使癌幹細胞可視化並消除癌幹細胞的組合物和方法
2023-07-27 14:18:16 1
專利名稱：使癌幹細胞可視化並消除癌幹細胞的組合物和方法
技術領域：
本發明一般地涉及癌症診斷與治療的領域，更具體而言涉及可用於消除HER2+乳腺癌細胞、不表達雌激素受體、孕酮受體或HER2/neU的三陰性乳腺癌細胞、和具有幹細胞樣特徵的癌細胞的組合物和方法。本發明的組合物和方法還可用於處置轉移乳腺癌和使患者體內的乳腺癌細胞可視化。
背景技術：
根據乳腺癌是否表達雌激素受體、孕酮受體和Her2/neU，可將其分為不同亞型。在開始癌症治療之前，確定患者的癌症亞型很重要，這是因為有些藥物靶向表達雌激素受體的癌細胞，而另一些藥物靶向表達其他受體的癌細胞。已表明HER2/neU基因涉及哺乳動物腫瘤發生、腫瘤生長和轉移。HER2/neU在20-30%的人乳腺癌中增多，並且HER2陽性亞型的乳腺癌與侵襲性轉移疾病相關(Korkaya等人2008. Oncogene)。本發明通過提供可用於消除HER2陽性乳腺癌細胞的新型組合物和方法，可有助於治療HER2陽性乳腺癌。最近鑑定了一種新的乳腺癌細胞亞型。這些癌細胞由於不表達雌激素受體、孕酮受體或Her2/neu而被稱為三陰性乳腺癌細胞(Dent等人2007. Clinical Cancer Research 13:4429-4434)。如Cancer Research UK^)07)所述，三陰性乳腺癌病例在所有乳腺癌病例中佔約15%。與其他已知的乳腺癌亞型相比，三陰性亞型更具侵襲性、對標準治療響應更低並且與整體患者預後更差有關(Dent等人2007. Clinical Cancer Research 13: 4429-4434)。因此，需要診斷和治療三陰性乳腺癌患者的組合物和方法。近期研究表明，包括乳腺癌在內的多種癌症都是由小亞群的癌幹細胞(CSC)因自我更新途徑的失調而產生。已經報導具有幹細胞樣特徵的乳腺癌細胞亞群為⑶44和⑶133 陽性、CD24陰性並且表達醛脫氫酶1 (ALDHl) (Crocker等人2008. J Cell Mol Med)。需要鑑定和消除具有幹細胞樣特徵的乳腺癌細胞亞群的組合物和方法。催乳素(「PRL」)是23-kDa的神經內分泌激素，在結構上與生長激素相關，並且以較低的程度與白介素家族的成員相關(Reynolds等人，1997，Endocrinol. 138 =5555-5560, Cunningham 等人，1990，Science 247 :1461-1465 ;Wells 等人，1993，Recent Prog. Horm. Res. 48 :253-275) 0催乳素受體存在於乳腺、卵巢、垂體腺、心臟、肺、胸腺、脾臟、肝臟、 胰腺、腎臟、腎上腺、子宮、骨骼肌、皮膚和中樞神經系統的區域中。Mancini T. (2008)， 「Hyperprolactinemia and Prolactinomas，，，Endocrinology & Metabolism Clinics of North America 37:67。當催乳素與其受體結合時，它引起它與另一催乳素受體二聚化，從而導致Janus激酶2的活化，Janus激酶2是啟動JAK-STAT路徑的酪氨酸激酶。催乳素受體的活化還導致有絲分裂原-活化蛋白激酶和Src激酶有絲分裂原的活化。Mancini，T. (2008). "Hyperprolactinemia and Prolactinomas,，，Endocrinology & Metabolism Clinics of North America 37 :67。「催乳素受體拮抗劑」是指幹擾催乳素信號轉導途徑的催乳素形式。發明人為W. Chen和T.Wagner的美國專利申請2007/0060520之前已描述了這種催乳素受體拮抗劑。
發明內容
本發明提供了一種用於抑制患者的不表達雌激素受體、孕酮受體或Her2/neU的乳腺癌三陰性細胞的生長的方法，所述方法包括對患者施用人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被另一個胺基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的其他人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被以下胺基酸中的任一個取代的那些人催乳素受體拮抗劑纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸或穀氨酸。在另一些實施方式中，本發明提供了用於抑制乳腺癌患者的轉移瘤的發展的方法，所述方法包括對患者施用人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被另一個胺基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的其他人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被以下胺基酸中的任一個取代的那些人催乳素受體拮抗劑纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、 天冬氨酸或穀氨酸。本發明還涉及用於降低乳腺癌患者的醛脫氫酶I(ALDHl)的活性的方法，所述方法包括對患者施用人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的人催乳素受體拮抗劑包括其中 129位的甘氨酸被另一個胺基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的其他人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被以下胺基酸中的任一個取代的那些人催乳素受體拮抗劑纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸或穀氨酸。本發明還涉及用於減少乳腺癌患者的癌幹細胞的數量的方法，所述方法包括對患者施用人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被另一個胺基酸如精氨酸取代的那些人催乳素受體拮抗劑。可用於該方法的其他人催乳素受體拮抗劑包括其中1 位的甘氨酸被以下胺基酸中的任一個取代的那些人催乳素受體拮抗劑纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸或穀氨酸。本發明的方法中的任一個均可通過與選自毒素、放射性同位素、螢光染料和蛋白的試劑綴合的催乳素受體拮抗劑來實施。在另一些實施方式中，可以通過將催乳素受體拮抗劑與化學治療劑同時施用或依次施用來進行本發明的方法。這種化學治療劑可以包括以下化合物中的任一個或它們的組合全反式視黃酸；阿扎胞苷；硫唑嘌呤；博來黴素；卡鉬；卡培他濱； 順鉬；苯丁酸氮芥；環磷醯胺；阿糖胞苷；道諾黴素；多西他賽；去氧氟尿苷；阿黴素；表柔比星；埃博黴素；依託泊苷；氟尿嘧啶；吉西他濱；羥基脲；伊達比星；伊馬替尼；氮芥；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；米託蒽醌；奧沙利鉬；紫杉醇；培美曲塞；替尼泊苷；硫鳥嘌呤；戊柔比星； 長春鹼；長春新鹼；長春地辛和長春瑞濱。可通過各種施用途徑將催乳素受體拮抗劑遞送至患者，所述各種施用途徑包括但不限於胃腸外、皮下、腹膜內、靜脈內、淋巴管內、鞘內、心室內或肺內。在本發明的方法中， 可以在乳腺癌切除之前和/或之後施用催乳素受體拮抗劑。本發明還涉及定位患者體內的癌細胞並且鑑定轉移的方法。為了實現該目的，將與放射性同位素、螢光染料或其他標記試劑綴合的催乳素受體拮抗劑施用於患者，然後對該患者進行鑑定該拮抗劑定位區域的程序。可用於定位綴合催乳素受體的程序包括計算機斷層掃描程序、計算機斷層掃描程序、磁共振成像和核磁共振成像。
圖1.用催乳素受體拮抗劑GU9R治療三陰性乳腺癌細胞使ALDHl活性降低。圖2.用催乳素受體拮抗劑GU9R治療負荷HER2+/neU乳腺腫瘤的小鼠使腫瘤細胞的ALDHl活性降低。圖3.用催乳素受體拮抗劑GU9R治療原發HER2+/neU乳腺癌細胞使ALDHl活性降低。圖4.催乳素拮抗劑G129R抑制攜帶HER2+/neU乳腺腫瘤的哺乳動物中轉移瘤的發展。圖 5.圖 6. 白的磷酸化。圖 7.圖 8.圖 9.
催乳素拮抗劑G129R抑制哺乳動物中HER2+/neU腫瘤的生長。
催乳素拮抗劑GU9R的治療抑制哺乳動物原發和繼發腫瘤中HER2+/neU蛋
體內HER2+腫瘤對催乳素拮抗劑GU9R治療的劑量依賴性響應。 體內HER+腫瘤對催乳素拮抗劑GU9R治療的時間依賴性響應。 人催乳素的胺基酸序列。
具體實施例方式
人催乳素的胺基酸序列如圖9所示。術語「催乳素(PRL) 」在本文中指人和非人動物形式的激素催乳素(還可見Cooke等人，J.Biol. Chem. ,256 =4007(1981) ；Cooke 等人，J. Biol. Chem.，225 :6502 (1980) ；Kohmoto 等人，Eur. J. Biochem.，138 :227 (1984)； Tsubokawa 等人，Int. J. Peptide Protein Res. ,25 :442(1985) ；Bondar 等人，GenBank 登錄號 #X63235(1991) ；Sasavage 等人，J. Biol. Chem. 257 :678(1982) ；Miller 等人， Endocrinol. 107 :851(1980) ；Li 等人，Arch. Biochem. Biophys. 141 :705(1970) ；Li, Int. J.Peptide Protein Res. ,8 :205(1976) ；Martinant φ A, Biochim. Biophys. Acta,1077 339(1991) ；Lehrman 等人，Int. J. P印tide Protein Res.，31 :544 (1988) ；Li 等人，Int. J. Peptide Protein Res. ,33 :67(1989) ；Hanks 等人，J. Mol. Endocrinol. ,2 :21(1989)； Watahiki 等人，J. Biol. Chem.，264 :5535 (1989) ；Karatzas 等人，Nucl. Acids Res., 18 :3071(1990) ；Yasuda 等人，Gen. Comp. Endocrinol. ,80 :363(1990) ；Noso 等人，Int. J. Peptide Protein Res. ,39 250 ；Buckbinder 等 Α Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α., 90 :3820(1993) ；Takahashi 等人，J Mol. 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Biochem.，172 279(1988) ；Mercier 等人，DNA 8:119(1989))。術語「催乳素受體拮抗劑」是指幹擾催乳素信號轉導途徑的催乳素形式。優選的催乳素受體拮抗劑包括其中至少一個胺基酸通過插入、缺失和/或取代而由其天然存在序列改變的催乳素。術語GU9R指其中1 位甘氨酸由精氨酸取代的例如圖9所示的催乳素受體拮抗劑。將催乳素受體拮抗劑拮抗PRL對其受體的作用的能力定義為該變體抑制由PRL介導的效應的能力。催乳素受體拮抗劑包括公開的美國專利申請號2005/02716 中描述的那些催乳素受體拮抗劑，將其內容以引用方式整體併入本文。在PRL和PRL變體都存在時，通過測定催乳素變體(「PRL變體」)對PRL經由其受體發揮作用的能力進行阻斷的能力，可以鑑定催乳素受體拮抗劑。PRL經由其受體發揮作用的能力可通過監測細胞增殖的變化以及MAP-激酶和HER2/neU信號轉導途徑中下遊靶標的磷酸化/活化來測定。可以將其中1 位的甘氨酸殘基被另一個胺基酸替換的催乳素變體用於本發明的方法中。以縮寫形式G 1 *(其中*是除甘氨酸之外的天然存在或合成胺基酸)表示的該取代可以是天然存在序列的唯一變化，也可以是多個改變(包括其他胺基酸的插入、缺失和/或取代)中的一個。取代胺基酸可以是中性-極性胺基酸，例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸；中性非極性胺基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸；酸性胺基酸，例如天冬氨酸或穀氨酸；以及鹼性胺基酸，例如精氨酸、組氨酸或賴氨酸。在本發明優選實施方式中，hPRL的1 位甘氨酸可以被纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸或穀氨酸取代。在本發明的一個實施方式中，該取代是以精氨酸替換1 位甘氨酸(GU9R)。在另一實施方式中，本發明提供了其中1 位甘氨酸缺失的催乳素變體。可以將催乳素受體拮抗劑與作為融合蛋白一部分的另一蛋白連接。例如，可將催乳素拮抗劑與白介素2、綠色螢光蛋白、β -半乳糖苷酶或選自例如美國專利7，425，535所述的那些蛋白的孔形成蛋白連接。在另一實施方式中，催乳素受體拮抗劑與化合物綴合。這種化合物包括、但不限於螢光染料、放射性同位素或細胞毒素，所述細胞毒素例如能夠引發細胞凋亡的小分子。本發明的催乳素受體拮抗劑可通過化學合成或通過重組DNA技術製備。通常，可通過以下方式製備PRL的cDNA 利用標準PCR擴增技術，以從產生PRL的細胞(例如垂體細胞)製備的RNA或cDNA為模板，根據已知PRL核酸或胺基酸序列設計寡核苷酸引物。製備編碼HPRL的cDNA的非限制性實例如公開的美國專利7，115，556 (Wagner等人)所述。然後可隨機或通過定點突變在PRL cDNA中引入改變。在通過重組技術製備催乳素受體拮抗劑的時候，可以將編碼PRL變體的核酸引入表達載體，並可操縱地連接於合適的啟動子/增強子序列。表達載體還可以含有一個或多個輔助PRL變體表達的元件，包括轉錄終止位點、多聚腺苷酸位點、核糖體結合位點、信號序列等。合適的表達系統包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母細胞、粘液菌、和包括轉基因植物和轉基因動物在內的生物體。適合的表達載體包括單純皰疹病毒類載體如 pHSVKGeller 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 87 :8950-8954(1990))；逆轉錄病毒載體如MFG(Jaffee等人，Cancer Res. 53 :2221-22 (199 )，特別是莫洛尼逆轉錄病毒載體如 LN、LNSX, LNCX, LXSN(Miller 禾口 Rosman, Biotechniques, 7 :980-989(1989))；牛痘病毒載體如 MVA(Sutter 和 Moss，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 :10847-10851 (1992))； 腺病毒載體如 pJM17(Ali 等人，Gene Therapy 1 :367-384(1994) ；Berker, Biotechniques 6 :616-624(1988) ；Wand 和 Finer, Nature Medicine 2 :714-716(1996))；腺相關病毒載體如 AAV/neo (Mura-Cacho 等人，J. Immunother.，11 :231-237 (1992))；慢病毒載體 (Zufferey 等人，Nature Biotechnology 15 :871-875(1997))；質粒載體如 pCDNA3 和 pCDNAl (InVitrogen)、pET 11a、pET3a、pETlld、pET3d、pET22d、禾口 pET12a (Novagen)； 質粒AH5 (其含有SV40起點和腺病毒主要後期啟動子)、pRC/CMV (InVitrogen)、pCMU IKPaabo 等人，EMBO J.，5 :1921-1927 (1986))，pZipNeo SV(Cepko 等人，Cell, 37 1053-1062(1984))。pSR. α · (DNAX, Palo Alto, Calif.)和 pBK-CMV ；以及杆狀病毒表達載體(O 『 Reilly 等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, Oxford University Press (1995))，例如 p2Bac (InVitrogen)。隨後可通過標準技術對重組表達系統產生的催乳素受體拮抗劑進行純化，所述標準技術包括電泳、色譜(包括親和色譜)、和超濾。可以製備與放射性同位素或螢光染料綴合的肽形式的催乳素受體拮抗劑。可以在體外轉錄/翻譯系統中合成生物素化或放射性標記的催乳素受體拮抗劑，在所述體外轉錄/翻譯系統中將變體基因克隆到載體中的SP6啟動子下，隨後通過利用SP6轉錄酶和兔網織紅細胞在生物素或放射性標記物的存在下製備蛋白。體外轉錄/翻譯系統可商購自QIAGEN。作為另一種選擇，可以在細菌細胞或哺乳動物細胞中產生綴合的催乳素受體拮抗劑，所述細菌細胞或哺乳動物細胞在放射性標記的、 螢光標記的或生物素化的胺基酸存在下培養。也可利用相關領域技術人員公知的其他合成標記蛋白的方法來製備與放射性同位素、螢光染料、順磁標籤或生物素綴合的催乳素受體拮抗劑。本發明提供了其中可利用催乳素受體拮抗劑抑制三陰性乳腺癌細胞或Her2+乳腺癌細胞增殖的方法和組合物。在一些實施方式中，通過獲取生物活檢樣並以標記物對所獲乳腺癌細胞染色，所述標記物可對癌細胞是否表達雌激素受體、HER2+和/或孕酮受體進行可視化，從而對乳腺癌患者進行診斷，以確定其乳腺癌是否為三陰性乳腺癌亞型或HER2陽性亞型。如果確定患者攜帶三陰性乳腺癌細胞或HER2+乳腺癌細胞，則用催乳素受體拮抗劑治療患者。為了確定用於治療的催乳素受體拮抗劑的有效量，可使用標準方法，如劑量-響應測試。然後以催乳素受體拮抗劑對患者按日進行治療。可以監測患者對治療的響應，三陰性乳腺癌細胞或HER2陽性細胞數量減少表明對治療有正面響應。每輪治療之後根據需要和總體改善，還可以對患者進行後續輪次的治療。本發明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑治療卵巢癌、子宮癌(子宮內膜癌)、和宮頸癌的方法和組合物。為了確定用於治療的催乳素受體拮抗劑的有效量，可使用標準方法，如劑量-響應測試。每輪治療之後根據需要和總體改善，還可以對患者進行後續輪次的治療。本發明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑消除具有轉移瘤的患者的繼發腫瘤細胞的方法和組合物。在所述方法中，在乳腺癌外科手術過程中從患者腫瘤取活檢物。隨後分析活檢物，從而確定患者癌症亞型是否是三陰性或HER2陽性。隨後使患者從其外科手術中恢復，並對其進行催乳素受體拮抗劑治療，例如為期2周的G129R治療。1至2周後，對患者再進行數輪治療。催乳素受體拮抗劑治療可以與其他治療方法如化學療法和/或放射同時施用。本發明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑消除具有幹細胞樣特徵的乳腺癌細胞的方法和組合物。在一些實施方式中，如上所述對患者進行催乳素受體拮抗劑治療。本發明還提供了其中可使用催乳素受體拮抗劑對患者的具有幹細胞樣特徵的乳腺癌細胞進行可視化的方法和組合物。在一些實施方式中，將催乳素拮抗劑首先與可檢測標記物如螢光染料或放射性同位素綴合，然後施用於患者。然後通過本領域已知程序中的任一種將拮抗劑在患者體內的定位可視化。所述程序例如包括計算機斷層掃描程序；磁共振成像和核磁共振成像。在本發明的方法中，可以將催乳素受體拮抗劑與其他適合治療乳腺癌的試劑相繼施用或在組合治療方案中一起施用。作為非限制性實例，用於組合方案的其他試劑可包括化學治療劑、使HER2/neU信號轉導途徑失活的試劑如賀賽汀、抗雄激素和/或抗雌激素，如他莫昔芬。對於治療應用，本發明的組合物可以以藥學可接受劑型施用於哺乳動物、優選人， 所述藥學可接受劑型包括可以作為靜脈內推注施用或經一段時間連續輸注、或通過肌肉內、腹膜內、腦脊腔內、皮下、動脈內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑施用的那些劑型。 本發明的組合物還適合於經腫瘤內、腫瘤周圍、病損內或病損周圍途徑施用，以便發揮局部的和全身的效果。預計腹膜內施用對各種癌症和轉移病灶的治療特別有用。可根據已知的製備藥用組合物的方法來配製本發明的組合物，通過所述方法將組合物試劑組合於與藥學可接受載體載質(carrier vehicle)的混合物中。包括其他人類蛋白如人血清白蛋白在內的適合的載質及其配製，在例如REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES(16版，Osol，A編，Mack，Easton Pa. (1980))中有所描述。為了形成適合有效施用的藥學可接受組合物，所述組合物含有有效量的本發明的蛋白中的一種或多種，以及適合量的載體載質。更具體而言，有效劑量(量)是指抑制HER2+乳腺癌細胞或三陰性乳腺癌細胞增殖所需的催乳素受體拮抗劑的量。可以根據實施例8所述的劑量-響應和時間-響應測試確定有效量。治療有效量的確定特別取決於藥物的毒性和功效等因素。可以利用本領域公知的方法和在先文獻中的方法來確定毒性。可利用相同的指導結合以下實施例所述方法來確定功效。因此，藥學有效量就是指被臨床醫師視為毒性可耐受並仍然有功效的量。 功效例如可通過靶向的腫瘤塊的質量減少而測定。可以用催乳素受體拮抗劑組合物治療乳腺癌、卵巢癌、子宮癌(子宮內膜癌)或宮頸癌的患者。隨後，可以通過監測患者癌細胞中ALDHl活性的下降來監測患者的具有幹細胞樣特徵的癌細胞的數量的減少。之後可重複進行催乳素受體拮抗劑治療的輪次，從而進一步消除具有幹細胞樣特徵的癌細胞。在本發明的一個實施方式中，可對患者處以1至6輪治療，每輪由1至10天組成。可使用催乳素受體拮抗劑對具有幹細胞樣特徵的乳腺癌、卵巢癌、子宮癌(子宮內膜癌)或宮頸癌細胞進行可視化。在一個實施方式中，可以施用與綠色螢光蛋白融合的催乳素受體拮抗劑。在其他實施方式中，可以將催乳素受體拮抗劑與螢光染料或放射性同位素綴合，並施用於患者。隨後對催乳素受體拮抗劑在患者體內的定位進行監測。可以利用一種或多種生理可接受的載體或賦形劑通過常規方式來配製根據本發明所用的組合物。因此，可將其配製為用於通過吸入或吹入施用(通過嘴或鼻)，或口服、口頰、胃腸外或直腸施用。可以對口服施用製劑進行適當配製，從而提供活性化合物的控釋。對於口頰施用， 組合物可以為常規方法配製的片劑或錠劑的形式。對於吸入施用，可以將根據本發明的組合物以氣霧噴劑方式由加壓包或噴霧器按常規方式遞送，並使用適當的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當氣體。在加壓氣霧劑情況中，可以通過設置可遞送計量量的閥來確定劑量單位。可以配製含有化合物和適當粉末基料如乳糖或澱粉的粉末混合物的膠囊和盒(例如明膠膠囊和盒)，以用於吸入器或吹入器。可以將本發明的組合物配製用於通過注射進行胃腸外施用，例如可通過推注或連續輸注。注射用製劑可以以單位劑量形式存在，例如在安培瓶或在多劑量容器中，並添加有防腐劑。組合物可以為在油性或水性載質中的懸浮液、溶液或乳液等形式，並且可含有配製劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。作為另一種選擇，活性成分可以為粉末形式，以便在使用前用適當載質如無菌無熱源水配製。還可以將組合物配製為直腸用組合物，例如如含有常規栓劑基質(如可可油或其他甘油酯)的栓劑或灌腸保留劑。除了上述製劑以外，還可以將本發明的組合物配製為長效製劑(cbpot pr印aration)。這種長時間作用製劑可通過植入(例如皮下或肌肉內植入)或肌肉內注射來施用。因此，例如可以將使HER2/neU信號轉導途徑失活的催乳素變體和/或試劑與適當聚合物或疏水材料(如作為在可接受油中的乳液)或離子交換樹脂配製，或配製為微溶衍生物，例如微溶鹽。如需要，該組合物可存在於可含有一個或多個包含活性成分的單位劑量形式的包裝或分配裝置中。所述包裝例如可以具有金屬箔或塑料箔，如泡罩包裝。所述包裝或分配裝置可帶有施用說明書。此外，還可以對本發明的組合物進行修飾，從而具有更長清除率，因而通過保護組合物免受受試者的免疫反應和其他清除基質的破壞而增加生物利用度。例如，PEG化的化合物顯示降低的免疫原性和抗原性，並在血流內的循環比未綴合的蛋白顯著延長。可通過本領域已知方法將PEG (聚乙二醇)聚合物鏈與催乳素變體/催乳素受體拮抗劑連接，例如通過 Roberts 等人，Adv. Drug Del. Rev. ,54(4) :459-76(2002)所述的 PEG 化程序。但其他可延長本發明治療組合物的清除半衰期的試劑是本領域技術人員已知的並且也包含在本發明中。實際上，還可以用羥乙基澱粉(HEQ修飾本文所述的組合物。HES是天然存在的支鏈澱粉的衍生物，並在體內被α澱粉酶降解。本領域已知製備HES-蛋白綴合物的方法。 例如見 EP 1398322、DE 2616086 和 DE 2646854ο為了延長本發明組合物的清除時間並增加其半衰期，本發明還包括將催乳素受體拮抗劑與血清白蛋白連接的試劑。雖然美國專利公開2007/0160534(將其通過引用併入本文)披露了這種試劑，還認為其他對可綴合本發明的催乳素受體拮抗劑的血清白蛋白有親和性的肽配體適合用於此處。參考以下實施例對本發明進行進一步描述，這些實施例僅用於說明目的。本發明不限於這些實施例，而是包含了因本文提供的教導而顯而易見的各種變化形式。實施例1人催乳素拮抗劑GU9R的製備利用逆轉錄(RT)和之後的聚合酶鏈式反應(PCR)成功克隆了人PRL。簡單來說， 將人垂體 polyA RNA(CloneTech, Inc. Palo Alto, Calif.)用作模板。由 hPRL cDNA 的距終止密碼子(TAA) 2個鹼基處開始設計HPRL反義引物(5 『 -GCTTAGCAGTTGTTGTTGTG-3 『 ； SEQ ID NO :1)，並從 ATG 起設計正義引物(5 『 -ATGAACATCAAAGGAT-3 『 ；SEQ ID NO :2)。利用 Perkin-Elmer Cetus，Inc. (Norwalk, Conn.)的試劑盒進行 RT/PCR。利用經修飾的 T7DNA 聚合酶Gequenase，United States Biochemical)通過雙脫氧鏈終止法測定所得hPRL的核苷酸序列，發現其與GenBank中報導的相似，不同之處在於導緻密碼子21處的沉默突變的一個鹼基差異(CTG- > CTC)。包括pUCIG-Met表達載體製備在內的克隆過程的示意圖在公開的美國申請號2003 002^33號(Wagner等人)中有所總結，將該文獻通過引用整體併入本文。將含有hPRL cDNA和M13 Fl複製起點的親本質粒轉化到E. coli (CJ236)中。利用輔助噬菌體M13k07從所轉化的CJ236菌中分離出含有尿苷的單鏈質粒DNA。通過在70°C 加熱5分鐘，然後緩慢冷卻，將6pmol含有指導G129R突變的寡核苷酸與0. 2pmol單鏈DNA 在退火緩衝液QOOmM Tris-HCl, 20mM MgCl2, IOOmM NaCl)中退火。用單鏈DNA為模板，以 T4DNA聚合酶催化，將編碼GU9R突變的寡核苷酸(5 『 -CGGCTCCTAGAGAGGATGGAGCT-3 『； SEQ ID NO :3)用於引發DNA互補鏈的合成。合成後，使用雙鏈DNA來轉化E. coli (DH5a)。 分離單克隆，並通過DNA核苷酸測序來篩選hPRL-G129R。將hPRL和G129R編碼核酸各自插入哺乳動物細胞表達載體中，所述哺乳動物細胞表達載體之中cDNA的轉錄受到小鼠金屬硫蛋白增強子/啟動子序列和bGH poly A添加信號的控制(Chen 等人，J. Biol. Chem.，266 :2252-2258(1991) ；Chen 等人，Endocrinol.，129 1402-1408(1991) ；Chen 等人，Mol. Endocrinol.，5 :1845-1852(1991) ；Chen 等人，J. Biol. Chem.，269 15892-15897 (1994))。為了建立產生hPRL和hPRLA的穩定小鼠L細胞系，將小鼠L細胞[胸苷激酶-陰性(TK)，且腺苷磷酸核糖基轉移酶-陰性(APRT)]選作體外表達體系。製備了表達HPRL的穩定細胞系(其被用作陽性對照)和人催乳素拮抗劑(約5-10mg/ 1/24 h/百萬個細胞)。利用Chen 等人，J. Biol. Chem. 269 :15892-15897(1994)所述技術，使用膜超濾從條件細胞培養基中部分純化和濃縮hPRL和人催乳素拮抗劑。分離基於相對分子尺寸和膜的孔尺寸。超濾膜獲自AmiconJnc. (Northorough，Mass.)。使用了兩種膜，YMlO和YM100。 首先，使用具有Amicon YM100的200ml超濾裝置，在20psia跨膜壓下從培養基中除去大雜質。將透過物(hPRL回收為>90%)用於第二過濾規程，該第二過濾規程用YMlO膜來減少溶液體積，從而濃縮蛋白。利用 Diagnostic Products Corp. (Los Angeles, Calif.)的免疫放射計量測試(IRMA)試劑盒來確定HPRL或人催乳素拮抗劑的濃度。實施例2
用催乳素受體拮抗劑GU9R治療三陰性乳腺癌細胞可降低細胞的ALDHl活性。將人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231和對照乳腺癌細胞T-47D以IxlO5個細胞/孔鋪於6孔板中，並使其在生長培養基中貼壁M小時，然後進行2小時的無血清培養基消耗。 隨後在不含(對照)或含有催乳素(lOOng/ml)或GU9R(10ug/ml)的情況下培養細胞3天。 然後收集細胞，並通過ALDEFLUORK-光測試(StemCell Technologies)測定ALDH-1活性 (該酶是癌幹細胞的標記物。見Ginestier等人，Cell Stem Cell 2007 1 (5) :555-567)。 如圖1所示，催乳素拮抗劑G129R治療顯著降低了三陰性乳腺癌細胞中的ALDHl活性。實施例3催乳素受體拮抗劑治療降低腫瘤細胞中的ALDHl活性MMTV/neu轉基因小鼠攜帶由小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子驅動的活化的 c-neu癌基因，並發展為乳腺HER2+腺癌(Muller等人1988. Cell. 54 (1) =105-15) 0對攜帶乳腺腫瘤的MMTV/neu轉基因小鼠以PBS (η = 4)或G129R治療5天(n = 2)或10天(n = 3) (10mg/kg, i.p.)。在治療結束時分離腫瘤，消化為單細胞懸浮液，並比較ALDHl活性水平。從圖2可見，在分離自G129R治療動物的癌細胞中，ALDHl活性顯著降低。實際上在以 G129R治療10天的癌細胞中未檢測到ALDHl活性。實施例4催乳素受體拮抗劑對癌細胞的治療使ALDHl活性降低從MMTV/neu轉基因小鼠中分離原髮乳腺腫瘤細胞，並在GU9R (10ug/ml)或 PRL(100ng/ml)存在下培養對、48、72、或96小時。具體而言，將取自MMTV-neu小鼠的腫瘤消化為單細胞懸浮液，並以IxlO5個細胞/ml鋪在12孔板中。使細胞在生長培養基中貼壁M小時，然後進行2小時的無血清培養基消耗。隨後不用(對照)催乳素或用催乳素 (100ng/ml) ^ G129R(10ug/ml)處理細胞。處理對、48、72、或96小時後收集細胞，並測定 ALDH-I活性。由圖3可見，對暴露於GU9R的原發MMTV/neu腫瘤細胞進行的時間過程研究揭示出ALDHl活性的穩定下降，最終水平顯著低於對照(96小時減少92. 3% )。實施例5催乳素拮抗劑抑制哺乳動物轉移瘤的發展從MMTV/neu轉基因小鼠中分離原髮乳腺腫瘤。以PBS或GU9R(200ug/天，i. p.) 對小鼠治療超過40天。當繼發腫瘤(復發)生長至一定尺寸，處死小鼠，切取肺並在包氏固定劑中固定以便觀察轉移。圖4顯示了在G129R治療組和對照組中具有肺轉移瘤的動物的百分比(應用卡方檢驗確定顯著性)。由圖4可見，與未治療的對照組相比，G129R治療組中具有肺轉移瘤的動物的百分比顯著降低< 0. 05)。實施例6催乳素拮抗劑抑制哺乳動物的腫瘤生長在兩個分開的實驗中，從雌性轉基因小鼠中分離腫瘤，將其切為等尺寸片並植入到年齡匹配的受體雌性轉基因小鼠。植入後10天，將小鼠隨機分為對照組(n = 3-4)或 GU9R治療組(n = 4，10mg/kg，i.p.每日進行)。對小鼠以每日為基礎進行50天治療，並監測對照組和治療組的腫瘤體積。如圖5所示，與對照組相比，兩個G129R治療組中最終腫瘤體積小67. 1% (士9. 18SEM)或71. 5% (士 14. 9SEM)。從圖5中還可以看出，與對照組相比，G129R治療組中最終腫瘤重量減少61. 3% (士 18. 4SEM) ^ 62. 5% (士7. 07SEM)。
實施例7催乳素拮抗劑治療抑制哺乳動物原發和繼發腫瘤中HER2+/neU蛋白的磷酸化每天以PBS (對照)或200ug的G129R對MMTV/neu小鼠(攜帶原發和繼發腫瘤) 治療5天。第5次治療後M小時取出原發和繼發腫瘤，並進行處理以用於蛋白質印記。如圖6所示，在分離自G129R治療動物的原發腫瘤中，磷酸化Neu蛋白顯著減少。G129R治療動物的繼發腫瘤也顯示出neu磷酸化的降低。然後，在G129R治療小鼠的繼發腫瘤中仍可檢測出一些磷酸化neu蛋白(見圖6)，提示催乳素拮抗劑GU9R治療可能以不同方式影響原發和繼發腫瘤。實施例8體內HER+腫瘤對催乳素拮抗劑GU9R治療的劑量-依賴響應和體內HER+腫瘤對催乳素拮抗劑GU9R治療的時間-依賴響應為確定降低HER+Aieu體內磷酸化所需的G129R的最小劑量，由MMTV/neu轉基因小鼠的腫瘤中移取活檢物，將其用作自我對照基線。然後以以下濃度的PBS或G129R對小鼠經腹膜內治療10天每日50、100、200或400呢(2. 5mg/kg/天、5mg/kg/天；10mg/kg/天；或 20mg/kg/天的GU9R)。然後收集腫瘤，並對其處理以進行蛋白質印記。然後以檢測磷酸化 HER2/neU蛋白的抗體和抗微管蛋白的抗體對蛋白質印記進行探測，微管蛋白是凝膠上樣及蛋白質印記轉移的對照。由圖7可見，在G129R劑量為5mg/kg/天那樣低時，就觀察到G129R對HER+Aieu磷酸化的抑制效果。為確定GU9R治療的最佳長度，用200ug G129R對攜MMTV瘤小鼠治療5天或10天。 最後一次治療後M小時取出腫瘤，並對其處理以用於蛋白質印記分析。由圖8可見，在接受5天GU9R(10mg/kg/天，i. p.)治療的14隻小鼠中，5隻小鼠的腫瘤與對照小鼠(n = 8) 相比顯示出磷酸化HER2/neu蛋白的顯著降低，4隻為中度響應，可觀察到磷酸化HER2/neu 蛋白的降低，而5隻沒有響應。由圖8可見，在接受10天GU9R(10mg/kg/天，i. p.)治療的10隻小鼠中，3隻小鼠的腫瘤具有高度響應，在這些腫瘤中實際上檢測不到磷酸化HER2/ neu，5隻小鼠為中度響應，而2隻沒有響應。
權利要求
1.一種用於抑制患者的癌細胞的生長的方法，所述方法包括對所述患者施用有效量的人催乳素受體拮抗劑；其中所述癌細胞不表達選自雌激素受體、孕酮受體和Her2/neu的受體；並且其中所述癌細胞選自卵巢癌細胞、子宮(子宮內膜)癌細胞、宮頸癌細胞和乳腺癌細胞。
2.一種用於抑制患者的轉移瘤的發展的方法，所述方法包括對所述患者施用有效量的人催乳素受體拮抗劑，其中所述患者選自乳腺癌患者、卵巢癌患者、子宮(子宮內膜)癌患者和宮頸癌患者。
3.一種用於降低患者的醛脫氫酶I(ALDHl)的活性的方法，所述方法包括對所述患者施用有效量的人催乳素受體拮抗劑，其中所述患者選自乳腺癌患者、卵巢癌患者、子宮(子宮內膜)癌患者和宮頸癌患者。
4.一種用於降低患者的癌幹細胞的數量的方法，所述方法包括對所述患者施用有效量的人催乳素受體拮抗劑，其中所述患者選自乳腺癌患者、卵巢癌患者、子宮(子宮內膜)癌患者和宮頸癌患者。
5.如權利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述催乳素受體拮抗劑是其中1 位的甘氨酸殘基被另一個胺基酸取代的人催乳素。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述胺基酸選自纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、 天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸和穀氨酸。
7.如權利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述催乳素拮抗劑是GU9R。
8.如權利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述催乳素受體拮抗劑與選自毒素、放射性同位素和螢光染料的試劑綴合。
9.如權利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述催乳素受體拮抗劑與化學治療劑同時施用或依次施用。
10.如權利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述催乳素受體拮抗劑通過選自胃腸外、 皮下、腹膜內、靜脈內、淋巴管內、鞘內、心室內或肺內施用的途徑施用。
11.如權利要求1、2、3或4所述的方法，其中所述催乳素受體拮抗劑在癌切除後施用。
12.一種用於檢測乳腺癌、卵巢癌、子宮(子宮內膜)癌或宮頸癌患者的癌細胞的方法， 所述方法包括以下步驟a)對所述癌症患者施用與可檢測標記綴合的人催乳素受體拮抗劑；b)檢測綴合的人催乳素受體拮抗劑在所述患者體內的定位；c)以催乳素-受體表達組織的正常分布為背景分析定位模式；和d)鑑定對健康組織為非典型的定位模式，其中所述患者體內所述綴合的人催乳素受體拮抗劑的非典型定位表明具有癌細胞的區域。
13.如權利要求12所述的方法，其中步驟b)通過計算機斷層掃描程序、磁共振成像或核磁共振成像完成。
14.如權利要求12所述的方法，其中所述癌細胞已轉移。
15.如權利要求12所述的方法，其中所述可檢測標記選自放射性同位素、螢光染料、蛋白、順磁標記物和生物素。
全文摘要
本發明一般地涉及癌症診斷與治療的領域，更具體而言涉及可用於消除具有幹細胞樣特徵的癌細胞的組合物和方法。所公開的組合物和方法還可用於處置具有轉移瘤的乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌或子宮內膜(子宮)癌；並使患者體內的癌細胞可視化。本發明的組合物包含人催乳素受體拮抗劑G129R。
文檔編號A61P35/04GK102341118SQ201080008996
公開日2012年2月1日 申請日期2010年2月16日 優先權日2009年2月26日
發明者W·Y·陳 申請人:翁科裡克斯公司