一種單鏈抗體及其在特異性檢測正平行型G‑四鏈體中的應用的製作方法
2023-07-27 16:21:11 2
本發明屬於生物檢測技術領域，更具體地，涉及一種單鏈抗體及其在特異性檢測正平行型G-四鏈體中的應用。
背景技術：
端粒G-四鏈體的構象確證一直以來都是G-四鏈體研究領域的熱點，已有結果表明端粒G-四鏈體在不同的溶液環境中會形成不同的構象，例如，在K+溶液中，端粒富G序列形成混合型G-四鏈體，在Na+溶液中，端粒富G序列形成反平行型G-四鏈體，而在Sr2+溶液中，端粒富G序列則會形成正平行型G-四鏈體。除此之外，分子擁擠，高溫等溶液環境也會促進端粒正平行型G-四鏈體的形成。但是，這些研究結果都只局限於在體外溶液環境中測得，對於端粒富G序列在細胞內環境下的構象確證依然缺乏相關證據。
G-四鏈體這一特殊的核酸二級結構參與的生命事件及其是否能成為藥物靶點也引起了研究者們的廣泛關注。因此，G-四鏈體在體內是否能夠穩定存在以及G-四鏈體小分子配體能否直接靶向G-四鏈體結構DNA成為了關鍵問題。近年來，G-四鏈體抗體發展成為了研究細胞內G-四鏈體的有用工具。2001年，Christiane Schaffitzel等利用核糖體展示技術篩選得到的G-四鏈體抗體Sty49，並利用此抗體檢測到了原核生物棘尾蟲中端粒G-四鏈體結構DNA。此研究成果首次證明了體內G-四鏈體結構的存在。而分別在2013年和2014年，Shankar Balasubramanian等利用噬菌體展示技術篩選得到的高親和力高選擇性G-四鏈體抗體BG4，首次證明了在哺乳動物細胞中存在DNA G-四鏈體結構以及RNA G-四鏈體結構，為體內G-四鏈體的研究取得了突破性的進展。同時，這些研究結果也表明G-四鏈體抗體成為了體內G4結構與功能的重要研究工具。目前為止，已發表的用於G4結構與功能研究的G-四鏈體抗體主要有五個，分別為mevIIB4，Sty49，HF2，BG4,1H6。這些抗體都能夠特異性識別G-四鏈體結構DNA，而與其他的DNA二級結構不結合，但是，它們對不同構象G-四鏈體的選擇性較差，這也限制了這些抗體用於特定功能位點的G-四鏈體的結構研究。
技術實現要素：
本發明的目的在於根據現有技術中的不足，提供了一種單鏈抗體。
本發明的另一目的在於提供上述單鏈抗體在特異性檢測正平行型G-四鏈體中的應用。
本發明的目的通過以下技術方案實現：
本發明提供了一種單鏈抗體，編碼該單鏈抗體的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本發明設計的單鏈抗體在體外酶聯免疫吸附試驗中可選擇性識別正平行型構象G-四鏈體DNA，而與混合型G-四鏈體以及反平行型G-四鏈體DNA檢測不到結合。同時，將純化的抗體用於細胞內G-四鏈體的檢測，也發現此抗體可選擇性識別正平行型構象G-四鏈體。因此，本發明的單鏈抗體片段可以用於細胞內源性G-四鏈體DNA的研究。以基因組DNA以及端粒DNA為例來說明本發明的單鏈抗體片段使用免疫螢光以及染色質免疫沉澱等方法檢測正平行構象G-四鏈體核酸二級結構的應用。
本發明同時提供了一種單鏈抗體的製備方法，將SEQ ID NO：1所示的基因序列插入到原核表達載體中，獲得重組質粒，再將重組質粒轉化到大腸桿菌中進行表達與純化。
本發明同時提供上述單鏈抗體在特異性檢測正平行型G-四鏈體中的應用。
更近一步地，可以將上述單鏈抗體應用於製備特異性檢測正平行型G-四鏈體的材料，例如，製備成相應的試劑盒或試紙材料。
一種特異性檢測正平行型G-四鏈體的免疫方法，具體為使用SEQ ID NO：1所示基因序列編碼的單鏈抗體作為探針，用於特異性識別正平行型G-四鏈體。
優選地，所述的免疫方法為ELISA方法。另外，採用現有其他免疫分析方法特異性檢測正平行型G-四鏈體均在本發明的保護範圍之內。
更優選地，一種特異性檢測正平行型G-四鏈體的ELISA方法，具體步驟為：將生物素標記的待測核酸樣品結合到鏈黴親和素包被的96孔板，4℃過夜，採用ELISA緩衝液洗板，然後採用封閉液室溫孵育，孵育後用ELISA緩衝液洗板；加入單鏈抗體，孵育後用ELISA緩衝液洗板，加入用封閉液稀釋的HRP-Protein A，孵育後，用緩衝液洗板；然後加入TMB底物，顯色，加入終止液終止反應，用酶標儀測定450nm的吸光值。
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
本發明提供的抗體基因序列長度較短，克隆簡單，便於表達；其轉錄翻譯的單鏈抗體片段(scFv)可以特異性地檢測識別正平行構象的G-四鏈體結構，實現了正平行構象G-四鏈體結構與其他二級結構的區分，用簡單的酶聯免疫吸附試驗可在體外檢測正平行型G-四鏈體DNA；本發明提供的基因序列所編輯的抗體蛋白作為有用工具實現在細胞內基因組中正平行型構象G-四鏈體的探測，並可通過共定位的方法實現在細胞內特定位點檢測正平行型構象G-四鏈體結構的形成及其相應生物功能。
附圖說明
圖1為基因序列編碼的單鏈抗體片段純化結果，其中，E-1、E-2、E-3、E-4分別為純化過程中洗脫下來的目的單鏈抗體片段四次重複檢測。
圖2為單鏈抗體片段選擇性結合正平行型G-四鏈體DNA的ELISA結果。
圖3為單鏈抗體片段選擇性結合正平行型G-四鏈體DNA的競爭性ELISA結果。
圖4為單鏈抗體片段在細胞水平上選擇性結合正平行型G-四鏈體DNA的免疫螢光結果。
圖5為單鏈抗體片段與正平行型G-四鏈體DNA(MYC)的結合常數測定。
圖6為單鏈抗體片段選擇性在基因組內的結合位點分布。
圖7為單鏈抗體片段選擇性在基因組內的結合序列G-四鏈體構象分析。
圖8為單鏈抗體片段在活細胞內結合端粒正平行型G-四鏈體的生物信息學結果分析。
圖9為單鏈抗體片段在活細胞內結合端粒正平行型G-四鏈體的免疫印跡結果分析。
圖10為端粒DNA在不同離子環境下的G-四鏈體構象測定。
圖11為單鏈抗體片段結合在不同離子環境下的不同構象端粒G-四鏈體DNA結合常數測定。
圖12為單鏈抗體片段與TRF2共定位檢測端粒正平行型G-四鏈體DNA的免疫螢光結果。
圖13為單鏈抗體片段或BG4與TRF2共定位檢測端粒G-四鏈體優勢構象的免疫螢光結果。
具體實施方式
以下結合具體實施例和附圖來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
實施例1
抗體的篩選：本發明的正平行型G-四鏈體抗體是採用噬菌體展示技術進行篩選的。篩選抗原為生物素標記的能形成正平行型G-四鏈體的DNA序列，將其溶解於50mM Tris-HCl(pH 7.4)，95℃加熱10分鐘並緩慢退火至室溫，使其形成正平行型G-四鏈體結構。噬菌體抗體庫為Tomlinson(I+J)，購買自英國(Source Bioscience)，用於正平行型G-四鏈體抗體篩選的抗體庫為Tomlinson J。抗體篩選過程都嚴格按照MRC描述的方法開展(http://www.geneservice.co.uk/products/proteomic/datasheets/tomlinsonIJ.pdf)，但由於G-四鏈體抗原的特殊性，在實驗中使用ELISA緩衝液(50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.4，100mM氯化鉀)替代了PBS來維持其正平行型G-四鏈體構象的穩定，用鏈黴親和素標記的磁珠替代了免疫管來實現抗原抗體的分離。簡單步驟如下所述：
首先，將生物素標記的正平行型G-四鏈體DNA包被在鏈黴親和素標記的磁珠上，室溫輕搖孵育15分鐘，洗去未結合的DNA並用生物素封閉磁珠表面。將2×1014個表面攜帶抗體的噬菌體與競爭性雙鏈DNA平衡1小時之後加入標有正平行型G-四鏈體的磁珠中，室溫孵育1小時，將未結合的噬菌體洗去，與正平行型G-四鏈體結合噬菌體使用胰酶消化洗脫。洗脫的噬菌體感染TG1大腸桿菌進行擴大培養。歷經三輪重複篩選之後，將獲得的噬菌體感染HB2151，平板培養獲得單菌落，挑取約100個單菌落進行單鏈抗體的表達，並使用ELISA的方法進行陽性克隆的驗證。通過對不同DNA二級結構結合的驗證以及對不同構象G-四鏈體的結合表徵，最終獲得能特異性識別正平行型G-四鏈體的單鏈抗體片段，對其基因序列進行測序分析得到序列SEQ ID NO：1。
實施例2
SEQ ID NO：1所示基因序列編碼的單鏈抗體片段的屬性表徵，具體步驟如下：
1.測試的核酸樣品製備：核酸樣品購自英駿生物技術有限公司，將核酸適量溶於磷酸鉀的緩衝液中(ELISA緩衝液：pH 7.4，50mM磷酸二氫鉀，100mM KCl)，超微量紫外測定濃度，再用ELISA緩衝液稀釋成5μM的DNA溶液在95℃下加熱5min後緩慢冷卻退火到室溫，用圓二色譜法測定核酸的DNA二級結構及G-四鏈體構象。
測試的核酸樣品代表性序列如表1所示，包括：
表1
2.單鏈抗體片段的表達
通過基因工程技術將SEQ ID NO：1所示的基因序列插入到原核表達載體pSANG10中，獲得重組質粒，經測序驗證序列正確。再將重組質粒轉化到大腸桿菌(BL21DE3)中進行表達與純化：將儲存在-80℃的菌種接種到5mL 2×TY+2％葡萄糖+50ng/μl卡那黴素的培養基中，放入搖床中30℃，200rpm過夜培養；取3mL過夜培養的菌種接種到300mL 2×TY+0.1％葡萄糖+50ng/μl卡那黴素的培養基中，放入搖床中37℃，250rpm培養3小時。加入IPTG到培養基中使其終濃度為0.2mM，放入搖床中25℃，280rpm過夜培養。收集過夜培養的細菌，4℃4000rpm離心30分鐘，棄去上清，得菌體沉澱。用12mL的TES重懸菌體沉澱，冰上放置10分鐘。加入18mL 5倍稀釋的TES(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,20％sucrose,pH8.0)，冰上放置15分鐘。4℃8000rpm離心10分鐘，取上清液。上清液用鎳柱純化，上樣之後，用20mL洗滌液(PBS+100mM NaCl+10mM咪唑,pH8.0)洗去雜蛋白。待雜蛋白衝洗完全，用洗脫液(PBS+250mM咪唑,pH8.0)將抗體洗脫下來。洗脫下來的樣品用超濾管超濾脫鹽濃縮。濃縮後的樣品用BCA法測定抗體濃度並用液氮速凍儲存於-80℃。
取表達純化過程中各個階段的樣品進行SDS-PAGE分析，得到結果如下圖1所示，洗脫下來的樣品即為目的抗體片段，並且純度高。純化獲得的單鏈抗體片段可用於後續的活性表徵。
3.單鏈抗體片段識別正平行型G-四鏈體DNA檢測：
(1)體外酶聯免疫吸附法檢測
體外酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法如下：配製生物素標記的100nM待測G-四鏈體樣品，分別結合到鏈黴親和素包被的96孔板，4℃過夜。ELISA緩衝液洗板3次。用封閉液(ELISA緩衝液中加入3％的BSA)室溫孵育3小時。ELISA緩衝液洗板3次。加入100μL封閉液稀釋的正平行型G-四鏈體抗體片段，孵育1小時後，用含0.1％Tween20的ELISA緩衝液洗板3次。加入用封閉液以1:5000稀釋的HRP-Protein A，孵育1小時後，再用含0.1％Tween20的ELISA緩衝液洗板3次。加入100μL新鮮配製的TMB底物，顯色5～30分鐘。加入50μL 1mol/L H2SO4終止反應，並用酶標儀測定450nm各孔的吸光值。450nm處的吸光值代表抗體與DNA的結合強度，吸光值越高代表結合越強。
酶聯免疫吸附法試驗(ELISA)的結果顯示(圖2)，單鏈抗體高選擇性結合正平行型G-四鏈體DNA(MYC和BCL-2)，對反平行型G-四鏈體(TBA)、混合型G-四鏈體(hTELO)、雙鏈DNA、單鏈DNA以及發卡DNA結構未檢測到結合，說明本發明所提的基因序列所編輯的單鏈抗體片段高選擇性識別正平行型構象G-四鏈體DNA。
競爭性ELISA進一步驗證抗體結合正平行型G-四鏈體的特異性，即在上述的ELISA實驗方法加入抗體的步驟之前，將抗體與等量的競爭性DNA先孵育1個小時。檢測結果顯示(圖3)，正平行型構象的G-四鏈體(MYC，KIT1，KIT2，HIF-1α，VEGF，KRAS，RET)可完全競爭結合單鏈抗體，而混合型G-四鏈體(hTELO)、反平行型G-四鏈體(TBA，HRAS-1)以及非G4序列(duplex，Random ssDNA，DNA Hairpin)都表現為很弱的競爭能力或無競爭能力。這一結果與之前的測定結果保持一致。
(2)細胞內免疫螢光法檢測
接種數量為4×105的SiHa細胞於confocal專用皿中，過夜培養待細胞貼壁，用Lipo2000分別轉染200nM的Cy5螢光基團標記的正平行型G-四鏈體DNA MYC以及反平行型G-四鏈體DNA TBA入SiHa細胞，培養24小時，收集細胞。用4％多聚甲醛室溫避光固定15分鐘，PBS洗5分鐘，共洗3次，用0.3％Triton X-100(破膜)孵育室溫孵育30分鐘，PBS洗5分鐘，3次，用5％山羊血清封閉液封閉細胞，室溫孵育3小時，直接孵育大連抗體片段，4℃過夜，封閉液洗細胞樣品，因單鏈抗體片段上攜帶FLAG標籤，因此孵育抗FLAG的一抗標記scFv，4℃過夜，封閉液洗去未結合的抗體，同時孵育螢光標記的二抗以及DAPI(染細胞核)，室溫孵育1小時，用封閉液洗去未結合的抗體及核染料後，使用雷射共聚焦顯微鏡進行成像分析。
免疫螢光法的結果顯示(圖4)，本發明所提的基因序列編輯的單鏈抗體片段在細胞內顯示的螢光點與螢光標記的正平行型G-四鏈體MYC的重疊融合高達80％，而與反平行型G-四鏈體TBA的螢光點重疊小於20％，表明，D1在細胞內對正平行型G-四鏈體的結合依然保持構象選擇性，可用於細胞內正平行型構象G-四鏈體DNA的檢測。
4.單鏈抗體片段與正平行型G-四鏈體抗體的結合常數測定
為定量表徵本發明所提的基因序列編輯的單鏈抗體片段對不同構象G-四鏈體的親和力，用ELISA的方法測定了scFv對MYC、TBA和hTELO的結合常數，結果顯示(圖5)，D1對正平行型構象G-四鏈體MYC的結合常數為27.8±0.9nM，而對反平行型G-四鏈體TBA以及混合型G-四鏈體hTELO檢測不到結合。這一結果也同時驗證本發明所提的基因序列編輯的單鏈抗體片段特異性結合正平行型構象G-四鏈體，並且結合親和力高。
實施例3
將發明單鏈抗體應用於基因組正平行型G-四鏈體DNA的檢測
為檢測基因組正平行型G-四鏈體在活細胞內的形成並穩定存在，將SEQ ID NO：1所示的基因片段插入真核表達載體pEGFP-N3質粒中，通過瞬時轉染的方法使單鏈抗體片段在活細胞中表達24小時。將表達了單鏈抗體片段的SiHa細胞收集，用1％多聚甲醛交聯固定15分鐘，終止交聯裂解細胞，用Micrococcal Nuclease(Chip Grade)切斷染色質得到200到500bp的染色質片段，該染色質片段去10％作為Input，剩下的進行後續的染色質免疫沉澱實驗。將已經結合染色質上正平行型G-四鏈體DNA與scFv複合物用Protein A進行分離，最終得到scFv結合的來自人基因組的DNA片段。
將上述實驗獲得的DNA片段進行Hiseq2500測序分析，結果顯示(圖6)，相比於Input，本發明的單鏈抗體片段在活細胞內富集了8345個顯著峰，顯示正平行型G-四鏈體廣泛分布在基因組中。單鏈抗體片段的結合位點主要分布於基因區(69.7％)，剩下的都分布在基因間區(30.3％)。正平行型G-四鏈體在基因區的分布情況為非翻譯區UTR(5％),啟動子轉錄起始位點promoter-TSS(16.8％),轉錄終止位點TTS(1.7％),外顯子(14.7％)以及內含子(30.3％)。
為了驗證本發明所提的基因序列所編輯的單鏈抗體片段在活細胞內結合的DNA片段是否為正平行型G-四鏈體DNA，從由scFv富集的前99個峰中選取寡核苷酸分別用圓二色譜法(CD)驗證。結果顯示(圖7)，大部分的DNA片段形成了正平行型構象的G-四鏈體(91/99,92％)，剩下的DNA形成了混合型G-四鏈體，而在混合型G-四鏈體的CD圖譜中也是以正平行型構象吸收峰為主峰。結果證明了本發明所提基因序列所編輯的單鏈抗體片段在基因組中選擇性結合正平行型G-四鏈體的特性。
實施例4
將本發明單鏈抗體應用於端粒正平行型G-四鏈體DNA的檢測
人端粒DNA由TTAGGG重複序列組成，符合形成G-四鏈體的序列特徵，為了探究正平行型G-四鏈體結構是否在細胞內端粒區穩定形成，根據上述ChIP-seq數據，我們設定出現大於3個TTAGGG/CCCTAA重複序列的峰為端粒峰，進行進一步的生物信息學數據分析。結果顯示(圖8)，在scFv ChIP樣品中，含有我們設定的端粒峰是Input樣品中的4.8倍，說明細胞內端粒正平行型G-四鏈體被scFv檢測到並被富集。同時，得到的樣品做端粒dot blotting分析得到結果顯示(圖9)，scFv能夠明顯富集端粒序列，說明D1在活細胞內結合到正平行型端粒G-四鏈體，也同時說明這種二級結構的在活細胞內的形成並穩定存在。
已有文獻報導，端粒富G序列在不同溶液背景下形成不同構象的G-四鏈體結構，我們選用了三種離子溶液環境下形成的三種不同構象端粒G-四鏈體以檢測本發明的單鏈抗體片段對其結合能力。首先，我們通過CD實驗驗證了端粒富G序列在Na+離子溶液中退火形成反平行型G-四鏈體，在K+離子溶液中退火形成混合型G-四鏈體，在Sr2+溶液中，則形成正平行型G-四鏈體(圖10)。在此三種溶液條件下，我們用ELISA實驗分別檢測scFv與三種不同構象端粒G-四鏈體的結合能力，結果顯示(圖11)，scFv與由Sr2+誘導的正平行型端粒G-四鏈體的結合常數為17.6±0.8nM，而與混合型以及反平行型的端粒G-四鏈體檢測不到結合，此結果再一次說明了scFv與正平行型構象G-四鏈體結合的選擇性，為細胞內端粒正平行型構象G-四鏈體的檢測提供了可靠依據。
免疫螢光結果顯示(圖12)，相比於未處理細胞中的scFv與TRF2融合螢光點，經RNase處理後的細胞中融合點並未發生顯著變化，說明端粒區正平行型構象G-四鏈體DNA的存在。相應的經DNase處理後的細胞中融合點減少，也說明端粒區正平行型G-四鏈體DNA的形成並被本發明所提基因序列編輯的單鏈抗體片段特異性識別而檢測到。
此外，我們將本發明設計的單鏈抗體(scFv)用於探究細胞內端粒G-四鏈體的主要存在構象，利用BG4與scFv這兩個G4抗體進行了定量分析研究。抗體BG4能夠結合不同構象的G-四鏈體DNA，而本發明所提基因序列編輯的scFv選擇性結合正平行型構象的G4DNA，通過對比檢測D1、BG4與端粒結合蛋白TRF2的共定位量來判斷端粒G-四鏈體構象的唯一性或多樣性。結果顯示(圖13)，在兩組細胞端粒結合蛋白TRF2螢光點計數無顯著變化的情況下，細胞核內BG4檢測到的G-四鏈體的量明顯多於scFv檢測到的正平行型G-四鏈體的量，說明體內存在不同構象的G-四鏈體DNA，並且BG4檢測到的端粒G-四鏈體的量也多於scFv檢測到的正平行型G-四鏈體的量，但增加倍數不大(1.3倍)，說明端粒區除了正平行型構象G-四鏈體之外，還存在其他兩種構象的G-四鏈體(混合型和反平行型)，而正平行型構象可能是端粒G-四鏈體在細胞內的主要存在方式(77％)。
上述結果表明本發明提供的單鏈抗體是一個優秀的大分子探針，可用於細胞內基因組以及特定功能區域的正平行型G-四鏈體DNA的結構研究。
SEQUENCE LISTING
中山大學
一種單鏈抗體及其在特異性檢測正平行型G-四鏈體中的應用
16
PatentIn version 3.3
1
735
DNA
單鏈抗體
1
atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 120
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta ctaagaatgg tgcggcgaca 180
aggtacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaag 300
ggtcatcaga ggtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga 360
ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 420
tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 480
cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 540
ctgatctatg ctgcatccag tttgcaaagt ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 600
tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 660
tactgtcaac agagttacag tacccctaat acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc 720
aaacgggcgg ccgca 735
2
27
DNA
MYC
2
tggggagggt ggggagggtg gggaagg 27
3
32
DNA
KRAS
3
agggcggtgt gggaagaggg aagaggggga gg 32
4
22
DNA
KIT1
4
agggagggcg ctgggaggag gg 22
5
21
DNA
KIT2
5
cgggcgggcg cgagggaggg g 21
6
27
DNA
BCL-2
6
gggcgggcgc gggaggaagg gggcggg 27
7
22
DNA
HIF-1α
7
ggggagggga gagggggcgg ga 22
8
20
DNA
VEGF
8
ggggcgggcc gggggcgggg 20
9
26
DNA
RET
9
gggtaggggc ggggcggggc gggggc 26
10
21
DNA
hTELO
10
gggttagggt tagggttagg g 21
11
15
DNA
TBA
11
ggttggtgtg gttgg 15
12
27
DNA
HRAS-1
12
tcgggttgcg ggcgcagggc acgggcg 27
13
27
DNA
duplex-1
13
cgggcgcggg aggaaggggg cgggagc 27
14
27
DNA
duplex-2
14
gctcccgccc ccttcctccc gcgcccg 27
15
16
DNA
DNA hairpin
15
tgcgatactc atcgca 16
16
17
DNA
Random ssDNA
16
ggcatagtgc gtgggcg 17