一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法
2023-07-27 10:43:11 3
一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法
【專利摘要】本發明提供了一種用紅豆杉愈傷組織產生紫杉醇的方法，以『曼地亞』紅豆杉葉片為外植體，經消毒、滅菌、接種，培養一段時間後，在葉片傷口處產生愈傷組織，繼續對愈傷組織進行增殖培養。取紅豆杉葉片愈傷組織研磨並用乙酸乙酯超聲萃取3次，收集有機相，過濾後用旋轉蒸發器減壓蒸餾，溶解於少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本發明應用組織培養技術克服紅豆杉植株生長緩慢、紫杉醇化學合成複雜的問題。所用基本培養基以SH培養基為基礎，輔以2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、蔗糖等成分；為進行工廠化細胞生產紫杉醇提供基礎，環境友好，原料豐富，可很好緩解市場對紫杉醇供應缺口大的問題。
【專利說明】一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及紫杉醇的產生，特別是一種通過紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方 法。
[0002]
【背景技術】 紫杉醇（Taxol)，化學式為C47H51N014,分子量是853.92,白色結晶體粉末，無臭，無 味，不溶於水，易溶於氯仿、丙酮等有機溶劑，熔點213?216°C。化學名稱：5β，20-環 氧-1，2〇,4,7 0，1〇0，13〇-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，1〇-二乙酸酯-2-苯甲酸 酯-13[(2'1?，3'3)-1^-苯甲醯-3-苯基異絲氨酸酯]。是從紅豆杉屬（^31118 8卩卩.）植 物中分離得到的一種具有獨特抗癌作用的二萜類化合物，具有很高的開發利用價值，是經 美國國家食品與藥品管理中心正式批准（1992. 12)的，目前世界主流的抗癌藥物之一。開 始，紫杉醇為晚期卵巢癌的治療藥物。隨後又批准用於治療乳腺癌。目前紫杉醇是最好的 治療卵巢癌和乳腺癌的藥物，價格非常昂貴，市場售價為4800美元/克。至今為止，紫杉醇 已經被成功地廣泛應用於對包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤在內的多種惡性腫瘤的 治療。而且紫杉醇對其它腫瘤的療效正在被進一步研究，測試證明它對其它的多種腫瘤也 有潛在的療效。
[0003] 目前，生產紫杉醇原料藥有以下幾種途徑：①直接從紅豆杉樹皮或整株紅豆杉 植株中提取；但是含有紫杉醇的自然資源一紅豆杉和東非羅漢松（1999年測知含紫杉 醇)-一都生長地十分緩慢，數量有限且其中有效成分的含量非常低。最初，用於治療的紫杉 醇都來源於太平洋紅豆杉，治療一個病人需要6棵百年樹齡的紅豆杉。②半合成法，即先從 紅豆杉中提取前體(體包括10-脫醯基巴卡丁 III、巴卡丁 III，10-脫醯基紫杉醇，10-脫醯 基三尖杉寧鹼，7-戊醛基-10-脫醯基紫杉醇等)，前體再進行化學半合成製得紫杉醇成品； 在一定的程度上，這緩和了藥源緊張的問題，但由於野生紅豆杉資源瀕危，原料仍然受到制 約。③全合成法，但由於步驟多，成本高尚未投入生產；④生物反應器法：培養寄生在紅豆 杉樹木身上的某些真菌來獲取紫杉醇。⑤培養能產生紫杉醇的紅豆杉細胞來生產紫杉醇。 其中培養紅豆杉內生真菌和紅豆杉細胞法生產紫杉醇屬於"環境友好型"工藝，對環境無汙 染，利用來源豐富的澱粉類原料，屬於綠色農產品原料。科學家普遍認為，真菌生物反應器 法和紅豆杉細胞法生產紫杉醇代表著紫杉醇生產的未來方向。
【發明內容】
[0004] 針對紫杉醇原料藥市場缺口較大的問題，本發明目的是提供一種通過紅豆杉葉片 愈傷組織產生紫杉醇的方法。
[0005] 本發明的技術方案是： 一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法，以紅豆杉葉片為外植體，經滅菌、接 種、誘導紅豆杉葉片愈傷組織，再培養紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法。
[0006] 前面所述的方法，優選的方案在於：步驟如下： Α、外植體的選擇和滅菌處理：以'曼地亞'紅豆杉（Taxus media)葉片為外植體，以2% 洗潔精浸泡，搖床120-180轉搖15-20分鐘，再用清水衝洗，再將衝洗後的外植體置於濃度 為0. 1%的氯化汞中，浸泡滅菌8-15分鐘，無菌水衝洗7-8次，備用； B、 外植體接種：將經過步驟A中準備的外植體葉片，接種在含有所用基本培養基以SH 培養基為基礎，添加了 2,4-D、L-脯氨酸的培養基中； C、 愈傷組織的誘導：將經過步驟B中得到的外植體葉片，培養於2,4-D 3. 0-5. Omg/L、 L_脯氨酸300-500 mg/L的SH培養基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7. 5g/L，ρΗ5· 85-5. 95,至 出現紅豆杉葉片愈傷組織； D、 愈傷組織培養：將步驟C中得到的紅豆杉葉片愈傷組織接種於SH+2,4-Dl. 0-3. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培養基中，培養溫度為21±2 °C，光照強度為 1000-1600Lux，光照時間為14小時，培養時間為10-15天。培養10-15天後檢測愈傷組織 中紫杉醇含量； E、 紫杉醇提取：將步驟D中的愈傷組織用液氮研磨並用乙酸乙酯超聲萃取3次，超聲處 理時間為25-35min，收集有機相，加入無水硫酸鈉乾燥，過濾後用旋轉蒸發器在35°C下旋 蒸至液體全部蒸發，殘留物體用溶解於少量甲醇中，0. 45 μ m濾膜過濾。，定容至10mL備用； F、 紫杉醇提取含量檢測：經HPLC檢測，真菌產生的愈傷組織中含有紫杉醇，平均含量 為 3. 24mg/L。
[0007] 前面所述的方法，優選的方案在於：所述的紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物'曼地 亞，紅豆杉（Taxus media)。
[0008] 前面所述的方法，優選的方案在於：步驟A、外植體的選擇和滅菌處理時：以2%洗 潔精浸泡，搖床120-180轉搖15-20分鐘，用清水衝洗時間為15-30分鐘，浸泡滅菌時間為 8-15分鐘，無菌去離子水衝洗次數為6-8次。
[0009] 前面所述的方法，優選的方案在於：步驟B、C外植體接種時：培養基為SH+2,4_D 3. 0-5. Omg/L+ L-脯氨酸300-500 mg/L。愈傷組織的誘導時：培養溫度為21 ±2°C，光照強 度為1000-1600Lux，光照時間為14小時，誘導時間為3-10天。
[0010] 前面所述的方法，優選的方案在於：步驟D時，培養基為：SH+2,4-Dl. 0-3.0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培養基中，培養溫度為21 ±2°C，光照強度為1600Lux，光照時間 為10-14小時，培養時間為10-15天。
[0011] 前面所述的方法，優選的方案在於：步驟E、紫杉醇提取：超聲處理時間為 25-35min，濾膜過濾時用0. 45 μ m濾膜。
[0012] 前面所述的方法，優選的方案在於：步驟F、紫杉醇提取含量檢測：色譜條件為： C18 柱：250_X46mm ;流動相，甲醇：水（v/v)=60 :40 ;壓力：1506PSI=10. 39MPa ;保護壓力： 100L0-Pr ;流速 0. 7mL/ min，檢測波長 228nm，靈敏度，(λ lAUf' s，柱溫 35°C。
[0013] 本發明提供的是一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法，以'曼地亞' 紅豆杉葉片為材料，經75%酒精殺毒，0. 1%氯化汞滅菌處理，置於含有2,4-D3. 0-5. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培養基中，待愈傷組織誘導出來以後繼代於2,4-D1. 0-3. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培養基的SH培養基中。培養15天後，進行紫杉醇提取。將愈 傷組織用液氮研磨並用乙酸乙酯超聲萃取3次，超聲處理時間為25-35min，收集有機相，力口 入無水硫酸鈉乾燥，過濾後用旋轉蒸發器在35°C下旋蒸至液體全部蒸發，殘留物體用溶解 於少量甲醇中，0. 45 μ m濾膜過濾。，定容至10mL備用。；經HPLC檢測，真菌產生的愈傷組織 中含有紫杉醇，平均含量為3. 24mg/L。
[0014] 具體包括下列步驟： A) 以'曼地亞'紅豆杉葉片為材料，2%?3%的洗潔精溶液進行浸泡和衝洗，經75%酒 精殺毒，0. 1%氯化汞滅菌處理8-15分鐘，置於含有2,4-D 3. 0-5. Omg/L、L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培養基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7. 5g/L，pH5. 8 ; B) 培養5-7天後，將紅豆杉葉片愈傷組織接種於SH+2,4-Dl. 0-3. 0 mg/L +L-脯氨酸 300-500 mg/L的培養基中，培養溫度為21±2°C，光照強度為1000-1600Lux，光照時間為14 小時，培養時間為10-15天。
[0015] C)培養10-15天後檢測紫杉醇含量，愈傷組織經液氮研磨，用等體積的乙酸乙酯 萃取，超聲30min收集有機相。取水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取1次，收集有機相。 重複處理1次。將所有的乙酸乙酯萃取液合併，加入無水硫酸鈉乾燥，過濾後用旋轉蒸發器 在35°C下減壓蒸餾，溶解於少量甲醇中，用0. 45 μ m濾膜過濾，定容至10mL備用。
[0016] E)經HPLC檢測，葉片誘導產生的愈傷組織中含有紫杉醇，平均含量為3. 24mg/L。
[0017] 步驟A)所述的紅豆杉基源植物為'曼地亞'紅豆杉（Taxus media),取幼嫩葉片為 外植體，2%?3%的洗潔精溶液進行浸泡和衝洗，外植體經75%酒精殺毒30秒，再經0. 1%氯 化汞滅菌處理10分鐘，置於2,4-D 3. 0-5. Omg/L、L-脯氨酸300-500 mg/L的SH培養基中， 其中蔗糖 30g/L，瓊脂粉 7. 5g/L，ρΗ5· 85-5. 95 ; SH培養基為Schenk and Hildebrandt基本培養基，所述的SH培養基的成分按常 規為：硝酸鉀（KN03) 2500. 00 mg/L，硫酸鎂（MgS04) 195. 05 mg/L，磷酸二氫銨[(NH4) Η2 Ρ04 ]300· 00 mg/L，氯化鈣（CaCl2) 151. 00 mg/L，氯化鈷（CoC12 · 6H20) 0· 10 mg/L，硫 酸銅（CuS04 · 5Η20)0· 20mg/L，硼酸（H3B03)5.0 mg/L，碘化鉀（ΚΙ) LOO mg/L，硫酸錳 (MnS04*H20) 10.00 mg/L，鑰酸鈉（Na2Mo04 · 2Η20)0· 10 mg/L，硫酸鋅（ZnS04*7H20) LOO mg/L，硫酸亞鐵（FeS04*7H20) 27. 8 mg/L，Na2-EDTA*2H20 37. 3mg/L，甘氨酸 2. 00 mg/L，鹽 酸硫胺素（維生素 Bl) 0· 10 mg/L，鹽酸批卩多醇（維生素 B6) 0· 50mg/L，IVB煙酸0· 5 mg/L， 肌醇 100 mg/L。
[0018] 步驟B)培養5-7天後，將紅豆杉葉片愈傷組織接種於SH+2,4-Dl. 0-3. 0 mg/L +L-脯氨酸300-500 mg/L的培養基中，培養溫度為21±2°C，光照強度為1000-1600Lux，光 照時間為14小時，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7. 5g/L，pH5. 8。培養時間為10-15天。
[0019] 步驟C)培養10-15天後檢測紫杉醇含量，愈傷組織經液氮研磨，用等體積的乙酸 乙酯萃取，超聲30min收集有機相。取水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取1次，收集有機 相。重複處理1次。將所有的乙酸乙酯萃取液合併，加入無水硫酸鈉乾燥，過濾後用旋轉蒸 發器在35°C下減壓蒸饋，溶解於少量甲醇中，用0. 45 μ m濾膜過濾，定容至10mL備用。
[0020] 步驟D)經HPLC檢測，葉片誘導產生的愈傷組織中含有紫杉醇，平均含量為 3. 24mg/L。其中色譜條件為：C18柱：250mmX46mm ;流動相，甲醇：水（v/v)=60 :40 ;壓力： 1506PSI=10. 39MPa ;保護壓力：100L0-Pr ;流速 0. 7mL/ min，檢測波長 228nm，靈敏度， 0· lAUf's，柱溫 35°C。
[0021] 本發明利用紅豆杉愈傷組織產生紫杉醇在以下四個方面具有重要意義：本發明應 用真菌培養技術紫杉醇化學合成複雜的問題： (1)愈傷組織生長迅速，能夠在生物反應器中工業化生產，本發明為進行工廠化植物細 胞生產紫杉醇提供技術基礎，佔用空間小、培養簡單、成本相對較低；不受地區、季節、氣候 限制，一年四季均可生產；（2)克服紅豆杉植株生長緩慢，可緩解紅豆杉植物資源瀕危及嚴 重不足的問題；（3)環境友好、原料豐富，可很好緩解市場對紫杉醇供應缺口大的問題；（4) 愈傷組織育種和選育速度很高，可以通過基因工程等方法篩選高產細胞株系，提高愈傷組 織的生產能力，提高紫杉醇的產量。
[0022] 本發明所用培養基配製簡單，誘發時間短、愈傷組織生長快、紫杉醇含量高，易於 操作、大規模生產。
[0023] 本發明以'曼地亞'紅豆杉葉片為材料，開展以紅豆杉葉片培養愈傷組織的工作， 這為保護紅豆杉種質資源，促進利用生物反應器方法獲取紫杉醇提供了一條新途徑，為解 決紫杉醇生產中紅豆杉原料的短缺、提高紫杉醇產量，提供植物細胞生物反應器生產的方 法。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例詳細說明本發明的技術方案，但保護範圍不被此限制。
[0025] 實施例1 一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法，包括下列步驟： A) '曼地亞'紅豆杉葉片用2%的洗潔精溶液進行浸泡，搖床100-150轉搖15分鐘，再 用清水衝洗15分鐘，再將衝洗後的外植體經75%酒精殺毒30s，置於濃度為0. 1%的氯化汞 中，浸泡滅菌9分鐘，無菌去離子水衝洗8次，接種於含有2,4-D 3. Omg/L、L-脯氨酸300 mg/ L的SH培養基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7. 5g/L，pH5. 8 ; B) 培養5天後，將紅豆杉葉片愈傷組織接種於SH+2,4-Dl. 0 mg/L +L-脯氨酸300mg/L 的培養基中，培養溫度為21 ±2°C，光照強度為1200Lux，光照時間為14小時，培養時間為10 天。
[0026] C)培養10-15天後檢測紫杉醇含量，愈傷組織經液氮研磨，用等體積的乙酸乙酯 萃取，超聲30min收集有機相。取水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取1次，收集有機相。 重複處理1次。將所有的乙酸乙酯萃取液合併，加入無水硫酸鈉乾燥，過濾後用旋轉蒸發器 在35°C下減壓蒸餾，溶解於少量甲醇中，用0. 45 μ m濾膜過濾，定容至10mL備用。
[0027] E)經HPLC檢測，葉片誘導產生的愈傷組織中含有紫杉醇，平均含量為2. 98mg/L。
[0028] 實施例2 一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法，包括下列步驟： A) '曼地亞'紅豆杉葉片用2%的洗潔精溶液進行浸泡，搖床100-150轉搖16分鐘，再 用清水衝洗18分鐘，再將衝洗後的外植體經75%酒精殺毒30s，置於濃度為0. 1%的氯化汞 中，浸泡滅菌10分鐘，無菌去離子水衝洗8次，接種於含有2,4-D 4. Omg/L、L-脯氨酸400 mg/L的SH培養基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7. 5g/L，pH5. 8 ; B) 培養5天後，將紅豆杉葉片愈傷組織接種於SH+2,4-D3. 0 mg/L +L-脯氨酸300mg/L 的培養基中，培養溫度為21±2°C，光照強度為1300Lux，光照時間為14小時，培養時間為10 天。
[0029] C)培養13天後檢測紫杉醇含量，愈傷組織經液氮研磨，用等體積的乙酸乙酯萃 取，超聲30min收集有機相。取水相部分再用等體積的乙酸乙酯萃取1次，收集有機相。重
【權利要求】
1. 一種利用紅豆杉葉片愈傷組織產生紫杉醇的方法，其特徵在於：以紅豆杉葉片為外 植體,經滅菌、接種、二次滅菌、接種，誘導產生紅豆杉葉片愈傷組織,再培養紅豆杉葉片愈 傷組織產生紫杉醇的方法。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：步驟如下： A、 外植體的選擇和滅菌處理：以紅豆杉葉片為外植體，以洗潔精浸泡，搖床100-150轉 搖15-20分鐘，再用清水衝洗，再將衝洗後的外植體置於濃度為0. 1%的升汞中，浸泡滅菌， 無菌去離子水衝洗，備用； B、 外植體接種：將經過步驟A中準備的外植體葉片，接種在含有所用基本培養基以SH 培養基為基礎，添加了 2,4-D、L-脯氨酸的培養基中； C、 愈傷組織的誘導：將經過步驟B中得到的外植體葉片，培養於2,4-D 3. 0-5. Omg/L、 L_脯氨酸300-500 mg/L的SH培養基中，其中蔗糖30g/L，瓊脂粉7. 5g/L，pH5. 85-5. 95,至 出現紅豆杉葉片愈傷組織； D、 愈傷組織培養：將步驟C中得到的紅豆杉葉片愈傷組織接種於SH+2,4-Dl. 0-3. 0 mg/ L +L -脯氨酸300-500 mg/L的培養基中，培養溫度為21 ±2°C，光照強度為1000-1600Lux， 光照時間為10-14小時，培養時間為10-15天； 培養10-15天後檢測愈傷組織中紫杉醇含量； E、 紫杉醇提取：將步驟D中的愈傷組織用液氮研磨並用乙酸乙酯超聲萃取3次，超聲處 理時間為25-35min，收集有機相，加入無水硫酸鈉乾燥，過濾後用旋轉蒸發器在35°C下旋 蒸至液體全部蒸發，殘留物體用溶解於少量甲醇中，0. 45 μ m濾膜過濾，定容至10mL備用； F、 紫杉醇提取含量檢測：經HPLC檢測，真菌產生的愈傷組織中含有紫杉醇，平均含量 為 3. 24mg/L。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於：所述的紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬 植物'曼地亞'紅豆杉（Taxus media)。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟A、外植體的選擇和滅菌處理時：使 用2%?3%的洗潔精溶液，浸泡和衝洗時間為15-30分鐘，0. 1%的氯化汞浸泡滅菌時間為 8-15分鐘，無菌去離子水衝洗次數為6-8次。
5. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟B、外植體接種時：培養時間為3-10 天。
6. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟C、愈傷組織誘導時，其中2,4-D 3. 0-5. Omg/L、L-脯氨酸 300-500 mg/L、蔗糖 30g/L，瓊脂粉 7. 5g/L，ρΗ5· 85-5. 95。
7. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟D愈傷組織培養時，2,4-D1. 0-3. 0 1^/1丄-脯氨酸300-500 11^/1，培養溫度為21±21：，光照強度為1000-16001^?，光照時間 為10-14小時，培養時間為10-15天，培養10-15天後檢測愈傷組織中紫杉醇含量。
8. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：步驟E紫杉醇提取：超聲處理時間為 25-35min，濾膜過濾時用0. 45 μ m濾膜。
9. 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於：紫杉醇提取含量檢測：色譜條件為：C18 柱：250_X46mm ;流動相，甲醇：水（v/v)=60 :40 ;壓力：1506PSI=10. 39MPa ;保護壓力： 100L0-Pr ;流速 0. 7mL/ min，檢測波長 228nm，靈敏度，(λ lAUf' s，柱溫 35°C。
【文檔編號】A01H4/00GK104041416SQ201410300039
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】穆紅梅, 杜秀菊, 曹貴玲 申請人:聊城大學