差異保護的正交羊毛硫氨酸技術的製作方法

2023-07-27 11:40:41

專利名稱：差異保護的正交羊毛硫氨酸技術的製作方法
差異保護的正交羊毛硫氨酸技術 相關申請的交叉參考
本申請要求2005年8月12日申請的美國序號60/708,086和2006 年5月26日申請的美國序號60/808,907的權益，這兩個文獻整體在 此引入作為參考。
背景技術：
在二十世紀下半葉，抗生素的發展使醫療實踐發生巨大變革。在 這個時期由於傳染性疾病引起的死亡率顯著下降。Armstrong等，(1999) 2S7， 61-66。然而，自1982年以來，因傳染性疾病所導致的死 亡穩步攀升，同時抗生素抗性病原體不斷增多。各種各樣的醫學上重 要的細菌正變得愈加抗臨床感染治療中常用的抗生素。在最近20年， 在文獻中已出現了成千上萬記錄此現象的報告和書籍。Armstrong等， (1999) 61-66; Dessen等，(2001) Cww i>wg T^geto /"/e".
D/soni /， 11-16; Rapp (2000) Swrg/w/ecf (X髒/z—. 7, 39-47; Benin & Dowell (2001) ^M打'6/o"'c -es^ta"ce <3M<i /wp/z.c如'ora f/ze a; pra戸'她 wse o/朋f/w/cro6/a/ Humana Press, Totowa, NJ。
儘管需要講授抗生素的更適宜用法，但更重要的是需要新抗生 素。萬古黴素被認為是抗許多嚴重細菌感染的最後一道防線。萬古黴 素抗性致病菌株的發現令人擔憂；其預示著用當前可用藥物不能治療 的多藥物抗性病原體增多。擔心之處在於，除非不久就開發出新抗生 素，否則我們將實際上回到抗生素前的時代。
有一類小的、新結構的抗生素，叫做羊毛硫抗生素(I類細菌素)， 其可基於它們的化學結構和生物合成差異而被分為5個亞類A(I)類、 A(II)類、B類、雙組分類和未知結構類。知曉該類抗生素已有幾十年，但仍沒有廣泛測試其治療傳染性疾病的潛在可用性，即便已知許多羊 毛硫抗生素既有效又具有尤其是抗革蘭氏陽性種的廣語活性。此情況 的主要原因在於普遍難以以足夠的、成本有效的量獲得這些分子，以 使它們能夠進行測試和商品化。
乳鏈菌肽A(NisinA)(圖l)提供了羊毛^L抗生素的良好實例，並 提供了與羊毛硫抗生素相關的化學複雜度的數量和類型的良好實例。 羊毛硫抗生素富含含硫胺基酸一羊毛硫氨酸(Lan, ala-S-ala),經常是 3-曱基-羊毛硫氨酸(MeLan, abu-S-ala)。 Lan由丙氨酸殘基組成，這些 丙氨酸殘基經硫醚橋連接，以建立對生物活性關鍵的環結構。典型地， 在羊毛硫抗生素上有3-5個這樣的環，這些環有許多經常彼此重疊。 Lan和MeLan被認為總是具有內消旋立體化學結構。除了 Lan和 MeLan殘基以外，在羊毛硫抗生素中還可存在其它的翻譯後修飾的氨 基酸(圖2),例如2，3-二脫氫丙氨酸(Dha)、 2，3-二脫氫ot-氨基丁酸 (didehydrobutyrine)(Dhb)、不飽和羊毛硫氨酸衍生物(例如S-氨基乙烯 基-D-半胱氨酸(AviCys)和S-氨基-D-曱基半胱氨酸)以及D-丙氨酸、2-氧代丙醯基、2-氧代丁醯基和羥丙醯基殘基。如在乳鏈菌肽A的情況 下，由Lan和MeLan組成的環結構可為重疊的(例如環D和E),這進 一步增加了分子的複雜度。
革蘭氏陽性細菌負責生物合成已知的羊毛硫抗生素。它們使用一 系列作用於核糖體合成的前原肽的有序酶促步驟製造成熟分子。負責 編碼修飾酶類的基因通常簇集在8-10 Kb的DNA片段上，該DNA片 段可位於染色體上、質粒上或作為轉座子的組成部分。在A(I)類羊毛 硫抗生素中，由/a^基因編碼的核糖體合成的前肽中的所有絲氨酸和 蘇氨酸殘基都由/aw萬基因編碼的酶脫水，這些脫水的胺基酸參與和更 接近分子的羧基端定位的鄰近半胱氨酸殘基形成硫醚鍵。該反應由 /a"C基因表達的蛋白催化。對於某些羊毛硫抗生素如表皮素(epidermin) 和變異菌素1140(mutacin 1140)而言，C-端半胱氨酸被/a"Z)基因表達 的酶脫羧基，並轉變為S-氨基乙烯基-D-半胱氨酸。在被/朋r基因的產物運出細胞後，接著修飾過的前原肽的前導序列被lanP編碼的胞外蛋白酶切除，產生成熟抗生素。Ra等，(1996) Microbiology-Uk.142,1281-1288; Kupke&Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69, 139-150; Kuipers 等, (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69, 139-169.
難以獲得足夠量或足夠純度的羊毛硫抗生素阻礙了對其治療應 用的潛在有用性的研究嘗試。在迄今為止表徵的40種左右的羊毛硫 抗生素(Chatterjee等，(2005) C7zew/c"/ 705, 633 683)中，只有
A(I)類羊毛硫抗生素一由乳鏈^求菌(5^eptococcw /ac泡)產生的乳鏈菌 肽A以工業規;漢製造，在最近50年發現了其作為食物防腐劑的廣泛 應用。長期廣泛地使用乳鏈菌肽A而沒有發生顯著抗性 (DelvesBroughton等,(19%)丄ee,e"/zoeA; /"^77加'o加/ Jbwr"a/ o/ Gewera/ awd Mo/ecw/ar MfcraZn'o/ogy.眠193-202)已為開發 用於各種用途的其它羊毛硫抗生素提供了強大推動力。
乳鏈菌肽A的大規模生產使用多年來已精通的發酵工藝進行。乳 鏈菌肽A的純化方法近來已申請了美國專利(USPA 2004/0072333)。 該方法使用昂貴的蛋白酶混合物後繼之以柱色譜。但是，沒有已公布 的、商業上可行的乳鏈菌肽A純化方法。這證實了當前尋找生產純乳 鏈菌肽A的適當方法和治療用的其它羊毛硫抗生素的價值。
出現了多種用於大規模生產羊毛硫抗生素的潛在選擇。站在原料 成本的立場上，發酵工藝毋庸置疑地應是最好的方法。當前用於許多 羊毛硫抗生素的發酵方法以每升微克的量生產，這對藥物開發是不夠的。
或者,已就A(I)類羊毛硫抗生素開發出使用羊毛硫抗生素修飾手段的體外生產。Kupke 和 Gotz (1996) Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. 69, 139-150; Kuipers 等， (1996) Antonie Van Leeuwenhoek InternationalJowwa/ o/Gewera/ aw<i Mb/ecw/ar M/craZ)〖o/ogy. 69， 161-169。 負責翁3譯 後修飾羊毛硫抗生素前原肽的酶在無細胞裂解物中無活性或者為被 純化的實體，但LanD是個例外。Kupke和Gotz (1996)爿wto"/e F"朋
M/croWo/ogy.仰，139-150; 10; Kupke和Gotz (1997) /owma/ o/ 編—ca/ CA纖勿.272， 4759-4762; Kupke等，(1992) Jow腦/ o/ 5aCo/ow. 77《5354-5361; Kupke等,(1993) M'croZn'o/ogy "2, 43-48; Kupke等，(1995) Jowtw/ o/C/zew/W^v. 風11282-11289; Kupke等，(1994) Jow腦/ 。/則og/ca/ CT 醒勿. 2M, 5653-5659。對於A(II)類羊毛硫抗生素，最近在5We"ce中已有報 道，體外合成乳鏈球菌素481是可能的。屬於該群組和B類羊毛硫抗 生素的分子僅使用單個多頭酶(multiheaded enzyme) LanM來完成 Dha、 Dhb、 Lan和MeLan殘基的形成。Xie等，(2004) 5We"ce. 3W, 679-681。乳鏈球菌素481生物合成的報告未提供有關產量和純度的任 何詳細信息，但他們的工作以納克規模進行。在該報告中描述的工藝 呈現出小但有意義的進步，其淨皮廣為稱讚地接受進一步表明了開發羊 毛硫抗生素作為治療劑的迫切需要。
使用被克隆入適宜表達載體和非敏感性宿主中的/朋基因簇以工 業規模生產羊毛硫抗生素的第三選4奪是不大可能的，原因在於系統的 複雜性和可能需要差異調節所涉及的多種基因的表達。業已將 gallidermin的/朋基因簇克隆入枯草桿菌(Bac/〃船wto'to)中，試圖改 善該特定羊毛硫抗生素的生產情況。但是，該策略沒有產生極大增加 的產量，不適於所有的羊毛硫抗生素，因為已知基因調節位點在種與 種之間可變。相關方法使用克隆到大腸桿菌(Esc/zen'c/z/a co//)中的變異 菌素1140的人工基因。該人工基因置換了參與和半胱氨酸密碼子形 成疏醚橋的絲氨酸和蘇氨酸殘基的天然密碼子。將此修飾過的基因克 隆到pET32中，並在大腸桿菌Origami菌抹中表達，以使二硫鍵最大 化。開發出新化學方法，以從二硫基逐出一個石克原子，由此將它們轉變為硫醚。 一般來說，該方法證明是可行的，但所獲得的產量低，原 因在於二硫鍵的多種排列和難以將活性形式與非活性異構體分離開。
對乳鏈菌肽A和其它羊毛硫抗生素的生物活性關鍵的是經常重 疊的環結構，這些重疊的環結構造成了在合成上難以克服的問題。已 廣泛研究了用於合成含各種羊毛硫氨酸的生物活性肽以及羊毛硫抗 生素的體外合成方法。合成羊毛硫抗生素的挑戰是艱巨的，迄今為止 還沒有研發全面的合成策略。在文獻中已報告了幾種合成羊毛硫氨酸 的方法。這些方法包括使用鹼性或親核條件基於原位脫硫預組裝肽中
的半胱氨酸單元。Galande等，(2003) Aopo/ymera Sde"c^ 7/,
543-551; Galande & Spatola (2001) .「e/fe ^ 戶e/ "6fe Sc/e"ce. S, 247-251。脫硫方法仍沒有顯示出任何商業可行性，原因在於沒有非對 映選擇性和產量低。還已經使用了仿生方法，其中Dha殘基在預先形 成的肽中產生，接著進行Michael加成，以形成羊毛硫氨酸環。肽的 預組織可能導致非對映選4奪性Michael加成。Burage等，(2000) C7zemz'Wo^Jowma/. 6， 1455-1466。還已經4吏用將樹脂上的肽 環化，其中合成含正交保護的羊毛硫氨酸的線性肽，接著環化和裂解 環形肽產物。Melacini等，(1997), J CTzew. W， 2252-2258; Osapay 等，(1997) c/ow"g/ o/Mecfc/"a/ C%ew&".卯，2441-2251 。這些方法有 前景，但沒有生產具有重疊^L醚環結構的羊毛^L抗生素的能力。這在 人們考慮到大部分已知的羊毛斬u抗生素含重疊環時變得特別重要。
從構思上說，開發體外合成方法，包括改進的固相肽合成(SPPS) 方法，相比於生物和仿生方法有明顯的優勢。首先，分子組成不限於 正常組別的生理性胺基酸；有可能設計胺基酸類似物並使用非常確實 的固相合成法摻入它們。還可以實施平行合成，由此急劇增加候選底 物的數量。因為該方法完全在體外實施，所以消除了許多由體內合成 生物活性分子引起的顧慮。例如，在發酵過程中產物降解不會是顧慮 因素，生物活性分子對生產微生物的細胞毒性效應也不會是顧慮因 素。為了達到體外合成的目的，已使用不同方法設計用於SPPS的具
有潛在適宜的保護基的正交羊毛硫氨酸，例如半胱氨酸的Michael加 成反應預形成Dha。 Probert等，(1996) 7^ra/ze^cw37, 1101-1104。該方法產生非對映體的1:1混合物，因此顯示出基本不具 有商業價值。還已經報告了用受保護的半胱氨酸使絲氨酸內酯開環， 但這產生羊毛硫氨酸和闢u酯的混合物。已研究了氮丙咬的開環法，但 表明其產生區域異構體混合物，原因是氮丙啶在oc和卩位斷開。Dugave & Menez (1997) r^ra/ze<ira"-Ay附/wef7. S， 1453-1465; Swali等，(2002) re/ra/ze^ow. 5& 9101-9109。大部分最新的報告提示，用受保護的卩-溴丙氨酸使適當保護的半胱氨酸烷基化可導致合成羊毛硫氨酸，但該 方法不允許構建具有重疊環的分子。Zhu (2003)Jowma/ o/ Og纖'c C7z細勿.20, 4062-4072。
因為市售可得用於SPPS的Fmoc/Boc保護的類似物不足以解決 合成羊毛硫抗生素和其它構象約束的生物活性肽的挑戰，本領域有需 要合成具有分子內橋的肽，所述分子內橋建立內部環結構，包括多個 環和重疊環結構。具體地說，需要大規模合成羊毛硫抗生素的體外方 法。
發明概述
因此，本發明提供合成分子內橋連的多肽的方法，所述多肽包含 至少一個分子內橋，所述方法包括
a)將下式的差異保護的正交分子內橋的游離並友基端
formula see original document page 12與固體支持體或者與任選地結合有固體支持體的胺基酸或多肽的遊
離氨基端偶聯，其中L"為共價結合的胺基酸側鏈，其中D、 E和G是保護基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中用於 脫去保護基D的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸的氨
基保護基的那些條件不同；
b) 脫去保護基E，形成游離氨基端；
c) 將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述胺基酸 脫保護，得到新的游離氨基端；
d) 任選地重複c)一次或多次；
e) 脫去保護基G,形成游離羧基端；
f) 將e)的游離羧基端與游離氨基端偶聯；
g) 脫去保護基D，形成游離氨基端；和
h) 任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所 述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；和
i) 任選地重複h)—次或多次。
本發明還提供合成分子內橋連多肽的方法，所述多肽包含兩個重 疊的分子內橋，所述方法包括
a)將下式的第 一個被差異保護的正交分子內橋的游離羧基端
formula see original document page 13
與固體支持體或者與任選地結合有固體支持體的胺基酸或多肽的遊
離氨基端共價結合，其中"為共價結合的胺基酸側鏈，其中D、 E和 G是保護基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中 用於脫去保護基D的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸 的氨基保護基的那些條件不同；
b) 脫去保護基E,形成游離氨基端；
c) 將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述胺基酸 脫保護，得到新的游離氨基端；d) 任選地重複c)一次或多次；
e) 將下式的第二個被差異^f呆護的正交分子內橋的游離羧基端
M——N-H
Q——N-H
O
O
—I H 、OH
與游離氨基端共價結合，其中L"如上定義，其中M、 Q和T是保護 基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中D和M 在不同條件下才被脫除，其中G和T在不同條件下才被脫除，其中用 於脫去保護基M的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸的 氨基保護基的那些條件不同，其中E和Q在與將脫去D的那些條件 和將脫去M的那些條件不同的條件下被脫除；
f) 脫去保護基Q，形成游離氨基端；
g) 任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所 述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；
h) 任選地重複g)—次或多次；
i) 脫去第一個被差異保護的正交分子內橋的保護基G，形成游離 羧基端；
j)將游離羧基端與游離氨基端偶聯；
k)脫去第一個被差異保護的正交分子內橋的保護基D,形成游離 氨基端；
1)任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述 胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端； m)任選地重複l)一次或多次；
n)脫去第二個被差異保護的正交分子內橋的保護基T，形成游離 羧基端；
o)將游離羧基端與游離氨基端偶聯；
p)脫去第二個被差異保護的正交分子內橋的保護基M，形成游離氨基端；和
q)任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所
述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；和 r)任選地重複q)—次或多次。
另外，本發明提供合成分子內橋連多肽的方法，所述多肽包含兩 個分子內橋，其中所述兩個分子內橋形成如本文定義的兩個串聯環或 兩個嵌入環。本發明還提供合成包括乳鏈菌肽A在內的羊毛硫抗生素 的方法。
另 一 方面，本發明提供通過本文公開的方法合成的分子內橋連多肽。
又一方面，本發明提供下式的差異保護的正交羊毛硫氨酸
formula see original document page 15
其中D和E是不同的保護基，例如為Fmoc、 Alloc或IvDde，而 G是保護基，例如炔丙酯和千酯。


圖1顯示了乳鏈菌肽A [SEQIDNO:l]的結構，包括殘基7和10 之間建立環E的分子內橋、殘基9和12之間建立環D的分子內橋、 殘基16和22之間建立環C的分子內橋、殘基24和27之間建立環B 的分子內橋以及殘基28和32之間建立環A的分子內橋。環A、 B和 C例舉了串聯環結構，而環D和E例舉了重疊環。還顯示了合成的乳 鏈菌肽A類似物[SEQ ID NO:2]。
圖2顯示了翻譯後修飾的胺基酸的非限制性實例。
圖3顯示了用於製造差異保護的羊毛硫氨酸的逆合成策略。
圖4顯示了 Fmoc-保護的半胱氨酸的合成策略。圖5顯示了用於正交保護的羊毛硫氨酸1的合成策略，包括
N(Alloc)-D-P-溴丙氨酸炔丙酯的合成。
圖6顯示了用於正交保護的羊毛硫氨酸2的合成策略，包括 N(ivdDe)-D-P-溴丙氨酸千酯的合成。
發明詳述
本文公開了用於固相合成肽的差異保護的正交羊毛硫氨酸技術 (DPOLT)。該技術依靠多種正交保護肽橋的大量生產，所述肽橋的活 性羧基和氨基保護基可被差異脫除。正交保護的肽橋可用於例如固相 肽合成，以製備構象約束的生物活性肽，其中含有形成環結構的分子 內橋。DPOLT尤其可用於合成含一個以上的分子內橋並具有重疊環 結構的多肽。
儘管並不限於此，但DPOLT能夠以商業上可行的方式進行結構 複雜的羊毛硫抗生素(包括具有重疊環結構的那些羊毛硫抗生素)的體 外生產。羊毛硫抗生素肽的合成使用例如常規固相肽合成方法進行， 該方法將羊毛硫氨酸類似物摻入到肽中，所述羊毛硫氨酸類似物的活 性羧基和氨基用可差異脫除的保護基正交保護起來。該方法可源源不 斷地提供用於例如治療應用的新抗生素。
縮寫詞
本文使用的以下縮寫詞具有下述含義
■ Alloc =烯丙氧基羰基
■ B(K^叔丁氧基羰基
■ DMAP-二曱氨基吡啶
■ DMF二二曱基曱醯胺
■ Fmoc-9-芴基甲氧基羰基 ,HMBC-異核多鍵相關譜
■ HMQC二異核多量子相關i普■ HPLC=高效液相色譜
■ ivDde- l-(4，4-二曱基-2,6-二氧代-亞環己基)-3-曱基-丁基
■ LC-MS =液相色譜-質語
■ MS-質譜
■ NMR-核磁共振光譜
■ NOESY二核歐沃豪斯效應光譜
■ TFA-三氟乙酸
■ TLC-薄層色譜
■ TOCSY-全相關譜
分子內橋連多肽
本文公開的方法可用於合成分子內橋連多肽，包括但不限於羊毛 硫抗生素。本文使用的術語"多肽"、"蛋白"和"肽"指由胺基酸單體通 過醯胺鍵連接的鏈組成的多聚體。多肽可通過一個胺基酸的oc-碳羧基 與另一個胺基酸的氨基之間的縮合或偶聯反應而形成。因此，在鏈的 一端(氨基端)的末端胺基酸具有游離氨基，而在鏈的另一端(羧基端) 的末端胺基酸具有游離羧基。本發明的分子內橋連多肽任選地可用各 種各樣的(包括氨基和/或羧基端上的)官能團或保護基修飾或保護。
本文使用的術語"分子內橋連肽"或"分子內橋連多肽"是指具有至 少一個分子內橋的肽鏈。本文使用的術語"分子內橋"、"肽橋"、"分子 內橋連部分"或"橋"是指單個肽鏈中包含的或製備用於摻入單個肽鏈 中的兩個胺基酸殘基彼此通過它們的側鏈共價結合時形成的結構。這 種鍵產生了內部交聯的多肽。本文使用的術語"環"或"環結構"是指分 子內橋連多肽的交聯部分，即需要介於兩個共價結合的胺基酸殘基之 間並包含這兩個共價結合的胺基酸殘基的多肽鏈連同由它們的側鏈 形成的共價鍵的結構。
本發明的分子內橋連肽具有下列通式formula see original document page 18
式I
其中A是H或氨基端保護基；Z是H或羧基端保護基；X"是共 價鍵、單個胺基酸或至少2個胺基酸長的肽鏈；R"是通過其側鏈形成 分子內橋的胺基酸殘基。在單個"X，，肽鏈中的側鏈之間或在位於不同 "X"肽鏈中的胺基酸之間可另外具有分子內橋。
本文使用的術語"氨基端保護基"和"羧基端保護基"指能夠加至反 應位點或任選地由反應位點(在此情況下分別為氨基和羧基)脫除的任 何化學部分，以允許在該反應^f立點以外的位點處操作化學實體。
本發明的分子內橋連多肽的胺基酸可包含20種天然胺基酸以及 非天然胺基酸、胺基酸類似物和肽模擬物。Spatola, (1983)載於
Weinstein編輯，Marcel Dekker， New York,第267頁。本發明中使用的 所有胺基酸都可為D-或L-光學異構體。在優選實施方案中，本發明 的分子內橋連多肽包含任意組合的一個或多個以下殘基2，3-二脫氫 丙氨酸(Dha)、 (Z)-2，3-二脫氫oc-氨基丁酸(Dhb)、羥基丙醯基、2-氧代 丁醯基和2-氧代丙醯基(參見圖2)。
本領域一般技術人員將認識到，本發明的分子內橋連肽可具有一 個以上的分子內橋，產生各種可能結構。例如，對於包含兩個分子內 橋的分子內橋連多肽，分子內橋可為如下所示的串聯的、嵌入的或重 疊的。formula see original document page 19
在兩個分子內橋是重疊的情況下，意味著第二個分子內橋的一個 胺基酸在一級胺基酸序列中位於第一個分子內橋的兩個胺基酸之間， 而第二個分子內橋的另一個胺基酸在第一個分子內橋的兩個胺基酸 之前或之後。在兩個分子內橋是串聯的情況下，意味著第二個分子內 橋的兩個胺基酸在一級胺基酸序列中位於第一個分子內橋的兩個氨 基酸之前或之後。在兩個分子內橋是嵌入的情況下，意味著第二個分 子內橋的兩個胺基酸在一級胺基酸序列中位於第一個分子內橋的兩 個胺基酸之間。
在分子內橋連肽具有3個以上分子內橋的情況下，可形成較大量 的可能結構。例如可存在多個重疊環。在非限制性實例中，分子內橋 連多肽可具有5個分子內橋，其中5個橋中有2個形成重疊環結構， 餘下的3個橋彼此串聯或與重疊環串聯。羊毛硫抗生素乳鏈菌肽A呈 現這樣的結構(參見圖1)。
在優選實施方案中，本發明的分子內橋連多肽是羊毛硫抗生素
肽。在更優選的實施方案中，本發明的分子內橋連多肽是乳鏈菌肽A 及其類似物。
差異保護的正交分子內橋本發明的正交保護的分子內橋具有下列通式:
formula see original document page 20
式II
其中L代表共價結合的胺基酸側鏈，D和E是氫或氨基端保護基， 而G和J是氫或羧基端保護基。
含胺基酸側鏈的鍵可為但不限於硫醚鍵、二硫鍵、醯胺鍵或醚鍵。 在優選實施方案中，分子內橋包含硫醚鍵。
在多肽合成中摻入"差異保護的"或"正交保護的"分子內橋提供了 對它們的保護基的選擇性脫除，此選擇性脫除與肽鏈其它部分(包括其 它分子內橋)上的保護基的脫除分開和無關。換句話說，選擇特定分子 內橋的保護基，使得它們的裂解條件不損害多肽上的其它保護基或官 能團的穩定性。在這些基團的脫保護過程中的交叉反應性是最小的， 可通過標準質譜技術監測。目標產物可通過標準HPLC或其它技術與 這些雜質純化開來。裂解可以任意選定的優先順序實施。
保護基和它們被引入和脫除的方式描述於例如"Protective Groups in Organic Chemistry," Plenum Press, London, N,Y. 1973; 和"Methoden der organischen Chemie," Houben-Weyl, 第 4 版，第 15/1 巻, Georg-Thieme-Verlag， Stuttgart 1974; 以及Theodora W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis,，，John Wiley & Sons, New York 1981。許多保護基的特徵在於它們例如可通過溶劑分解、還原、光分 解、通過使用有機金屬催化劑如有機鈀和有機鈷催化劑或在生理條件 下被容易地脫除，即沒有不希望的副反應發生。
眾多保護基是本領域已知的。非限制性的說明性保護基名單包括 曱基、曱醯基、乙基、乙醯基、叔丁基、茴香基、千基、三氟乙醯基、N-羥基琥珀醯亞胺基、叔丁氧基羰基、苯甲醯基、4-曱基千基、硫代 茴香基(thioanizyl)、硫代甲苯基、爺氧基甲基、4-硝基苯基、節氧基 羰基、2-硝基苯甲醯基、2-硝基苯基亞磺醯基、4-曱苯磺醯基、五氟 苯基、二苯基甲基、2-氯苄氧基羰基、2,4，5-三氯苯基、2-溴千氧基羰 基、9-芴基甲氧基羰基、三苯基甲基和2,2，5,7，8-五曱基-苯並二氬吡喃 -6-磺醯基。關於多種不同類型的氨基和羧基保護基的論述，參見例如 美國專利第5,221,736號(1993年6月22日授予專利權)；美國專利第 5,256,549號(1993年10月26日授予專利權)；美國專利第5,049,656 號(1991年9月17日授予專利權)；和美國專利第5,521,184號(1996 年5月28日授予專利權)。
可使用任何組合的保護基，只要所述保護基可在目標分子內橋連 多肽合成過程中被選擇性地脫除。在一個優選實施方案中，氨基端保 護基選自Fmoc、 Alloc和IvDde。在另一個優選實施方案中，羧基端 保護基選自炔丙酯和千酯。
在優選實施方案中，正交保護的分子內橋是正交保護的羊毛硫氨 酸或羊毛硫氨酸衍生物。在更優選的實施方案中，正交保護的分子內 橋是氨基端和/或羧基端保護的羊毛硫氨酸(Lan)、 P-曱基羊毛硫氨酸 (MeLan)、 S-[(Z)-2-氨基乙烯基]-D-半胱氨酸(AviCys)或S-[(Z)-2-氨基 乙烯基]-2-曱基-D-半胱氨酸(參見圖2)。這些正交保護的分子內橋可通 過本領域已知的方法合成。
在更優選的實施方案中，分子內橋是羊毛硫氨酸。被保護的羊毛 硫氨酸可如在圖3中逆合成所示使用常規方法合成。羊毛硫氨酸產物 的立體化學結構可在此階段通過以適宜胺基酸(例如半胱氨酸和絲氨 酸)的正確立體異構體開始而被l呆證。
在更優選的實施方案中，分子內橋是羊毛硫氨酸1或羊毛>5克氨酸
2:formula see original document page 22羊毛硫氨酸1 羊毛石克氨酸2
其可分別如在圖5和6中扭無述合成。簡而言之，參照圖5，對於 羊毛硫氨酸1， D-絲氨酸被轉變為其氨基端被保護的Alloc衍生物， 隨後轉變為羧基端被保護的炔丙酯。N(Alloc)-D-絲氨酸炔丙酯被轉變 為其對應的(3-溴丙氨酸衍生物。轉變例如可如下實現將N(Alloc)-D-絲氨酸炔丙酯溶解在二氯甲烷中，並用1當量的四溴化碳和三苯膦處 理該溶液。這些反應是非常溫和的，已常規地用於將羥基轉變為溴化 4勿。Zhu (2003)Jow 77a/ o/Orga"/c C7zem/s^y. 20, 4062-4072。 或者，使用在溶劑如曱苯或二氯曱烷中的三溴化磷實現合成，接著進 行溫和鹼性後處理，以獲得期望的D-(3-溴丙氨酸。Olah等，(1980) Jo^72"/ o/Ogara'c C7zew^^y. 45, 1638-1639。也可使用其它方法。最後， 在合適的烷基化條件下(3-溴丙氨酸衍生物與Fmoc-L-Cys反應，生成 羊毛硫氨酸1。羊毛硫氨酸2可如在圖6中概述類似地合成。
分子內橋連多肽的合成
內橋提供的任意方法合成，所述方法包括但不限於固相肽合成(SPPS)、 溶液相肽合成、天然化學連接、內蛋白子介導的蛋白連接和化學連接 或其組合。在優選實施方案中，本發明的分子內橋連多肽使用改進形 式的標準SPPS合成。本發明的分子內橋連多肽可通過人工SPPS或通 過使用市售可得的自動化SPPS合成儀合成。SPPS自20世紀60年代早期以來在本領域就是已知的(Merrifield, R. B，，J爿m. C72em.Soc., 85:2149-2154， 1963)，並廣泛使用。通用方法 有幾個已知的變化。(參見例如"Peptide Synthesis, Structures, and Applications" 1995 by Academic Press,第3章和White (2003) Fmoc iSb/W屍/zose屍取/cfe 5y"f/7as&, j ; raWca/ ^(p/ raac/z， Oxford University Press, Oxford)。非常簡單地講，在固相肽合成中，將期望的C-端氨基 酸殘基與固體支持體偶聯。待添加至肽鏈的後續胺基酸在其氨基端上 被Boc、 Fmoc或其它適宜的保護基保護起來，其羧基端用標準偶聯試 劑活化。使支持體結合的胺基酸的游離氨基端與後續胺基酸反應，再 將兩個胺基酸偶聯在一起。生長肽鏈的氨基端被脫保護，重複該過程， 直至完成期望的多肽。
按照本發明的方法，分子內橋連肽可通過將差異保護的正交分子 內橋摻入到標準SPPS中而合成。不是分子內橋的組成部分的多肽鏈 部分可通過本領域已知的標準SPPS技術合成。在優選實施方案中， 使用在氨基端被Fmoc-或Boc-保護的胺基酸，在更優選的實施方案中， 使用基於Fmoc的SPPS。通過選擇性脫去其活性氨基和羧基的保護基 將差異保護的正交分子內橋摻入到多肽鏈中。
本發明的方法可用於合成具有如通式III所示的單個分子內橋的 分子內橋連多肽formula see original document page 23
式III
其中A、 X"和Rn如先前對式I定義一樣。此多肽使用通式IV的
單個分子內橋製備formula see original document page 24式IV
其中L代表共價結合的胺基酸側鏈，D和E是氨基端保護基，G 是羧基端保護基。
簡單地講，分子內橋通過其游離#友基端與連接有固體支持體的肽 鏈偶聯，或直接與固體支持體偶聯。另外的胺基酸在分子內橋脫保護 (脫去E)後與其游離氨基端偶聯。脫去分子內橋的其餘羧基上的保護 基(G),將該羧基與如此形成的多肽鏈的游離氨基端偶聯。另外的氨基 酸任選地可隨後添加至餘下的氨基上。
在本發明的多肽合成中，在任一時刻在增長多肽鏈上都將僅有一 個"游離氨基端"和待與游離氨基端偶聯的一個"游離羧基端"。每當加 入胺基酸再將其脫保護時，新加入的胺基酸都將封閉游離氨基端，如 果新加入的胺基酸隨後被脫保護，則將形成新的游離氨基端。本領域 技術人員將認識到，在這些情況下僅有一個游離氨基端。
更具體地說，在具有單個分子內橋的分子內橋連多肽的合成中， 選擇D，使得用於脫去保護基D的反應條件不會導致E或G的脫去， 和/或多肽鏈其餘部分的胺基酸的氨基保護基的脫去。相反的情況也適 用。換句話說，作為非限制性實例，如果使用基於Fmoc的SPPS合 成多肽，則選擇D,以使其可在不脫去E、 G和/或Fmoc的條件下被 選擇性脫除。類似地，選擇D和G,使得脫去Fmoc的條件不會導致 D或G的裂解。在優選實施方案中，氨基保護基E等同於多肽鏈中不 是分子內橋的組成部分的胺基酸的氨基保護基。因此，例如在使用基 於Fmoc的SPPS的情況下，E優選為Fmoc。
分子內橋連多肽的合成以C-端胺基酸與固體支持體的偶聯開始。術語"固體支持體"指在其上合成多肽的任何固相材料。固體支持體包 含術語如"樹脂"、"固相"和"支持體"。固體支持體可由有機聚合物如 聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯醯胺及其 共聚物和接枝聚合物組成。固體支持體還可為無機的，例如具有適宜 基團的玻璃、矽石、可控孔度Jf皮璃(CPG)或反相矽膠，胺基酸可被連 接至所述適宜基團並以容易的方式被脫除。固體支持體的構型可為 珠、球、顆粒、微粒或表面的形式。表面可為平面、大致平面或非平 面。固體支持體可為有孔的或無孔的，並可具有溶脹或非溶脹的特徵。 固體支持體可為孔、凹坑或其它容器的形式。多數固體支持體可以機 器人傳送試劑可尋址的陣列形式排列，或者可根據檢測方法設置，所 述檢測方法包括以雷射照射掃描和共聚焦或偏轉聚光。許多固體支持 體是商品化的。第一個胺基酸與固體支持體的偶聯可通過本領域已知 的測定監測完成情況。
在優選實施方案中，Fmoc胺基酸用於合成多肽鏈。Fmoc胺基酸 是商品化的，或者可以通過本領域已知的方法合成。另外的胺基酸可 使用標準SPPS方法添加至多肽鏈上。例如，在使用Fmoc胺基酸的 情況下，C端胺基酸的Fmoc氨基保護基一旦與樹脂偶聯，就可通過 例如接觸20%哌啶的DMF溶液而被脫去。可採用標準偶聯化學，使 下一個Fmoc胺基酸與多肽鏈偶聯。具有活性側鏈的胺基酸可用適宜 的保護基保護起來，所以它們的側鏈在目標分子內橋連多肽的整個合 成當中仍是受保護的。偶聯和脫保護步驟可根據需要使用適宜的氨基
酸重複。這完成了通式in的xs的合成。
通過標準偶聯化學將分子內橋與增長多肽鏈偶聯。或者，如果分 子內橋落在分子內橋連多肽的C末端，則分子內橋可通過其游離羧基 直接與樹脂偶聯。然後在適宜的條件下選擇性脫去保護基E,例如使 用20%哌咬的DMF溶液，其中E為Fmoc。參照通式III， W現在與 多肽鏈偶聯。 一個或多個胺基酸隨後可通過序貫偶聯和脫保護添加至 多肽鏈(通式III的X^上。接著，在適宜的條件下選擇性脫去保護基G。在優選實施方案中， G是可使用八羰基二鈷的二氯甲烷溶液裂解的炔丙基，或是可使用氫 化方法裂解的千酯，所述氫化方法使用披鈀炭和環己二烯的二氯曱烷 溶液。這完成了通式III的R)的添加，由此將分子內橋完整摻入到多 肽中，形成環結構。
然後可在適宜的條件下選4奪性地脫去保護基D。在優選實施方案 中，D是可使用20 mol。/。Pd(PPh3)4和20-25當量PhSiH3的二氯曱烷溶 液裂解的Alloc,或是可由2-10%肼的DMF溶液裂解的ivDde。分子 內橋連多肽隨後可通過序貫偶聯另外的胺基酸再將其脫保護而延長 (通式m中的X1)。
可使用單個差異保護的分子內橋類似地合成具有多個串聯環的 分子內橋連多肽，即具有一個以上的分子內橋的分子內橋連多肽。任 選地，彼此之間的差異僅在於它們的保護基的一個以上差異保護的分 子內橋可用於合成具有多個環的多肽。它們的側鏈結構(例如Lan和 MeLan)可變的多個差異保護的分子內橋也可用於摻入不同的分子內 橋連部分。這些後續橋上的保護基可與摻入到多肽鏈中的第一個分子 內橋上的保護基相同或不同。具有多個串聯環的分子內橋連多肽如下 合成將第一個分子內橋完整摻入到多肽鏈中，形成第一個環結構， 脫去末端氨基保護基，任選地通過序貫偶聯另外的胺基酸再將其脫保 護而延長多肽鏈，通過其羧基端完整地摻入第二個分子內橋(與第 一個 分子內橋相同或不同)，任選地延長多肽，並根據需要重複這些步驟， 以合成目標分子內橋連多肽。
對於具有多個重疊或嵌入環的分子內橋連多肽，必須使用 一個以 上正交保護的分子內橋。儘管多個正交保護的分子內橋的側鏈結構可 相同或不同，但保護基必須被差異地正交保護，以允許選擇性地使它 們各自的氨基和羧基脫保護。這些橋的數量取決於重疊或嵌入環的數 量。例如，在分子內橋連多肽的兩個環彼此重疊或者一個嵌入到另一 個中的情況下，使用兩個不同的差異保護的正交分子內橋；例如在3個環彼此重疊或彼此嵌入的情況下，使用3個不同的差異保護的正交 分子內橋，諸如此類。
在非限制性實例中，在目標分子內橋連多肽包含兩個重疊環的情
況下，使用通式V和VI的兩個差異保護的正交分子內橋
式V 式VI
其中lJ和1^為共價結合的胺基酸側鏈(L'可與I 相同或不同)，
D、 M、 E和Q是氨基端保護基，而G和T是羧基端保護基；其中D
和M僅在不同條件下可被裂解；其中E和Q可在相同條件下被裂解；
其中E和Q在不同於裂解D和裂解M的那些條件下被裂解；其中G
和T在不同條件下才被裂解。在優選實施方案中，氨基保護基E和Q
等同於多肽鏈中不是分子內橋的組成部分的M酸的氨基保護基。因
此，例如在使用基於Fmoc的SPPS的情況下，E和Q優選為Fmoc，
但並不限於此。在這種情況下，E和Q還可為例如Boc。
按照本發明的方法，包含兩個重疊環的分子內橋連多肽可通過首
先將C-端胺基酸與固體支持體偶聯而合成。任選地，可使用標準SPPS
方法將另外的胺基酸添加至多肽鏈上。在優選實施方案中，Fmoc氨
基酸用於合成多肽鏈。具有活性側鏈的胺基酸可用適宜的保護基保
護，這樣它們的側鏈在整個目標分子內橋連多肽的合成中仍受保護起
來。偶聯和脫保護的步驟可根據需要使用適宜的胺基酸重複。然後將
通式V的分子內橋通過其游離羧基與生長肽鏈偶聯，隨後脫去E。 D
和G保持不受影響。在優選實施方案中，E是Fmoc。然後任選地通
過依照標準SPPS的偶聯和脫保護步驟進行環化，可將一個或多個氨
基酸序貫地與多肽的游離氨基端偶聯。接著，將通式VI的分子內橋通過其游離羧基與生長肽鏈偶聯，隨後脫去Q。 D、 G、 M和T保持 不受影響。在優選實施方案中，Q是Fmoc。再者，然後任選地可將 一個或多個胺基酸序貫地與多肽的游離氨基端偶聯。為形成第 一個 環，於是使用適宜的脫保護化學裂解G,將產生的游離羧基與多肽鏈 的游離氨基端偶聯。保護基D、 M和T保持不受影響。隨後，在適宜 的條件下脫去保護基D,暴露出遊離氨基。在脫去D的過程中保護基 M和T保持不受影響。然後任選地可將另外的胺基酸與位於多肽N-端的游離氨基偶聯。為形成第二個環，並由此形成重疊環，在適宜的 條件下裂解T,將所獲得的游離羧基與多肽鏈的游離氨基端偶聯。然 後可在適宜的條件下脫去保護基M,並通過序貫偶聯另外的胺基酸進 一步延長多肽鏈。
按照本發明的方法，包含兩個嵌入環的分子內橋連多肽可使用通 式V和VI的兩個差異保護的正交分子內橋類似地合成。包含兩個嵌 入環的分子內橋連多肽的合成與包含兩個重疊環的分子內橋連多肽 的合成相當，差別僅在於脫保護和偶聯式V和VI的分子內橋的順序。 具體地說，將式V的分子內橋與肽鏈的游離氨基端偶聯，肽鏈通過其 羧基端與固體支持體相連接，或者將式V的分子內橋直接與固體支持 體偶聯。隨後切除E,然後任選地通過依照標準SPPS的偶聯和脫保 護步驟可將一個或多個胺基酸序貫地與多肽的游離氨基端偶聯。接 著，將通式VI的分子內橋通過其游離羧基與生長肽鏈偶聯，隨後脫 去Q。再者，然後任選地可將一個或多個胺基酸序貫地與多肽的游離 氨基端偶聯。為形成第一個環，於是使用適宜的脫保護化學裂解T, 將所獲得的游離羧基與多肽鏈的游離氨基端偶聯。隨後，在適宜的條 件下脫去保護基M,暴露出遊離氨基。然後任選地可將另外的胺基酸 與位於多肽N-端的游離氨基偶聯。為形成第二個環，並由此形成嵌入 環，在適宜的條件下切除G，將所獲得的游離羧基與多肽鏈的游離氨 基端偶聯。然後可在適宜的條件下脫去保護基D，並通過序貫偶聯另 外的胺基酸進一步延長多肽鏈。本領域技術人員會認識到，可通過以上方法的變化類似地製備更 複雜的分子。例如，具有兩個重疊環和另外3個串聯環的多肽可通過 將所公開的用於合成含重疊環的分子內橋連多肽的方法與所公開的 用於合成具有串聯環的分子內橋連多肽的方法組合來合成。
在分子內橋連多肽的合成當中，合成的進展和精度任選地可通過
本領域已知的多種技術監測，包括但不限於Maldi和LC-MS。在合成
在合成的多肽含顯著量的硫的情況下(例如對於含羊毛硫氨酸的多 肽)，可使用TFA/茴香硫醚/水/笨酚/乙二疏醇(82.5/5/5/5/2.5)的混合物。 裂解反應的進展可通過LC-MS或其它合適的技術定期監測。根據選 定的側鏈保護基，可在從樹脂上裂解多肽的過程中或以獨立的步驟實 現它們的裂解。終產物例如可通過由冷乙醚沉澱分離，並通過已知方 法包括但不限於反相HPLC純化。
可通過已知技術從結構上分析本發明的分子內橋連多肽並分析 其生物化學功能。結構分析可通過包括但不限於二維NMR和X-射線 晶體學的技術實現。已使用以60 ms混合時間獲得的二維NMR TOCSY (Braunschweiler & Erast (1983)， Jowma/ o/Magwef/c i esow朋ce 53， 521-528)和以200 ms、 400 ms、 450 ms獲得的NOESY成功地從結 構上分析了分子內橋連多肽。Kumar等，(1980)，說0c/7em. ^o; /，. 7 仏 Ccw聽".95, 1-6。 Smith, J. L. (2002) D^eWa/io", University of Florida, Gainesville。 Smith等,(2000)，c/owma/ 0/ BZ0c/2ew&^7 267, 6810-6816。
在優選實施方案中，本發明的方法用於合成包含一個或多個羊毛 硫氨酸或羊毛硫氨酸衍生物的分子內橋連多肽。在更優選的實施方案 中，本發明方法用於合成羊毛碌b抗生素。在更優選的實施方案中，本 發明方法用於合成乳鏈菌肽A及其類似物。
可使用已知方法測定乳鏈菌肽A及其類似物的生物活性(Hillman 等，(1984), /"/ec"'o"朋d /mw畫'0; 44, 141-144; Hillman等，(1998)，/"/Wo"朋d/ww"m'(y 66, 2743-2749)。可通過與先前由Van De Yen等 通過NMR確定的用生物法生產的乳鏈菌肽A的三維結構(1991， 五wn / eafw oZowma/ o/5/oc/zew^^y 202， 1181-1188)只於比，輔助通過本發 明方法合成的乳鏈菌肽A及其類似物的結構分析。根據此較早共價結 構確定工作製作的胺基酸排列，有可能快速表徵共價一建，並鑑別所有 相關的長距離NOE，用於通過本發明方法合成的乳鏈菌肽A及其類 似物的結構確定。DPOLT技術的應用DPOLT是一種由多學科方法產生的平臺技術。有幾個優勢使該 技術如此合乎需要。首先且最重要的，其能夠快速合成顯著數量的候 選羊毛硫抗生素和其它生物活性肽並篩選它們在治療領域的潛在應 用，而不必為分析它們^:入大量時間和費用來設計發酵和純化方法。 有接近50種含重疊硫醚橋的羊毛硫抗生素，每年還有更多的被發現， 它們都可通過本文公開的方法合成。這些羊毛碌Ot生素包括A(I)類羊 毛硫抗生素乳鏈菌肽A、乳鏈菌肽Z、枯草菌素、槲皮素S (Ericin S)、 槲皮素A、紅網鏈菌素、表皮素、[Vall-Leu6]-表皮素、Gallidermin、 變異菌素1140、變異菌素B-Ny266、變異菌素III、變異菌素I、 Pep5、 Epilancin K7和Epicidin 280; A(II)類羊毛硫抗生素乳鏈球菌素481、 Variacin、變異菌素II、鏈球菌素(Streptococcin)A-FF22、 SalivaricinA、 [Lys2-Phe7]-salivaricin A、 植物乳桿菌素C、 Sublancin 168、 Butyrivibriocin OR79A; B類羊毛硫抗生素肉桂黴素、耐久黴素、耐久 黴素B、耐久黴素C、居拉黴素C、血管緊張肽轉化酶抑制肽、 Mersacidin、阿肽加定(Actagardine)、 Ala(0)-阿肽加定和Subtilocin A; 雙組分羊毛硫抗生素乳鏈球菌素3147Al、乳鏈球菌素3147A2、葡萄 球菌素C55ot、葡萄球菌素C55P、植物乳桿菌素Wot、植物乳桿菌素 W卩、溶細胞素LL和溶細胞素Ls;和其它羊毛硫抗生素，例如 Ruminococcin A、 Carnocin UI 49、 Macedocin、 BovicinHJ50、 NukacinISK-1和SapB形態發生素。(參見例如Chatterjee等，2005. CTze附.化v. 705, 633-83)。根據過去的經驗，似乎有可能是用於多種羊毛硫抗生素的許多發 酵和純化方法不能快速獲得。50多年前發現的乳鏈菌肽A仍是深入 研究的目標，以便發現快速和適合的純化方法，用於其作為治療劑的 開發。最新的美國專利申請(美國專利申請2004/0072333)嘗試達到此 目標，但使用了多種昂貴的蛋白酶和多個純化步驟。DPOLT使用的 SPPS法極有可能以遠為成本有效的方式實現預期目標。目前，超過 35種使用SPPS方法合成的生物活性分子是商品化的，例如催產素、 善寧(sandostatin)和福澤昂(fuzeon),隨著時間推移需求無疑會增加。 DPOLT的使用允許位點特異性置換胺基酸及其類似物，即便在組合 文庫法中，該方法提供了發現用於其預期目標的新的和改良的治療劑 的最佳方法。就此而言，DPOLT是用於合成具有重疊環的分子的唯物活性分子的潛力。DPOLT能夠體外生產例如結構複雜的羊毛硫抗 生素(包括具有重疊環結構的那些羊毛硫抗生素)，以使用常規固相肽 合成方法以商業上可行的方式製造。DPOLT提供了篩選和開發商業應用的新羊毛碌u抗生素的兩種顯 著優勢站在生產材料成本的立場上明顯優選發酵法，但在藥物發現 的初始階段優化這些方法需要的時間和精力可能令人望而卻步。另 外，象就乳鏈菌肽A而言，可能不容易實現高產發酵物的純化。終產 物的純化通常在SPPS中不是顯著問題。DPOLT具有允許以用於臨床 檢驗的快速方式篩選大量潛在有用化合物的優勢。對於看起來有前景 的化合物，DPOLT提供了通向市場的捷徑，還指明了那些可能適合 提供必需的時間和精力來開發發酵法的分子。對於沒有用於進一 步開 發的必需特徵的化合物，例如具有不良活性語、有缺陷的藥物動力學、 毒性問題等的那些化合物，DPOLT允許快速並有效地消除對這些的 顧慮。最後，因為DPOLT依靠固相肽合成，所以篩選和開發具有改良特徵(如那些克服細菌抗性的特徵)的類似物將是簡單的。因此，該 方法可應用於其它羊毛硫抗生素和目標肽，以及鑑別具有功能上期望 的和經濟上有利的特徵的羊毛石克抗生素和目標肽。DPOLT和通過本發明方法合成的羊毛硫抗生素最重要的用途是細菌感染的醫學和獸醫學治療。還有幾種其它的潛在應用。羊毛硫抗 生素是對食品防腐和化妝品中^f吏用的其它抗菌劑的已充分確認並有吸引力的替 。 DelvesBroughton等,(1996) ^"tom'e J^a" Z^eiwe"/ioeA: /"few加'owa/ Joi/ma/ o/ Ge"era/ 朋d Mo/ecw/ar M/cra6/o/ow. 眠 193-202; Rollema等,(1995) ￡wvz>owwew^r/ Mi!.cro6/o/ogK.67, 2873-2878; Liu & Hansen, (1990) J/^/Zed ￡"vz>owme"to/ M/craW。/ogy. 56, 2551-2558; Huot等，(1996) Z^"ens Mfcra6/o/ogy. 22, 76-79; Delvesbroughton， (1990) Food 7>c/2"o/ogy.", 100; Delvesbroughton (1990) /0wm3/ o/5bc/, 0/T^c/wo/ogy. 43， 73-76; Delvesbroughton等,(1992)z'w v4/ / //e<i Af/tro&o/ogy. /5, 133-136; Thomas & Wimpenny (1996) yl/ p"e(i oroi五謂Vo謂e幽/ Mcro6油gy. 62， 2006-2012; Sahl & Bierbaum (1998) *畫/ 7 eWew o/ M/cra^o/ogy. 52, 41 -79。另外，已對羊毛硫抗生素作為局部消毒劑、 尤其是作為促進口腔健康的漱口水進行了研究，取得一定成績。Howell 等,(1993) Jowr"a/ o/C7Zm'ca/屍enWowto/ogy. 20, 335-339。羊毛硫抗生素類藥物具有;[艮大潛力，最有可能被醫學界充分接 受。儘管只要有傳染性疾病則抗生素應用的市場就仍很高並將保持如 此，但大部分抗生素的整體生命周期是短暫的，原因是突變和細菌抗 性。羊毛碌u抗生素類抗生素藥物的好處在於它們具有相對抗細菌適應 的已證實記錄，並已被發現對眾多抗其它抗生素的細菌病原體具有有 效的殺細菌活性。本文無論何處提到的所有專利、專利申請和其它科學或技術文書 都整體引入作為參考。本文作為目前代表性的優選實施方案描述的方 法和組合物是示例性的，無限制本發明範圍的意圖。其中的變化和其它用途對本領域技術人員是顯而易見的，並包含在本發明的精神中。 本文說明性描述的本發明適宜地可在沒有本文未具體公開的任何一 個或多個要素、 一個或多個限制的情況下實施。因此，例如，在本文 的每種情況下，術語"包含"、"基本上由……組成"和"由......組成，，中的任一個都可用其餘兩個術語中的任一個代替，而不改變其通常的含 義。已使用的術語和表述用做描述性術語，無限制作用，並無意使用 這些術語和表述排除所示和所描述特徵或其部分的任意等同物，但要 認識到的是，多種修改可能落入要求保護的本發明範圍內。因此，應 當理解的是，儘管本發明已由實施方案和任選特徵具體地公開，但本 文公開的構思的修改和變更被《人為落入由說明書和隨附權利要求書 所限定的本發明範圍內。另外，當按照馬庫什要素或其它可選擇要素描述本發明的特徵或 方面時，本領域技術人員能理解，馬庫什要素或其它要素中的各成員或各成員組同樣為本發明的組成部分。依據以下實施例可更好地理解本發明，這些實施例僅用於說明目的，不得解釋為以任何方式限制本發明的範圍。 實施例實施例1:差異保護的正交羊毛硫氨酸的合成 A. Fmoc-Cys的合成Fmoc-保護的半胱氨酸(圖3，結構B)如在圖4中概述以兩步順序 由L-胱氨酸合成。將碳酸鈉(4.6 g, 43.6 mmol)和丄-胱氨酸(5.0 g， 20.8 mmol)溶解在水(200mL)中。將所獲得的溶液冷卻至10°C。將FmocCl (11.85 g, 45.8 mmol)溶解在二噁烷(80 mL)中，將所獲得的溶液滴加至 丄-胱氨酸的水溶液。於1(TC攪4半該溶液2小時，並使其逐漸升溫至室 溫。得到粘稠白色沉澱，將其過濾到燒結玻璃漏鬥上。產物用乙醚(50 mL)研磨，並真空乾燥2天。得到為白色粉末的AgV'-雙(Fmoc)-丄-胱氨 酸(14.0g,收率98%)。將A^V'-雙(Fmoc)-L-胱氨酸(12.0 g， 17.5 mmol)溶解在曱醇(300 mL)中。將粒狀鋅(12.0 g)加入該溶液，使用磁力攪拌器劇烈攪拌所獲 得的混合物。在2小時時間段內將三氟乙酸(75 mL, 1 mol)滴加入反應 混合物中，於室溫攪拌12小時的時間段。通過C-18反相高壓液相色 譜(HPLC)和薄層色諳(TLC,氯仿/甲醇/乙酸=30:1:0.1,體積/體積)監 測反應。在iV，7V'-雙(Fmoc)-丄-胱氨酸消失時，過濾反應混合物，並在 旋轉蒸發器上濃縮，以將體積減少到約100 mL。加入二氯曱烷(400 mL)。用2 N鹽酸水溶液洗滌混合物。水層用二氯曱烷萃取，合併的 有機層經硫酸鎂乾燥。濃縮溶液得到為白色粉末的AKFmoc)-丄-半胱氨 酸(8.8 g 73%)(圖3和4,結構B)。B. N-(Alloc)-D-絲氨酸炔丙酯的合成AHAlloc)-Z)-絲氨酸炔丙S旨(圖3,結構A)的合成如下進行(參見圖 5)。將D-絲氨酸(10.5 g, 100mmol)和碳酸鈉(lU g, 105 mmol)溶解在 水(100mL)中。將乙腈(50mL)加入到該溶液中，並將混合物在水浴中 冷卻至5。C 。在30分鐘的時間段內滴加氯曱酸烯丙酉旨(l 1.7 mL， 13.3 g， llOmmol)。將反應混合物逐漸升溫至室溫，並攪拌12小時。真空濃 縮混合物至約100mL,以除去乙腈，將殘餘物冷卻至0-5。C。通過加 入濃鹽酸水溶液(約10mL)將溶液的pH調節至2.0。用乙酸乙酯(5x40 mL)萃取產物，萃取物經無水^L酸鎂乾燥。在旋轉蒸發器上真空除去 溶劑，得到顯現為成黃色油狀物的AKAllocH)-絲氨酸(16.9 g， 89%)。將AKAlloc)-Z)-絲氨酸(16 g, 85 mmol)溶解在DMF (70 mL)中。將 碳酸氫鈉(7.9 g， 94 mmol)加入所得溶液。在20分鐘的時間段內於室溫 滴加溴丙炔(80%的甲苯溶液，10.5 mL， 94 mmol)。反應混合物於室溫 攪拌2天。在旋轉蒸發器上真空濃縮反應混合物，將殘餘物溶解在乙 酸乙酯(IOO mL)中。用碳酸氳鈉水溶液(2x50 mL)和水(2x50 mL)洗滌 溶液，並經硫酸鎂乾燥。在旋轉蒸發器上真空除去溶劑，得到 iV-(Alloc)-Z)-絲氨酸炔丙酯(18 g，收率93%)。C. N-(ivDde)-D-絲氨酸(千基)酯的合成由Z)-絲氨酸和ivDde-OH製備iV-(ivDde)-Z)-絲氨酸(圖3 ，結構C)， 通過在吡啶存在下用異戊醯氯j吏雙甲酮O-醯化而合成，接著使用先前 報導的方法用氯化鋁使所形成的3-曱基丁酸5,5-二甲基-3-氧代環己 -1-烯基酯重排(八1^^111,八.八.等，^"^&^ 1978, 925)。具體地說，在15 分鐘的時間段內將異戊醯氯(13.5 mL, 13.3 g, 110 mmol)的二氯曱烷 (50 mL)溶液滴加至攪拌的雙甲酮(14 g, 100 mmol)和吡啶(9.7 mL, 9.5 g, 120mmol)的二氯甲烷(150mL)溶液。攪拌反應混合物1.5小時，並 用2N鹽酸水溶液(2x50mL)、水和飽和碳酸氫鈉水溶液(50 mL)洗滌， 然後經石克酸4美乾燥。通過旋轉蒸發器真空除去溶劑，得到顯現為淡黃 色油狀物的3-曱基丁酸5，5-二甲基-3-氧代環己-1-烯基酯(22.4 g，收率 100%)。在30分鐘的時間段內，向在冰浴上冷卻的氯化鋁(16.0g, 120 mmol)的二氯曱烷(100 mL)攪拌懸浮液中，滴加3-曱基丁酸5，5-二曱基 -3-氧代環己-1-烯基酯(11.2 g， 50 mmol)溶液。使反應混合物升溫至室 溫，並攪拌l小時。然後將反應混合物緩慢地倒入37%鹽酸水溶液(50 mL)和水(150 g)的混合物中，同時在冰上冷卻，這樣溫度沒有超過5°C。 將鹽水(200 mL)加入混合物，產物用二氯曱烷(6x50 mL,萃取的完全 性通過TLC檢查)萃取。萃取物用鹽水(2x50mL)洗滌，經硫酸鎂乾燥， 並在旋轉蒸發器上真空濃縮。；組產物通過使用己烷至乙酸乙酯:己烷 (1:10)的梯度通過矽膠柱色i普法純化，得到顯現為淺黃色油狀物的 ivDde-OH(10.5 g， 94%)。然後如下合成7V-(ivDde)-D-絲氨酸向ivDde-OH (1.1 g， 5 mmol) 和D-絲氨酸(0.6 g， 5.75 mmol)與曱醇(50 mL)的混合物加入iV-二異丙 基乙胺(3.4 mL, 2.6 g， 20 mmol)。在回流下攪拌反應混合物過夜。TLC 檢驗(乙酸乙酯/己烷l:4)表明無游離ivDde-OH。將反應混合物冷卻至 室溫，通過旋轉蒸發器真空除去溶劑。將殘餘物溶解在水(40mL)中， 並冷卻至5-10°C ,通過滴加2 N鹽酸水溶液酸化至pH 2。攪拌混合物30分鐘，過濾沉澱，用水清洗，真空乾燥，得到為白色微晶的iV-(ivDde)畫Z)畫絲氨酸(1.5 g, 96%)。如下製備AHivDde)-D-絲氨酸千酯向7V-(ivDde)-D-絲氨酸(0.93 g: 3 mmol)和碳酸氫鈉(0.34 g， 4 mmol)與DMF (20 mL)的混合物中，加入 苄基溴(0.43mL, 0.62 g, 3.6 mmol)，於室溫攪拌混合物24小時。在旋 轉蒸發器上真空濃縮混合物，將殘餘物溶解在乙酸乙酯(40mL)中。用 水清洗溶液，水層用乙酸乙酯(2x30mL)萃取。合併的有機層用飽和碳 酸氫鈉水溶液(2x40 mL)和水(40 mL)洗滌。有機層經碳S吏鎂乾燥，在 旋轉蒸發器上真空除去溶劑，得到為白色針狀物的AKivDde)-D-絲氨 酸千酯(1.03 g, 86%)。D. N-(Alloc)-D-p-溴丙氨酸炔丙酯和N-(ivDde)-D-p-溴丙氨酸千酯的合成N(alloc)-D-絲氨酸(炔丙基)酯和N(ivDde)-D-絲氨酸(千基)酉旨的對 應(3-溴丙氨酸衍生物如下合成將1當量適宜的酯溶解在二氯曱烷(或 類似的質子惰性溶劑)中，並用1當量四溴化碳和三苯膦處理該溶液。 於室溫攪拌反應物，直至依據TLC觀察完成，通過快速色語純化目標 P-溴丙氨酸衍生物。或者，使用三溴化磷在溶劑如曱苯或二氯曱烷中 的溶液實現合成，接著進行溫和的^4性後處理，得到期望的D-(3-溴丙 氨酸。除了溴化以外，可在下迷烷基化步驟中使用曱苯石黃醯化或其它 離去基團，生產最終受保護的羊毛硫氨酸。E. 羊毛硫氨酸1和2的合成羊毛硫氨S臾1通過用(Fmoc)-L-半胱氨酸使N(alloc)-D-卩-溴丙氨酸 炔丙酯烷基化而合成(圖5)。羊毛硫氨酸2通過用(Fmoc)-L-半胱氨酸 使N(ivdDe)-D-P-溴丙氨酸千酯烷基化而合成(圖6)。如下用(Fmoc)-L-半胱氨酸使對應的(3-溴丙氨酸烷基化將1當量 P-溴丙氨酸溶解在二氯曱烷(或類似的質子惰性溶劑)中，並用(Fmoc)半胱氨酸在相轉移催化劑如四丁基溴化銨、四丁基碘化銨或Aliquat 336下處理。需要的催化劑量為5-50 mol%，並可被優化，以獲得良 好的反應速率和純淨形式的產物。反應溫度也可被優化在10-50。C的 範圍內。由此獲得的產物通過快速柱色譜純化；產物的純度和結構通過 NMR、 HPLC、質i普和/或TLC確定。羊毛硫氨酸1和2的合成路線 相對直接，預期產物是穩定的，使得可容易地實現放大和大規模合成 (>10g)。實施例2:使用羊毛硫氨酸1和2合成羊毛硫抗生素乳鏈菌肽A類似 鮑A.乳鏈菌肽A類似物的固相肽合成如下概述按照本發明合成乳鏈菌肽A類似物[SEQ ID NO: 2]。該 類似物含有對33位的脫氫a-氨基丁酸(dehydrobutarine)以及30和2位 的脫氫丙氨酸的丙氨酸取代。相當多的證據表明，相對於天然乳鏈菌 肽A這對產物的活性譜和效力沒有顯著作用(Kuipers等，(1996); Devos 等，(1995), Mo/ecw/w Mz'cra&.o/ogy 17, 427-437; Sahl等，(1995), Jowma/ o/ 230， 827-853; Bierbaum等,(1996),^/ / /i;W5謂'ra廳e"to/滅cra6/o/ogy 62, 385-392)。除非另有說明，否則所有方案都是在文獻中報導的標準Fmoc SPPS方法。White (2003)屍woc 5b"c/屍/zose Pe; "afe 5^w^ew:s， ^ praWca/ ^proac/z, Oxford University Press, Oxford。 乳鏈菌肽A以分 步方式由其羧基端開始合成(參見圖1)。1. 將Na-Fmoc-Lys-N、叔丁氧羰基-L-賴氨酸(殘基l)的羧基接上 CLEAR-Acid Resin (Peptide International)。用茚三酮檢查樹脂，以確 認反應完成情況。2. 使用20%。農啶的DMF溶液於室溫實現位於賴氨酸醯胺上的 Fmoc基團的脫保護。3. 使用各自的Fmoc L-胺基酸(市售可得)重複以上步驟(l-2)的偶 聯和脫保護，以按照順序連接丙氨酸、纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸和 絲氨酸(殘基2-6)。胺基酸如組氨酸、賴氨酸和絲氨酸具有連接有其活 性側鏈的叔丁基，以將這些基團保護起來。
4. 在使用20%哌啶的DMF溶液脫去正交羊毛硫氨酸1上的Fmoc 基團後，使用正交羊毛硫氨酸1進行下一個偶聯。
5. 偶聯Fmoc組氨酸(殘基8)。
6. 用20%派咬的DMF溶液使Fmoc組氨酸脫保護，將組氨酸與 正交羊毛硫氨酸2偶聯。
7. 使用八羰基二鈷的二氯曱烷溶液裂解正交羊毛硫氨酸1上的 炔丙基。使用20%哌啶的DMF溶液暴露正交羊毛硫氨酸2的Fmoc 氨基端。暴露的正交羊毛硫氨酸1的C-端和暴露的正交羊毛硫氨酸2 的N-端偶聯。在此步驟完成環E的合成。
8. 通過用20 moP/。Pd(PPh3)4和20-25當量PhSiH3的二氯甲烷溶 液處理肽基樹脂兩次達15-20分鐘，脫去羊毛硫氨酸1的N(Alloc)基 團。
9. 將暴露的N-端與Fmoc丙氨酸(殘基ll)偶聯。使用20%哌啶 的DMF溶液使丙氨酸上的Fmoc基團脫保護。
10. 使用轉移氫化方案用披鈀碳和環己二烯的二氯曱烷溶液使羊 毛硫氨酸2的其餘C-端脫保護。
11. 暴露的羊毛硫氨酸2的C-端和丙氨酸(殘基ll)的N-端偶聯。 重疊環E和D的合成在此步驟完成。為了^^查已合成正確的產物，取 出少量樹脂，使用裂解混合物z使肽裂解下來(參見下文)。所獲得的肽 通過Maldi和LC-MS進行分析。
12. 使用2-10%肼的DMF溶液脫去羊毛硫氨酸2上的ivDde，所 獲得的游離氨基端序貫地用Fmoc保護的賴氨酸、曱硫氨酸和天冬醯 胺(殘基13、 14和15)延長。
13. 將羊毛硫氨酸1與天冬醯胺的脫保護的N-端連接。(但是，羊毛硫氨酸1或羊毛硫氨酸2中的任一個均可用於完成環C、 B和A
的合成)。
14. 羊毛硫氨酸1的Fmoc基團被脫保護，並序貫地與Fmoc甘氨 酸、曱硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸(殘基17-21)偶聯，形成環C。
15. 羊毛硫氨酸1的C-端的炔丙基使用1當量的八羰基二鈷脫 去，並且與甘氨酸(殘基21)的N-端偶聯，完成環C。
16. 羊毛石克氨酸1的N-端上的Alloc基團按照步驟8中描述的方 法脫去，並且與Fmoc賴氨酸(殘基23)偶聯。
17. 賴氨酸的N-端被脫保護，將羊毛硫氨酸1與賴氨酸的N-端 偶聯。
18. 羊毛硫氨酸1的Fmoc基團被脫保護，並序貫地與Fmoc甘氨 酸和Fmoc脯氨酸(殘基25和26)偶聯。
19. 羊毛硫氨酸1的C-端的炔丙基使用1當量八羰基二鈷脫去， 並且與脯氨酸的脫保護的N-端偶聯，由此形成環B。
20. 羊毛碌^氨酸1的N-端上的Alloc基團按照上述方法脫去，並 且與羊毛疏氛酸i偶聯。
21. 羊毛碌u氨酸1的Fmoc基團^皮脫保護，並且序貫地與Fmoc 亮氨酸、丙氨酸和異亮氨酸(殘基29-31)偶聯。
22. 羊毛硫氨酸1的C-端的炔丙基使用1當量八羰基二鈷脫去， 並與異亮氨酸的脫保護的N-端偶聯，由此形成環A。
23. 羊毛石克氨酸1的N-端上的Alloc基團按照上述方法脫去，並 序貫地地與Fmoc丙氨酸和異亮氨酸(殘基33和34)偶聯。這完成了乳 鏈菌肽A類似物的合成。
B.合成的肽從樹脂上裂解下來
因為合成的肽包含大量的石克，所以使用含有TFA/茴香硫醚/水/ 苯酚/乙二硫醇(82.5/5/5/5/2.5)的混合物使肽從樹脂上裂解下來(White 2003)。用二氯曱烷徹底地清洗樹脂，以除去痕量的DMF和其它殘餘有機物，並用以上混合物處理。裂解時間點的優化如下實現在15-20 mg樹脂上進行反應，以每小時的間隔通過LC-MS跟蹤反應達18小 時。優化的條件用於放大裂解。逐漸地將裂解下來的肽倒入冷乙醚中， 由此沉澱肽。沉澱的肽用冷乙醚清洗，並乾燥。
C.裂解下來的肽的純化
所述肽通過在含1% TFA的水中重構而純化。溶液在C-18反相 柱上使用乙腈梯度:水梯度進行HPLC以及進行採用quadtech檢測器的 Biorad HPLC。收集各峰，並通過基質輔助雷射解析電離飛行時間分 析，以證實產物的結構。收集含期望肽的流分並凍幹，以獲得純化產 物。使用HPLC、 MS和NMR確定純度。
實施例3:純化的乳鏈菌肽A類似物的結構和生物學分析 A.乳鏈菌肽A類似物的生物測定
將如此在實施例1和3中所述合成和純化的羊毛碌^抗生素進行等 分並凍幹。稱重所獲得的產物，計算最終收率。通過本領域已知的延 期拮抗測定法來確定乳鏈菌肽A類似物的生物活性，所述延期拮抗測 定允許確定乳鏈菌肽A類似物的最小抑制濃度和殺細菌濃度(Hillman 等，(1984), .o" /顯腦^ 44, 141-144; Hillman等，(1998),
/"/e"/o" aw//wmwm* 66, 2743-2749)。與天然乳鏈菌肽A對比能夠確 定相應的比活。生物測定如下進行
在96孔微量滴定板中，使用乙腈:水(80:20),將要測試乳鏈菌肽 A活性的級分的樣品(20 (il)連續稀釋2倍。濃度在20-0.08 pg/mL的範 圍內。用胰化酪蛋白大豆肉湯(Difco)以1:1000 (約106 cfu/mL)稀釋籐 黃微球菌(M/cracoca^ /wfew力菌林ATCC272LS (自發地抗100 |ug/mL 鏈黴素)的過夜培養物，並於37。C生長至OD6Q = 0.2。將600 pl細胞 加至15 mL已冷卻至45。C的胰化酪蛋白大豆肉湯上層瓊脂(0.75。/o瓊 脂)，並倒在覆蓋含胰化酪蛋白大豆瓊脂(含100 |ig/mL鏈黴素)的大培養皿表面(鏈黴素防止可能存在的汙染物生長，但並不影響測定存在的 乳鏈菌肽A活性量的能力)。在上層瓊脂已凝固後，取待測試級分的2
倍連續稀釋液的5ML樣品，點樣到平板表面上，並使其風乾。
將平板於37。C溫育24小時，並檢驗指示菌抹的生長抑菌圈。樣 品的效價被視為藤黃微球菌(vW: /wto^)指示菌林產生可見生長抑制的 最高稀釋度的倒數。作為對照，稀釋真正的乳鏈菌肽A，並如上所述 點樣。濃度在20-0.08 |ig/mL的範圍內。結果使得能夠作為基於如在 先前步驟中確定的這些化合物的純度水平的百分率確定合成類似物 相對於天然乳鏈菌肽A的生物活性。
使用合成和天然乳鏈菌肽A對至少十多種革蘭氏陽性種，包括多 藥物抗性金黃色葡萄球菌(&a/ /^/ococcw 、 糞腸球菌
(5"ferococcw /aeca/Z力和單核糹田胞增生李斯特氏菌(Z/Wen'a 附。"ocy,進行以上生物測定。 一種或多種適於所測試的耙物 種的其它抗生素也平行操作，用於對比。
B.乳鏈菌肽A類似物的結構分析
通過使用TOSCY和NOESY NMR對比天然乳鏈菌肽A確定乳 鏈菌肽A類似物的三維結構。以總體積700 |uL在1120/020/3-(三曱基 曱矽烷基)-丙酸-D4、鈉鹽(TSP) (90.0:9.9:0.1%)中製備合成和天然乳鏈 菌肽A的樣品(3-5 mM)。用冷凍Bruker Avance光i普儀於25°C以600 MHz採集NMR數據，並將載波頻率以水共振為中心，水共振在1.5 秒弛豫延遲當中被預飽和抑制。TOCSY實驗以60 ms混合時間使用 MLEV-17序列獲得(Bax & Davis (1985)， Jowr"a/ o/ Mag"e"c i Mo"a"ce 65， 355-360)。 NOESY實驗以200 ms、 400 ms和450 ms混 合時間獲得。將HMQC和HMBC實驗中產生或重聚焦反相相干性的 延遲時間分別被調整至3.5 ms (140 Hz耦合)和60 ms (8.5 Hz耦合)。
所有2D數據在獲取維度中都以2048個復點採集，對於間接維度 以介於256-512之間的復點收集。所有實驗的相位靈敏性間接檢測都使用States-TPPI的方法完成(Marion等，(1989)， Jo"ma/ o/Mag""/c Aew"a"ce 85, 393-399)。 'H化學位移參考TSP。用NMRpipe處理數 據(Delaglio等，(1995)， Jowr"a/ o/A.owo/ecw/m" iVM/ 6, 277-293):首先 通過重疊合法消除殘餘水信號，將兩個維度中的數據乘以餘弦平方函 數或具有60。位移的餘弦平方函數(對於HMBC的'H維度)，一次清零， 傅立葉(Fourier)變換和基線校準。用交互式電腦程式NMRView分 4斤悽丈才居(Johnson & Blevins (1994)， Jown7"/ o/ 5/omo/ecw/<ar A^nr 4, 603-614)。按照標準方法(Wiithrich， K. (1986) iVMi o/7Voto'ra iVwc/e/c H， Wiley, New York)使用TOCSY (Braunschweiler & Ernst (1983), Jowr"a/ 。/7Wag"e"c / escw朋ce 53, 521-528)和NOESY (Kumar 等，(1980)， Commw". 95, l-6)實驗確定'H共振。
使用 HMQC (Bax等，(1983), Jowwa/ o/ Mag"e"c / asowwce 55, 301-315; Muller (1979), Jowma/ o/ Ae爿wm'ca" C7zemZca/ 5bc/, 101， 4481-4484)和HMBC (Bax & Summers (1986), Jow腦/ o/ Ae爿me"'纖 C/zew/ca/ So"'e^ 108， 2093-2094)實驗明晰TOCSY和NOESY光譜中 的某些意義不明確的區域。
賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸和天冬醯胺殘基具有截然不 同且容易表徵的〗H共振自旋模式，這使它們容易在2D TOCSY和 NOESY實驗中確認。這些殘基先被鑑別出來。硫醚鍵模式經長距離P 質子NOE連接性模式核實。在3和7位、8和11位、13和19位、 23和26位以及25和28位的殘基之間的長距離NOE估計是可鑑別的。 對如在Smith等,2002 (5W"wra/ Fwwc"o"a/ C7 aracfen'z加'o" o/Ae L朋^n'o"'c Mwtoc/" 7"0， University of Florida, Gainesville)中所述的三 維建模使用長距離NOE (>i+2)。
以NMRView檢測NOE交叉峰強度。使用關係式= rcal6(Kcal/K。6) 計算距離，其中rab是原子a和6之間的距離，是NOESY 交叉 峰體積，/^是已知的距離，Ka,是NOESY校準交叉峰的對應體積。 用於校準的距離是異亮氨酸的(3質子。僅殘基間的NOE交叉峰在計算中用作距離約束。勢阱使用lkcal/mol/A2的上和下力常數定義。
所有構象建模都使用InsightII軟體(Accerlys, San Diego, CA)進 行。分子動力學模擬在真空中^f吏用具有交叉項、Morse電勢和40A截 止距離的cvff力場以500K、介電常數4.0進行。肽使用InsightII中的 建立者(builder)函數構建。首先，使線性肽最小化，然後使無限制的 分子動力學運行10ps。此後，僅增加/ + 2或更大的距離約束。當在 組成各個硫醚環的殘基中/ + 2或更大的距離約束令人滿意時，定時停 止分子動力學模擬。先形成環A，之後形成環B和環C，然後纏結環 D和E。 一旦形成了硫醚環，就將/+ 1距離約束增加至/ + 2或更大 的距離約束，使用具有交叉項和Morse電勢的cvff力場以500K、介 電常數4.0使分子動力學模擬運行5 ns。然後用所有約束使分子動力 學模擬再運行20 ns。
每10ps寫入動力學的歷史文件。採用所有NMR約束，使用2000 步最速下降後接共輒梯度和Newton-Raphson，使來自以1 ns開始並每 100 ps間隔的歷史文件的200個結構能量最小化，直至達到0.01 kcal/mol/A能量的均方根(RMS)梯度。使用PROCHECK-NMR軟體檢 查200個能量最小化結構的NMR約束違反情況(Laskowski, R. A., Rullmann, J. A. C., MacArthur, M. W.， Kaptein, R. & Thornton, J. M. (1996) AQUA and PROCHECK-雨R: Programs for checking the quality of protein structures solved by NMR, Jowr"a/ o/ 5z'omo/ecw/<ar AW. S, 477-486)。使用XCluster程序將能量最小化的結構分類為家族(Shenkin, P. S. & McDonald, D. Q. (1994) Cluster-Analysis of Molecular-Conformations, o/ C蘭/ w她bwa/ C7zem/欲y /5,
899-916)。將構象與由VanDeVen等，1991 (五wra; e朋Jowr"a/ o/ j5Zoc/2em&^y 202, 1181-1188)確定的乳鏈菌肽A的天然結構對比。
權利要求
1.一種合成分子內橋連多肽的方法，所述多肽包含至少一個分子內橋，所述方法包括a)將下式的差異保護的正交分子內橋的游離羧基端與固體支持體或者與任選地結合有固體支持體的胺基酸或多肽的游離氨基端偶聯，其中Ln為共價結合的胺基酸側鏈，其中D、E和G是保護基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中用於脫去保護基D的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸的氨基保護基的那些條件不同；b)脫去保護基E，形成游離氨基端；c)將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；d)任選地重複c)一次或多次；e)脫去保護基G，形成游離羧基端；f)將e)的游離羧基端與游離氨基端偶聯；g)脫去保護基D，形成游離氨基端；和h)任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；和i)任選地重複h)一次或多次。
2. —種合成分子內橋連多肽的方法，所述多肽包含兩個重疊的分 子內橋，所述方法包括a)將下式的第 一個被差異保護的正交分子內橋的游離羧基端formula see original document page 3與固體支持體或者與任選地結合有固體支持體的胺基酸或多肽的游離氨基端共價結合，其中L"為共價結合的胺基酸側鏈，其中D、 E和 G是保護基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中 用於脫去保護基D的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸 的氨基保護基的那些條件不同；b) 脫去保護基E,形成游離氨基端；c) 將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述胺基酸 脫保護，得到新的游離氨基端；d) 任選地重複c)一次或多次；e) 將下式的第二個被差異保護的正交分子內橋的游離羧基端formula see original document page 3與游離氨基端共價結合，其中L"如上定義，其中M、 Q和T是保護 基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中D和M 在不同條件下才被脫除，其中G和T在不同條件下才被脫除，其中用 於脫去保護基M的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸的 氨基保護基的那些條件不同，其中E和Q在與將脫去D的那些條件 和將脫去M的那些條件不同的條件下被脫去；f) 脫去保護基Q，形成游離氨基端；g) 任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所 述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端； h) 任選地重複g)—次或多次；i) 脫去第一個被差異保護的正交分子內橋的保護基G，形成游離 羧基端；j)將游離羧基端與游離氨基端偶聯；k)脫去第一個被差異保護的正交分子內橋的保護基D,形成游離 氨基端；1)任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述 胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端； m)任選地重複l)一次或多次；n)脫去第二個被差異保護的正交分子內橋的保護基T,形成游離 羧基端；o)將游離羧基端與游離氨基端偶聯；p)脫去第二個被差異保護的正交分子內橋的保護基M,形成遊 離氨基端；和q)任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所 述胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；和 r)任選地重複q)—次或多次。
3.權利要求2的方法，所述方法還包括a) 脫去結合有固體支持體的多肽的氨基端保護基，形成游離氨基端；b) 將下式的差異保護的正交分子內橋formula see original document page 4與游離氨基端偶聯，其中L"為共價結合的胺基酸側鏈，其中D、 E和 G是保護基，所述各保護基均在不同反應條件下被選擇性脫除，其中 用於脫去保護基D的反應條件與用於脫去多肽鏈其餘部分的胺基酸的氨基保護基的那些條件不同；c) 脫去保護基E，形成游離氨基端；d) 將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述氨基 酸脫保護，得到新的游離氨基端；e) 任選地重複d)—次或多次；f) 脫去保護基G,形成游離羧基端；g) 將f)的游離羧基端與游離氨基端偶聯；h) 脫去保護基D,形成游離氨基端；i) 任選地將氨基受保護的胺基酸添加至游離氨基端，然後使所述 胺基酸脫保護，得到新的游離氨基端；j)任選地重複i)一次或多次；和 k)任選地重複步驟b)-j)。
4. 權利要求l的方法，其中所述多肽包含兩個分子內橋。
5. 權利要求4的方法，其中所述兩個分子內橋形成兩個串聯的環。
6. 權利要求4的方法，其中所述兩個分子內橋形成兩個環，其中 一個環嵌入到另 一個環中。
7. 權利要求2的方法，其中所述差異保護的正交分子內橋是羊毛 硫氨酸。
8. 權利要求2的方法，其中所述分子內橋連多肽是羊毛硫抗生素。
9. 權利要求2的方法，其中D、 E、 M和Q選自Fmoc、 Alloc 和IvDde。
10. 權利要求2的方法，其中G和T選自炔丙酯和千酯。
11. 權利要求7的方法，其中所述分子內橋選自(3-曱基羊毛硫氨 酸(MeLan)、 S-[(Z)-2-氨基乙烯基]-D-半胱氨酸(AviCys)和S-[(Z)-2-氨 基乙烯基]-2-曱基-D-半胱氨酸。
12. 權利要求8的方法，其中所述羊毛硫抗生素選自乳鏈菌肽A、乳鏈菌肽Z、枯草菌素、槲皮素S、槲皮素A、紅網鏈菌素、表皮素、 [Vall-Leu6]-表皮素、Gallidermin、變異菌素1140、變異菌素B-Ny266、 變異菌素m、變異菌素I、 Pep5、 EpilancinK7、 Epicidin 280、乳鏈球 菌素481、 Variacin、變異菌素II、鏈球菌素A-FF22、 SalivaricinA、 [Lys2-Phe7]-salivaricin A、植物乳桿菌素C、 Sublancin 168、 Butyrivibriocin OR79A、肉桂黴素、耐久黴素、耐久黴素B、耐久黴素 C、居拉黴素C、血管緊張肽轉化酶抑制肽、Mersacidin、阿肽加定、 Ala(0)-阿肽加定、Subtilocin A、乳鏈球菌素3147A1、乳鏈球菌素 3147A2、葡萄球菌素C55oc、葡萄球菌素C55p、植物乳桿菌素Wa、 植物乳桿菌素WP、溶細胞素L^和溶細胞素Ls。
13. 權利要求12的方法，其中所述羊毛硫抗生素是乳鏈菌肽A 或其類似物。
14. 通過權利要求1的方法製備的分子內橋連多肽。
15. 通過權利要求2的方法製備的分子內橋連多肽。
16. 通過權利要求3的方法製備的分子內橋連多肽。
17. —種下式的差異保護的正交羊毛硫氨酸其中D和E是不同的保護基，選自Fmoc、 Alloc和IvDde，而G 是選自炔丙酯和千酯的保護基。
全文摘要
本發明提供合成包含至少一個分子內橋的分子內橋連多肽的方法。本發明還提供合成包含兩個分子內橋的分子內橋連多肽的方法，其中這兩個分子內橋形成兩個重疊環、兩個串聯環或兩個嵌入環。本發明還提供用於合成羊毛硫抗生素包括乳鏈菌肽A的方法。另外，本發明提供通過本文公開的方法合成的分子內橋連多肽和差異保護的正交羊毛硫氨酸。
文檔編號C07K1/107GK101287746SQ200680037491
公開日2008年10月15日 申請日期2006年8月11日 優先權日2005年8月12日
發明者J·D·希爾曼, J·L·史密斯, R·S·奧魯岡蒂 申請人:奧潔克公司