人腫瘤特異性Ki67基因啟動子的製作方法

2023-07-15 23:19:31

專利名稱：：人腫瘤特異性Ki67基因啟動子的製作方法
技術領域：
：本發明屬於醫學基因工程
技術領域：
，涉及細胞生物學、分子生物學、癌症生物學等。具體是人腫瘤特異性Ki67啟動子的克隆及功能鑑定，該啟動子在腫瘤細胞或組織中有較高的轉錄活性，從而使外源基因在腫瘤細胞或組織中特異性表達，因此可以廣泛用於腫瘤靶向基因治療。
背景技術：
：腫瘤嚴重危害人類健康。雖然化療、放療和手術技術的改進使腫瘤治療效果取得很大改觀，但效果仍不理想，而且腫瘤常常最終對化療、放療耐受。近年來腫瘤基因治療研究取得較大進展，給人類戰勝腫瘤帶來希望。臨床上基因治療包括多種，如腫瘤自殺基因、抑癌基因、細胞凋亡基因、細胞因子、反義核苷酸、小幹擾RNA等，雖然已經取得了一定的療效[1]，但單純上述基因的應用缺乏腫瘤特異性，限制了基因治療在臨床上的應用範圍及治療效果。為了將治療基因產物限制在腫瘤細胞中，可以通過腫瘤特異性啟動子控制治療基因表達，使其局限在腫瘤細胞內，而不在正常細胞中表達，實現治療基因靶向轉錄，此即為腫瘤的耙向基因治療P"41。腫瘤特異性啟動子的活力和特異性決定腫瘤靶向基因治療的效果和安全性[5]。很多實驗室已經通過組織特異性啟動子實現腫瘤靶向基因治療，如AFP是原發性肝癌的特異性標誌物，其表達受AFP啟動子調控，在腺病毒中插入該啟動子，可使病毒僅在表達AFP的肝癌細胞內增殖^。這類啟動子尚有前列腺癌PSA啟動子、黑色素瘤Tyr酶啟動子[7]、消化道腫瘤CEA啟動子，乳腺癌MUC1啟動子。1997年Rodriguez等^構建了以PSA啟動子調控腺病毒ElA區基因的增殖腺病毒CV706。實驗發現CV706對PSA陽性LNCaP細胞的殺傷能力比PSA陰性DU15細胞增強400倍。5xlSpfu的CV706注入小鼠LNCaP種植瘤內，2周後腫瘤體積明顯下降，同時PSA水平顯著下降，6周後，10隻鼠中有5隻腫瘤完全消失。但這些啟動子具有腫瘤類型局限性，只能在該種組織來源的腫瘤中起作用，使其應用受到限制[5]。為此人們開始寄希望於針對所有腫瘤特徵的啟動子，如hTERT啟動子[9'10'11]、Survivin啟動子[12]、環氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)啟動子[13]等。此類啟動子可以使外源基因在多種腫瘤中特異性的表達，體內外研究取得了肯定的治療效果，但是其活性較低，不能令人滿意[14]。因此尋找啟動能力更強、特異性更高的腫瘤啟動子意義重大。Ki67蛋白是一種與腫瘤細胞增殖相關的核抗原，1983年被Gerdes""發現後，經多家研究證實其與腫瘤細胞增殖密切相關。幾乎所有的腫瘤細胞都表達Ki67蛋白，而正常組織和細胞不表達。Ki67在腫瘤組織中表達越高，預後越差。復發和進展期腫瘤Ki67表達高於原發性腫瘤[16。Ki67蛋白已成為臨床判斷腫瘤惡性度及預後最常用的細胞增殖標誌。近年研究表明，Ki67基因是一細胞增殖基因，編碼分子量為345kD和395kD的腫瘤細胞增殖必需的DNA結合蛋白。Ki67蛋白在G1中晚期出現，經S、G2期在M期達到高峰，M期後即快速降解。Ki67蛋白磷酸化與染色體的濃縮及染色單體的分離有關[17]。越來越多的研究表明Ki67與腫瘤的形成密切相關，是調節細胞周期必不可少的組成部分。1991年Ki67基因被定位在10號染色體[18]，但由於其初級結構獨特，在生物資料庫中尚未發現與之同源的序列[19]，也使其生物功能至今仍不清楚，對於Ki67基因功能以及基因表達調控機制等方面的研究甚少。啟動子是基因組中最重要的調控元件，基因表達調控主要發生在轉錄水平調控，而啟動子決定著轉錄的起始和轉錄的頻率，是闡明基因轉錄調控機制和表達模式的關鍵。啟動子區域內存在諸多的順式作用元件，更能提供研究基因間相互作用、相互調節的線索。Ki67基因上遊轉錄表達調控機制尚不清楚，因此我們克隆並鑑定該基因啟動子，通過分析、鑑定維持該啟動子轉錄活性的必需區域及該區域內的潛在轉錄因子，篩選出該啟動子的核心啟動子。不僅有幫於我們認識Ki67基因表達調控，更為重要的是由於Ki67基因在幾乎所有的腫瘤細胞中都有很高的表達，該啟動子會為我們提供一種應用範圍極廣的腫瘤靶向基因治療工具
發明內容本發明的目的在於提供一種新型的腫瘤特異性Ki67啟動子的克隆，確定該啟動子核心功能區域的核苷酸序列，以及核心啟動子的核苷酸序列。為腫瘤的耙向基因治療提供一個新的調控元件，為腫瘤治療提供新的技術。本發明的技術方案如下通過逆轉錄PCR技術擴增出長度為1591bp含有人腫瘤細胞Ki67基因啟動子的Ki67基因5'側翼序列，該序列包括從轉錄起始位點上遊-820至轉錄起始位點下遊起始密碼子ATG之後的+771，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。該段GC含量高達61.47%，轉錄起始點前200bp範圍內的GC含量更高，達67.71%。並且在-195、-189、-167、-156起始位置存在潛在轉錄因子Spl—致性序列(CCCGCC)，在-53、-6、+3起始位置存在多個轉錄因子Spl—致性序列(GGGCGG)，-80起始位置存在一個CHR(cell-cyclegeneshomologyregion,細胞周期調控基因的同源區)一致性序列(ATTTGAA)，-48起始位置存在一個ZF5(humanzincfinger5protein,人類鋅指蛋白5)—致性序列(GGCGCG)，但沒有典型的TATA盒和CAAT盒。提示Ki67基因表達調控存在多種因素，從中找出關鍵轉錄調控區域或調控元件，對闡明Ki67基因表達調控具有重要意義。為尋找Ki67基因啟動子的關鍵轉錄調控區域，我們使用缺失分析法分別從Ki67基因5'側翼的5'端逐段缺失，得到9個不同長度的截短片段，利用雙螢光素酶報告基因檢測系統鑑定截短片段在Hela細胞、BIU-87細胞、Ketr-3細胞、A549細胞四種人腫瘤細胞和人臍靜脈內皮細胞株Huvec中的啟動子活性。結果顯示，-223+771截短片段活性最強。然後對-223~+771片段自3'端缺失，形成的截短片段表現出較缺失前更強的啟動子活性，-223—30片段的活性在Hela細胞、BIU-87細胞、Ketr-3細胞、A549細胞內分別為-223~+771片段活性的2.9倍、2.6倍、2.4倍、2.7倍。我們將長度為253bp，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，位於Ki67基因5'端上遊-223+30的片斷命名為Ki67核心啟動子(Ki67-promoter)。Ki67-promoter在Hela細胞、BIU-87細胞、Ketr-3細胞、A549細胞四種腫瘤細胞中的活性均較hTERT啟動子、Survivin啟動子的活性為強。本發明還提供了一種含有Ki67核心啟動子的載體，該載體能在Ki67基因陽性的腫瘤細胞中啟動螢光素酶基因的表達。本發明還提供了一種以Ki67核心啟動子取代腺病毒E1A啟動子調控的條件增殖型腺病毒穿梭質粒。本發明首次鑑定了人Ki67基因啟動子位於Ki67基因-820~+771位置，並鑑定出-223~+30區域為Ki67基因核心啟動子，證明其在多種腫瘤細胞中的強大活性及很高的腫瘤特異性。本發明不僅對研究人Ki67基因在腫瘤細胞中的表達調控機制具有重要意義，更為重要的是因其具有腫瘤特異性和高啟動子活性，這些Ki67基因啟動子片段是非常有用的腫瘤特異性啟動子。此類啟動子可以定向插入新的基因治療用載體，在其調控下，外源治療基因或病毒增殖相關基因(如腺病毒E1A或E1B)只在腫瘤細胞中定位表達，從而在腫瘤的靶向治療中具有較好的應用價值。本文下列實例僅是用作舉例說明，但應注意的是並不構成對本發明範圍的限制。本發明範圍內的其他方面、優點和改進對本發明所屬
技術領域：
的技術人員來說是顯而易見的。圖1Ki67基因5'側翼序列(-820~+771)正向測序報告；圖2Ki67基因5'側翼序列(-820-+771)反向測序報告；圖35'端啟動子區域截短片段示意圖43'端啟動子區域截短片段示意圖；圖5真核表達質粒構建流程圖6Ki67核心啟動子克隆載體pGLBK2+(-223+30)正向測序報告；圖7pGLBK800在各細胞系中相對螢光強度；圖8自5'端缺失的各重組載體在腫瘤細胞內的相對螢光強度；圖9自5'端缺失的各重組載體在正常細胞內的相對螢光強度；圖10自3'端缺失的各重組載體在腫瘤細胞內的相對螢光強度；圖11自3'端缺失的各重組載體在正常細胞內的相對螢光強度；圖12Ki67核心啟動子與hTERT、Survivin啟動子在腫瘤細胞的活性比較；圖13Ki67核心啟動子與hTERT、Survivin啟動子在正常細胞的活性比較；圖14Ki67核心啟動子取代腺病毒ElA啟動子的條件增殖型腺病毒穿梭質粒的PCR鑑定示意圖。圖中A:Ki67啟動子片段M:D2000marker。具體實施例方式實施例l含有人Ki67基因啟動子的真核表達質粒的構建1.人Ki67基因5'側翼序列(-820+771)的克隆及序列鑑定在Genbank中查找Ki67基因轉錄起始點5'側翼序列，設計併合成擴增Ki67基因起始密碼子上遊1591大小片段的一對引物。在-820-805區域設計上遊引物，並引入XhoI酶切位點，在+758+771區域設計下遊引物，並引入ffindIII酶切位點。其中上遊引物命名為KU800，序列為5'-ttgtctcgagtttttctgtgcttttg-3'，下遊引物命名為KD1，序列為5'-tgtgaagctttcgaccccgctcct-3'。應用此對引物，以人腎癌Ketr-3細胞基因組DNA為模板，PCR擴增出約1.6kb的DNA片段，回收目的片段，XhoI/HindlII雙酶切後，與經同樣酶切的載體pGL3-Basic(購自美國Promega公司)連接，pGL3-Basic為螢火蟲螢光素酶報告基因前不含啟動子的表達載體。連接產物轉化大腸桿菌JM109，抗性篩選，測序。測序結果證明我們克隆出的Ki67基因5'側翼序列已定向克隆至pGL3-Basic載體螢火蟲螢光素酶報告基因上遊(測序圖譜見圖1、圖2)，該重組質粒命名為pGLBK800，核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，包含了長度為1591bp的Ki67基因5'側翼序列，包括從轉錄起始位點上遊-820至轉錄起始位點下遊起始密碼子ATG之後的+771的序列。該段序列GC含量高達61.47%，其特性為富含GC，無TATA盒和CAAT盒。2.Ki67基因啟動子核心功能區域克隆為了鑑定Ki67基因啟動子的核心功能區域，對Ki67基因5'側翼序列進行缺失分析，由PCR方法獲得啟動子區域截短片段，所用的上遊引物如表l所示，下遊引物為KD1:5'-tgtgaagctttcgaccccgctcct-3'。所有上遊引物均含XhoI酶切位點，下遊引物含HindIII酶切位點。上遊引物分別與下遊引物KD1組成一對引物，以質粒pGLBK800為模板進行PCR擴增，得到8段長度不同的片段。將這些片段分別與載體pGL3-Basic相連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109,進行抗性篩選及測序，即得到一系列真核表達質粒pGLBK600、pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200、pGLBK100、pGLBK50、pGLBK10、pGLBKN。自5'端逐段缺失所成的截短片段示意圖見圖3。表1自5'端對Ki67基因5'側翼行PCR逐段缺失所用上遊引物tableseeoriginaldocumentpage83.Ki67基因核心啟動子片段克隆Ki67基因啟動子核心功能區域在轉錄起始點和翻譯起始點之間(+l~+772)存在著700多個鹼基，即5'非翻譯區(5'-UTR)。通常情況下，長的5'-UTR對翻譯起始有阻礙作用[2]。為進一步檢測該部分對Ki67基因啟動子活性的影響，將pGLBK200質粒中的Ki67基因啟動子片段自3'端逐段缺失翻譯起始點至轉錄起始點間的鹼基，構建三個重組載體pGLBK2-、pGLBK2+0、pGLBK2+。質粒構建上遊引物KU200含XhoI酶切位點，序列為5'-ttgtctcgagatgcgtgagtggctcgcc-3'。下遊引物含HindIII酶切位點，序列見表2。具體方法同5'端逐段缺失載體的構建，其示意圖見圖4。以上所有真核表達質粒的構建流程圖見圖5。表2自3'端對Ki67基因啟動子核心功能區域行PCR缺失所用下遊引物引物名稱_引物序列_引物位置擴增長度KD25'-tgtgaagcttgtcagccctccactt-3'-26-12212bpKD35'-tgtgaagcttccgcccgcagcgtcagccc-3'國19-1223bpKD45'-tgtgaagcttccaccgagtcgagtcct-3'+14+30253bp實施例2細胞培養、質粒轉染和人Ki67基因啟動子活性分析各實驗質粒(Ki67啟動子片段的真核表達質粒)構建成功後，用PureYieldPlasmidMidiprepSystem試劑盒進行質粒中量提取，同時提取陽性對照質粒pGL3-Contro1(含SV40啟動子/增強子)、陰性對照質粒pGL3-Basic(不含SV40啟動子/增強子)以及內參照質粒pRL-TK(HSV-TK啟動子控制下表達海腎素螢光素酶)。實驗質粒、對照質粒分別稀釋至100ng/]al，內參照質粒pRL-TK稀釋至20一1。本發明將各實驗質粒、對照質粒分別轉染人宮頸癌細胞(Hela)、膀胱癌細胞(BIU-87)、腎癌細胞(Ketr-3)、肺癌細胞(A549)及人臍靜脈內皮細胞(Huvec)，檢測其啟動子活性。轉染方法如下①脂質體準備將脂質體(TmnfastReageat)加入400plNuclease-FreeWater,稀釋至l照4tl，劇烈振蕩10秒鐘，37。C水浴中完全溶解，-3(TC過夜；②質粒準備將各實驗質粒、或陽性對照質粒pGL3-Basic、或陰性對照質粒pGL3-Control與phRL-TK內參照質粒按50:1濃度混合(0.5pg:10ng);③脂質體質粒混合5nl混合質粒，用無血清無雙抗培養基稀釋後加入3pl脂質體，終體積為200^1。室溫孵育10分鐘；④細胞轉染24孔板內每孔放置1X1S個細胞，在含10%FCS的培養基中常規培養24h;移除培養基，使用無血清無雙抗培養基洗滌1遍，每孔加入200W質粒脂質體混合液，37'C下孵育1小時；⑤每孔加入含10%FCS無雙抗培養基800^1，繼續培養48小時，收穫細胞，進行雙螢光素酶活性分析。每組樣品4復孔，進行2次重複實驗。雙螢光素酶報告基因檢測採用美國Promega公司生產的Dual-LuciferaseReporterAssaySystem試劑盒分析。將轉染質粒的貼壁細胞用1XPBS洗滌一次，去盡殘液，加入100^1新鮮配置的PLB，室溫下振蕩15min以裂解細胞。將細胞裂解液移至1.5mlEP管中，室溫下13000xg離心lmin，留取上清。取20^1上清加入含10(HilLARlI溶液的1.5ml離心管中，測定螢火蟲螢光素酶活性，再向同一離心管中加入lOOpl新鮮配製的STOP液，測定海腎螢光素酶活性(內參照)，計算出兩種螢光素酶活性的比值，即相對螢光素酶活性。相對螢光素酶活性代表啟動子的轉錄活性。Ki67基因5'側翼序列啟動子轉錄活性分析Ki67基因5'側翼序列的真核表達質粒pGLBK800的轉錄活性在Hela細胞、BIU-87細胞、Ketr-3細胞、A549細胞四種人腫瘤細胞內分別達到SV40啟動子/增強子活性的21.0%、31.1%、23.9%禾卩7.2%;在人Huvec細胞沒有表現出明顯活性(表3、圖7)。說明我們克隆出的Ki67基因5'側翼序列包含Ki67基因啟動子，且具有較高的啟動子活性和腫瘤特異性。表3Ki67基因5'側翼序列在不同細胞中的相對螢光素酶活性_相對螢光素酶活性_細胞pGL3-BasicpGLBK800pGL3-ControlBIU873.4±0.6131.2±20.1(31.1%)b421.8±139.9Hela0.8±0.1105.6±12.6(21.0o/o)b502.5±148.5Kert32.6±0.489.0±16.3(23.9%)b371.9±159.3A5490.5±0.216.3±8.1(7.2%)b225.9±54.4Huvsc1.0±0.40.7±0.2(0.5%)b141.6±17.2與pGL3-Control質粒相對螢光素酶活性的比值Ki67基因啟動子核心功能區域截短片段轉錄活性分析我們檢測了pGLBK800、pGLBK600、pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200、pGLBK100、pGLBK50、pGLBK10和pGLBKN9個重組載體在四種不同來源的人腫瘤細胞和一種人正常細胞中的啟動子活性，對Ki67基因啟動子核心功能區域的轉錄活性進行研究。在所有腫瘤細胞中均表現出以下趨勢pGLBK800、pGLBK600、pGLBK400的啟動子活性逐漸增強，說明這一段含有沉默子序列；pGLBK400、pGLBK300、pGLBK200的活性變化不大，均處於峰值，其中pGLBK200活性最高，在腫瘤BIU87細胞、Ketr3細胞、Hela細胞和A549細胞中，pGLBK200活性分別達到SV40啟動子/增強子活性的58.0。/。、44.1%、22.7%和13.2%，說明在這一段沒有明顯影響轉錄活性的調控元件；自pGLBK200縮短到pGLBK50時，轉錄活性顯著下降，表明在這一區段存在重要的轉錄調控元件；pGLBK10、pGLBKN不表現啟動子活性。在正常細胞中所有重組載體均無啟動子活性，顯示出Ki67啟動子良好的腫瘤特異性(表4，圖8，9)。表4Ki67啟動子核心功能區域片段在各細胞中的相對螢光素酶活性相對螢光素酶活性tableseeoriginaldocumentpage11pGLBK105.1±1.23.5±0.410.2±1.82.3±0.60.8±0.1(1.2%)b(0.7%)b(2.7%)b(1.0%)b(0.6%)bpGLBKN4.2±0.83.2±0.48.9±1.22.0±0.50.3±0.1(1.0%)b(0.6%)b(2.4%)b(0.9%)b(0.2%)bb與pGL3-Control質粒相對螢光素酶活性的比值.Ki67基因核心啟動子轉錄活性分析為檢測Ki67啟動子轉錄起始點至翻譯起始點間調控元件對啟動子活性的影響，我們自3'端逐段缺失翻譯起始點至轉錄起始點間的鹼基，構建了三個重組載體pGLBK2+、pGLBK2+0、pGLBK2-，並檢測在四種不同來源的人腫瘤細胞和一種人正常細胞中的啟動子活性。結果顯示，在所有的腫瘤細胞中三個重組載體啟動子活性均較截短片段pGLBK200有很大程度的提高；而在正常細胞中與pGLBK200—樣轉錄活性均較低。由於pGLBK2十(測序圖譜見圖6)質粒包含了完整的轉錄起始點，因此我們把-223+30位置序列確定為Ki67基因核心啟動子，命名為Ki67-promoter(見表5、圖10、11)。表5Ki67基因核心啟動子片段在各細胞中的相對螢光素酶活性tableseeoriginaldocumentpage12b與pGL3-Control質粒相對螢光素酶活性的比值實施例3Ki67-promoter、hTERT啟動子、Survivin啟動子活性比較為進一步驗證Ki67-promoter轉錄活性的大小，我們將其與目前研究較多的兩種腫瘤特異性啟動子hTERT、Survivin啟動子相比較。實驗方法及步驟同實施例2。結果顯示，在所有腫瘤細胞中，Ki67-promoter的活性均比hTERT和Survivin啟動子的活性強，在正常細胞中，三種啟動子均無活性(見表6、圖12、13)。Ki67-promoter顯示出更好的啟動子活性。表6tableseeoriginaldocumentpage13b與pGL3-Con加l質粒相對螢光素酶活性的比值實施例4Ki67啟動子調控的條件增殖型腺病毒穿梭質粒的構建腫瘤基因治療至今沒有突破的最主要原因是目前所用病毒載體存在兩大缺陷(1)無增殖能力，導致抗癌基因表達不足。(2)無靶向性，導致抗癌基因不能靶向進入腫瘤細胞。近年來條件增殖型腺病毒(Conditionallyreplicativeadenovirus,CRAds)治療腫瘤研究取得重大進展。CRAds是指只在腫瘤細胞內增殖並將其裂解，而對正常細胞無影響的腺病毒。利用腫瘤特異性啟動子控制病毒複製的必需基因具有特異性強、安全性高和易操作等優點而成為CRAds構建最常用的一種方法。腺病毒感染細胞首先表達E1A基因然後才能複製。因此利用腫瘤特異啟動子控制EIA基因的表達，就能控制病毒只在具有該啟動子活性的腫瘤細胞內增殖，同時其選擇性增殖能力可使治療基因在腫瘤細胞內大量擴增，從而顯著增強殺傷腫瘤作用。Ki67啟動子在不同組織來源的腫瘤細胞中活性都很高，而在正常細胞中幾乎沒有活性，因此它可以用於提高基因、病毒治療的安全性和有效性。Ki67-promoter活性強、長度短，適用於病毒載體基因表達的特異性調控。我們將Ki67-promoter插入腺病毒複製必需基因E1A前面，構建Ki67-promoter調控的條件增殖型腺病毒。為了能夠方便的將該啟動子插入包裝病毒用穿梭質粒載體中，我們通過設計引物引入合適的酶切位點，上遊引物序列為5'-ttgtctcgagatgcgtgagtggctcgcc-3'，包含Xhol酶切位點。下遊引物序列為5'-tgtgtacgtaccaccgagtcgagtcctcc-3'，包含SnaBI酶切位點。利用此對引物以pGLBK2+為模板，PCR拉出Ki67-promoter，將該片段純化、酶切後克隆進經XhoI/SnaBI酶切過的pZXC2質粒(E1A啟動子被缺失)，命名為pZKi67。平板初步篩選鑑定具有該重組子的菌落，小量培養後，PCR鑑定並送測序。PCR電泳結果可見一大小為273bp的清晰條帶(圖14)，測序結果證明Ki67-promoter已定向克隆至pZXC2質粒中。若將pZKi67質粒與含有腺病毒右臂的質粒pBHGE3同源重組，即可包裝成條件增殖型腺病毒。權利要求1.一種人腫瘤特異性Ki67基因啟動子，其核苷酸序列選自下組(1)SEQIDNO1所示的核苷酸序列，或(2)SEQIDNO1所示的核苷酸序列的互補序列，或(3)SEQIDNO1所示的核苷酸序列中任一部分，或發生一處或多處缺失突變或替換突變，並具有與所述的鹼基序列相似的啟動子功能的等價物，即相似的腫瘤特異性和相似程度的啟動子活性；其核心啟動子存在於SEQIDNO2所示的核苷酸序列中。2.根據權利要求1所述的人腫瘤特異性Ki67基因啟動子，其特徵在於SEQIDNO:l所示的核苷酸序列中含有至少一個控制Ki67基因表達的調控元件。3.權利要求1中的腫瘤特異性Ki67基因啟動子的用途，其通過控制治療基因表達，用於腫瘤基因治療與預防復發。4.根據權利要求4所述的腫瘤特異性Ki67基因啟動子的用途，其特徵在於治療基因是血管抑制基因、腫瘤壞死因子基因、腫瘤自殺基因、促細胞凋亡基因、抑癌基因、細胞因子基因、反義核苷酸、或小幹擾RNA。5.權利要求l中的腫瘤特異性Ki67啟動子的用途，用於增殖病毒介導的腫瘤治療，利用權利要求l中的任一項腫瘤特異性Ki67啟動子調控病毒增殖相關基因如腺病毒E1A或E1B，使病毒僅在腫瘤細胞或組織中特異性的增殖並殺傷腫瘤。6.—種含有Ki67核心啟動子的載體，其特徵在於它含有權利要求1所述的腫瘤特異性Ki67啟動子。7.根據權利要求7所述的含有Ki67核心啟動子的載體，其特徵在於，它含有所述的啟動子調控的外源基因。8.根據權利要求8所述的含有Ki67核心啟動子的載體，其特徵在於所述外源基因是報告基因。全文摘要本發明公開了人腫瘤細胞增殖抗原Ki67蛋白編碼基因的啟動子，具體包括該啟動子的克隆、序列、功能及其用途。本發明公布了位於Ki67基因5′側翼-820～+771位置，包含Ki67基因啟動子的1591bp的序列。使用缺失分析法分別從Ki67基因5′側翼的5′端和3′端逐段缺失，得到不同長度的DNA截短片段，這些片段被插入螢火蟲螢光素酶報告基因上遊，構建一系列表達質粒。將這些質粒轉染四種腫瘤細胞和正常細胞瞬時表達，確定了Ki67基因核心啟動子位於Ki67基因-223～+30。Ki67基因核心啟動子在腫瘤細胞內具有高轉錄活性和腫瘤特異性，是非常有用的腫瘤特異性啟動子。該啟動子可用於調控治療基因表達，或用於構建條件增殖病毒，從而實現選擇性殺傷腫瘤細胞，廣泛用於腫瘤靶向治療。文檔編號A61K48/00GK101319215SQ20081002229公開日2008年12月10日申請日期2008年7月1日優先權日2008年7月1日發明者劉曉昀,孫方浩,圓李,望李,裴冬生,鄭駿年,東韓申請人:鄭駿年