柱層析法從組分i中提取人纖維蛋白原的方法
2023-07-15 19:56:01
專利名稱：柱層析法從組分i中提取人纖維蛋白原的方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥領域，特別是一種柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法。
背景技術：
人纖維蛋白原(Human Fibrinogen)即人凝血因子I，是血漿蛋白的主要成份之一，分子量約為34萬，等電點5. 5，加溫至57°C很快變性。它在血漿中的含量高，約為2-4g/ L，是血漿粘滯性的主要決定因素，肝臟是合成纖原的主要場所。人纖維蛋白原(Fg)能迅速提高血液中纖維蛋白原的含量，通過凝血酶的作用，使纖維蛋白原轉化為不溶的纖維蛋白，網絡血液中血球等有形成分凝成血塊，達到止血的目的。用於治療產後大出血和因大手術、外傷或內出血等引起的纖維蛋白原缺乏而造成的凝血障礙，以及胸廓、腹部和尿路等大型外科手術的出血等，對治療血友病的合併症也有效。由於血漿中纖維蛋白原含量十分豐富，並且纖維蛋白原分子量很大，所以纖維蛋白原較易從血漿中分離提純，而且該產品臨床需求量也較大，因此分離純化人纖維蛋白原， 不僅提高寶貴血漿資源的綜合利用，同時在醫藥衛生方面也有較大意義。人纖維蛋白原是已有國家標準的的血液製品，收錄在2010年版《中國藥典》三部中，該藥在國內已經臨床使用多年，其生產工藝已比較成熟，近年也有專利申請號為 200810046747. 5和專利申請號為200910237204. 6的人纖維蛋白原的生產方法，但目前國內外大多數血液製品廠家基本上都採用低溫乙醇法以血漿為原料，從Cohn6法的組分I中提取人纖維蛋白原，該法主要缺陷為製品的純度較低，一般70 80%，外觀較差，質量穩定性差。也有報導從冷沉澱中提取人纖維蛋白原，由於冷沉澱中的纖維蛋白原的含量較低，產品最終收率沒有從FI高，並且冷沉澱是作為人凝血因子VIII的起始原料，如果用於生產人纖維蛋白原，勢必降低人凝血因子VIII的生產量，收率低。因此，人纖維蛋白原的製備方法亟待改進和創新。
發明內容
針對上述情況，為克服現有技術的缺陷，本發明的目的就是提供一種柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，可有效解決人纖維蛋白原純度高，穩定性好，收率高的問題。本發明解決的技術方案是，由以下步驟實現(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用5 15倍體積的第一溶解液，20_26°C攪拌溶解1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；(2) S/D滅活將製品溫度控制在M ，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D溶液，保持製品溫度M 6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2 8°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，設定溫度0°C，收集沉澱； (4) 一次沉澱的溶解及過濾沉澱用5 10倍體積的第二溶解液，在20_26°C攪拌溶解1小時，溶解後過濾，收集濾液；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2 8°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7) 二次沉澱的溶解及過濾沉澱用3 5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時， 溶解後，過濾；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製， 使最終製品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。該方法是採用柱層析技術並結合甘氨酸沉澱法從組分I(FI)中提取人纖維蛋白原，該生產工藝中採用的甘氨酸沉澱法比傳統的低溫乙醇沉澱法條件溫和，能夠保證製品的活性和製品的穩定性，加入了 DEAE-650M凝膠吸附過程，能夠吸附生產過程中夾帶的其它凝血因子，進一步保障了製品的穩定，以組分I作原料能夠提高每升血漿人纖維蛋白原收率。該法採用甘氨酸作為沉澱劑，使最終製品中夾帶有0. 5%左右的甘氨酸，甘氨酸與鹽酸精氨酸聯合作為製品穩定劑，能夠增強制品凍幹後的穩定性。所以該生產工藝能夠提高製品的質量，純度、穩定性和最終產品的收率，是製備人纖維蛋白原的創新。
四
圖1為本發明的製備工藝流程圖。圖2為本發明所採用的S/D法對PRV的滅活動力學曲線圖。圖3為本發明所採用的S/D法處理Sindbis的滅活動力學曲線圖。圖4為本發明所採用的乾熱法病毒滅活對EMC的滅活動力學曲線圖。
五具體實施例方式以下結合工藝流程圖對本發明的具體實施方式
作詳細說明。由圖1所示，本發明在具體實施中是由以下步驟實現的(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用5 15倍體積的第一溶解液，20_26°C攪拌溶解1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10 14g檸檬酸三鈉，9gNaCl，8 12g蔗糖，2 4gTris(三羥甲基氨基甲烷)，3 5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值6. 90-7. 10 ；(2) S/D滅活將製品溫度控制在M ，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度M ^°C 6小時；所述的11% S/D溶液為，IOOOml注射用水溶液中含有IlOg吐溫-80，3 磷酸三丁酯；所述的S/D滅活劑，即用有機溶劑/去汙劑混合物(S/D)破壞包膜病毒的脂膜，一旦破壞脂膜的病毒不可能再與感染細胞結合，該法能有效的滅活脂包膜病毒，但不能滅活非包膜病毒；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2 8°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，設定溫度0°C，收集沉澱；(4) 一次沉澱的溶解及過濾沉澱用5 10倍體積的第二溶解液，在20_26°C攪拌溶解1小時，溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有 5 IOg檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值6. 90-7. 10 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中，矽膠柱層析流動相為水相；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1. 5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2 8°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7) 二次沉澱的溶解及過濾沉澱用3 5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14 16. 5g的枸櫞酸鈉，30 55g鹽酸精氨酸，7 9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH6. 9 7. 1 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製， 使最終製品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0. 7 μ m 1. 0 μ m ；所述的步驟(3)和步驟(6)中甘氨酸的濃度為1. 5 2. 2mol/L。本發明在具體實施中，還可由以下實施例給出實施例1 本發明在具體實施中由以下步驟實現(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用5倍體積的第一溶解液，20°C攪拌溶解1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，9g NaCl，8g蔗糖，2g Tris，3g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值為 6. 90 ；滅活將製品溫度控制在M°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1. 5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，0°C收集沉澱；(4) 一次沉澱的溶解及過濾沉澱用5倍體積的第二溶解液，在20°C攪拌溶解1小時，溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有5g檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值為6. 90 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1. 5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7) 二次沉澱的溶解及過濾沉澱用3倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14g的枸櫞酸鈉，30g鹽酸精氨酸，7g的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH為6. 9 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製， 使最終製品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0. 7 μ m。實施例2:(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用8倍體積的第一溶解液，23°C攪拌溶解1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有12g檸檬酸三鈉，9gNaCl，IOg蔗糖，3g Tris, 4g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值為 7 ；(2) S/D滅活將製品溫度控制在25°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度25°C 6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1. 8mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至5°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，0°C收集沉澱；(4) 一次沉澱的溶解及過濾沉澱用7倍體積的第二溶解液，在23°C攪拌溶解1小時，溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有7. 5g檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值為7 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1. 8mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至5°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7) 二次沉澱的溶解及過濾沉澱用4倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有15. 2g的枸櫞酸鈉，43g鹽酸精氨酸，Sg的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH為7 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製， 使最終製品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.85 μ m。實施例3 (1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用15倍體積的第一溶解液，攪拌溶解1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有14g檸檬酸三鈉，9g NaCl，12g蔗糖，4g Tris，5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值為 7. 10 ；(2) S/D滅活將製品溫度控制在，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至8°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，0°C收集沉澱；(4) 一次沉澱的溶解及過濾沉澱用10倍體積的第二溶解液，在攪拌溶解1 小時，溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值為7. 10 ；(5)柱層析DEAE_650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至8°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7) 二次沉澱的溶解及過濾沉澱用5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有16. 5g的枸櫞酸鈉，55g鹽酸精氨酸，9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH為7. 1 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製， 使最終製品中蛋白含量為25g/L ；(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘；所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為Ι.Ομπι。本發明產品經測試完全達到或超過了《中國藥典》2010年版(三部)的相關要求和國內已上市的同類產品，相關數據的對比分析見下表本發明產品與國內上市銷售產品質量比較資料(規格0. 5g/瓶)
權利要求
1.一種柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特徵在於，是由以下步驟實現(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用5 15倍體積的第一溶解液，2046°C攪拌溶解 1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10 14g檸檬酸三鈉，9g NaCl, 8 12g蔗糖，2 4gTris，3 5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值6. 90-7. 10 ；(2)S/D滅活將製品溫度控制在M ^TC,按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度M 6小時；所述的11% S/ D滅活劑為，IOOOml注射用水溶液中含有110g吐溫_80，33g磷酸三丁酯；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1.5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2 8°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，設定溫度0°C，收集沉澱；(4)一次沉澱的溶解及過濾沉澱用5 10倍體積的第二溶解液，在20-26°C攪拌溶解1小時，溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有5 IOg檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值6. 90-7. 10 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1.5 2. 2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2 8°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7)二次沉澱的溶解及過濾沉澱用3 5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後，過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14 16. 5g的枸櫞酸鈉， 30 55g鹽酸精氨酸，7 9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH6. 9 7. 1 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製，使最終製品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。 所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.7μπι 1. 0 μ m ；所述的步驟(3)和步驟(6)中甘氨酸的濃度為1. 5 2. 2mol/L。
2.根據權利要求1所述的柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特徵在於， 由所述的以下步驟實現(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用5倍體積的第一溶解液，20°C攪拌溶解1小時， 溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，9g NaCl，8g蔗糖，2g Tris，3g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值為 6. 90 ；滅活將製品溫度控制在M°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1. 5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，0°C收集沉澱；(4)一次沉澱的溶解及過濾沉澱用5倍體積的第二溶解液，在20°C攪拌溶解1小時， 溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有5g檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值為6. 90 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟(4)中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1.5mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至2°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7)二次沉澱的溶解及過濾沉澱用3倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後， 過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有14g的枸櫞酸鈉，30g鹽酸精氨酸，7g的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH為6. 9 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製，使最終製品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.7 μ m。
3.根據權利要求1所述的柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特徵在於， 由所述的以下步驟實現(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用8倍體積的第一溶解液，23°C攪拌溶解1小時，溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有12g檸檬酸三鈉，9g NaCl，10g蔗糖，3g Tris，4g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值為7 ； 滅活將製品溫度控制在25°C，按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度25°C 6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按1.8mol/L濃度加入甘氨酸粉末， 充分溶解後冷卻至5°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，0°C收集沉澱；(4)一次沉澱的溶解及過濾沉澱用7倍體積的第二溶解液，在23°C攪拌溶解1小時， 溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有7. 5g檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值為7 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按1.8mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至5°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7)二次沉澱的溶解及過濾沉澱用4倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後， 過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有15. 2g的枸櫞酸鈉，43g鹽酸精氨酸，Sg的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH為7 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製，使最終製品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘。所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為0.85 μ m。
4.根據權利要求1所述的柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，其特徵在於， 由所述的以下步驟實現(1)組分I沉澱的溶解及過濾沉澱用15倍體積的第一溶解液，26°C攪拌溶解1小時， 溶解後的製品澄清過濾，計量製品體積；所述的第一溶解液為每IOOOml注射用水溶液中含有14g檸檬酸三鈉，9g NaCl，12g蔗糖，4g Tris，5g賴氨酸鹽酸鹽，用HCl調整pH值為 7. 10 ；滅活將製品溫度控制在^TC,按每升濾液加IOOml的比例，在攪拌狀態下緩慢加入質量濃度的11% S/D滅活劑，保持製品溫度6小時；(3)第一次甘氨酸沉澱計量步驟2中滅活液體積，按2.2mol/L濃度加入甘氨酸粉末， 充分溶解後冷卻至8°C，以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，0°C收集沉澱；(4)一次沉澱的溶解及過濾沉澱用10倍體積的第二溶解液，在攪拌溶解1小時， 溶解後過濾，收集濾液；所述的第二溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有10g檸檬酸三鈉，加HCl調整pH值為7. 10 ；(5)柱層析DEAE-650M凝膠先用枸櫞酸緩衝液平衡，再將步驟(4)中的濾液上柱進行層析，收集流出液，層析結束後用3倍柱床體積的枸櫞酸緩衝液洗滌凝膠，併入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉澱層析流出液按2.2mol/L濃度加入甘氨酸粉末，充分溶解後冷卻至8°C，用離心機以4200rpm的速度進行連續離心分離40分鐘，_5°C收集沉澱；(7)二次沉澱的溶解及過濾沉澱用5倍體積的第三溶解液，室溫溶解1小時，溶解後， 過濾；所述的第三溶解液為，IOOOml注射用水溶液中含有16. 5g的枸櫞酸鈉，55g鹽酸精氨酸，9g的氯化鈉，用HCl或NaOH調整溶液pH為7. 1 ；(8)配製檢測過濾後製品蛋白質含量，根據蛋白質含量用第三溶解液進行配製，使最終製品中蛋白含量為25g/L;(9)分裝及凍幹配製後製品除菌分裝於50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分裝後凍幹；(10)乾熱滅活步驟9中凍幹後製品置於水浴中，保持水浴溫度100°C，30分鐘；所述的步驟(1)中所稱的澄清過濾採用濾板澄清過濾，其濾板孔徑為Ι.Ομπι。
全文摘要
本發明涉及柱層析法從組分I中提取人纖維蛋白原的方法，可有效解決人纖維蛋白原純度高，穩定性好，收率高的問題，本發明由以下步驟實現(1)FI沉澱的溶解及過濾；(2)S/D滅活；(3)第一次甘氨酸沉澱；(4)一次沉澱的溶解及過濾；(5)柱層析；(6)第二次甘氨酸沉澱；(7)二次沉澱的溶解及過濾；(8)配製；(9)分裝及凍幹；(10)乾熱滅活；該法採用甘氨酸作為沉澱劑，使最終製品中夾帶有0.5％左右的甘氨酸，甘氨酸與鹽酸精氨酸聯合作為製品穩定劑，能夠增強制品凍幹後的穩定性，提高製品的質量、純度和最終產品的收率，是製備人纖維蛋白原的創新。
文檔編號C07K1/16GK102212129SQ20111007855
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月5日 優先權日2011年5月5日
發明者劉國榮, 時凱, 江景玉, 皮川真, 陳惠珍, 雷文成 申請人:邦和藥業股份有限公司