一種質譜技術檢測蛋白質構象變化的方法與流程

2023-07-27 21:29:31 1

本發明屬於利用蛋白質組學分析技術研究蛋白質微觀構象的研究領域，具體涉及一種活性共價化學標記和質譜檢測技術相結合的方法，考察蛋白質構象以及賴氨酸在活性蛋白質中的局部結構微環境變化。
背景技術：
：：質譜技術在提供蛋白質結構信息方面有著巨大優勢，和其他技術如x射線晶體衍射和核磁共振相比，它不受蛋白質大小、溶解度、純度等限制(文獻1.aebersoldr,mannm.massspectrometry-basedproteomics.nature,2003,422(6928):198-207)。在應用質譜技術考察蛋白質結構時，通常需要對蛋白質進行化學標記處理，而氫氘交換和共價化學標記是最常用的標記策略(文獻2.konermannl,vahidis,sowolema.massspectrometrymethodsforstudyingstructureanddynamicsofbiologicalmacromolecules.analyticalchemistry,2013,86(1):213-232)。氫氘交換是一種活性標記的方法，不會改變蛋白質的生物活性。但是，氘氫的「回交(backexchange)」效應在很大程度上影響了這種方法的準確性(文獻3.scholtena,vissernfc,vandenheuvelrhh,etal.analysisofprotein-proteininteractionsurfacesusingacombinationofefficientlysineacetylationandnanolc-maldi-ms/msappliedtothee9:im9bacteriotoxin-immunityproteincomplex.journaloftheamericansocietyformassspectrometry,2006,17(7):983-994)。相比之下，穩定共價標記策略通常是修飾具有高反應活性的胺基酸殘基側鏈，例如賴氨酸殘基的側鏈伯胺基團。然而，大多數共價標記方法為了確保較高標記效率需要使用高反應活性的醯胺化反應試劑，如n-acetyl-succinimide,sulfosuccinimidylacetate和s-methylthioacetimidate，這些試劑會中和賴氨酸側鏈的正電荷，影響蛋白質中的靜電相互作用，從而導致標記後蛋白質結構的改變以及活性的喪失(文獻4.kvaratskheliam,millerjt,budihassr,etal.identificationofspecifichiv-1reversetranscriptasecontactstotheviralrna:trnacomplexbymassspectrometryandaprimaryamineselectivereagent.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2002,99(25):15988-15993)。結合活性共價化學標記和質譜檢測技術研究蛋白質構象至今尚未有報導。通過甲醛ch2o和氰基硼氫化鈉nabh3cn對賴氨酸側鏈上的伯胺進行還原二甲基化標記反應(文獻6.boersemapj,raijmakersr,lemeers,etal.multiplexpeptidestableisotopedimethyllabelingfor quantitativeproteomics.natureprotocols,2009,4(4):484-494)是一種高效穩定的共價化學標記方法，在核磁共振和x射線晶體衍射的研究中，已經證實這種方法不會改變蛋白質的結構與活性(文獻7.(a)gerkenta,jentoftje,jentoftn,etal.intramolecularinteractionsofaminogroupsin13creductivelymethylatedhenegg-whitelysozyme.journalofbiologicalchemistry,1982,257(6):2894-2900(b)walterts,meierc,assenbergr,etal.lysinemethylationasaroutinerescuestrategyforproteincrystallization.structure,2006,14(11):1617-1622)。此外，二甲基化標記後賴氨酸殘基的帶電狀態不改變，因此這種方法也幾乎不會引入人為的蛋白-蛋白相互作用(文獻8.huqueme,vogelhj.carbon-13nmrstudiesofthelysinesidechainsofcalmodulinanditsproteolyticfragments.journalofproteinchemistry,1993,12(6):695-707)。迄今為止，活性二甲基化標記反應尚未與質譜檢測技術結合用於研究蛋白質結構和相互作用。技術實現要素：本發明旨在開發一種結合活性共價化學標記和質譜技術研究蛋白質構象變化的方法,將整體蛋白質活性二甲基化標記方法與質譜技術相結合，基於位於蛋白質表面的賴氨酸殘基比掩埋在內部或有相互作用的賴氨酸殘基更容易接近和標記，揭示蛋白質構象及賴氨酸局部結構微環境的相關信息。本發明提供一種質譜技術檢測蛋白質構象變化的方法，具體為一種結合活性共價化學標記和質譜技術來檢測蛋白質構象變化的方法：通過甲醛和氰基硼氫化鈉對賴氨酸側鏈上的伯胺進行還原二甲基化標記反應，再用質譜技術檢測賴氨酸殘基的標記效率。本發明提供的方法是利用在整體蛋白質層次上對賴氨酸殘基進行活性化學標記，隨後進行蛋白質變性、酶解並用質譜進行檢測，通過質譜的鑑定結果計算賴氨酸殘基的標記效率。具體的,對於構象發生變化的同種蛋白或蛋白複合物，分別在蛋白層次上通過甲醛和氰基硼氫化鈉進行還原二甲基化標記反應，隨後進行蛋白質溶液的變性和酶解得到肽段溶液，用色譜對肽段溶液進行分離再用質譜進行檢測，通過質譜的鑑定結果計算賴氨酸殘基的標記效率。計算後若同一賴氨酸殘基的標記效率相差25％以上，則視為蛋白質構象發生變化。所述蛋白質構象變化是指蛋白質原本緊密有序的空間結構變得鬆散，甚至部分胺基酸序列發生脫落。該方法快速簡單、穩定高效，能夠用於考察蛋白質結構的細微構象變化，在標記過程中蛋白質活性保持不變，不受蛋白質大小、溶解度、純度等限制，能夠更加真實的反應蛋白質在生理活性狀態下的構象。本發明提供但不限制於下述質譜技術檢測蛋白質構象變化的方法:(1)取蛋白質樣品，溶於ph7.0-8.0的hepes溶液中，得到蛋白質溶液；(2)向上述步驟(1)得到的蛋白質溶液中加入甲醛(ch2o)和氰基硼氫化鈉 (nabh3cn)；(3)向上述步驟(2)得到的溶液中加入碳酸氫銨(nh4hco3)；(4)將上述步驟(3)得到的溶液煮沸，使蛋白變性，然後加入蛋白酶，20-40℃水浴中酶解得到肽段溶液；(5)對上述步驟(4)得到的酶解肽段溶液酸化處理，進行液相色譜分離和質譜檢測；(6)將上述步驟(5)得到的質譜數據進行資料庫檢索，根據檢索結果計算各個賴氨酸殘基的標記效率。本發明採用有機溶劑、紫外光照、高溫加熱等處理得到發生構象變化的蛋白質。步驟(1)所述的標準蛋白質溶液的濃度為0.01-10μg/μl，較低的蛋白質濃度使得進行活性標記反應時速度較緩慢。步驟(2)所述的ch2o和nabh3cn的終濃度為0.01-100mmol/l，反應溫度為4-40℃，反應時間為5-200min，保證蛋白保持活性，且能夠體現位於蛋白質不同位置的賴氨酸殘基的標記效率差異。步驟(2)中甲醛和氰基硼氫化鈉的摩爾濃度比的範圍為1-10；步驟(3)中碳酸氫銨與甲醛的摩爾濃度比的範圍為10-100；步驟(4)中煮沸溫度控制在90-100℃範圍內。步驟(5)中所述液相色譜分離的具體步驟和參數條件為：液相色譜儀：thermoaccela600；色譜柱：c18填料填裝的毛細管柱(75μm內徑,15cm長)；流動相：水(a)和乙腈(b)；梯度洗脫程序：0-2min，1％b-10％b；2-92min，10％b-35％；92-95min，35％b-80％b；95-105min，80％b；105-120min，0％b；流速：300nl/min；進樣量：10μl；步驟(5)中所述質譜檢測的具體步驟和參數條件為：質譜儀：thermoltq-orbitrapvelos；離子傳輸毛細管：250℃；噴霧電壓：1.8kv；歸一化碰撞能量：35％；採用數據依賴模式進行採集，包含一次全掃描(m/z400-2000)；解析度：60000；動態排除設置為：重複次數為1，重複容忍時間為30s，動態排除時間為120s。所有樣品均按上述的液相色譜和質譜條件進行檢測。所述賴氨酸殘基標記效率的計算方法是：l賴氨酸＝(n1/n2)×100％式中，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標記效率，n1為質譜鑑定到的標記肽段的譜 圖數，n2為質譜鑑定到的相應標記和非標記形式肽段的總譜圖數；或,l賴氨酸＝(a1/a2)×100％式中，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標記效率，a1為質譜鑑定到的標記肽段的質譜檢測峰面積，n2為質譜鑑定到的相應標記和非標記形式肽段的總峰面積。本發明的優點：通過賴氨酸活性條件下共價化學標記的效率體現蛋白質構象的變化，賴氨酸標記效率通過質譜檢測得到。該方法快速簡單、穩定高效，能夠用於考察蛋白質結構的細微構象變化，在標記過程中蛋白質活性保持不變，不受蛋白質大小、溶解度、純度等限制，能夠更加真實的反應蛋白質在生理活性狀態下的構象。附圖說明圖1為本方法的示意圖，在整體蛋白質層次上對賴氨酸殘基進行活性化學標記，隨後進行蛋白質變性、酶解並用質譜進行檢測，通過質譜的鑑定結果計算賴氨酸殘基的標記效率。圖2為實施例1肌紅蛋白和脫輔基肌紅蛋白的紫外-可見光譜圖，橫坐標為測定波長，縱坐標為吸光度。圖3為實施例1肌紅蛋白的結構圖，來源於pdb文件1ymb。(1)lys-46局部結構的微環境。(2)lys-78局部結構的微環境。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。實施例1蛋白質樣品的活性共價化學標記和質譜檢測選取肌紅蛋白(myoglobin，mb)和脫輔基肌紅蛋白(apomyoglobin，apomb)為蛋白質樣品。apomb是mb脫去輔基血紅素後的產物，二者的結構十分相近，除了apomb的ef、f和fg區結構變得鬆散(eliezerd,wrightpe.isapomyoglobinamoltenglobule？structuralcharacterizationbynmr.journalofmolecularbiology,1996,263(4):531-538)。(1)取mb和apomb，質量分別為100μg，溶於1ml的20mmol/lph7.0的hepes溶液中，使溶液中蛋白質的濃度為0.1μg/μl；(2)向上述步驟(1)得到的蛋白質溶液中加入3.2μl4％ch2o和3.2μl0.6mol/lnabh3cn，使nabh3cn的終濃度為2mmol/l，室溫下反應30min；(3)向上述步驟(2)得到的溶液中加入50μl1mol/lnh4hco3，至nh4hco3的終濃度為50mmol/l，室溫下反應20min；(4)將上述步驟(3)得到的溶液在100℃煮沸3min，使蛋白變性，然後加入糜蛋白酶(chymotrypsin)，糜蛋白酶與蛋白質的質量比為1:25，37℃水浴中酶解5-6h，得到肽段溶液；(5)對上述步驟(4)得到的酶解肽段溶液酸化處理，進行液相色譜分離和質譜檢測，檢測條件如下：液相色譜儀：thermoaccela600；色譜柱：c18填料填裝的毛細管柱(75μm內徑,15cm長)；流動相：水(a)和乙腈(b)；梯度洗脫程序：0-2min，1％b-10％b；2-92min，10％b-35％b；92-95min，35％b-80％b；95-105min，80％b；105-120min，0％b；流速：300nl/min；進樣量：10μl；質譜儀：thermoltq-orbitrapvelos；離子傳輸毛細管：250℃；噴霧電壓：1.8kv；歸一化碰撞能量：35％；採用數據依賴模式進行採集，包含一次全掃描(m/z400-2000)；解析度：60000；動態排除設置為：重複次數為1，重複容忍時間為30s，動態排除時間為120s；(6)將上述步驟(5)得到的質譜數據進行資料庫檢索，根據檢索結果計算各個賴氨酸殘基的標記效率，計算方法如下：l賴氨酸＝(n1/n2)×100％式中，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標記效率，n1為質譜鑑定到的標記肽段的譜圖數，n2為質譜鑑定到的相應標記和非標記形式肽段的譜圖數。表1為mb和apomb中賴氨酸殘基的標記效率，n1為質譜鑑定到的標記肽段的譜圖數，n2為質譜鑑定到的相應標記和非標記形式肽段的總譜圖數，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標記效率。根據表1可得出，大部分賴氨酸殘基標記效率在mb和apomb中一致(標記效率相差25％以上視為變化)，這一結果與已知結論相符，即mb和apomb的構象十分相近，除了apomb的ef、f和fg區結構變得鬆散。從表1中也可看出，極少數賴氨酸殘基的標記效率在兩種蛋白質中不一致，例如，lys-46在mb中標記效率為49％，而在apomb中為99％。還有lys-78,在mb中標記效率為69％，而在apomb中為95％。表1圖2所示為mb溶液和apomb溶液的紫外-可見光譜圖。a410/a280小於5％時，可視為溶液中不含血紅素，其中a410為血紅素在410nm的吸收峰，a280為蛋白在280nm的吸收峰。根據圖2所示，a410/a280，證明實驗所製備的apomb較純淨，不含血紅素。圖3所示為mb的結構圖，來源於pdb文件1ymb。由圖3(1)可看出，在mb中，lys-46側鏈的氨基與血紅素的羰基形成氫鍵，因此標記效率較低；而在apomb中血紅素被脫去後，這種相互作用不存在，因此lys-46幾乎被完全標記。由圖3(2)可看出，在mb中，lys-78側鏈的氨基與glu-19側鏈的羰基形成氫鍵，而lys-78非常接近ef區，因此在apomb中這種相互作用被破壞，導致lys-78的標記效率明顯不同。前文已提及，mb和apomb的構象十分相近，除了apomb的ef、f和fg區結構變得鬆散，lys-46和lys-78在mb和apomb中標記效率的變化正體現了apomb相較於mb在結構上的細微變化，說明這種結合活性共價化學標記和質譜技術研究蛋白質構象變化的方法是切實可行的，這種方法綜合了化學標記和質譜技術在提供蛋白質結構信息上的優點，並且首次將還原性二甲基標記反應應用於蛋白質結構領域。本發明涉及一種結合活性共價化學標記和質譜技術研究蛋白質構象變化的方法。該方法快速簡單、穩定高效，賴氨酸殘基標記效率的變化(25％以上)反應了蛋白質構象的變化，該方法能夠用於考察蛋白質結構的細微構象變化，在標記過程中蛋白質活性保持不變，不受蛋白質大小、溶解度、純度等限制，能夠更加真實的反應蛋白質在生理活性狀態下的構象。當前第1頁12當前第1頁12