一種顆粒化高分子膜及製備方法和應用的製作方法

2023-07-15 23:55:06 2

專利名稱：一種顆粒化高分子膜及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種顆粒化高分子膜及製備方法，特別是涉及一種顆粒化高分子膜在組織工程領域中作為一種新的培養細胞的膜基質的運用。
背景技術：
在組織工程領域中，生物材料是組織工程化的最基本構架，是組織工程研究必不可少的物質基礎。研究表明，理想的生物材料應該具有以下特點:1)具有良好生物相容性；
2)良好的生物機械性能；3)合適的生物降解性；4)特殊的材料微觀結構。其中，材料特殊的微觀結構在整個組織過程中具有舉足輕重的地位，合理的特殊的材料微觀結構能有利於細胞的粘附和增殖，過於光滑或過於粗糙的表面都不利於細胞的粘附。大量的研究表明，未經處理的高分子膜片常為光滑的表面，在體外細胞培養中的意義不大。所以，在原本光滑的高分子膜表面進行加工使其變得粗糙並設計出特殊的形貌受到廣泛關注。現有的主要的加工方法如下:I)鹽析制孔法，將不能溶解在有機溶劑的鹽類顆粒(如氯化鈉等)與溶解的材料的有機相一起混合，待有機溶劑揮發後，將膜片放置在純水中，鹽類顆粒溶解後留下相同大小的孔狀結構。這種方法操作簡單，但製備時間過長，一般為1-2周。2)雷射蝕刻法，利用雷射蝕刻技術將高分子膜片光滑的表面蝕刻成設計好的微觀形貌。所製備的微觀形貌規則精確，但成本昂貴，不利於大規模生產。3)模具印壓法， 將有規則表面形貌的模具貼附在高分子膜片表面，在一定溫度下印壓出互補對應的微觀形貌，這種方法操作簡單，但難以控制，常出現紋印不均的現象。總體少說上述方法可歸結為「開鑿制孔」的方法，也就是在膜片的表面向內部「開鑿」出規則的凹形孔洞。這一大類方法都存在製備時間過長或成本昂貴的問題。所以需要一種製備時間更短，操作更簡單，成本更廉價的高分子膜表面加工的方法，代替或改良上述「開鑿制孔」的加工的方法。

發明內容
本發明公開一種新型顆粒化高分子膜作為一種新的有利於細胞粘附和增殖的生物材料基質，運用於醫學組織工程和臨床研究。本發明設想將高分子顆粒鑲嵌到光滑的高分子膜片表面，使膜的表面粗糙。顆粒化高分子膜所用的材料為生物可以吸收的，具有粗糙的表面形貌，表面鑲嵌著有粒徑大小相同的顆粒，顆粒的大小和顆粒間的距離可以調節，顆粒的大小為50nm-3 μ m，顆粒間的距離為100nm-25ym。其特殊的顆粒鑲嵌在高分子膜的結構，具有良好的生物相容性，有利於細胞的粘附和增殖。本發明提供一種顆粒化高分子膜，其特徵在於，所述顆粒化高分子膜由高分子顆粒和高分子膜兩部分組成，高分子顆粒鑲嵌到光滑的高分子膜片表面，具有了粗糙的表面形貌，有利於細胞的粘附和增殖；表面的顆粒大小為50nm-3 μ m，顆粒間的距離為100nm-25 μ m。所述高分子膜由聚乳酸、聚3-羥基丁酸酯、聚乳酸-乙醇酸中的一種或其組合製備，優先選擇聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸中的一種或其組合。所述的高分子顆粒由聚乳酸、聚3-羥基丁酸酯、聚乳酸-乙醇酸、聚己內酯，聚(乳酸-乙烯酸)中的一種或其組合製備，優先選擇聚乳酸、聚(乳酸-乙烯酸)、聚3-羥基丁酸酯中的一種或其組合。本發明提供一種顆粒化高分子膜的製備方法，其特徵在於包括以下步驟:(I)高分子顆粒的製備:材料溶於有機溶劑A中，冷凝回流使之完全溶解，形成有機相；穩定劑溶於水中，形成水相；有機相和水相二者混合，並經勻漿或超聲處理，形成乳化液；乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷；反覆離心和重懸洗去殘餘的聚乙烯醇，得到高分子顆粒的懸浮液；(2)高分子膜的製備:生物可降解高分子材料溶於有機溶劑B中，冷凝回流使之完全溶解，形成有機相；將上述有機相倒入乾淨的玻璃培養皿中，常溫揮發，再冷凍乾燥處理，得到高分子膜片；(3)顆粒鑲嵌於膜:將顆粒用純水稀釋，懸浮液均勻地塗抹在高分子膜片上；自然風乾，放入烘箱中加熱；自然冷卻至室溫，即可得到顆粒化高分子膜。步驟(I)所述穩定劑為聚乙二醇水溶液、聚乙烯醇水溶液中的一種或其組合，濃度為0.05-4.00g/100ml ;所述有機溶劑A為氯仿，二氯甲烷中的一種或其組合，材料在有機溶劑A中的濃度為2.5-15% (g/100ml);所述乳化液，其有機相和水相二者混合時的體積比為 1: 20 1: 40。步驟(I)所述勻漿處理為1000-1500轉/分鐘，工作總時間為1_3分鐘；所述超聲處理為100-400W，工作總時間為5-30分鐘。步驟(2)所述有機溶劑B為氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，1，4_ 二氧六環中的一種或其組合；材料在有機溶劑B中的濃度為0.2-5.0% (g/100ml)。步驟(2)所述烘箱的溫度為40_80°C，加熱處理的時間為5-60分鐘。本發明提供一種顆粒化高分子膜作為組織工程中一種細胞粘附和增殖的生物材料基質的應用。本發明所用的材料為生物可以吸收的，表面鑲嵌著有粒徑大小相同的顆粒，使其具有粗糙的表面形貌；其中顆粒的大小和顆粒間的距離可以調節以適應不同細胞的需求。將顆粒化膜與相同材料光滑的膜種植小鼠成纖維細胞L929和小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3進行生物學評估，發現其特殊的顆粒鑲嵌在高分子膜的結構表現出具有更好的生物相容性，有利於細胞的粘附和增殖。本發明 提供的顆粒化膜的製備工藝操作簡單，無需特殊的大型儀器，成本低廉，有利於在技術推廣。


圖1為本發明製備的生物可降解的顆粒化高分子膜的電子掃描電鏡照片。圖2為本發明製備的生物可降解的顆粒化高分子膜種植了細胞的電子掃描電鏡照片。
具體實施例方式實施例1:微米級聚乳酸顆粒的製備。稱取2g聚乳酸溶於20ml 二氯甲烷中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。稱取0.1g聚乙烯醇溶解於IOOOml水中，高溫溶解I小時至完全溶解，形成水相。取出上述有機相5ml和水相150ml置於乾燥的250ml型的燒杯中，隨後進行1000轉/分鐘勻漿處理I分鐘，形成乳化液。立刻將乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷。經粒徑分析儀檢測，所製備的顆粒為2.52 μ m的微米級的聚乳酸顆粒。實施例2:微米級聚3-羥基丁酸酯顆粒的製備。稱取3g聚3-羥基丁酸酯溶於20ml 二氯甲烷/氯仿(體積比為80: 20)中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。稱取30g聚乙烯醇溶解於IOOOml水中，高溫溶解I小時至完全溶解，形成水相。取出上述有機相5ml和水相IOOml置於乾燥的250ml型的燒杯中，隨後進行1500轉/分鐘勻漿處理3分鐘，形成乳化液。立刻將乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷。\經粒徑分析儀 檢測，所製備的顆粒的粒徑為2.98 μ m。實施例3:納米級的聚乳酸顆粒的製備。稱取Ig聚乳酸溶於20ml 二氯甲烷中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。稱取40g聚乙烯醇溶解於IOOOml水中，高溫溶解I小時至完全溶解，形成水相。取出上述有機相5ml和水相200ml置於乾燥的250ml型的燒杯中，隨後進行超聲(功率100W，工作總時間30分鐘)處理，形成乳化液。立刻將乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷。經粒徑分析儀檢測，所製備的顆粒的粒徑為880nm。實施例4:納米級的聚3-羥基丁酸酯顆粒的製備。稱取0.5g聚3-羥基丁酸酯溶於20ml氯仿中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。稱取38g聚乙烯醇和2g聚乙二醇的溶解於IOOOml水中，高溫溶解I小時至完全溶解，形成水相。取出上述有機相5ml和水相150ml置於乾燥的250ml型的燒杯中，隨後進行超聲(功率400W，工作總時間5分鐘)處理，形成乳化液。立刻將乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷。經粒徑分析儀檢測，所製備的顆粒的粒徑為420nm。實施例5:納米級的聚(乳酸-乙烯酸)顆粒的製備。
稱取Ig聚(乳酸-乙烯酸)溶於20ml 二氯甲烷中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。稱取35g聚乙烯醇和5g的聚乙二醇溶解於IOOOml水中，高溫溶解I小時至完全溶解，形成水相。取出上述有機相5ml和水相IOOml置於乾燥的250ml型的燒杯中，隨後進行超聲(功率150W，工作總時間15分鐘)處理，形成乳化液。立刻將乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷。經粒徑分析儀檢測，所製備的顆粒的粒徑為403nm。實施例6:納米級的聚己內酯顆粒的製備。稱取Ig聚己內酯溶於20ml 二氯甲烷中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。稱取20g聚乙烯醇溶解於IOOOml水中，高溫溶解I小時至完全溶解，形成水相。取出上述有機相5ml和水相IOOml置於乾燥的250ml型的燒杯中，隨後進行超聲(功率150W，工作總時間20分鐘)處理，形成乳化液。立刻將乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去
二氯甲烷。經粒徑分析儀檢測，所製備的顆粒的粒徑為211nm。實施例7:聚乳酸和聚乳酸-乙醇酸膜的製備。稱取Ig的聚乳酸分別溶於20ml、100ml和500ml的氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯/ 二氯甲烷(體積比為20: 80)的混合液、I，4-二氧六環/氯仿(體積比為5: 95)的混合液中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。將上述有機相倒入乾淨的玻璃培養皿中，20°C常溫揮發。48小時，將樣品進行冷凍乾燥處理，24小時後，均可得到光滑的的聚乳酸膜片。稱取Ig的聚乳酸-乙醇酸分別溶於20ml、50ml和IOOml的氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯/氯仿(體積比為10: 90)的混合液、I，4-二氧六環/氯仿(體積比為5: 95)的混合液中，高溫冷凝回流溶解I小時至完全溶解，形成有機相。將上述有機相倒入乾淨的玻璃培養皿中，20°C常溫揮發。48小時，將樣品進行冷凍乾燥處理，24小時後，均可得到光滑的聚乳酸-乙醇酸膜片。實施例8:將實施例7中所製備的聚乳酸膜片平鋪在乾淨的玻璃板上。將實施例2中製備的納米級的聚乳酸顆粒稀釋到0.5mg/ml的濃度，適度超聲後，均勻地塗抹在聚乳酸膜片上。自然風乾24小時，放入70°C烘箱中加熱20分鐘。取出後自然冷卻至室溫。即可得到顆粒化聞分子膜。通過掃描電子顯微鏡觀察並測量顆粒間的距離，統計1000個數據取平均值。顆粒化高分子膜為鑲嵌了平均粒徑為200nm的聚乳酸顆粒，聚乳酸顆粒之間的平均間距為4.67 μ m。實施例9:將實施例7中所製備的聚乳酸膜片平鋪在乾淨的玻璃板上。將實施例2中製備的納米級的聚乳酸顆粒稀釋到4mg/ml的 濃度，適度超聲後，均勻地塗抹在聚乳酸膜片上。自然風乾24小時，放入70°C烘箱中加熱20分鐘。取出後自然冷卻至室溫。即可得到顆粒化高分子膜。
通過掃描電子顯微鏡觀察並測量顆粒間的距離，統計1000個數據取平均值。顆粒化高分子膜為鑲嵌了平均粒徑為200nm的聚乳酸顆粒，聚乳酸顆粒之間的平均間距為0.67 μ m。實施例10:將實施例8中所製備的顆粒化高分子膜和實施例7中所製備的光滑的膜(對照組)用於細胞相關實驗。將顆粒化高分子膜分別剪成24孔板大小相當圓形。75%乙醇浸泡12小時滅菌，I倍的磷酸緩衝溶液溶液洗去殘餘的乙醇，細胞培養基浸泡6小時，每個孔中加入1.0X IO4個小鼠成纖維細胞L929。在37°C，5.0%二氧化碳細胞培養箱中分別培養I天，4天和7天。用CCK-8細胞活性試劑盒(天根，中國)進行細胞活性測試，在450nm波長的濾光片下的吸光值反應了細胞總活性，當吸光值越大，總活性越大；當吸光值越小，總活性越小，吸光值隨時間增長，說明細胞在增殖。結果如表I所示:表1.顆粒化高分子膜上種植的細胞活性測試(450nm的吸光值)
權利要求
1.一種顆粒化高分子膜，其特徵在於，所述顆粒化高分子膜由高分子顆粒和高分子膜兩部分組成，高分子顆粒鑲嵌到光滑的高分子膜片表面，具有了粗糙的表面形貌，有利於細胞的粘附和增殖；表面的顆粒大小為50nm-3 μ m,顆粒間的距離為100nm_25 μ m。
2.根據權利要求1所述一種顆粒化高分子膜，其特徵在於，所述高分子膜由聚乳酸、聚3-羥基丁酸酯、聚乳酸-乙醇酸中的一種或其組合製備，優先選擇聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸中的一種或其組合。
3.根據權利要求1所述一種顆粒化高分子膜，其特徵在於，所述的高分子顆粒由聚乳酸、聚3-羥基丁酸酯、聚乳酸-乙醇酸、聚己內酯，聚(乳酸-乙烯酸)中的一種或其組合製備，優先選擇聚乳酸、聚(乳酸-乙烯酸)、聚3-羥基丁酸酯中的一種或其組合。
4.根據權利要求1，或2，或3所述一種顆粒化高分子膜的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)高分子顆粒的製備: 材料溶於有機溶劑A中，冷凝回流使之完全溶解，形成有機相； 穩定劑溶於水中，形成水相； 有機相和水相二者混合，並經勻漿或超聲處理，形成乳化液； 乳化液倒入旋轉蒸發儀處理除去二氯甲烷； 反覆離心和重懸洗去殘餘的聚乙烯醇，得到高分子顆粒的懸浮液； (2)高分子膜的製備: 生物可降解高分子材料溶於有機溶劑B中，冷凝回流使之完全溶解，形成有機相； 將上述有機相倒入乾淨的玻璃培養皿中，常溫揮發，再冷凍乾燥處理，得到高分子膜片; (3)顆粒鑲嵌於膜: 將顆粒用純水稀釋，懸浮液均勻地塗抹在高分子膜片上； 自然風乾，放入烘箱中加熱； 自然冷卻至室溫，即可得到顆粒化高分子膜。
5.根據權利要求4所述一種顆粒化高分子膜的製備方法，其特徵在於，步驟(I)所述穩定劑為聚乙二醇水溶液、聚乙烯醇水溶液中的一種或其組合，濃度為0.05-4.00g/100ml ;所述有機溶劑A為氯仿，二氯甲烷中的一種或其組合，材料在有機溶劑A中的濃度為2.5-15%(g/100ml);所述乳化液，其有機相和水相二者混合時的體積比為1: 20 1: 40。
6.根據權利要求4所述一種顆粒化高分子膜的製備方法，其特徵在於，步驟(I)所述勻漿處理為1000-1500轉/分鐘，工作總時間為1-3分鐘；所述超聲處理為100-400W，工作總時間為5-30分鐘。
7.根據權利要求4所述一種顆粒化高分子膜的製備方法，其特徵在於，步驟(2)所述有機溶劑B為氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，1，4_ 二氧六環中的一種或其組合；材料在有機溶劑B中的濃度為 0.2-5.0% (g/100ml)。
8.根據權利要求4所述一種顆粒化高分子膜的製備方法，其特徵在於，步驟(2)所述烘箱的溫度為40-80°C，加熱處理的時間為5-60分鐘。
9.根據權利要求1所述一種顆粒化高分子膜作為組織工程中一種細胞粘附和增殖的生物材料基質的應用。
全文摘要
本發明涉及一種顆粒化高分子膜，其特徵在於，所述顆粒化高分子膜由高分子顆粒和高分子膜兩部分組成，高分子顆粒鑲嵌到光滑的高分子膜片表面，具有了粗糙的表面形貌，有利於細胞的粘附和增殖；表面的顆粒大小為50nm-3μm，顆粒間的距離為100nm-25μm。本發明還涉及該顆粒化高分子膜得製備方法。本工藝操作簡單，成本低廉，所製備的顆粒化高分子膜為生物可降解材料，表面可鑲嵌不同材料、不同大小、不同間距的納米顆粒或微米顆粒。用於組織工程中細胞的培養，和傳統光滑的高分子膜相比較，具有更好地生物相容性，有利於細胞的粘附和增殖。
文檔編號C08L67/04GK103239757SQ201110436868
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月7日 優先權日2012年2月7日
發明者魏岱旭, 鍾建, 閆志強, 何丹農 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司