一種生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法及其培養產物的應用的製作方法
2023-08-04 12:12:51 1
專利名稱：一種生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法及其培養產物的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵技術領域，具體涉及一種生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法及其培養產物的應用。
背景技術：
蟬花，學名蟬擬青黴(Paecilomyces cicadae)，是某些蟬若蟲受蟬擬青黴菌寄生後的產物，是一種菌蟲複合體。含有肝糖、蟲草酸、多種必需胺基酸、D-甘露醇、多種生物鹼、 麥角留醇等活性成分。蟬花中所含的17種胺基酸、多糖、甘露醇均與冬蟲夏草相近，所以常用被用作冬蟲夏草的代用品。蟬花具有抗腫瘤、調節免疫、降血糖、降血脂、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮痛、鎮靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等多種藥理作用，可被應用到食品、保健品、藥品、化妝品等領域。現有專利中蟬花的人工培育方法大多數都集中在固體發酵方面，涉及到液體發酵的很少。而固體發酵往往存在培養周期長、產量較低，易汙染。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的缺陷，提供一種生產周期短、產量高、產品質量穩定、適用於大規模生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法及其培養物的應用。為實現上述目的，本發明採取如下技術方案一種生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，包括以下步驟1)菌種製備包括斜面種製備和搖瓶種製備過程；2)液體發酵採用二級發酵；①一級種子罐發酵發酵罐中裝入培養液，加入消泡劑0. 1 0. 2% (以培養液重量為基礎，按重量百分比計)，滅菌(一般為121°C30 60min)並冷卻後將步驟1)中的搖瓶種接入培養，接種量為5 10%，在溫度23 25°C下發酵72 放罐；②發酵罐發酵發酵罐中裝入培養液，加入消泡劑0. 1 0. 2% (以培養液重量為基礎，按重量百分比計)，滅菌(一般為121°C 30 60min)並冷卻後將一級種子罐發酵好的液體種子接入培養，接種量為5 10%，在溫度23 25°C下發酵7 10天放罐。較佳的，所述一級種子罐發酵與發酵罐發酵時的罐壓為0.05MPa;所述一級種子罐發酵與發酵罐發酵時的通氣量為1 0.5。較佳的，步驟1)中，所述斜面種製備包括如下步驟將分離純化後的蟬擬青黴菌株(Paecilomyces cicadae)移殖到PSA斜面試管中，在22°C 25°C下培養5 7天，挑選長勢好的種作為斜面種。優選的，所述PSA固體培養基中含有如下組分(每IOOOml培養基中含有)馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g。較佳的，步驟1)中，所述搖瓶種製備包括如下步驟將斜面種接入馬鈴薯蔗糖培養液中，在22°C 25°C，振蕩頻率為130 150r/min的條件下培養3 7天，至錐形瓶內出現大量菌絲球後作為搖瓶種。優選的，所述馬鈴薯蔗糖培養液中含有如下組分(每IOOOml培養基中含有)馬鈴薯200g、蔗糖20g。較佳的，步驟i)中，所述一級種子罐和二級種子罐的液體培養基配方(按重量百分比計)為20 25%的馬鈴薯煮汁、1 2%蔗糖、蛋白腖-魚粉0.2 0.5%、磷酸二氫鉀0. 15 0. 3%、硫酸鎂0. 1 0. 25%、硝酸鉀0.3 0.5%、消泡劑0. 1 0.2%、水 71. 25 78. 15. %, pH6. 0 6. 5。所述消泡劑可為植物油。較佳的，所述生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法採用蟬擬青黴菌株 CGMCCNo. 3453 [Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson]進行發酵，該菌株已於 2009 年 11 月 18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)註冊保藏，保藏號為 CGMCC No. 3453。本發明所得產物蟬擬青黴菌絲體與發酵液，可用於製備具有抗腫瘤、調節免疫、降血糖、降血脂、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮痛、鎮靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等功能的食品或保健品或藥品或化妝品；本發明的方法生產工藝周期短、產量高、產品質量穩定、適用於大規模生產。尤其是採用蟬擬青黴菌株CGMCC No. 3453，並使用本發明的液體發酵方法發酵之後獲得的發酵產物中甘露醇含量高於野生蟬花中的含量，並且具有質量穩定，產量較高等突出特點。
圖1 蟲草多糖標準曲線圖2:甘露醇標準曲線圖3 腺苷蟲草素校正曲線圖
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步描述本發明的技術方案。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例11、菌種的製備和培養1)菌種製備包括斜面種製備和搖瓶種製備過程；其中，斜面種製備包括如下步驟將分離純化後的蟬擬青黴菌株移殖到PSA斜面試管中，在24°C下培養7天，挑選長勢好的種保存備用；搖瓶種製備包括如下步驟將斜面種接入馬鈴薯蔗糖培養液中，在25°C，振蕩頻率為140r/min的條件下培養5天，至錐形瓶內出現大量菌絲球後作為搖瓶種備用；所述PSA固體培養基中含有如下組分(每IOOOml培養基中含有)馬鈴薯200g、 蔗糖20g、瓊脂20g ；所述馬鈴薯蔗糖培養液中含有如下組分(每IOOOml培養基中含有)馬鈴薯 200g、蔗糖 20g ；
2)液體發酵採用二級發酵一級、二級種子罐的液體培養基配方為20%的馬鈴薯煮汁、蔗糖、蛋白腖-魚粉0. 5%、磷酸二氫鉀0. 2%、硫酸鎂0. 1%、硝酸鉀0. 3%、植物油0. 2%、水餘量、PH6. 5。或者，一級、二級種子罐的液體培養基配方為25%的馬鈴薯煮汁、蔗糖、蛋白腖-魚粉0. 2%、磷酸二氫鉀0. 3%、硫酸鎂0. 25%、硝酸鉀0. 5%、植物油0. 2%、水餘量、 PH6. 5。發酵方法(1) 一級種子罐發酵100L發酵罐中裝入60L培養液，加入消泡劑0.2%，121 滅菌60min，冷卻後將步驟1)中的搖瓶種接入培養，接種量為10 %，在溫度，通氣量 1 0. 5，在0. 05MPa罐壓下發酵84h放罐；(2)發酵罐發酵10T發酵罐中裝入6Τ培養液，加入消泡劑0. 2%，121°C滅菌 60min,冷卻後將一級種子罐發酵好的液體種子接入培養，接種量為10 %，在溫度，通氣量1 0. 5，在0.05MPa罐壓下發酵8天放罐；3、發酵產物的藥理作用的檢測經過檢測，本實施例中製得的發酵產物具有抗腫瘤、調節免疫、降血糖、降血脂、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮痛、鎮靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等功能。實施例21、菌種的製備和培養採用蟬擬青黴菌株[Paecilomyces cicadae (Miq. ) Samson] CGMCCNo. 3453進行液體發酵1)菌種製備包括斜面種製備和搖瓶種製備過程；其中，斜面種製備包括如下步驟將分離純化後的菌株移殖到PSA斜面試管中，在下培養7天，挑選長勢好的種保存備用；搖瓶種製備包括如下步驟將斜面種接入馬鈴薯蔗糖培養液中，在25°C，振蕩頻率為140r/min的條件下培養5天，至錐形瓶內出現大量菌絲球後作為搖瓶種備用；所述PSA固體培養基中含有如下組分(每IOOOml培養基中含有)馬鈴薯200g、 蔗糖20g、瓊脂20g ；所述馬鈴薯蔗糖培養液中含有如下組分(每IOOOml培養基中含有)馬鈴薯 200g、蔗糖 20g ；2)液體發酵採用二級發酵(1) 一級種子罐發酵100L發酵罐中裝入60L培養液，加入消泡劑0. 1%，121°C 滅菌30min，冷卻後將步驟1)中的搖瓶種接入培養，接種量為10 %，在溫度，通氣量 1 0. 5，在0. 05MPa罐壓下發酵72h放罐；(2)發酵罐發酵10T發酵罐中裝入6Τ培養液，加入消泡劑0. 1 %, 121 V滅菌 30min,冷卻後將一級種子罐發酵好的液體種子接入培養，接種量為10 %，在溫度，通氣量1 0. 5，在0.05MPa罐壓下發酵7天放罐；所述的一級、發酵罐的液體培養基配方為20%的馬鈴薯煮汁、2%蔗糖、蛋白腖-魚粉0.5%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸鎂0. 1%、硝酸鉀0. 3%、植物油0. 1%、水 76. 85%,PH6. 5。2、發酵產物中有效物質含量檢測
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一多糖檢測方法1實驗原理採用苯酚硫酸比色法對樣品多糖進行檢測。其原理是多糖類在濃硫酸作用下先水解成單糖分子，並迅速脫水生成糖醛衍生物，糖醛衍生物再與酚性物質如苯酚反應生成有色化合物，在波長490nm處有最大吸收，且滿足朗伯-比爾定律，通過檢測樣品在該波長下的吸光值，即可算出樣品中多糖的含量。2儀器與材料2. 1主要儀器紫外可見分光光度計；電子天平；可調式封閉電爐；離心機H-1650。2. 2實驗試劑無水葡萄糖(AR)；苯酚(AR)；濃硫酸(AR)；屈臣氏蒸餾水。試劑配製5%苯酚溶液精確稱取5g苯酚，用水定容至100ml。葡萄糖標準液配製配製濃度為0. 25mg/mL的葡萄糖標準液，精確稱取0. 2500g烘乾後的葡萄糖，加水定容至1000mL。2. 3材料實施例1的培養產物3實驗方法3. 1樣品粗多糖提取液的製備精確稱取Ig樣品置於乾燥的500ml錐形瓶內，稱量瓶與樣品的總質量記為ml，向三角瓶中加入沸騰蒸餾水約70ml，放置於電爐之上使其持續沸騰15min後，迅速放於冷水中冷卻至室溫，取出，擦乾瓶外壁的水珠後，向其中加入蒸餾水至最終質量為ml+100g，加水完畢之後搖勻，過濾，接取過濾液，稀釋2倍備用，即為待測樣品，-20°C保存。3. 2樣品粗多糖的測定3. 2. 1標準曲線的繪製精密稱取無水葡糖0. 2500g，用蒸餾水配製成0. 25mg/ml 的葡萄糖標準品溶液，吸取葡萄糖標準液0、0. 1,0. 3,0. 5,0. 7,0. 9、1. 1ml，分別置於具塞試管中，各加蒸餾水，使體積為2. 0ml，再加5%苯酚溶液1ml，搖勻，迅速滴加98%硫酸5ml， 搖勻後放置5分鐘，置沸水浴中加熱15分鐘，取出冷水冷卻至室溫；另加蒸餾水anl，同上操作做空白對照，於490nm處測定吸光值(Abs)。以標準品葡萄糖濃度(mg/ml)為橫坐標， Abs為縱坐標，得回歸方程Y = 0. 6622Χ+0. 0088，R2 = 0. 9997，說明標準品葡萄糖量在0 2. 75mg/ml範圍內，與Abs呈良好的線性關係。3. 2. 2實驗數據處理
ax C X VX CSmLl _4] M= WX(0.1na ^M 多糖含量(mg/g) ；a 稀釋倍數；C 待測液多糖濃度(mg/mL) ；V 體積(mL) ；W 樣品質量(g)二 甘露醇檢測方法1實驗原理利用多元醇化合物甘露醇成分與高碘酸鈉及Nash試劑產生的顯色反應，測定樣品中甘露醇的含量。2儀器與材料2. 1主要儀器紫外可見分光光度計；電子天平；離心機H-1650 ；電熱恆溫水箱 ⑶600型；可調式封閉電爐。2. 2實驗試劑甘露醇標準品；醋酸銨、乙醯丙酮、冰醋酸、高碘酸鉀、L-鼠李糖。試劑配製
高碘酸鉀溶液15mmol (即3. 45g)高碘酸鉀溶於IL 0. 12mol/L鹽酸溶液中。Nash 試劑150g醋酸銨+2mL冰醋酸+2mL乙醯丙酮，用蒸餾水稀釋至IL (現用現配)。L-鼠李糖溶液L-鼠李糖lOOmg，用蒸餾水定容至lOOmL。2. 3實驗材料實施例1的培養產物3實驗方法3. 1樣品甘露醇提取液的製備精確稱取Ig樣品置於乾燥的500ml錐形瓶內，稱量瓶與樣品的總質量記為ml，向三角瓶中加入沸騰蒸餾水約70ml，放置於電爐之上使其持續沸騰15min後，迅速放於冷水中冷卻至室溫，取出，擦乾瓶外壁的水珠後，向其中加入蒸餾水至最終質量為ml+100g，加水完畢之後搖勻，過濾，接取過濾液，即為待測樣品，-20°C保存。3. 2樣品甘露醇的測定3. 2. 1標準溶液的配製精密稱取D-甘露醇標準品0. Ig於燒杯中，加少量蒸餾水溶解完全，轉移至IOOml容量瓶中定容，配製成lmg/ml的甘露醇溶液，進行稀釋後，得到質量濃度分別為10、50、90、130、170mg/L的甘露醇標準溶液。取上述濃度標準品甘露醇溶液各lmL，分置不同試管中，然後分別加ImL高碘酸鈉溶液，混勻，室溫放置lOmin，加2mL0. 1 % L-鼠李糖溶液以除去過多的高碘酸鹽，振蕩混勻，加4mL新鮮配製的Nash試劑，53°C水浴加熱15min使其顯色，快速冷卻至室溫，在412nm波長處測定其吸光度。以蒸餾水代替甘露醇標準溶液，用同樣的方法操作作為對照，測定其吸光度。以標準液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪製標準曲線。以標準品甘露醇濃度(mg/ml)為橫坐標，Abs為縱坐標，得回歸方程=Y = 0. 0826Χ+0. 0019，R2 = 0. 9998，說明標準品甘露醇量在O 21. 25mg/L範圍內，與 Abs呈良好的線性關係。3. 2. 2實驗數據處理
aXCX VX(BniL)M=-
WX(ImL)M 甘露醇含量(mg/g) ；a 稀釋倍數；C 待測液甘露醇濃度(mg/mL) ；V 提取溶液體積(mL) ；W 測試樣品量(g)三腺苷含量測定方法1.儀器與試劑1. 1 儀器Waters 1525Binary HPLC Pump ；Waters 2998Photodiode Aarry Detector ；超聲波清洗儀SB25-12DT，寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平AL104型，梅特勒-託利多儀器(上海)有限公司；二兩裝高速萬能粉碎機QE-100克，浙江屹立工貿有限公司；Simplicity, Millipore ；針筒式過濾器0. 22 μ m，Pall。1. 2 試齊[J腺苷068K0691，Sigma ；蟲草素2007914，Sigma ；
乙腈 HPLC，Lot 100606，Fisher ；甲醇 HPLC，Lot096964, Fisher ；石油醚AR級，60_90°C，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀AR，10017618，國藥集團化學試劑有限公司；屈臣氏蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。1. 3樣品實施例1的培養產物2.方法2.1色譜條件色譜柱XBridgeC18 色譜柱(Waters，4. 6mmX 250mm，5 μ m)；流動相乙腈-0.04mol/L磷酸二氫鉀(5 95)；、流速1. OmL/min ；檢測波長260nm;柱溫35°C；進樣量20yL。2. 2腺苷蟲草素標準曲線繪製精密稱取50mg腺苷對照品，置50mL容量瓶中，加超純水溶解並稀釋至刻度製成 lmg/mL溶液。精密移取適量lmg/mL腺苷對照品溶液，分別配製成1、5、10、30、50、100 μ g/ mL的腺苷標準液，備用。2. 3供試品溶液的製備取約1. Og樣品粉末，精密稱定，置具塞IOOmL具塞錐形瓶中，加石油醚 (60-900C ) IOmL,密塞，超聲30分鐘，濾過，棄去石油醚，取藥渣揮幹，連同濾紙一併置具塞瓶中，在瓶中加入20mL超純水，稱總重(包括錐形瓶重量)，超聲30min。快速冷卻後稱重， 以超純水補至總重，混勻後離心，取上清液，過0. 22 μ m微孔濾膜，備用。2. 4標準曲線繪製將對照品1 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、30 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL 溶液進樣，按2.1項下色譜條件測定，以樣品濃度(μ g/mL)為橫坐標，峰面積(微伏 秒)為縱坐標，繪製標準曲線，得回歸方程為y = 7. 08e+004x-l. 05e+004, R2 = 0. 999978，在1 100 μ g/mL與峰面積線性關係良好。2. 5供試品腺苷含量測定取2. 3項下製備的供試品溶液，與超純水以2 1的比例混合，製成待測液。取待測液按2. 1項下色譜條件進樣，由回歸方程得待測液腺苷濃度χ( μ g/mL)，根據下列公式得到供試品腺苷含量(mg/g)。
x(pg/mL) xV (mL) χ稀釋倍數
含量(mg/g)=------------------------------------------
m(g)xl000檢測結果mg/g
權利要求
1.一種生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，包括以下步驟1)菌種製備包括斜面種製備和搖瓶種製備過程；2)液體發酵採用二級發酵；①一級種子罐發酵發酵罐中裝入培養液，加入消泡劑0.1 0. 2 %，滅菌並冷卻後將步驟1)中的搖瓶種接入培養，接種量為5 10%，在溫度23 25°C下發酵72 放罐；②發酵罐發酵發酵罐中裝入培養液，加入消泡劑0.1 0. 2 %，滅菌並冷卻後將一級種子罐發酵好的液體種子接入培養，接種量為5 10%，在溫度23 25°C下發酵7 10 天放罐。
2.如權利要求1中所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，所述一級種子罐發酵與發酵罐發酵時的罐壓均為0. 05MPa。
3.如權利要求1中所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，步驟1) 中，所述斜面種製備包括如下步驟將分離純化後的菌株移殖到PSA斜面試管中，在22°C 25°C下培養5 7天，挑選長勢好的種作為斜面種。
4.如權利要求2中所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，每 IOOOml所述PSA斜面培養基中含有如下組分馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g。
5.如權利要求1中所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，步驟1) 中，所述搖瓶種製備包括如下步驟將斜面種接入馬鈴薯蔗糖培養液中，在22°C 25°C，振蕩頻率為130 150r/min的條件下培養3 7天，至錐形瓶內出現大量菌絲球後作為搖瓶種。
6.如權利要求1中所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，步驟2) 中，所述一級種子罐和發酵罐的液體培養基配方為20 25%的馬鈴薯煮汁、1 2%蔗糖、 蛋白腖-魚粉0. 2 0. 5%、磷酸二氫鉀0. 15 0. 3%、硫酸鎂0. 1 0. 25%、硝酸鉀0. 3 0. 5%、消泡劑 0. 1 0. 2%,/K 71. 25 78. 15%,PH6. 0 6. 5。
7.如權利要求1中所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，步驟1) 和步驟2、中，所述消泡劑選自天然植物油、聚醚類消泡劑、高碳醇和矽類中的一種。
8.如權利要求1 7中任一權利要求所述的生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法，其特徵在於，所述液體發酵方法採用蟬擬青黴菌株CGMCC No. 3453進行液體發酵。
9.一種蟬擬青黴液體發酵產物，由權利要求1 8中任一權利要求所述的液體發酵方法進行發酵製得。
10.權利要求9中所述的蟬擬青黴液體發酵產物在製備具有抗腫瘤、調節免疫、降血糖、降血脂、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮痛、鎮靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等功能的食品、保健品、藥品或化妝品中的應用。
全文摘要
本發明屬於微生物發酵技術領域，具體涉及一種生產蟬擬青黴菌絲體的液體發酵方法及其培養產物的應用。該方法包括以下步驟配製培養基、製備培養液、將培養液分裝入發酵罐、滅菌、冷卻、接種、通氣發酵。本發明的培養方法能夠產生大量蟬擬青黴菌絲體與分生孢子，且其培養產物具有抗腫瘤、調節免疫、降血糖、降血脂、降血壓、明目、抗輻射、解熱鎮痛、鎮靜催眠、滋補強壯、改善腎功能等功能，可以應用於食品、保健品、藥品、化妝品等。本發明的液體發酵生產工藝周期短、產量高、不易汙染、產品質量穩定、適用於大規模生產。
文檔編號A61P17/16GK102242154SQ201110120360
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月11日 優先權日2010年5月14日
發明者孫長勝, 李成, 趙偉, 陳祝安 申請人:浙江泛亞生物醫藥股份有限公司