T7脫氧核糖酸聚合酶的製作方法

2023-07-27 14:38:21

專利名稱：T7脫氧核糖酸聚合酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及適用於DNA順序的DNA聚合酶。
DNA順序測定涉及四種單鏈DNA片段的形成，每一條鏈具有一個確定的末端和一個可變的末端。可變末端總是終止於某一給定的特異核苷酸鹼基(鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)中任一種)。四套不同的片段根據其長度在高解析度的聚丙烯醯胺凝膠上分離;凝膠上的每一條帶，線性地對應於DNA順序中的某一特異核苷酸，這樣可鑑別出特定核苷酸鹼基在順序中的位置。
一般說來，有兩種測定DNA順序的方法。一種方法(Maxam和Gilbert測定法)涉及DNA分離片段的化學降解，每一條鏈在其確定的末端用單一放射性標記進行標記，每一反應專一於四種鹼基中(G、A、T或C)的一種或多種而進行有限的切割。另一種方法(雙脫氧測序法)涉及DNA鏈的酶促合成。分別進行四種合成，每一反應通過加入合適的鏈終止雙脫氧核苷酸而終止於某一特定鹼基(G、A、T或C)。後一種方法較為優越，因為DNA片段被均一標記(而不是末端標記)，因此較大的DNA片段含有逐步增加的放射性強度。並且，可用35S-標記的核苷酸代替32P-標記的核苷酸，使結果更為清晰;由於每一泳帶只對應於G、A、T或C中的任一種，因此，很容易闡明反應產物。大多數雙脫氧測序法所用的酶是大腸桿菌(Escherichia coli)DNA聚合酶Ⅰ大片段(「Klenow」)。所用另一種聚合酶是AMV逆轉錄酶。
在一個方面，本發明的牲是一種測定DNA分子中核苷酸鹼基順序的方法，包括使DNA分子與能與此DNA分子雜交的引物分子退火;使退火混合物分成幾份後至少在四個容器中保溫，這四個容器中含有四種不同的脫氧核苷三磷酸;一種連續性DNA聚合酶，該聚合酶在DNA測序反應的延長反應通常所用的環境條件下，可在它與DNA解離之前，與DNA維持結合狀態至少達到500鹼基，聚合酶的核酸外切酶活性為每毫克酶小於500單位;以及四種DNA合成終止試劑中的一種，它在特異的核苷酸鹼基處終止DNA合成。四個容器中的試劑分別在不同的特異核苷酸鹼基處終止。保溫反應的DNA產物根據其大小分離，這樣，至少能測出DNA分子的部分核苷酸鹼基順序。
在較好的具體方案中，聚合酶與DNA分子在解離前保持結合至少達1000鹼基;該聚合酶實質上與用T7-型噬菌體(即其中DNA聚合酶需要宿主的硫氧還蛋白作為一個亞基的噬菌體;例如，T7-型噬菌體是T7、T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122或SP6，Studier，Virology9570，1979);感染的細胞中的聚合酶相同;該聚合酶不能區分雙脫氧核苷酸類似物;該聚合酶被修飾，使每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小於50單位，更好是小於1單位，進一步更好是小於0.1單位，最好是檢測不出核酸外切酶活性;聚合酶能夠利用短至10個鹼基或更好是短至4個鹼基的引物;引物含有4至40個核苷酸鹼基，並且是單鏈DNA或RNA;退火步驟包括使DNA分子和引物加熱至65℃以上，最好是65℃至100℃，使加熱後的混合物冷卻至65℃以下，最好是0℃至30℃;保溫步驟包括一個脈衝步驟和一個追止步驟，其中脈衝步驟包括使退火混合物與所有四種不同的脫氧核苷三磷酸和一種連續性DNA聚合酶混合，其中至少有一種脫氧核苷三磷酸是標記的;脫衝步驟最好在聚合酶不表現其連續性的條件下進行，在0℃至20℃進行30秒至20分鐘，或者至少限制一種三磷酸核苷;追止步驟包括在四份等分量的脈衝步驟後的混合物中分別加入一種鏈終止試劑;追止步驟最好是在30℃至50℃下進行1至60分鐘;終止試劑是雙脫氧核苷酸，或一種有限量的脫氧核苷三磷酸;四種脫氧核苷酸中的一種是dITP或脫氮鳥苷，使用標記引物可免去脈衝步驟，標記最好是放射性或螢光標記;在DNA順序反應的脈衝反應通常所用的第二環境條件下，聚合酶不能表現其連續性。
在其它方面，本發明的牲是a)使用沒有核酸外切酶活性的連續性DNA聚合酶，由沒有3′伸出末端的線性DNA分子產生平端雙鏈DNA分子的方法;b)一種擴增DNA順序的方法，包括使第一和第二引物與雙鏈DNA順序的相反鏈退火，使退火後的混合物與連續性DNA聚合酶保溫，每毫克該聚合酶的核酸外切酶活性小於500單位，最好是小於1單位，在此方法中，第一和第二引物與DNA順序的相反鏈退火;在一個較好的具體槳鋼校鐧 ′端位於相互對立的方向;此方法進一步包括，在保溫步驟後使產生的DNA變性，使第一和第二引物與產生的DNA退火，使退火後的混合物與聚合酶保溫;變性退火和保溫的循環最好重複10至40次;c)一種體外誘變克隆的DNA片段的方法，包括提供一種克隆片段，並用連續性DNA聚合酶合成DNA鏈，每毫克該聚合酶的核酸外切酶活性小於1單位;d)一種由在同一細胞中非滲漏啟動子(見下述)控制下的克隆的DNA片段產生活性T7型DNA聚合酶的方法，包括僅在細胞處於對數生長期或平衡期時誘導基因表達，並從細胞中分離聚合酶;克隆片段最好在需T7RNA聚合酶進行表達的啟動子的調控下;e)一種編碼T7-型DNA聚合酶的基因，該基因經過基因修飾降低了天然存在的核酸外切酶活性;最好是修飾了一個組氨酸(His)殘基，進一步更好的是修飾了基因5的His-123;f)編碼經過基因修飾的聚合酶基因的產物;g)一種從含有聚合酶表達載體的細胞中純化T7DNA聚合酶的方法，包括的步驟有細胞裂解，使聚合酶通過離了交換柱，通過DE52DEAE柱、磷酸纖維素柱、羥基磷灰石柱;在柱層析步驟之前，此方法最好包括用硫酸胺沉澱聚合酶;此方法進一步包括使聚合酶通過SephadexDEAEA50柱的步驟;離子交換柱是DE52DEAE柱;h)一種使DNA聚合酶溶液中核酸外切酶活性失活的方法，包括使該溶液在含有氧、還原劑和過渡金屬的容器中保溫;i)一種測定DNA順序的藥盒，包括如上述定義的連續性DNA聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小於500單位，其中，聚合酶能夠在第一環境條件下表現其連續性，在第二環境條件下最好不能表現其連續性，以及一種測定順序必需的選自鏈終止劑的試劑，以及dITP;j)一種標記DNA片段3′端的方法，包括使DNA片段與連續性DNA聚合酶以及一種標記的脫氧核苷酸保溫，每毫克該聚合酶的核酸外切酶活性小於500單位;k)一種克隆的DNA片段體外誘變的方法，包括提供一種引物和一種模板，引物和模板具有一個特異的錯配鹼基，用連續性DNA聚合酶延長引物;l)一種克隆的DNA片段體外誘變的方法，包括提供克隆片段，用核酸外切酶活性小於50單位的連續性DNA聚合酶，在導致核苷酸鹼基錯誤摻入的條件下合成DNA鏈。
本發明提供的DNA聚合酶是連續性的、無區別力的，並能夠利用短引物。而且，此聚合酶沒有結合的核酸外切酶活性。這些特點對於上述方法都是理想的性質，對於DNA順序反應尤其是這樣，因為聚醯胺凝膠中放射性的本底水平可以忽略，泳帶上很少或沒他偽帶，而且條帶很清晰-這使得很容易閱讀DNA順序。進一步，這種聚合酶能夠用於DNA長片段的新測序方法，下面將予詳細描述。
本發明的其它特點和長處從下面的優選具體實例的描述及權利要求書中將是明顯可見的。
首先簡要描述附圖。


圖1-3分別是載體pTrx-2、mGP1-1和pGP5-5的圖示;
圖4是T7DNA聚合酶選擇性氧化的示意圖;
圖5是修飾的T7聚合酶在亞乙烯基-dATP存在下合成DNA能力的示意圖;
圖6是使用修飾的T7DNA聚合酶酶促擴增基因組DNA的示意圖;
圖7、8和9分別是pTrx-2、pGP5-5的一部分和mGP1-2的核苷酸順序;
圖10是pGP5-6的圖示。
DNA聚合酶一般說來，本發明的DNA聚合酶是連續性的，沒有結合的核酸外切酶活性，不區分核苷酸類似物的摻入，能夠使用小的寡核苷酸(如四聚體、六聚體和八聚體)作為特殊引物。現在詳細討論這些性質。
連續性連續性(Processivity)是指DNA聚合酶在DNA順序測定的延長反應所常用的條件下，能夠利用同一引物-模板連續摻入許多核苷酸而不從模板上解離。不同聚合酶的連續性程度不同有些只摻入幾個鹼基即解離，如Klenow(約15個鹼基)、T4DNA聚合酶(約10個鹼基)、T5DNA聚合酶(約180鹼基)和逆轉錄酶(約200鹼基)(Dasetal.，J.Biol.Chem.2541227，1979;Bambaraetal.，J.Biol.Chem.253413，1978)，而其它聚合酶，例如本發明的聚合酶，在合適的環境條件下將保持結合至少到500鹼基，更好是至少1000鹼基。這種環境條件包括提供足夠的所有四種脫氧核苷三磷酸，並且保溫溫度為10℃-50℃。連續性在大腸桿菌單鏈結合(ssb)蛋白存在下大大提高。
使用連續性酶時，測序反應的終止只會在摻入了一個鏈終止劑例如雙脫氧核苷酸的鹼基處發生。如果DNA聚合酶是非連續性的，則在測序反應中在對應於聚合酶解離的核苷酸處產生偽帶。頻繁的解離在錯誤位置形成條帶的本底，使真正的DNA順序模糊不清。用高濃度底物使反應混合物長時間(30-60分鐘)保溫可以部分克服這一弊病，這樣可「追止」偽帶直至凝膠頂部的高分子量區，使其離開閱讀DNA順序的區域。這並不是理想的解決方案，因為非連續性DNA聚合酶在模板的二級結構緻密區域(或髮夾區)解離的機率很高。在這些位點沒有充分地重新啟動引物的延長，則通常的結果是，在同一位置形成了所有四種核苷酸的帶，從而模糊了DNA順序。
類似物區分本發明的DNA聚合酶不能清楚地區分雙脫氧核苷酸類似物和正常的核苷酸。就是說，類似物摻入的機會大約等同於正常核苷酸，或至少以正常分子十分之一的效率摻入類似物。本發明的聚合酶也不能清楚地分辨其他一些類似物。這一點很重要。因為除了四種正常的脫氧核苷三磷酸(dGTP、dATP、dTTP和dCTP)外，順序測定反應還需要摻入其他類型的核苷酸衍生物，例如放射性或螢光標記的核苷三磷酸，通常用於用35S、32P或其它化學試劑標記合成鏈。如果DNA聚合酶不能區分類似物，則類似物的摻入機率將和正常核苷酸相同。這一點是很重要的。因為這樣便可用最少量的放射性，用標記的核苷三磷酸高效率標記合成的DNA鏈。進一步，這種酶只需要低濃度的類似物，這使測序反應比使用區分性酶時更為便宜。
區分性聚合酶當以連續方式進行聚合和受阻時(克服二級結構障礙進行合成)表現出不同程度的區分性。由於這種障礙，凝膠上不同的放射性條帶的強度將出現差異，這可能使順序模糊不清。
核酸外切酶活性本發明DNA聚合酶的核酸外切酶活性小於正常的或天然水平的50%，更好是小於1%，最好是小於0.1%(每個聚合酶分子的活性量)。正常或天然水平是指未修飾的T7-型聚合酶的核酸外切酶活性。根據下述改變的Chase等人的方法(J.Biol.Chem.2494545，1974)，測得每毫克聚合酶中結合的核酸外切酶活性一般為約5，000單位。核酸外切酶通過切下與模板錯誤配對的新合成鹼基而提高DNA合成的精確度。這種結合的核酸外切酶活性不利於DNA測序反應的質量，它們提高了必須加入反應中的所需核苷酸前體的最低濃度，因為當核苷酸濃度下降時，聚合酶活性的速率降至和核酸外切酶活性差不多，導致沒有DNA淨合成，或甚至降解已合成的DNA。
更重要的是，結合的核酸外切酶活性將導致DNA聚合酶閒滯於模板上具有二級結構障礙的區域，當聚合酶接近這種結構時，其合成速率在它努力穿過此區域時會降低。當聚合酶受阻時，結合的核酸外切酶將切下新合成的DNA。其結果是將發生合成和切割的多次循環。這可能導致聚合酶最終越過髮夾區進行合成(不損害測序反應的質量);或者聚合酶可能從合成的鏈上解離(在所有四種測序反應中導致同一位置的偽帶);或者，一種鏈終止劑可能以高頻率摻入，並使測序凝膠上的不同片段的強度產生很大的差異。發生這一現象是由於鏈終止劑在任何給定位點的摻入頻率隨著聚合酶摻入終止核苷酸的機會的次數而上升，因此，DNA聚合酶在閒滯位點將以比在其他位點高得多的頻率摻入鏈終止劑。
一個理想的測序反應將在整個凝膠上產生強度均一的帶。這對於使每一放射性片段在X-光膠片上得到最佳曝光是至關重要的。如果放射性條帶有不同強度，則弱帶可能檢測不出來。為了使所有片段得到均一的放射性強度，DNA聚合酶在DNA的每一位置上應當佔用同樣的時間間隔，在任何給定位點對核苷酸的加入或去除都不表現出偏重。DNA聚合酶如果缺乏任何結合的核酸外切酶則會發生這一現象，這樣，它將在沿著模板的每一位置都只有一次摻入鏈終止核苷酸的機會。
短引物本發明的DNA聚合酶能夠使用10個或更少鹼基的引物，也能使用更長的引物，最好是4-20鹼基的引物。使用短鏈引物的能力為DNA順序測定提供了若干重要的有利條件。購買較短的引物更為便宜，也比通常的15-20聚體引物更易合成。它們與DNA模板上的互補位點退火也更為迅速，從而使測序反應進行得更快。進一步，在DNA順序測定中使用小的寡核苷酸引物(如6或7個鹼基)的能力，使得能夠測定用別的方法不能測定的長DNA片段的順序。例如，可以生產一種含有80個隨機六聚體的藥盒，其中沒有一個互補於克隆載體的任何位點。從統計學觀點來看，在有待測定順序的DNA片段上，平均每50個鹼基中將會出現一個80個六聚體中之一的順序。3000鹼基順序的測定將只需進行五次測序循環。首先，用一種「普遍的」引物(如NewEnglandBiolabs＃1211，順序為5′GTAAAACGACGGCCAGT3′)測定插入片段一端大約600個鹼基的順序。利用此測序反應的結果，可從藥盒中選出一個新的引物，它與測定順序的末端附近的一個區域同源，在第二次循環中，用此引物測定下一個600鹼基的順序。此過程重複五次將測完3000鹼基的順序，不需要任何亞克隆步驟，不必化學形成任何新的寡核苷酸引物。在測序反應中加進T7的基因2.5和4蛋白，可提高使用這種短引物的效果。
本發明的DNA聚合酶(即具有上述性質)包括修飾的T7-型聚合酶。即該DNA聚合酶需要宿主硫氧還蛋白作為一個亞基，它們與修飾的T7DNA聚合酶或從有關噬菌體例如T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122和SP6等中分離的等價酶是基本一致的。這些酶中的每一種都能經修飾而具有類似於修飾的T7酶的性質。能夠從噬菌體感染的細胞中直接分離該酶，但該酶最好從過量生產它的細胞中分離，基本一致是指該酶可能具有不影響酶的總體性質的胺基酸置換。特別期望的胺基酸置換的實例之一是對天然酶進行修飾以去除任何外切核酸酶活性。此修飾可在基因或化學水平上進行(見下述)。
T7聚合酶的克隆作為本發明的一個實例，我們將描述T7DNA聚合酶的克隆、過量生成、純化、修飾及應用。這種連續酶由兩個密切複合的多肽以一對一的化學數量組成。一個是84，000道爾頓的噬菌體T7編碼的基因5蛋白(Modrich等人，J.Biol.Chem.1505515，1975)，另一個是12，000道爾頓的大腸桿菌編碼的硫氧還蛋白(Tabor等人，J.Biol.Chem.26216.216，1987)。硫氧還蛋白是一種輔助蛋白，它使基因5蛋白(非連續性的實際DNA聚合酶)附著在引物模板上。天然的DNA聚合酶結合有很高的3′至5′核酸外切酶活性。此活性使得聚合酶不能用DNA順序測定，而必須在使用聚合酶之前使其失活或進行修飾。如下所述，通過化學法局部氧化核酸外切酶區域，或通過基因工程修飾聚合酶基因中編碼此活性的編碼區，很容易達到這一點。
pTrx-2為了克隆大腸桿菌的trxA(硫氧還蛋白)基因，用Sau3A部分切割野生型大腸桿菌DNA，將所得片段與從T7ST9菌株中分離的BamHI切割的T7DNA連接(Tabor等人，inThioredoxinandGlutaredoxinSystemsStructureandFunction(Holmgren等人，eds)pp.285-300，RavePress，NY;andTabor等人，如上)。連接後的DNA轉染至大腸桿菌trxA細胞中，將混合物塗布在trxA細胞上，挑出產生的T7空斑。由於T7沒有大腸桿菌的活性trxA基因就不能生長，因此只有那些含有trxA基因的噬菌體才能形成空斑。克隆的trxA基因定位於470鹼基對HincⅡ片段上。
為了過量生成硫氧還蛋白，構建一種叫pTrx-2的質粒。簡單地說，通過常規方法(Maniatisetal.，CloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLabs.，ColdSpringHarbor，N.Y.)分離含有trxA基因的470鹼基對HincⅡ片段，將其連接到含有Ptac啟動子(ptac-12，Amannetal.，Gene25167，1983)的pBR322衍生物上。參見圖2，用PvuⅡ切割含有β-內醯胺酶和ColEI起點的ptac-12，產生一個2290鹼基對的片段，然後用市售的連接子(SmaⅠ-BamHI多連接子)使之與二個串聯的trxA拷貝(HincⅡ片段)連接，形成pTrx-2。圖7顯示了pTrx-2的完整核苷酸順序。現有，硫氧還蛋白的生成在tac啟動子的調控下，這樣可特異地例如利用IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖苷)進行誘導。
pGP5-5和mGP1-2T7的某些基因產物在大腸桿菌中的表達是致死性的。以T7RNA聚合酶的可誘導表達為基礎，發展出了促進致死基因克降和表達的表達系統。基因5蛋白在某些大腸桿菌株中是致死性的，Tabor等人(Proc.Nat.Acad.Sci.821074，1985)描述了這樣一種系統的一個實例，其中，T7的基因5處在φ10啟動子的調控下，只有當細胞中存在有T7RNA聚合酶時才會表達。
簡言之，通過常規方法構建pGP5-5(圖3)，利用合成的BamHI連接子，使T7的含有基因5的14306(NdeⅠ)至16869(AhaⅢ)片段，與T7的含有φ1.1A和φ1.1B兩個啟動子的5667(HincⅡ)至6166(Fnu4H1)的560鹼基對片段(它由T7RNA聚合酶所識別)，以及pACYC177的3KbBamHⅠ-HincⅡ片段相連接(Changetal.，J.Bacteriol.1341141，1978)。圖8顯示了T7插入片段和連接子的核苷酸順序。在此質粒中，基因5隻在細胞中提供有T7RNA聚酶時表達。
參見圖3，T7RNA聚合酶是在噬菌體載體mGP1-2上提供的。這與pGP1-2(Taboretal.，同上)相類似，不同的是分別用BglⅡ和SalⅠ連接子。將含有T7RNA聚合酶的3133(HaeⅢ)至5840(HinfⅠ)的T7片段，與BamHⅠ-SalⅠ切割的M13mp8相連接，使聚合酶基因置於1ac啟動子的調控下。圖9顯示了mGP1-2的完整核苷酸順序。
由於pGP5-5和pTrx-2有不同的複製起點(分別為P15A和CalE1起點)，所以它們能同時轉化到一個細胞中去pTrx-2在IPTG存在下表達大量的硫氧還原白。mGP1-2象這兩個質粒一樣能共存於同一細胞中，並能簡單地通過用IPTG誘導1ac啟動子導致T7-RNA聚合酶的生成，而用於調控pGP5-5的T7-DNA聚合酶表達。
T7DNA聚合酶的過量生成有機種可行的方案可用於trxA和基因5兩種基因產物的過量生成和再構成。在所有方案中可使用相同的細胞株和質粒。在較好的方案中，兩種基因在同一細胞中共同進行過量表達。(這是因為基因5在與硫氧還蛋白結合之前對蛋白酶敏感。)正如下面詳細描述的，一種方法是將兩種基因分別置於同一細胞中的兩個相容質粒上。另外，兩種基因也可串聯置於同一質粒上。將T7基因5置於非滲漏的可誘導啟動子如T7的φ1.1A、φ1.1B和φ10的調控之下是很重要的，因為在大多數大腸桿菌細胞中，這兩種多肽即使少量地同時合成也是有害的。非滲漏是指當控制基因表達的啟動子未活化時，在每個細世代中由基因產生的基因產物少於500分子。最好是使用T7RNA聚合酶表達系統，但是可誘導啟動子的其他表達系統也可使用。滲漏啟動子(例如plac)即使在未誘導時，也允許合成多於500分子的蛋白質，這樣，含有在這種啟動子控制之下的致死基因的細胞生長不良，因此，不能用於本發明中。當然，也可能產生的產物對細胞並非致死。此時，如plac啟動子則適用於這種細胞。
在第二方案中，每種基因可分別克隆並進行過量表達。應用這種方案時，將含有單種過量生成的多肽的細胞先行合併，然後製備提取物，此時兩種多肽形成活性的T7DNA聚合酶。
實例1T7DNA聚合酶的生成用大腸桿菌71.18株(Messing et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.743642，1977)製備mGP1-2貯備物。71.18株於-80℃下儲存在50%甘油中，在常規的基本培養基瓊脂平板上劃線培養。使單一菌落於37℃下在25ml常規M9培養基中生長過夜，利用新製備的71.18細胞測定貯備物效價得到mGP1-2的單個噬斑。用噬斑接種10ml含有JM103的2×LB(2%Bacto-Tryptone，1%酵母抽提物，0.5%NaCl，8mM NaOH)使之生長至A590＝5.0。此培養物將提供大量製備mGP1-2培養物的噬菌體貯備。3-12小時後，離心此10ml培養物，用上清液感染大量(2L)培養物。對於此大量培養物，用培養在M9中的4×5ML 71.18細胞接種4×500ml 2×LB，並在37℃下振搖。當大量細胞培養物生長至A590＝1.0時(大約3小時)，用10ml含有mGP1-2初始溶菌液的上清液對它們接種。然後將感染的細胞於37℃下培養過夜。第二天，離心去除細胞，上清液可備用於K38/pGP5-5/pTrx-2的誘導(見下述)。上清液可以～5×1011φ/ml的滴定度在4℃下儲存大約6個月。在此滴定度下，1升噬菌體將感染12升A590＝5的細胞，感染複數是15。如果滴定度很低，可在上清液中溶入NaCl(60g/l)和PEG-6000(65g/l)，使混合物於0℃下靜置1-72小時，然後離心(7000rpm，20分鐘)，使mGP1-2噬菌體從上清液中濃縮。含有mGP1-2噬菌體的沉澱再懸浮於大約原來體積1/20的M9培養基中。
K38/pGP5-5/pTrx-2是含有兩種相容質粒pGP5-5和pTrx-2的大腸桿菌株(基因型Hfr-C(λ))。pGP5-5質粒具有P15A複製起點並表達卡那黴素(Km)抗性基因。pTrx-2具有ColE1複製起點並表達氨苄青黴素(Ap)抗性基因。質粒是通過常規方法導入K38中的，分別選擇KmR和ApR。K38/pGP5-5/pTrx-2細胞於-80℃儲存在50%甘油中。使用之前，使它們在含有50μg/ml氨苄青黴素和卡那黴素的平板上劃線培養，在37℃下培養過夜，單一菌落於37℃下在10ml含有50μg/ml氨苄青黴素和卡那黴素的LB培養基中培養4-6小時。用此10ml細胞培養物接種500ml含有50μg/ml氨苄青黴素和卡那黴素的LB培養基，於37℃下振搖過夜。第二天1，用此500ml培養物接種12升2×LB-KPO4培養基(2%Bacto-Trypton，1%酵母抽提物，0.5%NaCl，20mM KPO4，0.2%右旋糖和0.2%酪蛋白胺基酸，pH7.4)，於37℃下在發酵罐中通氣培養。當細胞達到A590＝5.0(即對數期或穩定期細胞)時，用感染複數10的mGP1-2感染，並加入IPTG(終濃度為0.5mM)。IPTG在mGP1-2中誘導硫氧還蛋白和T7 RNA聚合酶的產生，並因此誘導克隆的DNA聚合酶的生成。細胞再在攪拌和通氣下培養2.5小時，然後收集。細胞沉澱再懸浮於1.5升10%蔗糖/20mMTris-HCl pH8.0/25mMEDTA中並再離心。最後，細胞沉澱再懸浮於200ml10%蔗糖/20mMTris-HClpH8/1.0mMEDTA中，冰凍在液氮中。由12升誘導細胞中得到70克細胞膏狀物，其中含有大700mg基因5蛋白和100mg硫氧還蛋白。
K38/pTrx-2(僅含有pTrx-2的K38)過量生產硫氧還蛋白，將它作為「激發劑」加到K38/pGP5-5/pTrx-2提取物中，以確保開始純化時硫氧還蛋白多於基因5蛋白。K38/pTrx-2細胞於-80℃下儲存於50%甘油中。使用之前，使它們在含有50μg/ml氨苄青黴素的平板上劃線培養，於37℃下培養24小時，單一菌落於37℃下在25ml含有50μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中培養過夜。用此25ml培養物接種2升2×LB培養基並於37℃下振蕩。當細胞達到A590＝3.0時，加入IPTG(終濃度0.5mM)誘導pTac啟動子，並因此誘導硫氧還蛋白的生成。細胞於37℃再振蕩培養12-16小時，然後收集，再懸浮於600ml 10%蔗糖/20mM Tris-HCl，pH8.0/25mM EDTA中並再離心。最後，細胞再懸浮於40ml 10%蔗糖/20mM Tris-HCl，pH8/0.5mM DETA中，冰凍在液氮中，由2升細胞得到16g細胞膏狀物，其中含有150mg硫氧還蛋白。
檢測聚合酶時，要使用單鏈小牛胸腺DNA(6mM)作為底物。這是馬上就要使用之前如下述製備的用50mMNaOH於20℃處理雙鏈小牛胸腺DNA15分鐘使之變性，然後用HCl中和。任何純化的DNA都可用來作為聚合酶檢測的模板，但它最好具有大於1，000鹼基的長度。
所用的常規T7 DNA聚合酶檢測法是經修改的Grippo等人所述的方法(J.Biol.chem.2466867，1971)。標準的反應混合物(終體積200μl)含有40mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、100nmol鹼變性的小牛胸腺DNA、0.3mM dGTP、dATP、dCTP和〔3H〕dTTP(20cpm/pm)、50μg/ml BSA和含量不同的T7 DNA聚合酶。在37℃(10℃-45℃)下保溫30分鐘(5分-60分)。加入3ml冷的(0℃)1N HCl-0.1M焦磷酸鹽終止反應。根據Hinkle等人的方法(J.Biol.Chem.2505523，1974)測定不溶於酸的放射性。DNA在冰上沉澱15分鐘(5分-12小時)，然後通過過濾而沉澱在玻璃纖維濾器上。濾器用4ml冷的(0℃)0.1MHCl-0.1M焦磷酸鹽洗滌5次，再用冷的(0℃)90%乙醇洗滌2次。乾燥後，濾器上的放射性利用非水閃爍液計數。
在上述給定條件下，一單位聚合酶活性於37℃下30分鐘時間內，催化10nmol的總核苷酸摻入到溶於酸的形式中。利用上述的常規檢測條件，天然的T7DNA聚合酶和修飾的T7DNA聚合酶(見下)具有相同的聚合酶比活±20%，對於天然型酶範圍在5，000-20，000單位/mg，對於修飾的聚合酶範圍在5，000-50，000單位/mg，根據製劑而不同。
通過沉澱和層析技術從上述提取物中純化T7DNA聚合酶。下面是這種純化的一個實例。
冰凍細胞(200mlK38/pGP5-5/pTrx-2和40mlK38/pTrx-2)的提取物在0℃下融解過夜。合併上述細胞，加入5ml溶菌酶(15mg/ml)和10mlNaCl(5M)。0℃下45分鐘後，細胞置入37℃水浴中直至其溫度達到20℃。然後使細胞在液氮中冰凍。再加入50mlNaCl(5M)。細胞在37℃水浴中融解。融解後，細胞在0℃下輕輕混合60分鐘。溶解液在Beckman45Ti轉子中以35，000rpm離心1小時。上清液(250ml)即是組分1。它含有大約700mg基因5蛋白和250mg硫氧還蛋白(硫氧還蛋白與基因5蛋白的比例為2∶1)。
將90g硫酸胺溶入組分Ⅰ(250ml)中攪動60分鐘。使懸浮液靜置60分鐘，以8000rpm離心60分鐘以收集產生的沉澱。沉澱再溶入300ml20mMTris-HClpH7.5/5mM2-巰基乙醇/0.1mMEDTA/10%甘油(緩衝液A)中。這即是組分Ⅱ。
製備Whatman DE52 DEAE柱(12.6cm2×18cm)並用緩衝液A洗滌。組分Ⅱ在1升緩衝液A中透析過夜，換液2次，直至組分Ⅱ的電導率與含100mMNaCl的緩衝液A的電導率相等時為止。透析過的組分Ⅱ以100ml/小時的流速加到柱上，用400ml含有100mMNaCl的緩衝液A洗滌。用3.5升梯度為100-400mMNaCl的緩衝液A以60ml/小時的流速洗脫蛋白。收集在200mMNaCl時洗脫的含有T7DNA聚合酶的組分。這即是組分Ⅲ(190ml)。
製備Whatman p11磷酸纖維素柱(12.6cm2×12cm)，並用20mM KPO4pH7.4/5mM2-巰基乙醇/0.1mM EDTA/10%甘油(緩衝液B)洗滌。組分Ⅲ用緩衝液B稀釋2倍(380ml)，然後以60ml/小時的流速加到柱上，用200ml含有100mM KCl的緩衝洗B洗滌。用1.8升梯度為100-400mM KCl緩衝液B以60ml/小時的流速洗滌蛋白。收集用300mM KCl洗脫的含有T7 DNA聚合酶的組分。這即是組分Ⅳ(370ml)。
製備DEAE-Sephadex A-50柱(4.9cm2×15cm)，並用20mM Tris-HCl pH7.0/0.1mM二硫蘇糖醇/0.1mM EDTA/10%甘油(緩衝液C)洗滌。組分Ⅳ用1升緩衝液C透析2次，透析至最終電導率與含100mM NaCl的緩衝液C的電導率相等。以40ml/小時的流速將透析過的組Ⅳ加到柱1上，用150ml含有100mM NaCl的緩衝液C洗滌。用1升梯度為100-300mM NaCl的緩衝液C以40ml/小時的流速洗脫蛋白。收集以210mM NaCl洗脫的含T7 DNA聚合酶的組分。這即是組分Ⅴ(120ml)。
製備Bio Rad HTP羥磷灰石柱(4.9cm2×15cm)，並用20mM KPO4，pH7.4/10mM 2-巰基乙醇/2mM檸檬酸鈉/10%甘油(緩液液D)洗滌。每次用500ml緩衝液D透析組分Ⅴ2次。透析過的組分Ⅴ以30ml/小時的流速加到柱上，用100ml緩衝液D洗滌。用900ml梯度為0-180mM KPO4，pH7.4的緩衝液D以30ml/小時的流速洗脫蛋白。收集以50mM KPO4洗脫的含有T7 DNA聚合酶的組分。這即是組分Ⅵ(130ml)。它含有270mg均一的T7 DNA聚合酶。
組分Ⅵ在20mM KPO4pH7.4/0.1mM二硫蘇糖醇/0.1mM EDTA/50%甘油中透析。這是濃縮的組分Ⅵ(～65ml，4mg/ml)，於-20℃下保存。
分離的T7聚合酶結合有核酸外切酶活性。如上所述必須使此活性失活。下面是一個通過化學修飾進行失活的實例。
濃縮的組分Ⅵ在20mMKPOpH7.4/0.1mM二硫蘇糖醇/10%甘油中透齬梗ゴ嬖謨詿⒋婊撼逡褐械腅DTA。透析後，將濃度用20mMKPOpH7.4/0.1mM二硫蘇糖醇/10%甘油調整為2mg/ml，將30ml(2mg/ml)的等分試樣置於50ml聚丙烯管中(2mg/ml時，T7DNA聚合酶的摩爾濃度為22μM)。
二硫蘇糖醇(DTT)和硫酸銨亞鐵(Fe(NH4)2(SO4)26H2O)在即將使用前新製備，並加到T7 DNA聚合酶的30ml等分試樣中，加入濃度為5mM DTT(0.6ml 250mM母液)和20μM Fe(NH4)2(SO4)26H2O(0.6ml 1mM母液)。在修飾時，T7 DNA聚合酶和鐵的摩爾濃度都是大約20μm，而DTT的摩爾數則過量250倍。
修飾過程如下述於0℃下在飽和的氧氣氛中進行。反應混合物置於乾燥器中的冰上，乾燥器通過真空排除了空氣並隨之用100%氧充滿。此循環重複3次。反應可在空氣(20%氧)中進行，但速率只有三分之一。
圖4給出了喪失核酸外切酶活性的時間過程。根據Richardson所述(J.Molec.Biol.1549，1966)，由細菌噬菌體T7製備3H-標記的雙鏈DNA(6cpm/p mol)。3H-標記的單鏈T7 DNA在即將使用前如下製備用50mM NaOH於20℃下使3H標記的雙鏈T7 DNA變性15分鐘，然後用HCl中和。所用的常規核酸外切酶檢測法是修改過的Chase等人所述的方法(同上)。標準的反應混合物(終體積100μl)含有40mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、60nmol3H-標記的單鏈T7 DNA(6cpm/pmole)，以及含量不同的T7 DNA聚合酶。3H-標記的雙鏈T7 DNA也可作為底物使用。而且，任何均一放射標記的DNA，單鏈的或雙鏈的，都可用於檢測中。3′端標記的單鏈或雙鏈DNA也可用於檢測。在37℃下保溫15分鐘後，加入30μlBSA(10mg/ml)和25μlTCA(100%W/V)終止反應。檢測可在10℃-45℃下進行1-60分鐘。DNA在冰上沉澱15分鐘(1分鐘-12小時)，然後以12，000g離心30分鐘(5分鐘-3小時)。用100μl上清液測定溶於酸的放射性，即通過將它加入400μl水和5ml水性閃爍混合液中測定。
在檢測條件下，一個單位的核酸外切酶活性在30分鐘內，催化10nmol的總核苷酸的酸溶解。使用上述的標準檢測條件，天然T7DNA聚合酶的核酸外切酶比活為5000單位/mg。修飾的T7DNA聚合酶的核酸外切酶比活根據化學修飾的程度而定，但理想情況是至少比天然T7DNA聚合酶低10-100倍，或使用上述的標準檢測條件為500至50或更少的單位/mg。如果使用雙鏈底物，則核酸外切酶活性大約高7倍。
在前面概括的條件下，核酸外切酶活性指數衰變，半衰期為8小時。每天混合一次反應容器，使溶解氧均勻分布，否則，反應在氧濃度較高的表面進行得更為迅速。每天加入一次2.5mMDTT(0.3ml新製備的250mM母液加至30ml反應液中)以補充被氧化的DTT。
8小時後，T7DNA聚合酶的核酸外切酶活性降低50%，損失的聚合酶活性可忽略。50%的損失可能是一半聚合酶分子的核酸外切酶活性完全失活的結果，而不是所有分子的核酸外切酶活性速率普遍降低。因此，在8小時反應後，所有分子都具有正常的聚合酶活性，一半分子具有正常的核酸外切酶活性，而另一半分子的核酸外切酶活性小於原來的0.1%。
當50%的分子被修飾時(8小時反應)，儘管不太理想，此酶仍適用於DNA順序測定。為了進行更高質量的DNA順序測定，使反應一直進行到發生大於99%的修飾(核酸外切酶活性小於50單位)，這需要4天時間。
4天後，反應混合物用2次250ml的20mM KPO4pH7.4/0.1mM DTT/0.1mM EDTA/50%甘油透析，除去鐵。修飾的T7 DNA聚合酶(～4mg/ml)於-20℃下存儲。
T7DNA聚合酶化學修飾的反應機理依賴於由於還原態過渡金屬(如Fe+)和氧的存在而產生的活潑氧。下面概括了產生羥基自由基的可能的反應機理(1)Fe2++O2→Fe3++O2(2)2O2+2H+→H2O2+O2(3)Fe2++H2O2→Fe3++OH+OH-在反應式1中，還原態金屬鐵的氧化作用產生超氧物自由基O2。超氧物自由基可經過歧化反應產生過氧化氫(反應式2)。最後，過氧化氫可與還原態金屬鐵離子反應形成羥基自由由基即OH-(Fenton反應，反應式3)。利用還原劑如DTT，氧化的金屬離子再循環到還原態。
這些活潑氧可能通過特異胺基酸殘基的不可逆的化學改變而使蛋白質失活。對由CNBr或胰蛋白酶產生的基因5的片段進行SDB-PAGE時觀察到了這種損害。有些片段消失了，發生高分子量的交聯，而某些段被斷裂成兩個較小的片段。
如前所述，氧、還原劑(如DTT、2-羥醯基乙醇)和過渡金屬(如鐵)是修飾反應中的重要成分。反應可在空氣中進行，使用100%的氧可促使反應速率提高3倍。反應在不加入過渡金屬時將進行緩慢，因為在大多數緩衝液製劑中含有微量過渡金屬(1-2μM)。
正如所預想的，修飾反應的抑制劑包括無氧條件(如氮)如金屬螯合劑(如EDTA、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸鹽等)。此外，過氧化氫酶和超氧物歧化酶可能抑制反應，這與活潑氧在生成修飾的T7DNA聚合酶中具有主要作用是一致的。
作為可供選擇的方法，有可能使T7的基團5發生基因突變，從而專一性地使該蛋白的核酸外切酶結構域失活。從這種突變體中純化得到的T7基因5蛋白可很理想地用於DNA順序測定，而不需要通過氧過化使核酸外切酶失活，也不會在化學修飾時對蛋白質產生不可避免的二級結構損害。
基因修飾的T7DNA聚合酶可如下分離使基因5發生隨機突變，然後篩選那些喪失核酸外切酶活性，但未喪失聚合酶活性的突變體。誘變如下述進行。通過常規方法製備在T7RNA聚合酶啟動子控制下的含有基因5的單鏈DNA(如克隆在pEMBL-8中，這是一個含有單鏈DNA複製起點的質粒)，用兩種不同的化學誘變劑處理肼，它將使C和T變突;以及甲酸，它將使G和A突變(Myersetal.，Science229242，1985)。應用能使平均每一質粒分子中有一個鹼基改變的劑量使DNA誘變。然後，此單鏈的誘變質粒接上普遍性的17聚體引物(見上述)，並用作合成相反鏈的模板。合成鏈在對應於模板的突變鹼基處含有隨機摻入的鹼基。然後，用此雙鏈的突變DNA轉化K38/pGP1-2菌株，它是含有質粒pGP1-2的K38株(Taboretal.，見上)。在熱誘導條件下，此菌株表達T7DNA聚合酶。轉化的細胞於30℃下進行平板培養，每個平板大約200個菌落。
以下列發現為基礎，篩選具有缺乏核酸外切酶活性的T7DNA聚合酶細胞。DNA聚合酶的3′至5′核酸外切酶活性具有校正的功能。當摻入錯誤鹼基時，核酸外切酶將把新摻入的鹼基作為「非正常」的鹼基切掉。dATP的類似物就是這種情況，T7DNA聚合酶很容易在dATP的位置摻入亞乙烯基-dATP。但如果T7DNA聚合酶具有3′至5′核酸外切酶活性，它一摻入就迅速被切下，從而沒有DNA淨合成。如圖6所示，利用交錯的共聚物多聚d(AT)作為模板，天然的T7DNA聚合酶只有在dATP存在下才能催化大量DNA的合成，而亞乙烯基-dATP存在時不行。與此相反，修飾的T7DNA聚合酶由於沒有結合的核酸外切酶活性，則以可與dATP相比的速率將亞乙烯基-dATP穩定地摻入DNA中。因此，利用多聚d(AT)作為模板，dTTP和亞乙烯基-dATP作為前體，天然的T7DNA聚合酶不能由此模板合成DNA，而缺乏核酸外切酶活性的T7DNA聚合酶將能夠用此模板合成DNA。
Raetz描述了裂解和篩選大量菌落的方法(Proc.Nat.Acad.Sci.722274，1975)。簡言之，將用含有突變的基因5的質粒轉化的K38/pGP1-2細胞，從培養皿轉移至濾紙片上(「複製平板」)，在培養皿上的轉化細胞大約為每塊平板200個菌落。然後，將濾紙圓片置於42℃下60分鐘以誘導T7 RNA聚合酶，它則能使基因5蛋白得到表達。硫氧還蛋白本質上是從染色體基因中產生的。在濾紙片上加入溶菌酶以溶解細胞。在經過凍融步驟以確保細胞溶解後，濾紙圓片與多聚d(AT)、[α32P]dTTP和亞乙烯基-dATP於37℃下保溫60分鐘。然後用酸洗滌濾紙圓片以去除未摻入的[32P]dATP。DNA將在酸中沉澱在濾紙片上，而核苷酸是可溶的。然後用X-光膠片對洗過的濾紙曝光。誘導出缺乏核酸外切酶活性的T7 DNA聚合酶的菌落，將摻入不溶於酸的32P，並將由放射自顯影而觀察到。表達天然的T7 DNA聚合酶，或表達缺乏聚合酶活性的T7 DNA聚合酶的菌落，則將不會在放射自顯影中出現。
從含有原初菌落的主培養皿中回收呈現陽性的菌落。對每份含可能的陽性克隆的細胞進行大規模(1升)誘導，從每份製備物中純化T7DNA聚合物，以確定每個突變體結合的核酸外切酶水平。核酸外切酶活性較低的適於進行DNA順序測定。
也可使用定向誘變以分離出T7基因5蛋白的核酸外切酶結構域的基因突變體。下面是此方法的一個實例。
核酸外切酶活性降低的T7DNA聚合酶(修飾的T7DNA聚合酶)也可利用其穿越二級結構區域進行合成的能力而與天然的T7DNA聚合酶區別開。也就是說，用修飾的DNA聚合酶，由標記引物在具有二線結構的模板上合成DNA時，延伸長度與未修飾的或天然的DNA聚合酶相比長得多。這種檢測法可作為對小百分比DNA聚合酶分子轉化為修飾聚合酶進行篩選的基礎。
用若干化學試劑處理後，用上述檢測法篩選改變的T7DNA聚合酶。有三種反應導致該酶轉化成修飾的酶。第一是如上述的用鐵和還原劑處理。另兩個是用光氧化染料玫瑰紅和甲烯藍在光的存在下處理酶。染料必須小心滴定，但與鐵誘導的氧化作用相比較，即使在最佳條件下，對核酸外切酶活性而不對聚合酶活性失活的專一性也較低。由於這些染料對於組氨酸殘基的修飾有高度專一性，此結果有力地表明，組氨酸殘基是核酸外切酶活性位點中的一個重要部分。
在T7基因5蛋白中有23個組氨酸殘基。其中有8個殘基位於蛋白質的氨基端一半，根據與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段的同源性，這個區域可能是核酸外切酶結構域所在之處(Ollisetal.，Nature313818，1984)。如下所述，8個組氨酸殘基中有7個通過合成合適的寡核苷酸而單個地進行突變，然後摻入基因5中。它們相應於表1中的突變體1和6-10。
突變體的構建是首先將來自pGP5-3的T7基因5(Taboretal.，J.Biol.Chem.282，1987)克隆入M13mp18載體的SmaⅠ和HindⅢ位點中，產生mGP5-2(在此方法中，所用載體和基因5的來源不是很關鍵的)。由在脫氧胸腺嘧啶處摻入了脫氧尿嘧啶的菌株製備單鏈的mGP5-2DNA(Kunke;Proe.Natl.Acad.Sci.USA82488，1985)。轉染到野生型大腸桿菌中後，由於含有尿嘧啶的鏈將優先降解，因此，此方法對於僅有合成鏈(含有突變的鏈)的存活提供了有利的選擇作用。
利用常規方法合成長度為15-20鹼基的突變的寡核苷酸。將每種寡核苷酸與模板退火，用天然的T7DNA聚合酶延伸，用T4DNA連接酶連接。由瓊脂糖凝膠電脈分離出共價閉合的環狀分子，電泳時存在有0.5μg/ml的溴化乙錠。然後，用得到的純化分子轉化大腸桿菌71.18。從產生的空斑分離DNA，測定相關區域的順序以證實每一個突變的存在。
以下概括了用以在基因5核酸外切酶中產生基因突變的寡核苷酸。用劃下線標出產生的突變。採用Dunn等人(J.Molec.Biol.166477，1983)的胺基酸和鹼基對編號。同時還顯示了與突變的基因5區域相關的野生型順序。
野生型順序109(aa)122123LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyLysArgPheGlySerHisAlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGAAAACCCTTTGGGTCTCACGCTTTGGAG14677(T7鹼基對)突變1His123→Ser123所用引物5′CGCTTTGGATCCTCCGCTTTG3′突變順序123LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyLysArgPheGlySerSerAlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGAAAACGCTTTGGATCCTCCGCTTTGGAG突變2Ser122和His123的缺失所用引物5′GGAAAACGCTTTGGCGCCTTGGAGGCG3′Δ6個鹼基缺失突變順序122123LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyLysArgPheGly……AlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGAAAACGCTTTGGC------GCCTTGGAG突變3Ser122，His123→Ala122，Glu123所用引物5′CGCTTTGGGGCTGAGGCTTTGG3′突變順序122123LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyLysArgPheGlyAlaGluAlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGAAAACGCTTTGGGGCTGAGGCTTTGGAG突變4Lys118，Arg119→Glu118，Glu119所用引物5′5′GCCCGGGGAAGAGTTTGGGTCTCACGC3′突變順序118119LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyGluGluPheGlySerHisAlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGGGAAGAGTTTGGGTCTCACGCTTTGGAG
突變5Arg111，Ser112，Lys114→Glu111，Ala112，Glu114所用引物5′GGGTCTTCTGGAAGCCGGCGAGTTGCCCGG3′突變順序111112114LeuLeuGluAlaGlyGluLeuProGlyLysArgPheGlySerHisAlaLeuGluCTTCTGGAAGCCGGCGAGTTGCCCGGAAAACGCTTTGGGTCTCACGCTTTGGAG突變6His59，His62→Ser59，Ser62所用引物5′ATTGTGTTCTCCAACGGATCCAAGTATGACG3′野生型順序aa555962LeuIleValPheHisAsnGlyHisLysTyrAspValCTTATTGTGTTCCACAACGGTCACAAGTATGACGTTT7鹼基對14515突變順序5962LeuIleValPheSerAsnGlySerLysTyrAspValCTTATTGTGTTCTCCAACGGATCCAAGTATGACGTT突變7His82→Ser82所用引物5′GAGTTCTCCCTTCCTCG3′野生型順序aa7782LeuAsnArgGluPheHisLeuProArgGluAsnTTGAACCGAGAGTTCCACCTTCCTCGTGAGAACT7鹼基對14581突變型順序82LeuAsnArgGluPheSerLeuProArgGluAsnTTGAACCGAGAGTTCTCCCTTCCTCGTGAGAAC
突變8Arg96，His99→Leu96，Ser99所用引物5′CTGTTGATTTCTTCCAACCTC3′野生型順序aa939699ValLeuSerArgLeuIleHisSerAsnLeuLysAspThrAspGTGTTGTCACGTTTGATTCATTCCAACCTCAAGGACACCGATT7鹼基對14629突變順序9699ValLeuSerLeuLeuIleSerSerAsnLeuLysAspThrAspGTGTTGTCACTGTTGATTTCTTCCAACCTCAAGGACACCGAT突變9His190→Ser190所用引物5′CTGACAAATCTTACTTCCCT3′野生型順序aa185190LeuLeuSerAspLysHisTyrPheProProGluCTACTCTCTGACAAACATTACTTCCCTCCTGAGT7鹼基對14905突變順序190LeuLeuSerAspLysSerTyrPheProProGluCTACTCTCTGACAAATCTTACTTCCCTCCTGAG突變10His218→Ser218所用引物5′GACATTGAATCTCGTGCTGC3′
野生型順序aa214218ValAspIleGluHisArgAlaAlaTrpLeuLeuGTTGACATTGAACATCGTGCTGCATGGCTGCTCT7鹼基對14992突變順序218ValAspIleGluSerArgAlaAlaTrpLeuLeuGTTGACATTGAATCTCGTGCTGCATGGCTGCTC突變11缺失胺基酸118至123所用引物5′CGGCAAGTTGCCCGGGGCTTTGGAGGCGTGGG3′Δ18個鹼基缺失野生型順序109(aa)118122123126LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyLysArgPheGlySerHisAlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGAAAACGCTTTGGGTCTCACGCTTTGGAG14677(T7鹼基對)突變順序117124LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGly……(6個胺基酸)……AlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGG……(18個鹼基)……GCTTTGGAG突變12His123→Glu123所用引物5′GGGTCTGAGGCTTTGG3′
突變順序123LeuLeuArgSerGlyLysLeuProGlyLysArgPheGlySerGluAlaLeuGluCTTCTGCGTTCCGGCAAGTTGCCCGGAAAACGCTTTGGGTCTGAGGCTTTGGAG突變13(Arg131，Lys136，Lys140，Lys144，Arg145→Glu131，Glu136，Glu140，Glu144，Glu145)作用引物5′GGTTATGAGCTCGGCGAGATGGAGGGTGAATACGAAGACGACTTTGAGGAAATGCTTGAAG3′野生型順序129(aa)131136140144145GlyTyrArgLeuGlyGluMetLysGlyGluTyrLysAspAspPheLysArgMetLeuGluGluGGTTATCGCTTAGGCGAGATGAAGGGTGAATACAAAGACGACTTTAAGCGTATGCTTGAAG14737(T7bp)突變順序129(aa)131136140144145GlyTyrGluLeuGlyGluMetGluGlyGluTyrGluAspAspPheGluGluMetLeuGluGluGGTTATGAGCTCGGCGAGATGGAGGGTGAATACGAAGACGACTTTGAGGAAATGCTTGAAG14737(T7bp)如下所述，通過使突變的噬菌體感染進K38/pGP1-2而產生每一種突變的基因5蛋白。細胞於30℃下生長至A590＝1.0。溫度轉至42℃維持30分鐘，以誘導T7 RNA聚合酶。加入IPTG至0.5mM，加入每一種噬菌體的溶解產物使moi＝10。感染的細胞於37℃下生長90分鐘。然後收集細胞，根據常規方法製備T7基因5蛋白的提取物。
提取物通過磷酸纖維素和DEAEA-50柱而部分純化，如上述直接測定聚合酶和核酸外切酶活性進行檢驗。結果示於表1中。
表1T7基因5突變體的核酸外切酶和聚合酶活性。
突變體核酸外切酶聚合酶活性活性%%[野生型] [100]a[100]b突變1(His123→Ser123)10-25＞90突變2(ΔSer122，His123)0.2-0.4＞90突變3(Ser122，His123→Ala122，Glu123)＜2＞90突變4(Lys118，Arg119→Glu118，Glu119)＜30＞90突變5(Arg111，Ser112，Lys114→Glu111，Ala112，Glu114)＞75＞90突變6(His59，His62→Ser59，Ser62)＞75＞90突變7(His82→Ser82)＞75＞90
表1T7基因5突變體的核酸外切酶和聚合酶活性。
突變體核酸外切酶聚合酶活性活性%%突變8(Arg96，His99→Leu96，Ser99)＞75＞90突變9(His190→Ser190)＞75＞90突變10(His218→Ser218)＞75＞90突變11(ΔLys118，Arg119，Phe120，Gly121，Ser122，His123)＜0.02＞90突變12(His123→Glu123)＜30＞90突變13(Arg131，Lys136，Lys140，Lys144，Arg145→Glu131，Glu136，Glu140，Glu144，Glu145)＜30＞90a.核酸外切酶活性用單鏈[3H]T7 DNA測定。100%核酸外切酶活性相應於5，000單位/mg。
b.聚合酶活性用單鏈的小牛胸腺DNA測定。100%的聚合酶活性相應於8，000單位/mg。
在所測的7個組氨酸中，只有一個(His123突變體1)具有修飾的T7DNA聚合酶特徵的酶活性。用DEAE-纖維素、磷酸纖維素、DEAE-Sephadex和羥磷灰石層析從此突變體中純化T7的基因5蛋白。聚合酶活性幾乎是正常的(大於天然酶水平的90%)，而核酸外切酶活性則降低了4至10倍。
構建了一個此突變體的變種，其中His123和Ser122都缺失掉了。從此突變體中純化的基因5蛋白的核酸外切酶活性低200-500倍，並也保留了大於90%的聚合酶活性。
這些數據有力地表明，His123位於T7基因5蛋白的核酸外切酶結構域的活性位點。進一步，有可能His123實際上是通過鐵、氧和還原劑氧化而修飾的殘基，因為這種氧化作用在其他蛋白中已表明是修飾組氨酸殘基的(Levine，J.Biol.Chem，25811823，1983;Hodgsonetal.，Biochem.145294，1975)。突變體11中殘留的核酸外切酶水平與通過化學修飾得到的水平差不多。
雖然描述了在組氨酸殘基的突變作用，在附進位點或甚至在遠位點的突變作用也可能產生適於本發明的突變酶，例如Lys和Arg(突變體4和15。)與此相似，雖然某些組氨酸殘基的突變對於核酸外切酶活性很少有影響，但這並不一定表明，靠近這些殘基的突變將不會影響核酸外切酶活性。特別有效果的突變包括具有2個或更多胺基酸缺失的突變，例如最好是6-8個，並靠近His-123區域。其他突變將進一步或完全降低核酸外切酶活性。
作為應用這些突變體菌株的實例，下面給出說明。含有pGP5-6(突變體11)的菌株已寄存於ATCC(見下述)。此菌株如上述進行培養，如Tabor等人(J.Biol.Chem.26216212，1987)所述進行誘導。可加入K38/Ptrx-2細胞以提高基因修飾的T7DNA聚合酶的產量。
上述已寄存的菌株還含有質粒pGP1-2，它表達T7RNA聚合酶。Tabor等人(Proc.Nat.Acad.Sci.USA821074，1985)描述了此質粒，它在1985年3月22日寄存於ATCC，寄存號為40，175。
參見圖10，pGP5-6包括下列片段1.來自M13mp10的EcoRⅠ-SacⅠ-SmaⅠ-BamHⅠ多連接子順序(21鹼基對)。
2.T7的鹼基對14309至16747，其中含有T7的基因5，並具有下述修飾
T7鹼基對14703由A變成G，產生一個SmaⅠ位點。
T7鹼基對14304至14321缺失(包括它們二者本身，18鹼基對)。
3.來自M13mp10的SalⅠ-PatⅠ-HindⅢ多連接子順序(15鹼基對)。
4.pBR322鹼基對29(HindⅢ位點)至pBR322鹼基對375(BamHⅠ位點)。
5.T7的鹼基對22855至T7的鹼基對22927，其中含有T7RNA聚合酶啟動子φ10，每一端都插有BamHⅠ連接子(82鹼基對)。
6.pBR322鹼基對375(BamHⅠ位點)至pBR322鹼基對4361(EcoRⅠ位點)。
利用修飾的T7-型DNA聚合酶測定DNA順序使用修飾的T7-型DNA聚合酶進行DNA合成反應，在長度為幾個鹼基至成千個鹼基的範圍內，使鏈終止片段具有均一的放射性強度。由於終止位點不依賴於鏈終止劑的摻入(即在暫停位點或二級結構障礙處)，因此基本上沒有本底。
使用修飾的T7-型聚合酶進行測序反應由脈衝和追止組成，脈衝是指合成短標記的DNA片段;追止是指延長短片段直至鏈終止劑摻入為止。每一步的基本原理與常規的DNA測序反應不同。在脈衝中，反應液在高水平的三種核苷三磷酸(如dGTP、dCTP和dTTP)和有限水平的另一種標記的、無載體的核苷三磷酸(如[35S]dATP)存在下，於0℃-37℃下保溫0.5-4分鐘。在這些條件下，修飾的聚合酶無法表現其連續特性，因而將會合成一批其大小在幾個鹼基至幾百鹼基的放射性片段。脈衝的目的是放射標記每個引物，利用最少量的放射性核苷酸摻入最多的放射性。在此實例中，脈衝反應中的兩個條件(低溫，如從0-20℃，以及有限水平的dATP，如從0.1μM至1μM)限制了修飾的T7-型聚合酶表現其連續特性。混合物中的其他重要的環境組分將具有相似的作用，例如限制不止一種的核苷三磷酸或提高反應液的離子強度。如果引物已經標記(例如通過激酶)，則不需要脈衝步驟。
在追止中，反應在高水平(50-500μM)的所有四種脫氧核苷三磷酸和有限有水平(1-50μM)的四種鏈終止劑中的任一種，例如雙脫氧核苷三磷酸存在下，於45℃下保溫1-30分鐘，DNA合成在平均為50-600個鹼基後終止。追止的目的是在DNA連續合成條件下延伸每一個放射標記的引物，在分別利用四種雙脫氧核苷三磷酸的四個獨立的反應中，鏈延長無一例外地在正確位點終止。追止的兩個條件(高溫，例如從30-50℃，以及高水平的所有四種脫氧核苷三磷酸，(高於50μM)，允許修飾的T7-DNA聚合酶表現其連續特性，摻入成千上萬的鹼基;因此，同一聚合酶分子將通過引物-模板合成到摻入一個雙脫氧核苷酸為止。在45℃的追止溫度下，合成速率為大於700核苷酸/秒。因此，對於測序反應來說追止步驟在不到一秒內就完成了。在整個測序反應中如果使用dITP，或如果使用低溫或高離子強度，或低水平的三磷酸鹽，則單鏈結合蛋白可提高連續性。
在用修飾的T7-型DNA聚合酶進行的DNA測序反應中，可以使用[α35S]dATP、[α32P]dATP或螢光標記的核苷酸。如果螢光類似物在引物的5′末端，則不需要脈衝步驟。
兩個因素決定合成反應的平均延伸長度。第一是脈衝反應的時間長度。由於脈衝是在沒有鏈終止劑存在下進行的，所以脈衝反應時間越長，引物延伸就越長。在0℃時，聚合酶平均延伸10核苷酸/秒。第二是追止反應中脫氧核糖核苷三磷酸與鏈終止劑的比例。修飾的T7-型DNA聚合酶不能辨別這些類似物的摻入，因此，追止中的平均延伸長度是追止反應中脫氧核苷三磷酸濃度與鏈終止劑濃度比值的四倍。因此，為了縮短延伸的平均長度，將脈衝時間縮短至例如30秒和/或在追止反應中提高鏈終止劑與脫氧核苷三磷酸濃度的比例。提高鏈終止劑濃度或降低脫氧核苷三磷酸濃度可做到這一點。在追止反應中，為了提高延伸的平均長度，則增加脈衝時間至例如3-4分鐘，和/或降低鏈終止劑濃度(例如20μM至2μM)。
實例2利用修飾的T7DNA聚合酶測定DNA順序下面是用雙脫氧核苷酸作為終止劑測定順序的實例。
濃度為0.7mM的9μl單鏈M13 DNA(mGP1-2，由常規方法製備)與1μl互補的順序測定引物(常規的普遍性17聚體，0.5pmole引物/μl)和2.5μl 5X退火緩衝液(200mM Tris-HCl，pH7.5，50mM MgCl2)旌希尤戎 5℃維持3分鐘，在30分鐘內緩慢冷卻至室溫。在脈衝反應中，將12.5μl上述的退火混合物與下述溶液混合1μl 0.1MDTT、3mM的3種dNTP(dGTP、dCTP、dTTP)各2μl(P.L.Biochemi-cals，在ET中)、2.5μl[α35S]dATP(1500Ci/mmol，New England Nuclear)和1μl實例1所述的修飾的T7 DNA聚合酶(0.4mg/ml，2500單位/ml，即0.4μg，2.5單位)，於0℃下保溫2分鐘，旋轉攪拌後，再用微型離心機離心1秒鐘。保溫時間可在30秒至20分鐘間變動，溫度可在0℃至37℃間變動。用較長的時間測定遠離引物的順序。
分別取4.5μl的上述脈衝反應液的等分試樣加入含有預保溫至45℃的追止混合物的四支試管中，這四支試管標以G、A、T、C，每支中含有痕量的雙脫氧(dd)G、A、T或C(P-L Biochemicals)中的任一種。專用的追蹤止液在下面給出。每支試管含有1.5μl 1mM dATP，0.5μl 5×退火緩衝液(200mM Tris-HCl，pH7.5，50mM MgCl2)和1.0μl 100μM ddNTP(其中的ddNTP對應於各試管中的ddG、A、T或C)。每份追止反應液於45℃下(或30℃-50℃)保溫10分鐘，然後，在每支試管中加入6μl終止溶液(90%甲醯胺、10mM EDTA、0.1%二甲苯胺)，將試管置於冰上。追蹤時間可在1-30分鐘之間變動。
測序反應液在常規的含7M脲的6%聚丙烯醯胺測序凝膠中電泳，電泳在30瓦下進行6小時。在凝膠上進行電泳之前，反應液加熱至75℃維持2分鐘。用10%乙酸、10%甲醇固定凝膠，在凝膠乾燥器上乾燥，並在柯達OM1高反差放射自顯影膠片上曝光過夜。
實例3利用有限濃度的dNTP測定DNA順序在此實例中，在脈衝反應中使用限定水平的所有四種脫氧核糖核苷三磷酸，以進行mGP1-2DNA的DNA順序分析。此方法與實例2的方案相比有若干優越之處。首先，脈衝反應進行至完全，而在前一方案中必須在時間進程中打斷。其結果是反應更易於操縱。其次，此方法更易於控制脈衝的延伸程度，並因此將引物附近順序(前面50個鹼基)的標記效率提高大約10倍。
7μl 0.75mM單鏈M13 DNA(mGP1-2)與1μl互補的測序引物(17聚體，0.5pmole引物/μl)和2μl 5×退火緩衝液(200mM TrIS-HCl pH7.5，50mM MgCl2，250mM NaCl)混合，加熱至65℃維持2分鐘，在30分鐘內緩慢冷卻至室溫。在脈衝反應中，10μl上述退火混合物與下述溶液混合1μl 0.1M DTT、2μl各為1μM的3種dNTP(dGTP、dCTP、dTTP)、0.5μl[α35S]dATP，[α10μM](約10μM，1500Ci/m mol，New England Nuclear)和2μl修飾的T7DNA聚合酶(0.1mg/ml，1000單位/ml，即0.2μg，2單位)，於37℃下保溫5分鐘(保溫溫度和時間分別可在20℃-45℃和1-60分鐘之間變動)。
分別取3.5μl的上述脈衝反應液試樣加入含有預保溫至37℃的追止混合物的四支試管中。這四支試管標以G、A、T、C，每支中含有痕量的雙脫氧G、A、T、C中的一種。專用的追止溶液在下面給出。每支試管含有0.5μl 5×退火緩衝液(200mM Tris-HCl pH7.5，50mM MgCl2、250mM NaCl)、200μM的4種dNTP(dGTP、dATP、dTPP、dCTP)各1μl，和1.0μl 20μM ddNTP.每份追止反應液於37℃保溫5分鐘(或分別是20℃-45℃和1-60分鐘)，然後，每支試管中加入4μl終止溶液(95%甲醯胺、20mM，EDTA、0.05%二甲苯胺)，將試管置於冰上，然後如上述在常規聚丙烯醯胺測序凝膠上進行電泳。
實例4用dITP代替dGTP測定DNA順序為了穿過DNA的壓縮區(即具有緻密的二級結構的區域)進行順序測定，通常使用dITP(Millsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.762232，1979)或脫氮鳥苷三磷酸(脫氮GTP，Mizusawaetal.，Nuc.AcidRes.141319，1986)。我們發現這兩種類似物都能與T7-型聚合酶正常作用，尤其是在單鏈結合蛋白存在下使用dITP時。這些反應最好是用上述基因修飾的T7聚合酶進行，或者為了降低核酸外切酶的降解作用，追止反應進行1-2分鐘和/或在20℃下進行。
修飾的T7DNA聚合酶有效地使用dITP或脫氮GTP以代替dGTP。在脈衝和追止混合物中，用dITP取代dGTP，濃度為使用dGTP時的2-5倍。在ddG追止混合物中仍然使用ddGTP(不是ddITP)。
使用dITP的追止反Χ圓辛艫牡退劍ㄔ .01單位)核酸外切酶活性很敏感。為了避免這一麻煩，如果使用dITP，則追止反應的時間不應超過5分鐘。建議使四份dITP反應與四份使用dGTP的反應一起進行，而不是將後者取消。如果常規性地使用dGTP和dITP二者，可通過下述方法使所需的混合物數目降至最低(1)在追止混合物中不加dGTP和dITP，這意味著對於dGTP和dITP追止反應來說，可使用四種追止混合物。(2)在合適的脈衝混合物中加入高濃度的dGTP或dITP(分別為0.5mM和1-2.5mM，各2μl)。這樣，兩種脈衝混合物都含有低濃度的dCTP、dTTP和[α35S]dATP，和高濃度的dGTP或dITP中的一種。這種改變一般不會對測序反應的質量產生不利影響，並將用dGTP和dITP進行反應所需的脈衝和追止混合物的數目降至6份。
測序反應與實例3差不多，只是脈衝混合物中有二份含有a)對dGTP有3種dNTP混合物1.5μMdCTP、dTTP，和2mMdITP和b)對dITP有3種dNTP混合物1μMdCTP、dTTP和2mMdITP。在追止反應中，從追止混合物中去掉dGTP(即追止混合物含有30μMdATP、dTTP和dCTP，以及8μM的四種雙脫氧核苷酸中的一種)，使用dITP的追止時間不超過5分鐘。
寄存菌株K38/pGP5-5/pTrx-2、K38/pTrx-2和M13mGP1-2已寄存於ATCC，寄存號分別為67，287、67，286和40，303，日期為1987年1月13日。菌株K38/pGP1-2/pGP5-6已寄存於ATCC，寄存日為1987年12月4日，寄存號67571。
申請人及其代理人認可他們具有下述責任這些培養物如果在此處公布的專利的期限終點之前死亡，最後一次請求培養物後5年內死亡，或30年內死亡，依時限最長的那種情況而定，則他們有責任替換這些培養物，並有責任在些專利公開時公布寄存物，此時，將使寄存物可由公眾不可取消地得到。直至那時之前，根據37CFR的1-14條和35USC的112條，這些寄存物將由專利局局長不可取消地得到。
其他具體方案其他具體方案在下面權利要求書的範圍內。
本發明的修飾的DNA聚合酶的其他用途，即利用其連續性和缺乏核酸外切酶活性的優點的用途，包括基因組DNA順序的直接酶促擴增。這一方法對於其他聚合酶已有描述(Saikietal.，Science2301350，1985;Scharf，Science2331076，1986)。
參見圖6，特定DNA區域的酶促擴增需要使用兩個引物，它們在雙鏈DNA順序的目的區域與對立鏈退火，其3′端方向相對(見黑箭頭)。實際方法涉及變性、退火和DNA合成的多重循環(10-40次，最好是16-20次)。利用此方法，有可能使人基因組DNA的特定區域擴增200，000倍以上。其結果是特定基因片段代表大約五分之一，而不是原來的百萬分之一。這極大地促進了基因組DNA的克隆和直接分析。對於診斷應用來說，它可將分析過程由幾周加速到1-2天。
Klenow片段的擴增過程限於長度小於200鹼基的片段。與此不同，修飾的T7-型DNA聚合酶應能允許長度為數千鹼基的DNA片段擴增(最好是與大腸桿菌DNA結合蛋白或單鏈結合蛋白結合，以防止單鏈DNA的「快速恢復形成)」。
修飾的T7-型DNA聚合酶也適用於標準的反應混合物1)填平由限制性酶切割產生的DNA片段的5′伸出末端，以便(例如)由具有無3′伸出端的單鏈區的線性DNA分子產生平末端的雙鏈DNA;b)用於標記限制性片段的3′端，由S1核酸酶分析確定mRNA起始位點的圖譜，或用Maxam和Gilbert的化學修飾法測定DNA順序;C)用於克隆的DNA片段的體外誘變。例如，使含有專一錯配鹼基的化學合成的引物與DNA模板雜交，然後利用修飾的T7-型DNA聚合酶進行延伸。用這種方法，突變將永遠摻入合成鏈中。用聚合酶由引物合成完整長度的DNA是有利的。使用連續性DNA聚合酶能最有效地做到這一點。另外，通過DNA合成(見上)時的錯誤摻入可進行誘變。此方法已用於使用克隆的DNA片段的特定區域發生誘變。所用酶沒有核酸外切酶活性是很重要的。標準反應混合物是指含有聚合酶和任何必需的脫氧核苷或其他化合物的緩衝液。
權利要求
1.一種測定DNA分子的塑帳峒罨承虻姆椒ǎǎ 使所述DNA分子與能與所述DNA分子雜交的引物分子退火；在至少四個容器中分別保溫退火混合物的各部分，每個容器中含有四種不同的脫氧核苷三磷酸；一種連續性DNA聚合酶，其中，所述聚合酶與所述DNA分子維持結合狀態至少達500個鹼基，然後在DNA測序反應的延長反應通常所用的環境條件下解離，所述聚合酶的核酸外切酶活性少於每毫克所述聚合酶500單位；以及四種DNA合成終止劑中的一種，它在特定的核苷酸鹼基位點終止DNA合成，其中每一種所述終止劑在不同的核苷酸鹼基處終止DNA合成；根據大小分離每個保溫反應液中的DNA產物，通過這種方法，至少能夠確定所述DNA分子的部分核苷酸鹼基順序。
2.權利要求1的方法，其中所述聚合酶與所述DNA分子維持結合狀態至少達500個鹼基後才解離。
3.權利要求1的方法，其中所述聚合酶與所述DNA分子維持結合狀態至少達1000個鹼基後才解離。
4.權利要求1的方法，其中所述聚合酶是用T7-型噬菌體感染的細胞中的聚合酶。
5.權利要求4的方法，其中所述的T7-型噬菌體是T7、T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122或SP6。
6.權利要求1的方法，其中所述聚合酶是不區分雙脫氧核苷酸類似物的。
7.權利要求1的方法，其中所述聚合酶是修飾過的聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性少於50單位。
8.權利要求7的方法，其中所述修飾的聚合酶的核酸外切酶活性小於每毫克聚合酶1單位。
9.權利要求7的方法，其中所述修飾的聚合酶的核酸外切酶活性小於每毫克聚合酶0.1單位。
10.權利要求1的方法，其中所述聚合酶沒有可測的核酸外切酶活性。
11.權利要求1的方法，其中所述聚合酶能夠利用10鹼基對或更多鹼基對的引物。
12.權利要求1的方法，其中所述聚合酶能夠利用4鹼基對或更多鹼基對的引物。
13.權利要求1的方法，其中所述引物包括4-20鹼基對，所述聚合酶能夠利用4-20鹼基對的引物。
14.權利要求4的方法，其中所述聚合酶不區分核苷酸類似物，它是一種修飾的聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小於500單位，所述引物是含有4-10個鹼基的單鏈RNA或DNA，所述聚合酶能夠利用4-10個鹼基的引物，所述保溫過程包括一個脈衝和一個追止步驟。
15.權利要求1的方法，其中所述引物是單鏈DNA或RNA。
16.權利要求1的方法，其中所述退火步驟包括使所述DNA分子和所述引物加熱到65℃以上，並使加熱混合物冷卻至0℃-30℃。
17.權利要求1的方法，其中所述保溫過程包括一個脈衝和一個追止步驟。
18.權利要求17的方法，其中所述的脈衝步驟包括使所述的退火混合物與所有四種脫氧核苷三磷酸和一種連續性DNA聚合酶混合，其中至少一種所述脫氧核苷三磷酸具有標記並以有限濃度存在。
19.權利要求18的方法，其中所述脈衝步驟的保溫進行30秒至20分鐘。
20.權利要求18的方法，其中所述追止步驟包括在進行了所述脈衝步驟後，在四等份混合物中分別加入一種所述鏈終止劑。
21.權利要求20的方法，其中所述追止步驟的保溫進行1至60分鐘。
22.權利要求1的方法，其中所述終止劑是雙脫氧核苷酸。
23.權利要求1的方法，其中所述終止劑是一種有限水平的脫氧核苷三磷酸。
24.權利要求1的方法，其中一種所述脫氧核苷三磷酸從dITP或脫氮鳥苷中選擇。
25.權利要求1的方法，其中所述引物在所述退火步驟前進行標記。
26.權利要求25的方法，其中所述保溫過程包括一個追止步驟。
27.權利要求25的方法，其中所述引物是螢光標記的。
28.一種由克隆的片段產生活性T7-型DNA聚合酶的方法，包括將編碼所述聚合酶的基因置於單一細胞中非滲漏啟動子的調控之下，誘導所述基因在所述細胞處於對數生長期或穩定期時的表達，並從所述細胞中分離所述聚合酶。
29.權利要求28的方法，其中所述基因之一處在表達時需要T7RNA聚合酶的啟動子的調控之下。
30.權利要求28的方法，其中所述聚合酶是從兩個克隆基因中產生的活性T7DNA聚合酶，一個所述基因處在表達時需要T7RNA聚合酶的啟動子的調控之下。
31.一種從含有表達所述聚合酶的載體的細胞中純化T7DNA聚合酶的方法，包括下列步驟溶解所述細胞，使所述聚合酶通過按分子大小分離的層析柱、DE52 DEAE柱、磷酸纖維素柱和羥基磷灰石柱。
32.權利要求31的方法，該方法在層析步驟之前包括用硫酸銨沉澱所述聚合酶。
33.權利要求31的方法，其中進一步包括使所述聚合酶通過Sephadex DEAE A-50柱的步驟。
34.權利要求31的方法，其中所述按分子大小分離的柱是Sephadex C150柱。
35.一種在DNA重組技術所產生的DNA聚合酶溶液中使核酸外切酶失活的方法，包括使所述溶液在含有氧、還原劑和過渡金屬的容器中保溫。
36.一種測定DNA順序的藥盒，包括一種連續性DNA聚合酶，其中所述聚合酶與DNA分子的至少500鹼基維持結合狀態後才解離，所述聚合酶的核酸外切酶活性小於每毫克聚合酶500單位，在DNA測序反應的延伸反應通常所用的環境條件下，所述聚合酶能夠表現其連續性，所述順序測定的一種必需的試劑，選自(a)dITP(b)一種鏈終止劑。
37.一種製造編碼T7-型DNA聚合酶基因的方法，此種聚合酶具有降低了其天然存在的核胤外切酶活性，該方法包括遺傳修飾T7-型DNA聚合酶基因。
38.一種製造具有降低了其天然存在的核酸外切酶活性的T7-型DNA聚合酶的方法，此種方法包括權利要求38的基因表達。
39.一種從具有單鏈區的線性DNA分子產生平末端雙鏈DNA的方法，其中所述分子的3′端是雙鏈的並且沒有3′伸出末端，該方法包括使所述DNA分子與連續性DNA聚合酶保溫，所述聚合酶基本上沒有天然存在的核酸外切酶活性。
40.一種擴增DNA順序的方法，包括使第一和第二引物與雙鏈DNA順序相反的鏈退火，使退火混合物與一種連續性DNA聚合酶保溫，每毫克該聚合酶的核酸外切酶活性小於500單位，其中所述第一和第二引物是與所述DNA順序相反的鏈退火。
41.權利要求41的方法，其中所述第一和第二引物的3′端在退火後位於相對方向。
42.權利要求41的方法，其中所述方法在所述保溫步驟後進一步包括，使產生的DNA變性，使所述第一和第二引物對所述產生的DNA退火，用所述聚合酶與退火混合物保溫。
43.權利要求43的方法，其中所述的變性、退火和保溫的循環重複10-40次。
44.權利要求41的方法，其中每毫克聚合酶的所述核酸外切酶活性小於1單位。
45.一種標記DNA片段3′端的方法，包括使所述DNA片段與一種連續性DNA聚合酶和一種標記的脫氧核苷酸保溫，其中每毫克所述聚合酶的核酸外切酶活性小於500單位。
46.一種克隆的DNA片段體外誘變的方法，包括提供一種引物和一種模板，所述引物和所述模板具有特異錯配的鹼基，並用一種連續性的修飾的DNA聚合酶延伸所述引物。
47.一種克隆的DNA片段體外誘變的方法，包括提供所述克隆的片段，並在導致錯誤摻入核苷酸鹼基的條件下，用一種連續性DNA聚合酶合成DNA鏈，其中每毫克該聚合酶的核酸外切酶活性小於1單位。
48.權利要求12的方法，其中所述混合物包括T7基因2.5或基因4。
49.權利要求13的方法，其中所述混合物包括T7基因2.5或基因4。
50.權利要求38方法，其中所述的具有降低了核酸外切酶活性的基因，含有一個修飾了的His殘基。
51.權利要求51的方法，其中所述的His殘基是His-123。
52.權利要求51的方法，其中刪除了His殘基。
53.製造具有降低了其天然存在的核酸外切酶活性的T7-型DNA聚合酶的方法，此方法包括權利要求52或53的基因表達。
54.如在權利要求38中所要求的方法，其中所述的基因修飾作用包括刪除用於所述的T7-型聚合酶的118至123胺基酸編碼的鹼基序列。
55.一種藥盒，包括多種適於DNA順序測定的至少25寡聚體，每種所述寡聚體裝在不同的容器中，並具有長度小於15個鹼基的不同的鹼基順序。
56.權利要求56的藥盒，其中所述寡聚體各含有6-9個鹼基。
57.權利要求1的方法，其中所述聚合酶在DNA測序反應的脈衝反應通常所用的第二環境條件下，不能表現其連續性。
58.權利要求36的藥盒，其中所述聚合酶在DNA測序反應的脈衝反應通常所用的第二環境條件下，不能表現其連續性。
59.權利要求4的方法，其中所述T7型噬菌體是T-7。
全文摘要
本發明涉及T7-型DNA聚合酶及其使用方法。
文檔編號C12NGK1031251SQ8810064
公開日1989年2月22日 申請日期1988年1月14日 優先權日1987年1月14日
發明者斯坦利·泰伯, 查理斯·C·理察遜 申請人:哈佛大學校長及研究員協會