩30-60S，混勻後於37±0.5°C靜置2_3h ；
[0013]D、理性化篩選:將亞硝基胍處理的孢子懸液稀釋至IO1-1O7倍，稀釋液塗布在含10-15 μ g/mL 土黴素及0.2-0.4 μ g/mL的鏈黴素分離培養基上，於37.0±0.5°C，40%_60%溼度條件下暗培養3-5天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；
[0014]E、高產菌株篩選:在分離培養基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到F1斜面培養基上，於37.0±0.5°C，40%-60%溼度條件下培養3_5天；斜面成熟後接種到種子培養基中，於30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養24_30h ;種液成熟後接種到發酵培養基中，與種子相同條件30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養5_7天，生長到周期後檢測效價，選效價高於14000u/mL的菌株進行砂土乾燥保藏；
[0015]F、菌株複試:取沙土乾燥保藏的菌株轉接試管斜面，於37.0±0.5°C，40%_60%溼度條件下培養3-5天，斜面成熟轉接至種子培養基中，於37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養24-30h，種液成熟後轉接至發酵培養基中，于于37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養5-7天，取樣檢測效價，篩選保留效價高於14000u/mL的菌株。
[0016]所述步驟D中土黴素含量為10-15 μ g/mL，鏈黴素含量為0.2_0.4μ g/mL。
[0017]所述步驟A、步驟E和步驟F中所用的試管斜面培養基成分及其含量為:
6.0%-7.0% 麩皮，2.0%-2.5% 瓊脂。
[0018]所述步驟D固體分離培養基中成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米澱粉，0.2%_0.5%玉米漿，0.1%-0.3%硫酸銨，0.1%-0.5%碳酸鈣，0.3%-0.5%氯化鈉，2.0%_2.5%瓊脂。
[0019]所述的步驟E 和步驟F中所用的種子培養基成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米澱粉，0.2%-0.5% 玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，0.1%-0.3% 硫酸銨，0.1%_0.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5%氯化鈉。
[0020]所述的步驟E和步驟F中所用的發酵培養基成分及其含量為:10%_15%玉米澱粉，
0.2%-0.5% 玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，1.0%-1.5% 硫酸銨，1.0%_1.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑。
[0021]本發明的有益效果是:該菌株搖瓶發酵6天時，檢測效價為18000U/mL，較出發株(相同條件下效價為14000U/mL)提高了 28.6%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是本發明的篩選方法流程圖。
[0023]圖2是本發明中菌株DC473單菌落形態圖。
【具體實施方式】
[0024]本發明為一種土黴素高產菌株及其高通量篩選方法，該菌株搖瓶發酵6天時，檢測效價為18000U/mL，較出發株(相同條件下效價為14000U/mL)提高了 28.6%。
[0025]下面結合附圖對本發明做進一步說明。
[0026]具體實施例1，如圖2所示，一種土黴素高產菌株，分類名為龜裂鏈黴菌(Streptomyces rimosus) DC473,該菌株單菌落為扁平梅花型、孢子白色,基內菌絲棕褐色，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
[0027]一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0028]A、試管斜面培養:砂土管保藏的出發株轉接試管斜面，於溫度37.0±0.5°C，溼度40%-60%恆溫室培養3-5天。斜面培養基中成分及其含量為:6.0%-7.0%麩皮，2.0%_2.5%瓊脂；
[0029]B、孢子懸液製備:向成熟的試管斜面中加入一定量無菌水，將孢子刮下，混勻，製成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為IO12-1O14個/mL ；
[0030]C、孢子懸液預處理:取製備好的孢子懸液，加入一定量亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.1%-0.3%，漩渦振蕩器振蕩30-60S，混勻後於37±0.5°C靜置2_3h ；
[0031]D、理性化篩選:將亞硝基胍處理的孢子懸液進行稀釋，稀釋液塗布在含10-15 μ g/mL 土黴素及0.2-0.4 μ g/mL的鏈黴素分離培養基上，於37.0±0.5°C，40%_60%溼度條件下暗培養3-5天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養；分離培養中成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，0.1%-0.3%硫酸銨，0.1%_0.5%碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，2.0%-2.5% 瓊脂；
[0032]E、高產菌株篩選:在分離培養基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到Fl斜面培養基上，於37.0±0.5°C，40%-60%溼度條件下培養3_5天；斜面成熟後接種到種子培養基中，於30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養24_30h ;種液成熟後接種到發酵培養基中，與種子相同條件30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養5_7天，種子培養基成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0%黃豆粉，0.1%_0.3%硫酸銨， 0.1%-0.5%碳酸鈣，0.3-0.5%氯化鈉；發酵培養基成分及其含量為:10%-15%玉米澱粉，0.2%-0.5% 玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，1.0%-1.5% 硫酸銨，1.0%_1.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑；
[0033]F、菌株複試:取沙土乾燥保藏的菌株轉接試管斜面，於37.0±0.5°C，40%_60%溼度條件下培養3-5天，斜面成熟轉接至種子培養基中，於37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養24-30h，種液成熟後轉接至發酵培養基中，於37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養5-7天，取樣檢測效價，篩選保留效價高於14000u/mL的菌株；發酵培養到周期後，用比色法進行效價檢測，篩選得到一株效價達18000U/mL的菌株(相同條件下效價為14000U/mL)，此菌株進行沙土乾燥保藏。該高產菌株命名為DC473，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期為2012年06月14日。
[0034]具體實施例2，菌株複試
[0035]A.試管斜面培養:砂土管保藏的出發株及篩選出的高產菌株DC473分別轉接試管斜面，於溫度37.0±0.5°C，溼度40%-60%恆溫室培養3_5天，斜面培養基中成分及其含量為:6.0%-7.0% 麩皮，2.0%-2.5% 瓊脂；
[0036]B.種子培養:斜面成熟分別轉接至種子培養基中，於30.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養24-30h ;種子培養基成分及其含量為:2.0-3.0%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，0.1%-0.3% 硫酸銨，0.1%-0.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉；
[0037]C.發酵培養:種液成熟後分別接種到發酵培養基中，於30.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養3-5天，發酵培養基成分及其含量為:10%-15%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0% 黃豆粉，1.0%-1.5% 硫酸銨，1.0%-1.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑；
[0038]效價檢測:發酵培養到周期後使用比色法對發酵單位進行檢測。以上實施事例2中的實驗重複進行三次，出發株三次複試發酵單位為14105U/mL、14240U/mL、14010U/mL，平均值為14118U/mL ； DC473菌株三次複試發酵單位分別為18120U/mL、18502U/mL、18370U/mL，平均值為18331U/mL.。比較DC473與出發菌株的平均效價克制，與出發株相比本發明所述的龜裂鏈黴菌DC473的發酵單位提高了 29.8%。
【權利要求】
1.一種土黴素高產菌株，其特徵在於:分類名為龜裂鏈黴菌(Streptomyces rimosus)DC473，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6216，保藏日期是2012年6月14日。
2.根據權利要求1所述的一種土黴素高產菌株，其特徵在於:所述的菌株單菌落為扁平梅花型、孢子白色，基內菌絲棕褐色。
3.—種土黴素高產菌株高通量篩選方法，其特徵在於包括以下步驟: A、試管斜面培養:砂土管保藏的出發株轉接試管斜面，於溫度37.0±0.5°C，溼度40%-60%恆溫室培養3-5天； B、孢子懸液製備:向成熟的試管斜面中加入IOmL無菌水，將孢子刮下，混勻，製成孢子懸液，用血球計數板計數，使孢子濃度為IO12-1O14個/mL ； C、孢子懸液預處理:取製備好的孢子懸液，加入0.5-1.5uL亞硝基胍溶液，使其終濃度為0.1%-0.3%，漩渦振蕩器振蕩30-60s，混勻後於37±0.5°C靜置2_3h ； D、理性化篩選:將亞硝基胍處理的孢子懸液稀釋至IO1-1O7倍，稀釋液塗布在含10-15μ g/mL土黴素及0.2-0.4 μ g/mL的鏈黴素分離培養基上，於37.0±0.5°C，40%_60%溼度條件下暗培養3-5天，培養時第一天正置，第二天起倒置培養； E、高產菌株篩選:在分離培養基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到F1斜面培養基上，於37.0±0.5°C，40%-60%溼度條件下培養3_5天；斜面成熟後接種到種子培養基中，於30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養24_30h ;種液成熟後接種到發酵培養基中，與種子相同條件30.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養5_7天，生長到周期後檢測效價，選效價高於14000u/mL的菌株進行砂土乾燥保藏； F、菌株複試:取沙土乾燥保藏的菌株轉接試管斜面，於37.0±0.5°C，40%-60%溼度條件下培養3-5天，斜面成熟轉接至種子培養基中，於37.0±0.5°C,220rpm條件下震蕩培養24-30h,種液成熟後轉接至發酵培養基中，於37.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養5_7天，取樣檢測效價，篩選保留效價高於14000u/mL的菌株。
4.根據權利要求3所述的一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，其特徵在於:所述步驟D中土黴素含量為10-15 μ g/mL,鏈黴素含量為0.2-0.4 μ g/mL。
5.根據權利要求3所述的一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，其特徵在於:所述步驟A、步驟E和步驟F中所用的試管斜面培養基成分及其含量為:6.0%-7.0%麩皮，.2.0%-2.5% 瓊脂。
6.根據權利要求3所述的一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，其特徵在於:所述步驟D固體分離培養基中成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，.0.1%-0.3% 硫酸銨，0.1%-0.5% 碳酸鈣，0.3%-0.5% 氯化鈉，2.0%-2.5% 瓊脂。
7.根據權利要求3所述的一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，其特徵在於:所述的步驟E和步驟F中所用的種子培養基成分及其含量為:2.0%-3.0%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0%黃豆粉，0.1%-0.3%硫酸銨，0.1%-0.5%碳酸鈣，0.3%-0.5%氯化鈉。
8.根據權利要求3所述的一種土黴素高產菌株高通量篩選方法，其特徵在於:所述的步驟E和步驟F中所用的發酵培養基成分及其含量為:10%-15%玉米澱粉，0.2%-0.5%玉米漿，2.0%-3.0%黃豆粉，1.0%-1.5%硫酸銨，1.0%-1.5%碳酸鈣，0.3%_0.5%氯化鈉，.0.01%-0.05%磷酸二氫鉀，0.1%-0.3%聚醚消沫劑。
【文檔編號】C12N1/20GK103789245SQ201410087566
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月11日 優先權日:2014年3月11日
【發明者】張慧, 趙麗紅, 鄭萬靜 申請人:河北聖雪大成製藥有限責任公司