一步法製備微流診斷晶片的方法
2023-07-15 19:46:16
專利名稱：一步法製備微流診斷晶片的方法
技術領域：
本發明涉及微流診斷晶片技術領域，具體地說涉及的是一種在晶片內表面定點固 定生物分子以製作微流診斷晶片的方法。
背景技術：
經過十幾年的發展，微流診斷晶片已經在生化分析領域得到了廣泛應用，其中微 量多元診斷晶片已成為未來臨床診斷中的一個新的發展方向。製作微流診斷晶片材料主要 有PDMS (聚二甲基矽氧烷，Polydimethylsiloxane)等高分子材料，其具有加工成型方便、 價格便宜，可以廉價的大批量生產的優點。
微流診斷晶片除了製作微管道結構用於反應，往往還需要將生物大分子固定 在管道內部，以便後續的捕獲、分離及抗原抗體(核酸雜交)等生物反應的進行。製作 過程通常分為兩個步驟，首先是高分子材料晶片的製作，然後是晶片表面的改性和生物 分子的固定。生物分子在高分子材料表面的有效固定是構建診斷晶片的核心步驟，目 前常用的方法主要是對高分子材料表面進行改性，賦予高分子材料的疏水表面以親水 性，進而有效固定特異抗體分子，較少非特異性吸附。經過對現有文獻進行檢索，2009 年 Peng Li 等在 Microfluid and Nanofluid 發表文章中(Peng Li, Assem AboImaaty, Christine D' Amore,etal,Development of an ultrafast quantitative heterogeneous immunoassay on pre—functionalized poly (dimethylsiloxane)microfluidic chips for the next-generation immunosensors) ^lJMS S A PDMS^t PDMS 流道內表面固定牛IgG,製備免疫反應晶片。而新加坡Ling Yu等人在文章中(Ling Yu, Chang Ming Li,Yingshuai Liu,etal,Flow-through functionalized PDMS microfluidic channels with dextran derivative for ELISAs. Lab Chip，2009，9，1243-1247)提出利 用葡聚糖修飾PDMS晶片表面，共價固定兔IgG抗體，製作檢測兔IgG的ELISA晶片。但上 述這些方法步驟多，成本高，製備速度慢，最大的問題是很難在晶片內特定的位置進行生 物分子的固定，極大限制了微流診斷晶片的廉價大批量生產。法國學者Kevin A. Heyries 等發表文章提出新的方法(Kevin A. Heyries, Celine A. Mandon, Laura Ceriotti, etal, "Macromolecules to PDMS transfer" as a general route for PDMS biochips. Biosensors and Bioelectronics 24 U009) 1146-1152)，在 iTeflon 3D 模具上點樣 CRP 等 生物分子，然後澆鑄PDMS，利用直接轉印法將CRP等生物分子的固定與PDMS反應池製作一 步法完成，大大簡化了生物分子在PDMS表面的固定困難。但上述方法中所得的固定有生物 分子的PDMS晶片為平面結構，而反應池是通過另外加工的基於SU-8的微管道晶片與其相 鍵合形成，這樣還需後續的管道結構加工，工序複雜，如果能將微流診斷晶片製作和生物大 分子固定一步完成，將極大簡化目前工藝流程，加快微流診斷晶片的製作過程，促進診斷芯 片早日走向市場。
因此，有必要開發一種新的在晶片內表面進行生物分子定點固化以便快速製作微 流診斷晶片的方法。發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中的不足，提供一種微流診斷晶片結構製作的方 法，尤其涉及一種一步法製備微流診斷晶片的方法。
本發明方法在保持高分子材料對模具圖形複製好、易脫模的優點同時，使蛋白抗 體等生物分子的特異地固定與晶片製作同時完成，從而快速製作微流診斷晶片。
本發明是通過以下技術方案實現的，首先製作微流診斷晶片的陽版模具，在模具 表面塗覆防粘塗層，例如Teflon層，再將蛋白抗體溶液噴點於晶片模具表面特定的位置， 隨後澆鑄PDMS，熱烘後脫模，與玻片鍵合，使微流診斷晶片製作與蛋白抗體固定同步完成， 大大縮短工藝流程所需時間。
本發明方法包括如下步驟
第一步，首先是製作陽版模具，可採用微機電加工中的矽深刻蝕技術製作矽模具， 或在基底片上旋塗光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；也可通過雷射加工、精機械加 工的方法製作金屬模具等。
第二步，在陽版模具表面均勻滴加Teflon溶液，甩塗機適當轉速進行甩塗。
第三步，表面甩塗Teflon的晶片模具進行熱烘，自然冷卻。
第四步，利用點樣儀在晶片特定位置噴點蛋白抗體溶液，形成陣列。
第五步，將PDMS的預聚體與固化劑混合，經超聲、攪拌、真空脫氣等步驟後澆鑄在 陽版模具上，適當溫度熱烘，自然冷卻。
第六步，PDMS晶片從模具上揭下來進行鍵合，經過表面封閉處理後就得到了已固 定蛋白抗體的微流控診斷晶片。
本發明和傳統的兩步法製備相比，具有成本低(無需複雜昂貴的表面修飾試劑)、 製備時間短(一步法完成，完全省略了固定蛋白抗體之前繁複的表面改性步驟)、蛋白抗體 固定效果好、非特異性吸附小、可即做即用的優點，因此具有廣泛的應用前景。
圖1本發明的工藝路線示意圖，其中顯示了根據本發明的方法製作的微流控晶片 在各個步驟中的剖面結構。
圖2為實施例1中檢測人IgG的螢光顯微鏡圖片。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明方法的具體實施例作詳細說明。
圖1的示意圖顯示了根據本發明的方法製作的微流控晶片在各個步驟中的剖面 結構。如圖1所示，根據本發明的方法主要包括如下步驟
第一步，首先是製作陽版模具，可採用微機電加工中的矽深刻蝕技術製作矽模具， 或在基底片上旋塗光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；也可通過雷射加工、精機械加 工的方法製作金屬模具等。
第二步，在陽版模具表面均勻滴加Teflon溶液，甩塗機適當轉速進行甩塗。
第三步，表面甩塗Teflon的晶片模具進行熱烘，自然冷卻。
第四步，利用點樣儀在晶片特定位置噴點蛋白抗體溶液，形成陣列。
第五步，將PDMS的預聚體與固化劑混合，經超聲、攪拌、真空脫氣等步驟後澆鑄在 陽版模具上，適當溫度熱烘，自然冷卻。
第六步，PDMS晶片從模具上揭下來進行鍵合，經過表面封閉處理後就得到了已固 定蛋白抗體的微流診斷晶片。
實施例1 一步法製備人IgG微流診斷晶片
(1)光刻膠模板的製備
首先採用SU-8-100型負性光刻膠(美國Micro Chem公司)，以2500r/min的轉 速在單面拋光的矽片上甩膠，獲得厚度為80 μ m的光刻膠。前烘條件為IOmin從室溫升至 65°C，保溫lOmin，然後30min升至95°C，並保溫35min，隨爐冷。曝光採用德國Karl Suss 公司MA6型光刻機，曝光時間為60s。後烘條件為30min從室溫升至90°C，並保溫lOmin，隨 爐冷。採用Micro Chem公司專用的SU-8顯影液，顯影時間為6min，顯影后用異丙醇清洗， 氮氣吹乾，即獲得所需的光刻膠模板。
(2)模板表面Teflon處理
把光刻膠模板置於甩塗機上(美國Micro Chem公司)，均勻滴加Teflon溶液， 200rpm 預轉 10s, 500rpm 轉 30s。
(3) 1Tef Ion 處理後熱烘
把Teflon處理後的光刻膠模板置於烘箱內，180°C熱烘2小時，自然冷卻。
(4)蛋白抗體的噴點
兔抗人IgG抗體用PBS(IX)稀釋成lmg/ml，利用Biodot AD1500工作站進行蛋白 噴點，噴點陣列為3*3，間距0. 75mm,噴點量20nl。37°C適當乾燥。
(5) PDMS 澆鑄
PDMS前體與固化劑(牌號Sygard 184，美國道康寧公司的產品)按10 :1質量 比進行物理混合，充分攪拌，真空脫氣20min後澆鑄在陽版模具上，90°C熱烘20min，自然冷卻。
(6)PDMS晶片鍵合與封閉
將PDMS晶片從模具上揭下，與潔淨玻片加壓鍵合。在晶片內注入封閉液(IX PBS 含BSA，0. 1% Tween-20)，37°C溼盒內孵育20min，取出後用IX PBS適當衝洗就得到了 人IgG微流診斷晶片。
(7)夾心法檢測人IgG
將各濃度人IgG與螢光標記的山羊抗人IgG注入晶片，37°C溼盒內孵育20min， PBST (含Tween-200. 1% )衝洗15min，PBS衝洗5min後在螢光顯微鏡下進行定量檢測，結 果如圖2所示。
本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體 的操作過程，但本發明的保護範圍不限於上述的實施例。
權利要求
1.一種微流診斷晶片的製備方法，包含在晶片模具表面定點固定生物大分子的步驟， 其特徵在於，在所述定點固定步驟中，首先利用防粘塗料塗覆在晶片模具表面；再將生物大 分子溶液點樣於特定區域；然後澆鑄PDMS ；待PDMS澆注層固化後進行脫模，同時揭下所固 定的生物分子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中晶片模具採用微機電加工中的矽深 刻蝕技術製作矽模具，或在基底片上旋塗光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；或通過 雷射加工、精機械加工的方法製作金屬模具。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述防粘塗料為Teflon材料。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述生物大分子選自蛋白質、核酸、脂類、 糖類中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中經過防粘處理的晶片模具表面點樣 生物分子採用手工點樣，或機械點樣；所述點樣類型為接觸式點樣，半接觸式點樣或非接觸 點樣。
全文摘要
本發明涉及一種微流診斷晶片的製作方法，包含在晶片模具表面定點固定生物大分子的步驟，其特徵在於在所述定點固定步驟中，首先利用防粘塗料塗覆在晶片模具表面；再將生物大分子溶液點樣於特定區域；然後澆鑄PDMS；待PDMS澆注層固化後進行脫模，同時揭下所固定的生物分子。如此，通過一步法實現晶片製備與生物分子固定的同步完成，快速高效地縮短工藝流程所需時間，降低了製造微流診斷晶片的成本。
文檔編號G01N33/543GK102033126SQ20091019667
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月28日 優先權日2009年9月28日
發明者周崇治, 夏駿, 彭志海, 陳翔 申請人:上海交通大學附屬第一人民醫院