一種報春苣苔(PrimulinatabacumHance)組織培養繁殖及野外栽培方法
2023-08-04 14:48:06
專利名稱：一種報春苣苔(Primulina tabacum Hance)組織培養繁殖及野外栽培方法
技術領域：
本發明涉及一種對珍稀瀕危植物報春苣苔(戶"附"//朋to6ac"w Hance)的離體保存和繁育的 生物技術，具體地說，涉及一種對報春苣苔(屍n'ww""a to6ac"m Hance)的組織培養繁殖及野外 栽培方法。
技術背景報春苣苔CFW/m^"atok o/附Hance)為苦苣苔科多年生小型草本植物，自1881年美國人亨 利在粵北連州連江流域的石壁上發現了報春苣苔這一珍稀植物後，它又神秘消失了 120年。 直到幾年前，國內有關媒體報導了在連州又發現了報春苣苔這一國家第一批一級瀕危保護植物。它的發現對研究嶺南古氣候、土壤和動植物演變無疑具有重大的學術價值。運用植物組 織培養技術開展植物的保護和繁殖在很多植物種上已獲得成功。根據不同類型的植物在離體 培養所需要的培養條件及方法等方面存在很大的不同，而報春苣苔作為中國第一批重點一級 保護的珍稀瀕危保護植物，由於該物種生存環境要求特殊、地理分布狹小、種群數量很少。 目前運用植物生物技術繁殖和栽培報春苣苔，保護和利用這種珍稀瀕危植物，國內外均未見 報導。 發明內容為保護報春苣苔(屍〃> "//""to6flcww Hance)這種珍稀瀕危植物，申請人開展了該植物組織 培養的研究工作，成功地誘導了體細胞胚胎發生和不定芽的形成，以此建立了有效的繁殖體 系和植株再生體系，並結合恢復生態原理實現了報春苣苔在原生地的種植存活，從而提出了 本發明。本發明的目的是提出一種報春苣苔(iV/m"""a to6"c"w Hance)組織培養繁殖及野外栽培 方法。本發明所提出的報春苣苔(戶n'mw/^a toZ^cwn Hance)組織培養繁殖及野外栽培方法，其技術方案如下以野外採集的報春苣苔植株葉片作為外植體，按以下步驟進行培養繁殖和栽培(l)誘導培養步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養基培養，誘導報春苣苔 葉片外植體體細胞胚胎發生或/和不定芽的形成，在20 3(TC下，於黑暗培養或每天於1 20 pmolm—2s—H光照射12 14小時，培養50 70天，在外植體能夠誘導形成體細胞胚或不定 芽後，繼續培養20-30天，所述的誘導培養基以MS基本培養基，附加鈣220 440 mgL"， 蔗糖20 30g1/1， pH值6.5 7.5為基礎，另配加有NAA0.5 1.0 mgU1 +TDZ 0.5 1.0 mg L—1，或BAP0.5 1.0mgU1 +TDZ 0.2 1.0 mg L—1 ，或BAP 0.5 1.0 mg L-1 +NAA0.5
l.Omgi;1。其中NAA0.5 1.0mg1/1 +TDZ 0.5 1.0 mg U1可誘導體細胞胚胎發生；BAP 0.5 1.0 mg L" +NAA 0.5 1.0 mg L"可誘導不定芽的形成；BAP 0.5 1.0 mg L" +TDZ 0.2 1.0 mg L'1則可同時誘導體細胞胚和不定芽的形成。平均每個外植體能夠誘導80 90個 左右的體細胞胚或不定芽。(2) 叢芽繁殖步驟將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養基上培養，條件為在20 3(TC 下，每天光照20 50pmolnT、^14小時， 一個月至一個半月繼代一次，繁殖頻率可達5 8， 所述的繁殖培養基以MS基本培養基，附加鈣220 440 mg L—1，蔗糖20 30 g L—1， pH值6.5 7.5為基礎，另配加有BAP0.5 1.0mgL"+NAA0.1 0.5mgL";(3) 生根培養步驟將叢芽分切轉入到生根培養基上光照培養誘導生根，成為試管苗， 條件為20 3(TC，每天光照20 50nmolm—23_114小時，生根培養基以MS基本培養基，附 加鈣220 440mgU1，蔗糖20 30gU1， pH值6.5 7.5為基礎，另配加有IBA0.2 1.0 mg U1或/和0.2%活性碳，試管苗在該培養基上培養1個月後進行移栽；(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置於溼潤、遮蔭的環境下培養，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=(1 2) : (2 4) : (1 2)的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗後的試管苗種植於石灰巖洞口環境，與伴生種苔蘚一同種植。在上述的誘導培養步驟中，所述的誘導培養基的優選配方為以MS基本培養基，附加鈣440mgL"，蔗糖20 30gL"，pH值6.5 7.0為基礎，另配加有NAA0.5 mg L" +TDZ 1.0 mgL-1，或BAP0.5mgL-1 +TDZ0.2mgU1 ，或BAP1.0mgU1 +NAA0.5 mg L";。在上述的叢芽繁殖步驟中，所述的繁殖培養基的優選配方為以MS基本培養基，附加,丐440mgU1,蔗糖20 30gL"， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有BAP 1.0 mg L"+NAA0.1 mgL.1。在上述的生根培養步驟中，所述的生根培養基的優先配方為以MS基本培養基，附加鈣440 mg L"，蔗糖20 30 g L"， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L"或/和0.2%活性碳。在上述的移栽步驟中，試管苗所移栽的沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 : 2 : i的 比例配置為佳。本發明通過提供一系列合適的配方和培養條件，包括從誘導、繁殖、生根、移栽等系列 基本過程的配方，使報春苣苔能夠實現其有效繁殖的目的。結合生態恢復原理將試管苗在發 現報春苣苔的當地種植，實現報春苣苔在原生地的種植成活和生態恢復。a)誘導培養階段通過調節生長調節劑配方，可有目的地誘導報春苣苔葉片外植體體細胞
胚胎發生或不定芽的形成； b)叢芽繁殖階段將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養基上能夠建立叢芽繁殖體系，篩選最適培養基，以獲得較高的增殖頻率； C)生根階段將叢芽分切轉入到所篩選的最適生根培養基上光照培養誘導生根，試管苗在該培養基上培養1個月內均能夠生根；d) 移栽階段將長根的試管苗移栽到室外，利用石灰石、蛭石以及沙石的基質並附加置於 溼潤、遮蔭的環境下培養，產生適應報春苣苔喜歡高鈣和高pH值的生長環境，保證了 試管苗有較高的移栽成活率，其移栽成活率達到85 90%;e) 野外移栽試驗利用恢復生態學物種回歸原理，再造恢復生境，提高成活率；通過該項 目的運用，總成活率高達80%以上，能夠使這一國家一級瀕危植物得以保存和發展，利 於石灰巖地區洞口的植被恢復，為今後更進一步利用該物種奠定良好的基礎。
具體實施方式
實施例一以從連州地下河景區採集的報春苣苔葉片作為外植體，進行報春苣苔(屍r/mw/z7^ toZ^a^ Hance)組織培養繁殖及野外栽培，具體步驟如下(1) 誘導培養步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養基培養，誘導報春苣苔 葉片外植體體細胞胚胎發生和不定芽的形成，誘導培養基以MS基本培養基，附加鈣440mg L"，蔗糖30 g L"， pH值7.0為基礎，另配加有BAP 0.5 mg L" +TDZ 0.2mg L"，培養條件 20 30°C，每天於lOnmolm—2s—^i光照射14小時，培養60天，在外植體能夠誘導形成體 細胞胚和不定芽後，繼續培養30天。平均每個外植體能夠誘導80 90個左右的體細胞胚或 不定芽。(2) 叢芽繁殖步驟將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養基上培養，條件為在20 30'C 下，每天光照30^imolnT25—'14小時， 一個月繼代一次，所述的繁殖培養基以MS基本培養 基，附加鈣440 mg U1，蔗糖30 g L"， pH值6.5為基礎，另配加有BAP 1.0 mg L"+ NAAO.lmg(3) 生根培養步驟將叢芽分切轉入到生根培養基上光照培養誘導生根，成為試管苗，條件為20 30'C，每天光照50nmolnT、^14小時，生根培養基以MS基本培養基，附加鈣 440mgl/1，蔗糖20gL'1， pH值6.5為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L"和0.2%活性碳。試管 苗在該培養基上培養1個月後進行移栽；(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置於溼潤、遮蔭的環境下培養，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 :2:i的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗後的試管苗種植於石灰巖洞口環境，與伴生種苔蘚一同種植。
實施例二以從連州地下河景區採集的報春苣苔葉片作為外植體，進行報春苣苔(/>^"//"" Hance)組織培養繁殖及野外栽培，具體步驟如下(1) 誘導培養步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養基培養，誘導報春苣苔 葉片外植體體細胞胚胎發生，誘導培養基以MS基本培養基，附加鈣400 mg L"，蔗糖30 g U1， pH值6.5為基礎，另配加有NAA0.5mgL" +TDZ 1.0 mg U1，培養條件20 30°C，每天 於5pmolm—2s—'弱光照射14小時，培養60天，在外植體能夠誘導形成體細胞胚後，繼續培 養30天。(2) 叢芽繁殖步驟將體細胞胚轉入到繁殖培養基上培養，條件為在20 3(TC下，每 天光照20pmolm—2s—h4小時， 一個月繼代一次，所述的繁殖培養基以MS基本培養基，附 加鈣400mg1/1，蔗糖30gl/1， pH值7.0為基礎，另配加有BAP 1.0mgL"+NAA0.1mgL";(3) 生根培養步驟將叢芽分切轉入到生根培養基上光照培養誘導生根，成為試管苗， 條件為20 30'C，每天光照50pmolm—、^14小時，生根培養基以MS基本培養基，附加鈣 440mgL'1，蔗糖20gL"， pH值7.0為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L"。試管苗在該培養基上 培養l個月後進行移栽；(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置於溼潤、遮蔭的環境下培養，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 :2:i的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗後的試管苗種植於石灰巖洞口環境，與伴生種苔蘚一同種植。 實施例三以從連州地下河景區採集的報春苣苔葉片作為外植體，進行報春苣苔(iVfm"/z'"a to6flc"m Hance)組織培養繁殖及野外栽培，具體步驟如下(1) 誘導培養步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養基培養，誘導培養基以 MS基本培養基，附加鈣300mgU1，蔗糖30gL'1， pH值7.0為基礎，另配加有BAP1.0mg I/1 +NAA0.5mgL-'，培養條件20 30°C，每天於10 p mol nT2 s—1弱光照射14小時，誘 導報春苣苔葉片外植體不定芽的形成，培養60天，在外植體能夠誘導形成不定芽後，繼續培 養30天。(2) 叢芽繁殖步驟將不定芽轉入到繁殖培養基上培養，條件為在20 3(TC下，每天 光照30pmolnT23—44小時， 一個月繼代一次，所述的繁殖培養基以MS基本培養基，附加 鈣440mgL"，蔗糖30g!/1， pH值7.0為基礎，另酉己加有BAP 1.0 mg L"+NAA0.1 mg L";(3) 生根培養步驟將叢芽分切轉入到生根培養基上光照培養誘導生根，成為試管苗， 條件為20 3(TC，每天光照50pmolm-、—!14小時，生根培養基以MS基本培養基，附加鈣 440 mgL'1，蔗糖30gL'1, pH值7.0為基礎，另配加有0.2%活性碳。試管苗在該培養基上培 養l個月後進行移栽；
(4) 移栽步驟將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置於溼潤、遮蔭的環境下培養，沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 :3:i的比例配置；(5) 野外移栽步驟將經上述沙盆中壯苗後的試管苗種植於石灰巖洞口環境，與伴生種苔蘚一同種植。
權利要求
1.一種報春苣苔(Primulina tabacum Hance)組織培養繁殖及野外栽培方法，其特徵在於以野外採集的報春苣苔植株葉片作為外植體，按以下步驟進行培養繁殖和栽培(1)誘導培養步驟將報春苣苔植株葉片外植體接插到誘導培養基培養，誘導報春苣苔葉片外植體體細胞胚胎發生或/和不定芽的形成，在20～30℃下，於黑暗培養或每天於1～20μmolm-2 s-1弱光照射12～14小時，培養50～70天，在外植體能夠誘導形成體細胞胚或不定芽後，繼續培養20-30天，所述的誘導培養基以MS基本培養基，附加鈣220～440mg L-1，蔗糖20～30 g L-1，pH值6.5～7.5為基礎，另配加有NAA 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.5～1.0mgL-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+TDZ 0.2～1.0mg L-1，或BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.5～1.0mg L-1；(2)叢芽繁殖步驟將體細胞胚或不定芽轉入到繁殖培養基上培養，條件為在20～30℃下，每天光照20～50μmol m-2 s-114小時，一個月至一個半月繼代一次，所述的繁殖培養基以MS基本培養基，附加鈣220～440mg L-1，蔗糖20～30g L-1，pH值6.5～7.5為基礎，另配加有BAP 0.5～1.0mg L-1+NAA 0.1～0.5mg L-1；(3)生根階段將叢芽分切轉入到生根培養基上光照培養誘導生根，成為試管苗，條件為20～30℃，每天光照20～50μmol m-2 s-114小時，生根培養基以MS基本培養基，附加鈣220～440mg L-1，蔗糖20g L-1，pH值6.5～7.5為基礎，另配加有IBA 0.2～1.0mg L-1和/或0.2％活性碳，試管苗在該培養基上培養1個月後進行移栽；(4)移栽階段將長根的試管苗移栽到移植到沙盆的基質中，放置於溼潤、遮蔭的環境下培養，沙盆中的基質按石灰石∶蛭石∶沙石＝(1～2)∶(2～4)∶(1～2)的比例配置；(5)野外移栽階段將經上述沙盆中壯苗後的試管苗種植於石灰巖洞口環境，與伴生種苔蘚一同種植。
2. 根據權利要求1所述的報春苣苔(屍〃'》^//冊to6ac"m Hance)組織培養繁殖及野外栽培 方法，其特徵在於所述的誘導培養基以MS基本培養基，附加鈣440 mg L—1，蔗糖20 30 g L—1, pH值6.5 7.0為基礎，另配加有NAA0.5mg1/1 +TDZ 1.0 mg L"，或BAP 0.5 mg L" +TDZ 0.2mgl/1，或BAP1.0mg1/1 +NAA 0.5 mg I/1 。
3. 根據權利要求1所述的報春苣苔CPn7m^'"fl to6acwm Hance)組織培養繁殖及野外栽培 方法，其特徵在於所述的繁殖培養基以MS基本培養基，附加鈣440 mg L'1，蔗糖20 30 g L—1 ， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有BAP 1.0 mg L"+NAA0.1 mg L—1 。
4. 根據權利要求1所述的報春苣苔(iV/mw/Z朋to6acwm Hance)組織培養繁殖及野外栽培 方法，其特徵在於所述的生根培養基以MS基本培養基，附加鈣440 mg L—1，蔗糖20 30 g L—1， pH值6.5 7.0為基礎，另配加有IBA 1.0 mg L—1和/或0.2%活性碳。
5. 根據權利要求1所述的報春苣苔(iV^w/i朋to6aow2 Hance)組織培養繁殖及野外栽培 方法，其特徵在於在移栽階段，試管苗所移栽的沙盆中的基質按石灰石蛭石沙石=1 : 2 : l的比例配置。
全文摘要
一種報春苣苔(Primulina tabacum Hance)組織培養繁殖及野外栽培方法，本發明以野外採集的報春苣苔植株葉片作為外植體，通過誘導培養步驟、叢芽繁殖步驟、生根培養步驟、移栽步驟和野外移栽步驟等培養階段，調配和優選誘導、繁殖、生根、移栽等各培養階段的培養基配方，使報春苣苔能夠實現其有效繁殖的目的。結合生態恢復原理將試管苗在發現報春苣苔的當地種植，實現報春苣苔在原生地的種植成活和生態恢復。
文檔編號A01G31/00GK101116423SQ20071003026
公開日2008年2月6日 申請日期2007年9月17日 優先權日2007年9月17日
發明者海 任, 何長信, 張倩媚, 張新華, 李世晉, 楊偉雄, 焦德強, 胡玉姬, 鄧偉雄, 馬國華 申請人:中國科學院華南植物園;清遠市連州愛地旅遊發展有限公司