人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體的合成及表位疫苗的製作方法

2023-08-04 15:27:41

專利名稱：人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體的合成及表位疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。特別是涉及一種人癌胚抗原CAP1肽表位基因編碼序列的同向串聯體及癌胚抗原表位基因疫苗的製備方法。
背景技術：
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一種重要的腫瘤相關抗原和國際上公認的腫瘤標誌物。CEA陽性腫瘤的發病率和死亡率較高，嚴重威脅人類的生命和健康。手術、放療和化療雖然是治療惡性腫瘤的主要方法，但由於無法解決復發和轉移問題，或具有嚴重的毒副作用，效果不能令人滿意。因此，如果能夠開發出預防腫瘤發生並有效治療腫瘤的方法，將具有極其重要的實用價值。近年來，隨著分子生物學及相關技術的發展和完善，腫瘤生物治療已成為惡性腫瘤治療的新模式，日益受到重視。腫瘤生物治療包括腫瘤免疫治療和腫瘤基因治療兩方面，前者是腫瘤生物治療的基礎，後者是腫瘤生物治療的發展方向。結合了上述兩方面治療內容的腫瘤基因疫苗(cancer genetic vaccine)，是九十年代發展起來的腫瘤治療新技術，也是當前腫瘤分子免疫學和腫瘤分子生物學領域研究的熱點之一。
CEA作為腫瘤相關抗原，可被機體內特異性CTL識別，誘發全身性抗腫瘤免疫反應，因此被用於其陽性腫瘤的免疫治療。近年來隨著T細胞識別腫瘤抗原免疫活性表位概念的確立，以T細胞識別的腫瘤抗原肽疫苗為核心的免疫治療得到了極大的發展。但肽疫苗的不足是合成短肽在人體內由於分子量小，易被蛋白水解酶降解及半衰期短(只有幾分鐘)，不能持續刺激機體的免疫系統，其應用受到了一定的限制。
以往為獲得多拷貝數的某一基因片段，通常要將欲合成的目的基因分成幾個片斷分別合成，然後用化學拼接法連接起來，成本較高，且獲得的串聯體拷貝數有限；而使用同尾酶技術雖然可以得到任意拷貝數的基因片段，但每增加一個拷貝就要進行一次基因克隆，操作複雜、費時。
技術內容本發明的目的在於建立以抗原表位為基礎的基因免疫方案(epitope-based gene immunization，EBGI)，增強癌胚抗原基因疫苗的抗原性，並減少無關序列的幹擾，使基因免疫的效果更加專一和精確。
本發明DNA片段由人癌胚抗原CAP1肽表位和連接肽基因編碼序列同向串聯而成。
本發明的生產方法，所用的兩條PCR引物中含有CAP1和連接肽的編碼序列，在3』端有11鹼基互補，5』端有15個鹼基反向互補，進行PCR時能以引物自身為模板擴增出不同拷貝數的人癌胚抗原CAP1肽表位基因編碼序列串聯體。
本發明方法的串聯體片段的合成採用自身引物-模板PCR方法。
本發明外源基因為人癌胚抗原肽表位和連接肽基因編碼序列的同向串聯體。
本發明所用的真核表達載體為pVAX1。
本發明基於對CEA基因開放讀碼框架和CEA蛋白結構的分析，以CEA免疫優勢肽表位CAP1的DNA編碼序列為目的基因，採用自身引物-模板PCR方法，以引物自身為模板，通過聚合酶鏈反應擴增多拷貝CAP1基因編碼序列的同向串聯體。在上述串聯體兩端加入酶切位點後，插入真核表達載體構成的表位基因疫苗，將具有更好的靶向性，並能持續、有效地激活T細胞，解除機體對腫瘤的免疫耐受。同時，該串聯體片段較短，易於同其它免疫增強基因重組成聯合疫苗，提高CEA基因疫苗的抗腫瘤效果。克隆入經美國FDA批准可用於基因治療的真核表達載體pVAX1，可成為癌胚抗原表位基因疫苗，用於惡性腫瘤的免疫基因治療。應用自身引物-模板PCR方法可以克服現有不足，根據需要合成並獲得不同拷貝數的目的基因片段。CEA表位基因疫苗一次免疫後，質粒即可長期存在於接種組織內，模擬自然感染過程，表達CEA蛋白CAP1免疫優勢肽表位，持續刺激免疫系統，誘導產生持久的抗CEA陽性腫瘤免疫。該方法還具有技術簡便、質量易於控制和評價、成本低廉、等優點，並將隨著腫瘤基因治療和免疫治療技術的進步，逐漸發展與完善。
具體實施例方式一、CAP1肽表位基因編碼序列同向串聯體的合成1、串聯體的PCR引物設計及合成所設計的一對PCR引物中含有CAP1和連接肽的編碼序列，在3』端有11鹼基互補，5』端有15個鹼基反向互補。進行PCR時能以引物自身為模板擴增出不同拷貝數的人癌胚抗原CAP1肽表位基因編碼序列串聯體。
引物用DNA合成儀合成。
引物15』GGAGCAGGAGCAGCGTACCTTTCGGGAGCGTTGG 3』引物25』CGCTGCTCCTGCTCCCTCCAACTCCAACGCTCCC 3』2、PCR擴增在反應體系中加入特異性引物1與2共4l(各20pmol)、dNTP8l、Tag酶2.5U、10×Tag酶反應緩衝液10l、加雙蒸水至100l。PCR反應條件為94℃1min、30℃1min、72℃1min、10個循環，然後94℃1min、50℃1min、72℃1min、30個循環，最後72℃充分延伸10min。
3、PCR產物的聚丙烯醯胺凝膠電泳分離(1)清潔玻璃板，固定於電泳裝置上。
(2)配製8％分離膠(20ml)電泳30％丙烯醯氨5.3ml5×TBE 4ml10％過硫酸銨0.14ml雙蒸水 10.6ml加TEMED10l混勻後，迅速注入膠床，再加雙蒸水覆蓋。待聚合完全後，吸出雙蒸水。將PCR產物與加樣緩衝液混合，注入加樣孔中電泳，另孔加標準分子量對照，電壓2-8V/cm。
(3)染色；將凝膠浸入用1×TBE配製的0.5g/l溴化乙錠染液中染色30-45分鐘。
(4)在紫外燈下確定目的基因片段的位置，切下該塊凝膠，轉移到微量離心管中。
(5)在離心管中加入2倍體積的洗脫緩衝液洗脫緩衝液的配製0.5mol/L乙酸銨10mol/L乙酸鎂1mmol/L EDTA(pH8.0)0.1％SDS(6)37℃溫育4-12小時。
(7)12000rpm離心2min，上清液轉移到另一離心管中。
(8)加2倍體積的冰預冷無水乙醇，-20C放置30分鐘，12000rpm離心10min，沉澱目的基因片段。
二、構建真核表達質粒pVAX1-CEA1、克隆用基因片段的合成(1)PCR引物引物的5』端加入BamHI酶切位點和起始密碼子，3』端加入EcoRI酶切位點和終止密碼子的互補序列引物15』GAGGATCCACCATGGAGCAGGAGCAGCG 3』引物25』CCGGATTCCTAAATCGCTGCTCCTGCTCC 3』(2)PCR擴增和產物回收在反應體系中加入引物1與2共4l(各20pmol)、dNTP8l、Tag(Ex)聚合酶2.5U、10×Tag酶反應緩衝液10l、加雙蒸水至100l。循環擴增程序為預變性95℃5min，然後變性95℃1min、復性58℃1min、延伸72℃1min，共30個循環，充分延伸72℃10min。瓊脂糖凝膠電泳鑑定PCR產物後用DNA純化試劑盒回收。
2、構建真核表達質粒pVAX1-CEA(1)雙酶切反應用EcoRI和BamHI雙酶切反應分別製備有粘性末端的CEA基因片段和線性載體pVAX1。
DNA15l(2g/l)10×buffer 10lEcoRI/BamHI5l(10U/l)
雙蒸水加至100l置37℃水浴1.5-2小時。
瓊脂糖凝膠電泳後，用DNA純化試劑盒回收酶切產物。
(2)DNA片段的連接連接有共同粘性末端的CEA基因片段和線性載體pVAX1DNA片段 0.1g線性pVAX1質粒 0.4g10×buffer2lT4DNA連接酶 1l雙蒸水加至20l25℃，連接1-2小時。
三、重組質粒pVAX1-CEA的生產1、製備感受態大腸桿菌(氯化鈣法)(1)用無菌接種環刮取凍存於液氮中的大腸桿菌菌種，劃線接種於LB瓊脂平皿，37℃培養12-16h。
(2)挑取單菌落，接種於5ml LB液體培養基中，37℃、200rpm/min振搖培養12h。
(3)取1％培養液，接種於50ml LB液體培養基中，37℃、250rpm/min振搖培養2-3h，至OD600＝0.4-0.6。
(4)取出後立即冰浴10min。
以下均需無菌操作。
(5)將培養液轉移到用冰預冷的50ml離心管中，4℃、4000rpm離心10min。
(6)棄淨上清液，用冰預冷的0.1mol CaCl210ml重懸菌體，冰水浴30min。
(7)4℃、4000rpm離心10min，棄淨上清液。
(8)用冰預冷的0.1mol CaCl22ml重懸菌體，4℃放置12-24h，即成感受態細菌。可分裝為200l/份，加30％甘油，-70℃保存備用。
2、細菌轉化(1)取50ng質粒加入含0.2ml感受態細菌的無菌玻璃試管中，輕輕混勻，冰水浴30min。
(2)42℃熱休克90s。
(3)加0.8l LB液體培養基，37℃、120rpm/min溫和振搖45mi。
(4)用玻璃彎頭鋪菌器將200l菌液塗於含氨苄青黴素50g/ml的瓊脂培養皿中，37℃平放吸附20min後，倒置培養10-14h。
3、重組質粒的快速鑑定(1)將轉化菌落依次轉移到含Amp的瓊脂培養皿中，編號後，37℃過夜培養。
(2)挑取適量菌落，加入25l溶液A，混勻。
(3)加入25l溶液B，混勻，70℃保溫5min後，4℃、12000rpm離心10min。
(4)取上清，行瓊脂糖凝膠電泳(同時用空質粒作對照)，根據分子量大小確定是否為重組質粒。
4、質粒的大量提取(鹼裂解法)(1)將1％轉化菌接種於100ml LB培養基(含Amp50g/ml)中，37℃、250rpm/min振搖培養12-16h，至OD600＝0.6-0.8。
(2)取出後立即冰浴10min，轉移到用冰預冷的50ml離心管中，4℃、4000rpm離心10min。
(3)棄淨上清液，加入冰預冷的溶液I(40mmol/L葡萄糖、2540mmol/L Tris-CI pH8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)4ml，劇烈震蕩混勻。
(4)加新鮮配製的溶液II(0.2mol/L NaCI、1％SDS)8ml，緩慢顛倒混勻，放置5-10min。
(5)加用冰預冷的溶液III(5mol/L乙酸鉀3.6ml、3mol/L冰乙酸0.69ml、雙蒸水1.71ml)6ml，顛倒混勻，冰水浴10min。4℃、8000rpm離心10min。
(6)取上清液，加0.6體積異戊醇，混勻，-20℃沉澱20min。4℃、12000rpm離心10min。
(7)棄淨上清液，用70％乙醇洗沉澱，晾乾，溶於1.2mlTE(pH8.0)溶液中。
(8)加Rnase A30l，37℃水浴30min。
(9)加等體積平衡酚，混合。5000rpm離心10min。
(10)小心吸取上層水相，平衡酚抽提及氯仿-異戊醇(24∶1)抽提。
(11)5000rpm離心10min，小心吸取上層水相。
(12)加1/10體積NaAc(pH5.3)，2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-20℃沉澱20min。
(13)12000rpm離心10min，棄淨上清，70％洗2次。
(14)沉澱晾乾，溶於200l TE(pH8.0)溶液中。
(15)取10l按1∶100稀釋後測量OD260，計算質粒DNA濃度。-20℃保存備用。
權利要求
1.一種人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體，其特徵在於該DNA片段由人癌胚抗原CAP1肽表位和連接肽基因編碼序列同向串聯而成。
2.一種人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體的的生產方法，其特徵在於所用的兩條PCR引物中含有CAP1和連接肽的編碼序列，在3』端有11鹼基互補，5』端有15個鹼基反向互補，進行PCR時能以引物自身為模板擴增出不同拷貝數的人癌胚抗原CAP1肽表位基因編碼序列串聯體。
3.根據權利要求2所述的人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體的的生產方法，其特徵在於串聯體片段的合成採用自身引物-模板PCR方法。
4.根據權利要求2所述的人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體的的生產方法，其特徵在於外源基因為人癌胚抗原肽表位和連接肽基因編碼序列的同向串聯體。
5.根據權利要求2所述的人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體的的生產方法，其特徵在於所用的真核表達載體為pVAX1。
全文摘要
一種人癌胚抗原肽表位基因編碼序列串聯體及其生產方法，屬於生物技術領域。本發明採用自身引物－模板PCR方法合成人癌胚抗原CAP1肽表位基因編碼序列的串聯體，並以此為基礎構建癌胚抗原表位基因疫苗。所用的PCR引物中含有CAP1和連接肽的基因編碼序列，並且3』端有部分鹼基互補，5』端有部分鹼基反向互補，在進行聚合酶鏈反應時能以引物自身為模板，通過多步反應擴增出CAP1基因編碼序列的同向串聯體。經聚丙烯醯胺凝膠電泳分離可得到不同拷貝數的人癌胚抗原CAP1肽表位基因編碼序列的串聯體片段。在串聯體片段的兩端加入酶切位點後，插入基因真核表達載體pVAX1，可製成癌胚抗原表位疫苗，用於惡性腫瘤的免疫基因治療。
文檔編號C12N15/12GK1635118SQ20031011599
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月29日 優先權日2003年12月29日
發明者譚巖, 熊偉, 方豔秋, 段秀梅, 劉力華, 姜豔芳, 許淑芬 申請人:吉林大學第一醫院