產耐鹽中性纖維素酶的菌株及篩選方法和應用與流程

2023-08-04 14:42:16

本發明屬於微生物學、酶工程、發酵工程、食品工程及畜牧養殖等領域，具體涉及一種產耐鹽中性纖維素酶的海洋菌株及篩選方法及其生產纖維素酶的方法。本發明生產的纖維素酶主要應用於紡織、食品加工及飼料添加劑等行業。

背景技術：

纖維素酶是一種能將纖維素及其衍生物水解成葡萄糖和纖維素二糖等小分子物質的一組酶的總稱。一組完整的纖維素酶系通常有相互協同催化水解纖維素的三類酶組成：內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶。內切纖維素酶能作用於纖維素的非結晶區，隨機水解β-1，4-糖苷鍵生成帶非還原端的較短的寡聚糖；外切纖維素酶能作用於纖維素分子的非還原端水解β-1，4-糖苷鍵生成纖維二糖；葡萄糖苷酶能將纖維二糖水解成葡萄糖。

根據纖維素酶的應用條件，可以將纖維素酶分為酸性纖維素酶、中性纖維素酶、鹼性纖維素酶。由於不同領域的環境不同對纖維素酶的需求也不盡相同，在紡織行業，中性纖維素酶的優勢較大。目前國產商品化纖維素酶多為酸性纖維素酶，中性纖維素酶多為國外廠家生產。因此，本領域急需開發新的產高活力的中性纖維素酶菌株。

能產生纖維素酶的微生物主要是真菌和部分細菌。一般真菌產的纖維素酶為酸性纖維素酶且多為胞外酶，酶系組成一般較為複雜，一般會存在多種同工酶。細菌所產的纖維素酶成分較為單一，但是細菌纖維素酶多為中性或鹼性胞內酶，多吸附於菌壁，且酶活普遍較低。鏈黴菌結構簡單，有一定的產纖維素能力，是一種較有潛力的纖維素酶生產菌屬。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一株產耐鹽中性纖維素酶的菌株，該菌株已經被中國典型培養物保藏中心保藏，保藏地址：中國武漢武漢大學，分類命名：Streptomyces sp CW，保藏號CCTCC NO:M 2016437，保藏日：2016.8.29。該菌株的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明的另一個目的是提供一株產耐鹽中性纖維素酶菌株的篩選方法，通過以下步驟實現：

(1)取少量樣品加入到液體富集培養基富集1天後，將經過富集培養後的菌液稀釋到10-4，取稀釋液塗布於剛果紅平板上；

(2)培養5天後，用接種針挑出剛果紅平板上產生明顯透明圈且不同形態的菌落，轉接到剛果紅平板上分離單菌落，獲得多株菌；

(3)將每株菌株接種於產酶培養基，28℃培養5天，取發酵後的培養基6000rpm離心5分鐘獲取粗酶液；

(4)實驗組將適當稀釋的粗酶液0.5mL，含1％CMC-Na的pH6.0的磷酸緩衝液2.0mL混合，空白組不加入粗酶液，於50℃孵育30分鐘，實驗組再加入2.5mL的DNS溶液，空白組同時再加入相應的粗酶液，混合均勻後沸水浴5分鐘，待冷卻後測定實驗組與空白組在540nm的吸光值，差值大即為酶活高，選出纖維素酶酶活高的一株菌株，將其命名為Streptomyces sp CW。

上述步驟(1)中富集培養基的組成為：CMC-Na 5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，蒸餾水1000mL，pH6.5～7。

上述步驟(1)和步驟(2)中剛果紅平板培養基組分為：CMC-Na 5g，NH4Cl 1g，剛果紅0.4g，瓊脂16g，蒸餾水1000mL，pH6.5～7。

上述步驟(3)產酶培養基組分為：麩皮48.9g，NH4NO3 8g，K2HPO4 4g，NaCl 4g，FeSO41g，蒸餾水1000mL。

本發明的再一個目的是提供一種所述菌株生產耐鹽中性纖維素酶的方法，通過以下步驟實現：

(1)產酶培養:將Streptomyces sp CW接種於斜面高氏1號培養基，30℃培養4天後轉接不含瓊脂的高氏1號液體培養基，30℃200rpm下培養24小時，以5％接種量再轉接發酵產酶培養基，在30℃200rpm條件下培養6天；

(2)胞外產物粗酶液的處理:將發酵液以6000rpm的轉速離心5分鐘，取上清液，即為粗酶液；

(3)硫酸銨分級沉澱處理：取20mL粗酶液加入(NH4)SO4粉末3.52g，混合均勻，靜置2小試，6700rpm冷凍離心20分鐘，取上清液，加入(NH4)SO4粉末3.96g，混合均勻，靜置2小時，6700rpm冷凍離心20分鐘，棄上清液，取沉澱溶於20mL 0.06M的磷酸緩衝液中，再將溶於磷酸緩衝液中酶液於0.06M磷酸緩衝液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經0.22微米微孔濾膜過濾除雜，收集濾液；濾液即為耐鹽中性纖維素酶酶液。

上述步驟(1)中，所述高氏培養基組成為：可溶性澱粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH6.5～7.0。

上述步驟(1)中，所述產酶培養基組成為：麩皮48.9g，NH4NO3 8g，K2HPO4 4g，NaCl 4g，FeSO4 1g，蒸餾水1000mL。

本發明提供的一株產耐鹽中性纖維素酶菌株，利用農業廢棄物配置發酵培養基生產纖維素酶，原料簡單，環保。培養方法簡單，通過發酵生產能為國內用戶提供一種應用較為廣泛、價格較為合理的耐鹽的中性條件下具有高活力的纖維素酶，本發明生產的中性纖維素酶具有耐鹽的性質，可以應用於飼料添加，紡織行業，環境處理方面，因其具有耐鹽性，在處理含纖維素的高鹽度廢水具有優勢。本發明所用菌株，發酵培養基價格低廉、發酵周期短、發酵培養條件溫和且在產酶過程中無需誘導，因此該菌適用於大規模的發酵生產的特點。

附圖說明

圖1為本發明菌株在剛果紅平板上的透明圈。

圖2為本發明菌株所產纖維素酶CMC-Na酶活最適的反應溫度。

圖3為本發明菌株所產纖維素酶CMC-Na酶活最適的反應pH。

圖4為本發明菌株所產纖維素酶的耐鹽性質圖。

圖5為本發明菌株所產纖維素酶的耐熱性質圖。

圖6為本發明菌株所產纖維素酶的熱穩定性質圖。

圖7為本發明菌株所產纖維素酶在不同金屬離子影響下的酶活。

具體實施方式

為進一步了解本發明，下面結合實施例和附圖對本發明的優選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特徵和優點而不是對本發明的限制。

本發明中所使用的培養基為：富集培養基的組成為：CMC-Na 5g，K2HPO4 0.5g，MgSO40.5g，NaCl 0.5g，蒸餾水1000mL，pH6.5～7。

剛果紅平板培養基組分為：CMC-Na 5g，NH4Cl 1g，剛果紅0.4g，瓊脂16g，蒸餾水1000mL，pH6.5～7。

產酶培養基組分為：麩皮48.9g，NH4NO3 8g，K2HPO4 4g，NaCl 4g，FeSO4 1g，蒸餾水1000mL。

高氏培養基組成為：可溶性澱粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，瓊脂18g，蒸餾水1000mL，pH6.5～7.0。

實施例1：菌株的篩選

取舟山海域採集的腐爛木頭樣品少量加入到液體富集培養基富集1天後，將經過富集培養後的菌液稀釋到10-4，取稀釋液塗布於剛果紅平板上；培養5天後，用接種針挑出剛果紅平板上產生明顯透明圈且不同形態的菌落，轉接到剛果紅平板上分離單菌落，獲得多株菌；將每株菌株接種於產酶培養基，28℃培養5天，取發酵後的培養基6000rpm離心5分鐘獲取粗酶液；實驗組將適當稀釋的粗酶液0.5mL，含1％CMC-Na的pH6.0的磷酸緩衝液2.0mL混合，空白組不加入粗酶液，於50℃孵育30分鐘，實驗組再加入2.5mL的DNS溶液，空白組同時再加入相應的粗酶液，混合均勻後沸水浴5分鐘，待冷卻後測定實驗組與空白組在540nm的吸光值，差值大即為酶活高，選出纖維素酶酶活高的一株菌株，將其命名為Streptomyces sp CW。圖1為Streptomyces sp CW在剛果紅平板上形成的透明圈。該菌株的16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，擴增16S rRNA基因的通用引物如下：

正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』；

反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3』。

實施例2：Streptomyces sp CW產纖維素酶

將Streptomyces sp CW接種於斜面高氏1號培養基，30℃培養4天後轉接不含瓊脂的高氏1號液體培養基，30℃200rpm下培養24小時，以5％接種量再轉接發酵產酶培養基，在30℃200rpm條件下培養6天；將發酵液以6000rpm的轉速離心5分鐘，取上清液，即為粗酶液；取20mL粗酶液加入(NH4)SO4粉末3.52g，混合均勻，靜置2小試，6700rpm冷凍離心20分鐘，取上清液，加入(NH4)SO4粉末3.96g，混合均勻，靜置2小時，6700rpm冷凍離心20分鐘，棄上清液，取沉澱溶於20mL 0.06M的磷酸緩衝液中，再將溶於磷酸緩衝液中酶液於0.06M磷酸緩衝液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經0.22微米微孔濾膜過濾除雜，收集濾液；濾液即為耐鹽中性纖維素酶酶液。

實施例3：Streptomyces sp CW耐鹽中性纖維素酶相關性質

酶的最適反應溫度：將耐鹽中性纖維素酶酶液分別放置不同溫度下反應30分鐘，測定其酶活，如圖2所示:結果表明耐鹽中性纖維素酶在40-60℃，都能保持較高的活力，最適溫度在60℃左右。

酶的最適反應pH：將耐鹽中性纖維素酶酶液分別放置不同pH值的CMC-Na底物反應30分鐘，測定其酶活，如圖3所示:結果表明耐鹽中性纖維素酶在pH值5.0-8.0，都能保持較高的活力，最適pH在6.0-7.0之間。

酶的耐鹽性質：將耐鹽中性纖維素酶酶液分別放置含不同質量分數NaCl的CMC-Na底物反應30分鐘，測定其酶活，如圖4所示：結果表明耐鹽中性纖維素酶在含14％質量分數的NaCl時還能保持80％的酶活力，具有良好的耐鹽性質。

酶的耐熱性質：將耐鹽中性纖維素酶酶液分別放置於40℃、50℃、55℃、60℃、70℃水浴1小時，然後測定酶活，如圖5所示：結果表明耐鹽中性纖維素酶在50℃以下有很好的保持酶活力，55℃也能保持85％的酶活力。

酶的熱穩定性質：將耐鹽中性纖維素酶液分別置於50℃、60℃、65℃中水浴，每隔2小時取酶液測定酶活，如圖6所示：結果表明耐鹽中性纖維素酶在50℃能很好保持酶活力，孵育12小時還能保持85％以上的酶活力。

金屬離子對酶活力的影響：配置含5mmol/L、10mmol/L的Na+、K+、Fe2+、Cu2+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Sr2+、Zn2+、EDTA的耐鹽中性纖維素酶，分別測定上述酶液的酶活，探討不同金屬離子對耐鹽中性纖維素酶的影響，結果如圖7所示：在5mmol/L時Na+、K+、Mg2+、Zn2+對酶有一定的促進作用，在10mmol/L時除了Mg2+，其它離子對酶均有一定的抑制作用。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何背離本發明的敬神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化、均為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍內。