一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用的製作方法
2023-07-16 05:44:41 1
一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方法和應用。所述人胃癌細胞系保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：2013154。該人胃癌細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，成瘤率高，潛伏期短，均一性好，為胃癌研究提供新的更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料。該人胃癌細胞系具有成瘤性，而且產生的腫瘤具有順鉑耐藥性，可用來分析體外、體內藥物敏感性及耐藥性的相關性，進而建立體外、體內兩個相關聯的藥物篩選平臺，是人胃癌基礎研究和臨床前期應用的理想細胞系。CCTCC NO：C201315420131120
【專利說明】一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細胞系及其建立方 法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細胞 系及其建立方法和應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是目前嚴重危害人類健康的主要疾病，其中，胃癌是全球發病率最高的 癌症之一，也是世界上第2位癌症死亡原因，僅次於肺癌。據2011年的Global Cancer Statistics報告，目前全球超過70%的胃癌新發病例和死亡都發生在發展中國家，其中東 亞高居榜首，發病率分別達到男性42. 4%和女性18. 3%。而根據中國抗癌協會臨床腫瘤 協作中心（CSCO)列舉的數據，目前全球每年新發胃癌有九十三萬四千例，其中有近四十萬 在中國內地，中國的胃癌發病已佔全世界的42%。我國每年死於胃癌約30萬人，死亡率為 25. 2/10萬（男性：32. 8/10萬，女性：17. 0/10萬），佔全部惡性腫瘤死亡的23. 2%。而在 上海，男性胃癌的發病率為47. 1/10萬?63. 2/10萬，女性為20. 1/10萬?24. 8/10萬，分 別佔惡性腫瘤發病率的第1位和第2位。其中，胃腺癌的發生率佔胃惡性腫瘤的95%。
[0003] 近年來，胃癌的治療模式已從單一的手術治療進入綜合治療加規範化手術的新治 療模式，其中輔助化療作為綜合治療的方法之一，已得到越來越多的關注。目前胃癌臨床化 療主要存在如下問題：首先，常用的化療方案缺乏客觀指標反應藥物的抗癌敏感性；其次， 耐藥現象的發生仍然是胃癌化療中存在的最大問題。鑑於此，建立不同病理類型的胃癌細 胞系，尤其是具有耐藥特性的細胞系，對於有效指導臨床前研究和臨床不同分型的治療相 關性，具有必不可少的重要作用。同時由於運用臨床腫瘤組織直接建立細胞系的成功率較 低，因此，通過運用臨床腫瘤標本先建立動物模型，進而通過原代培養建立人源腫瘤細胞更 具有可行性，同時也接近於腫瘤的臨床生物學特性，對藥物的耐藥性及敏感性具有良好的 預測性。
[0004] 胃癌細胞系在新藥開發臨床前應用的一個重要方面就是建立小鼠異種移植瘤模 型，用於預測抗癌藥物的臨床療效。然而，目前建立的大多數胃癌細胞系受限於成瘤率低或 均一性差等問題，難以應用於大規模藥物篩選。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題就是針對現有的人胃癌細胞系生物多樣性低，與臨床胃 癌的生物學性狀相差較大等不足，提供一種新的具有5-氟尿嘧啶耐藥性的人胃癌細胞系 及其建立方法和應用。
[0006] 因此，本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之一是：一種人胃癌細胞系，其 保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :2013154。
[0007] 本發明所述人胃癌細胞系較佳地還包括如上所述的人胃癌細胞系的子代細胞。
[0008] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之二是：如上所述的人胃癌細胞系在 製備使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑中的用途。
[0009] 本發明所述的使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑為本領域常規的試劑，該試劑的制 備方法較佳地為將本發明所述人胃癌細胞系混懸於各種溶劑中即得。其中所述溶劑為本 領域常規溶劑，較佳地為HBSS緩衝液，所述HBSS緩衝液的配方為：含500U/ml青黴素 G、 500 μ g/ml硫酸鏈黴素和1. 25 μ g/ml兩性黴素 B。
[0010] 本發明所述試劑較佳地用於製備胃癌動物模型。其中所述胃癌動物模型的製備方 法為本領域常規方法，較佳地包括以下步驟：將所述使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑接種 於免疫缺陷小鼠進行飼養，獲得胃癌動物模型。其中所述免疫缺陷小鼠較佳地為裸小鼠或 嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），優選地為嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），其中 所述裸小鼠較佳地為NU/NU品系的裸小鼠。利用本發明所述細胞系製備的胃癌動物模型具 有5-氟尿嘧啶耐藥性。
[0011] 其中所述的接種的方式為本領域常規使用的接種方式。所述接種方式較佳地包括 皮下穿刺接種，原位接種或者腎囊膜內接種，優選地為皮下穿刺接種。所述接種的細胞量較 佳地為I. 0?2X IO7個細胞，優選地為5. OX IO6個細胞。
[0012] 本發明所述胃癌動物模型的應用方法較佳地為，利用所得胃癌動物模型檢測待測 化合物的抑制胃癌活性，將待測化合物施用於胃癌動物模型，觀察和測量動物的體重與腫 瘤生長情況；施用後導致胃癌動物模型胃癌症狀改善或治癒的待測化合物具有抑制胃癌活 性。
[0013] 其中所述的待測化合物施用的方法為本領域常規的施用方法，較佳地包括：尾靜 脈注射、腹腔注射、灌胃、口服和腫瘤局部用藥中的一種或幾種方式施用於胃癌的荷瘤動 物。所述實驗中的對照例較佳地為：同時使用不含待測化合物的溶劑施用於胃癌的荷瘤動 物作為對照實驗組。
[0014] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之三是：一種待測化合物抑制胃癌細 胞活性的體外檢測方法，該體外檢測方法包括以下步驟：將待測化合物施用於細胞模型中， 施用後抑制細胞增殖或導致細胞凋亡的待測化合物為具有抑制胃癌細胞活性的化合物，其 中所述的細胞模型是如上所述的人胃癌細胞系。
[0015] 本發明所述體外檢測方法為本領域常規使用的方法，該體外檢測方法較佳地包括 以下步驟：
[0016] (1)將本發明所述人胃癌細胞系或其子代細胞接種於96孔細胞培養板孔中，培養 24小時；
[0017] (2)將待測化合物稀釋成不同濃度施用於細胞，化合物作用72小時後通過測定細 胞的活力，計算不同濃度的化合物對細胞的增殖抑制能力，計算化合物半數抑制濃度，用以 判斷待測化合物的抗胃癌細胞的能力。
[0018] 其中步驟（1)所述人胃癌細胞系或其子代細胞的接種量較佳地為5000/孔。其中 步驟（2)所述半數抑制濃度檢測方法較佳地包括ATP生物發光法或MTT法，本發明所述檢 測方法優選地為ATP生物發光法。所述的ATP生物發光法是通過對細胞中的ATP進行定量 測定來檢測培養物中活細胞數目的一種均質檢測方法，其中所述的ATP是活細胞新陳代謝 的一個重要指標，所述ATP生物發光法可以利用市售檢測試劑盒進行。
[0019] 本發明解決上述技術問題所採用的技術方案之四是：一種如上所述人胃癌細胞系 的建立方法，該建立方法包括以下步驟：
[0020] (1)獲得新鮮的臨床人胃癌手術切除標本，剪切成小塊，皮下穿刺接種免疫缺陷小 鼠；
[0021] (2)穿刺接種70?90天後，將荷瘤動物處死，取出腫瘤組織，進行癌細胞的原代培 養和傳代培養。
[0022] 其中步驟（1)所述的新鮮的臨床人胃癌手術切除標本剪切而成的小塊的質量較 佳地為20?50mg。其中所述的免疫缺陷小鼠較佳地為嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠） 或裸小鼠。其中所述的新鮮的臨床人胃癌切除標本更佳的處理方式為：用新鮮的HBSS緩衝 液（所述HBSS緩衝液較佳地包含500U/ml青黴素 G、500 μ g/ml硫酸鏈黴素和1. 25 μ g/ml 兩性黴素 B)漂洗。
[0023] 其中步驟（2)所述的原代培養方法是常規的哺乳動物細胞的原代培養方法；所述 的原代培養方法較佳地包括以下步驟：
[0024] 將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養瓶中，於37°C孵箱5% CO2條件下培養；次日，將 培養瓶慢慢翻轉平放，向瓶內加入RPMI-1640培養液（含5%胎牛血清，lOOU/ml青黴素 G、 100 μ g/ml硫酸鏈黴素和0. 25 μ g/ml兩性黴素 B)，靜置培養。
[0025] 其中所述的傳代培養方法是常規哺乳動物細胞的傳代培養方法；所述的傳代培養 方法較佳地包括以下步驟：待原代培養的細胞鋪展到70%滿時進行傳代培養和純化，吸棄 舊培養液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，終止消化，加入新鮮的 RPMI-1640培養液，吹打使之脫離瓶壁形成細胞懸液；離心接種於新的培養瓶繼續培養。
[0026] 所述傳代培養方法中較佳地還包括細胞純化的步驟，所述細胞純化的方法較佳地 包括以下步驟：利用腫瘤細胞和成纖維細胞貼壁速率的不同，在傳代接種於新的培養瓶20 分鐘後吸取上清轉移到新的培養瓶，多次差速貼壁去除成纖維細胞。
[0027] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0028] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0029] 本發明的積極進步效果在於：
[0030] 1、本發明建立的人胃癌細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，為胃癌研究提供新的 更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料；
[0031] 2、本發明建立的人胃癌細胞系在保留主要臨床生物學特徵的前提下，具有成瘤率 高，潛伏期短，均一性好等特點，可以成功製備胃癌動物模型，所製得的動物模型可以用於 基礎研究及藥物篩選，為基於中國人群遺傳背景開展的研究提供了有力的科研資料，也為 新藥臨床前研究體內實驗針對臨床抗癌藥物敏感性及耐藥性的測試提供新的試驗材料。
[0032] 3、本發明建立的人胃癌細胞系通過與裸小鼠體內傳代親本腫瘤相比較，可用來分 析體外、體內藥物敏感性及耐藥性的相關性，進而可以建立體外、體內兩個相關聯的藥物篩 選平臺，是人胃癌基礎研究和臨床前期應用的理想細胞系。
[0033] 4、本發明建立的人胃癌細胞系所成的裸鼠腫瘤還具有對胃癌臨床一線藥物5-氟 尿嘧啶的耐藥性，是研究胃癌耐藥機制的良好試驗材料，具有很高的科研價值和開發意義。
[0034] 5、本發明建立的細胞系具高成瘤率，高均一性，又保持有臨床胃癌分子背景，同時 來源於中國人群，符合中國人的遺傳特徵，對研發適合國人的抗胃癌新藥具有十分重要的 理論和臨床意義。
[0035] 牛物材料保藏信息
[0036] 本發明的人胃癌細胞系，於2013年11月20日保藏在中國典型培養物保藏中 心（CCTCC)，保藏地址為：中國.武漢.武漢大學郵編：430072,培養物名稱為人胃癌細胞 GAXC066,保藏編號為 CCTCC NO :C2013154。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037] 圖1為GAXC066細胞的形態學觀察（放大一百倍視野）。
[0038] 圖2為GAXC066細胞的染色體分析。其中圖2 (A)為GAXC066細胞；圖2 (B)為小 鼠細胞染色體。
[0039] 圖3為GAXC066細胞免疫組化染色結果（DAB法）。其中圖3 (A)為陰性對照； 圖3(B)為癌胚抗原（CEA);圖3(C)為細胞角蛋白（Cytokeratin);圖3(D)為波形蛋 白（Vimentin);圖3(E)為糖類抗原19-9(CA19-9);圖3(F)為人類表皮生長因子受體 2(HER-2)。
[0040] 圖4為GAXC066細胞倍增時間曲線。
[0041] 圖5為GAXC066細胞周期分析結果。
[0042] 圖6為體外測試多個抗癌藥物對GAXC066細胞增殖的抑制作用結果。其中圖6 (A) 為順鉬對GAXC066的生長抑制作用；圖6(B)為伊立替康對GAXC066的生長抑制作用；圖 6(C)為5-氟尿嘧啶對GAXC066的生長抑制作用；圖6(D)為紫杉醇對GAXC066的生長抑制 作用 ；圖6出）為表柔比星對6八乂0)66的生長抑制作用；圖6$)為多西紫杉醇對64乂0)66的 生長抑制作用。
[0043] 圖7為GAXC066細胞的成瘤性結果。
[0044] 圖8為GAX⑶66細胞在裸小鼠體內成瘤的病理組織切片（放大10倍視野）。其中 圖8(A)為正常肺組織；圖8(B)為對應標本移植瘤塊；圖8(C)為GAXC066細胞接種瘤塊。
[0045] 圖9為體內測試順鉬和5-氟尿嘧啶對GAXC066細胞裸小鼠模型的腫瘤生長抑制 作用結果圖。
【具體實施方式】
[0046] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實 施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0047] 順鉬購自江蘇豪森藥業，5-氟尿嘧啶購自天津金耀胺基酸有限公司，生理鹽水購 自浙江天瑞藥業有限公司，細胞培養試劑均購買自美國Invitrogen公司。
[0048] 實施例1GAXC066細胞的製備
[0049] 從南通腫瘤醫院獲得新鮮的臨床胃癌切除標本（患者性別：男，年齡：72歲，民族： 漢，籍貫：江蘇省南通市。），臨床診斷結果為低分化胃腺癌。
[0050] 用新鮮的HBSS緩衝液（含500U/ml青黴素 G、500 μ g/ml硫酸鏈黴素和1. 25 μ g/ml 兩性黴素 B)漂洗後，切成20?50mg的小塊，皮下穿刺接種於免疫缺陷動物SCID鼠 （SCID 鼠購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司）。穿刺接種70?90天後，將荷瘤動物處 死，取出腫瘤組織，進行癌細胞的原代培養和傳代培養。
[0051] 原代培養步驟為：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養瓶中，於37°C孵箱5% CO2條 件下培養；次日，將培養瓶慢慢翻轉平放，向瓶內加入RPMI-1640培養液（含5%胎牛血清， 100U/ml青黴素 G、100 μ g/ml硫酸鏈黴素和0. 25 μ g/ml兩性黴素 B)，靜置培養；待細胞鋪 展到70%滿時先進行傳代，再純化，之後放入37%恆溫培養箱中培養。傳代的方法是吸棄 舊培養液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後，終止消化，加入新鮮的 RPMI-1640培養液，吹打使之脫離瓶壁形成細胞懸液；離心接種於新的培養瓶繼續培養。
[0052] 純化的方法是將所得細胞懸液接種於新的培養瓶，20分鐘後，吸取上清轉移到新 的培養瓶，由於成纖維貼壁速率較快，在新的培養基中培養20分鐘後，細胞懸液中的成纖 維細胞大部分貼壁生長，所以細胞懸液中的腫瘤細胞得到了純化，將上述步驟重複多次，即 達到了純化腫瘤細胞的目的。
[0053] 本發明將來源於腫瘤組織的原代培養及傳代培養細胞系命名為人胃癌細胞 GAXC066,於2013年11月20日保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :C2013154。提交保藏的細胞系是傳代30代後的細胞系。
[0054] 實施例2GAXC066細胞的生物學特性及應用
[0055] 本發明採用RPMI1640培養並用差速貼壁法純化GAXC066細胞，使其能體外長期 生長和穩定傳代。當細胞傳至20代以上，細胞性狀逐漸穩定，進行相關的生物學、遺傳學 和組織來源鑑定，直至第50代都具有相同的穩定的性狀。經實驗觀察與驗證，體外生長的 GAXC066主體細胞呈大柳葉形，無接觸抑制特性。遺傳學研究證實該細胞為異倍體，染色體 數目和結構畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。該細胞能在裸小鼠體內可形成腫瘤，具 有致瘤性。該細胞和其來源的臨床腫瘤標本、裸小鼠體內傳代親本腫瘤形成對應關係，可為 研究體外、體內和臨床抗癌藥物敏感性及耐藥性的相關性提供新的試驗材料。具體如下：
[0056] a.形態學觀察
[0057] 將培養GAXC066細胞的培養瓶置於倒置顯微鏡下，在明視野下進行觀察，結果見 圖1(圖1為GAXC066細胞的形態學觀察100X所示），可見GAXC066主體細胞呈大柳葉形， 無接觸抑制特性。
[0058] b.染色體的鑑定
[0059] 在培養的GAXC066細胞中加入秋水仙素，使其終濃度為0. 25 μ g/ml，再於37°C孵 箱中繼續培養4小時。採集分裂中期的細胞，用固定液進行固定，然後將細胞懸液滴於預冷 的載物片上，用Giemsa染色液染色，於顯微鏡下計數染色體數。結果見圖2,其中圖2 (A)為 GAXC066細胞；圖2(B)為小鼠細胞染色體。結果可見，GAXC066細胞連續傳代後，染色體仍 保持人源性腫瘤細胞染色體的特徵，染色體眾數為51±2,佔80. 89%，表現為超二倍體，存 在多數中央及亞中央著絲粒染色體（圖2(A)，1000X);而裸小鼠的染色體數2n = 40,且均 為頂端著絲粒（圖2(B)，1000X)，據此可與人類染色體相區別。可見該細胞為異倍體（超 二倍體），染色體數目和結構畸變，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。
[0060] C.短片段重複序列（STR)鑑定
[0061] 短串聯重複序列（short tandem repeat, STR)又稱為微衛星DNA，是指染色體上， 由數個鹼基對作為核心單位（2-6個鹼基對），串聯重複形成的一類DNA序列（重複次數為 10?60多次，基因片段在400鹼基對以下）；每個核心單位重複的次數會出現個體差異，從 而形成片段長度不同的等位基因。因此，一組STR序列的重複次數在不同個體中幾乎是唯 一的，是個體的基因身份特徵，也是細胞生物學對細胞身份和來源進行鑑定的主要方法。
[0062] 收集新鮮培養的GAXC066細胞，用AxyPr印基因組DNA小量試劑盒（購自Axygen 公司的 AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，貨號為 AP-MN-MS-GDNA)提取 細胞基因組DNA，用5'端螢光標記的引物進行PCR擴增，對所得產物進行測序，計算各個短 片段重複序列的重複數。
[0063] 提取細胞的基因組DNA，對STR位點進行特異性擴增，通過測序分析包括 Amelogenin，TH01，TPOX，D13S317, vWA，D16S539, D5S818, CSFlPO 以及 D7S820 等各個 STR 位點的序列重複數，並和ATCC，DSMZ等細胞保存庫的資料庫進行查詢對比，未返回相同的 遺傳圖譜，可證明其獨一無二性，且在原代培養過程中未發生和其他細胞的交叉汙染，STR 位點的引物序列如序列表中SEQ ID NO: I-SEQ ID NO. 18所示，具體請參見表1和表2 :
[0064] 表I STR位點的引物序列
【權利要求】
1. 一種人胃癌細胞系，其特徵在於，其保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO :2013154。
2. 如權利要求1所述人胃癌細胞系的子代細胞。
3. 如權利要求1所述的人胃癌細胞系在製備使免疫缺陷小鼠產生胃癌的試劑中的用 途。
4. 如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的使免疫缺陷小鼠為SCID小鼠或裸小 鼠。
5. -種待測化合物抑制胃癌細胞活性的體外檢測方法，其特徵在於，該體外檢測方法 包括以下步驟：將待測化合物施用於細胞模型中，施用後抑制細胞增殖或導致細胞凋亡的 待測化合物為具有抑制胃癌活性的化合物，其中所述的細胞模型是權利要求1所述的人胃 癌細胞系。
6. -種如權利要求1所述人胃癌細胞系的建立方法，其特徵在於，該建立方法包括以 下步驟： (1) 獲得新鮮的臨床人胃癌手術切除標本，剪切成小塊，皮下穿刺接種免疫缺陷小鼠； (2) 穿刺接種70?90天後，將荷瘤動物處死，取出腫瘤組織，進行癌細胞的原代培養和 傳代培養。
7. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（1)所述的小塊的質量為20? 50mg〇
8. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（1)所述的免疫缺陷小鼠為SCID 小鼠或裸小鼠。
9. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（1)所述的新鮮的臨床人胃癌切除 標本用HBSS緩衝液漂洗後，再進行皮下穿刺接種，所述的HBSS緩衝液包含500U/ml的青黴 素G，500 ii g/ml的硫酸鏈黴素和1. 25 ii g/ml的兩性黴素B。
10. 如權利要求6所述的建立方法，其特徵在於，步驟（2)所述的細胞的原代培養包括 以下步驟：將腫瘤組織剪切成小塊，置入培養瓶中，於37°C孵箱5% C02條件下培養；次日 向瓶內加入RPMI-1640培養液，所述RPMI-1640培養液含5%胎牛血清，100U/ml青黴素G， 100 y g/ml硫酸鏈黴素和0. 25 y g/ml兩性黴素B，靜置培養；步驟（2)所述的細胞的傳代培 養包括以下步驟：吸棄舊培養液，向瓶中加入新鮮的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待細胞脫落後， 加入新鮮的DMEM/F12培養液，仔細吹打，使之脫離瓶壁形成細胞懸液；收集全部細胞，離 心，分別接種於新的培養瓶繼續培養，所述百分比為質量百分比。
【文檔編號】C12R1/91GK104403996SQ201410499357
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】強福林, 胡剛, 湯旭蓁, 張一心, 方後順, 汪宗宇, 秦宵然 申請人:上海睿智化學研究有限公司, 南通市腫瘤醫院