用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法

2023-07-22 03:56:16 1

專利名稱：用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法
技術領域：
本發明涉及免疫原 的製備方法。
背景技術：
各種各樣的微生物存在於我們的生活空間中，如空氣、水和物體表面等。在利用微生物進行生產過程中，如菌種保藏、微生物轉接、菌種活化等都涉及無菌操作這一環節，包括使用超淨臺、操作前使用紫外燈照射、化學滅菌、高溫滅菌、火焰滅菌等。我們在進行操作過程中發現，即使經過認真仔細的操作也會經常被一種雜菌汙染，並且在其他實驗室操作過程中也會出現這種現象。這種雜菌的汙染會干擾欲保存菌種的轉接、分離與純化，甚至使這種雜菌成為優勢菌種，而導致保藏菌株不純或產生死亡的現象。

發明內容
本發明是要解決目前無菌操作中常被一株汙染菌汙染的問題，提供用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法。本發明中汙染菌為產朊假絲酵母JTW-I (Candida utilis JTW-1)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，保藏日期為2011年3月21日，保藏編號為CGMCC No. 4700。本發明用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、製備菌懸液將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，然後放置於80 300r/min的搖床上，於28°C培養3天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物，將產朊假絲酵母JTW-I培養物溶於無菌水中製成密度為 1 X IO7 1 X IO9個/mL的菌懸液；二、製備免疫原將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比1 1 4混均，得混合液，然後按每ImL混合液加入Ig羊毛脂的比例向混合液中加入羊毛脂混勻，形成乳化液即為免疫原。本發明用於生成汙染菌抗血清的免疫原的另一種製備方法，按以下步驟進行將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，於28°C培養3天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物；將產朊假絲酵母 JTff-I培養物加入到體積濃度為0. 5 % 20 %的戊二醛水溶液中，產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 1 IOOmL,然後在室溫下於80 300r/min的搖床上振蕩16h，收集產物；然後將產物用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾，濾去液體部分，再以抽濾方式用去離子水洗滌，然後濾去水分，得到交聯酵母菌；按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 1 IOOmL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌，震蕩混勻後形成的懸液即為免疫原。利用本發明製備的免疫原製成汙染菌抗血清，再將抗血清加入到易受汙染的培養基中，可有效抑制產朊假絲酵母JTW-I的汙染，解決了目前無菌操作中常被汙染菌產朊假絲酵母JTW-I汙染的問題。本發明的方法簡單，易於操作。


圖1為具體實施方式
一中產朊假絲酵母JTW-I在麥芽汁瓊脂培養基中生長的菌落形態圖；圖2為具體實施方式
一中產朊假絲酵母JTW-I的細胞形態圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、製備菌懸液將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，然後放置於80 300r/min的搖床上，於28°C培養3天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物，將產朊假絲酵母JTW-I培養物溶於無菌水中製成密度為IX IO7 IX IO9個/mL的菌懸液；二、製備免疫原將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比1 1 4混均，得混合液，然後按每ImL混合液加入Ig羊毛脂的比例向混合液中加入羊毛脂混勻，形成乳化液即為免疫原。利用本實施方式的免疫原進行汙染菌抗血清的製備，方法如下取2 4公斤重的健康雄性家兔，對家兔進行耳靜脈注射本實施方式製得的免疫原，每隻家兔每天同一時間注射1次，每次每隻注射1 3mL，連續注射6天；對經過上述免疫後的家兔進行無菌取血， 然後放置分層，離心後取上清，即得到汙染菌抗血清。將汙染菌抗血清加入易受汙染的培養基中，可有效抑制產朊假絲酵母JTW-I的汙染，解決了目前無菌操作中常被雜菌產朊假絲酵母JTW-I汙染的問題。本發明的方法簡單， 易於操作。本實施方式步驟一所述的產朊假絲酵母JTW-I (Candida utilis JTW-1)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年3月21日，保藏編號為CGMCC No. 4700。產朊假絲酵母JTW-I在麥芽汁液體培養基中培養不產醭，管底有菌體沉澱；在麥芽汁瓊脂培養基上培養，菌落呈乳白色，平滑有光澤，邊緣整齊(如圖1)，以分裂和多端出芽的營養體方式繁殖； 在加蓋玻片的玉米粉瓊脂培養基上培養，形成大量假菌絲。產朊假絲酵母JTW-I細胞呈圓形或橢圓形(如圖2)，大小為(3 5) μπιΧ(7 13) μ m。發酵糖實驗表明，產朊假絲酵母JTW-I可以發酵葡萄糖和蔗糖，但不能發酵 半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、海藻糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、菊糖或棉籽糖。同化碳源實驗表明， 產朊假絲酵母JTW-I對葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、麥芽糖、菊糖、松三糖、纖維二糖、甘油利用良好，但不能利用半乳糖、乳糖、蜜二糖、可溶性澱粉。產朊假絲酵母JTW-I的同化硝酸鉀陽性，可在無維生素的培養基中生長。能夠良好利用硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、尿素。產朊假絲酵母JTW-I耐氯化鈉濃度最高為8%。產朊假絲酵母JTW-I可在麥芽汁培養基、玉米粉瓊脂培養基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中生長。產朊假絲酵母JTW-I在43°C下能夠生長。對照《酵母菌的特徵與鑑定手冊》、《菌種保藏手冊》和《真菌鑑定手冊》中對酵母形態特徵和生理特徵的描述，可以鑑定此菌株為產朊假絲酵母(Candida utilis)。
本實施方式步驟一所述的產朊假絲酵母JTW-I是由受汙染的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中分離得到。挑取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中白色的單個汙染菌落，經多次馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板劃線培養，得到單菌落的純培養物產朊假絲酵母JTW-I。 製得的汙染菌抗血清可以稀釋1 256倍使用，使用時將稀釋後的抗血清與培養基按體積比1 4 20混合。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中放置於 100 250r/min的搖床上。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中放置於 150 200r/min的搖床上。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟一中製成密度為IX IO8個/mL的菌懸液。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比12混均。其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比13混均。其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
七本實施方式用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、製備菌懸液將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，然後放置於120r/min的搖床上，於28°C培養3天，用0. 45 μ m微孔濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物，將產朊假絲酵母JTW-I培養物溶解於無菌水中製成密度為IX IO8個/mL的菌懸液；二、製備免疫原將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比1 1混均，得混合液，然後按每ImL混合液加入Ig羊毛脂的比例向混合液中加入羊毛脂混勻，形成乳化液即為免疫原。利用本實施方式的免疫原進行汙染菌抗血清的製備，方法如下取3公斤重的健康雄性家兔，對家兔進行耳靜脈注射本實施方式製得的免疫原，每隻家兔每天同一時間注射1次，每次每隻注射2mL，連續注射6天；對經過上述免疫後的家兔進行無菌取血，然後放置分層，離心後取上清，即得到汙染菌抗血清。將4mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基高溫滅菌，涼至40 50°C，將上述汙染菌抗血清稀釋10倍，無菌操作取0. 5mL稀釋後抗血清加入到4mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，混勻， 製成斜面培養基；將產朊假絲酵母JTW-I溶解於無菌水中製成密度為1 X IO7 1 X IO9個/ mL的菌懸液，挑取一環菌懸液接種於斜面培養基，劃線28°C培養2天之後，未有汙染酵母菌落出現；而未加入汙染菌抗血清的斜面培養基，接種上述菌懸液一環，劃線28°C培養2天， 則出現汙染酵母菌落。將20mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基高溫滅菌，涼至40 50°C，將上述汙染菌抗血清稀釋10倍，無菌操作取2. 5mL稀釋後的抗血清加入到20mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，混勻，製成平板培養基；將產朊假絲酵母JTW-I溶解於無菌水中製成密度為IXlO7 IXlO9 個/mL的菌懸液，挑取一環菌懸液接種於平板培養基，劃線28°C培養2天之後，未有汙染酵母菌落出現；而未加入汙染菌抗血清的平板培養基，接種上述菌懸液一環，劃線28°C培養2天，則出現汙染酵母菌落。

具體實施方式
八本實施方式用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，於 28°C培養3天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物；二、將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為0. 5% 20%的戊二醛水溶液中， 產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 1 IOOmL,然後在室溫下於80 300r/min的搖床上振蕩16h，收集產物；三、然後將產物用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾，濾去液體部分，再以抽濾方式用去離子水洗滌，然後濾去水分，得到交聯酵母菌；四、 按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 1 IOOmL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌，震蕩混勻後形成的懸液即為免疫原。利用本實施方式的免疫原進行汙染菌抗血清的製備，方法如下選擇體重在2 3kg健壯的家兔，第1天每隻兔子四足掌各注射0. 2mL免疫原，背部皮下4點注射，每點 0. 2mL免疫原，第3天每隻兔四足掌各注射0. ImL免疫原，背部皮下4點注射，每點0. ImL免疫原；第5天每隻兔四足掌各注射0. ImL免疫原，背部皮下4點注射，每點0. ImL免疫原；兩天後無菌取血，然後放置分層，離心後取上清，即得到抗血清。將汙染菌抗血清加入易受汙染的培養基中，可有效抑制產朊假絲酵母JTW-I的汙染，解決了目前無菌操作中常被雜菌產朊假絲酵母JTW-I汙染的問題。本發明的方法簡單， 易於操作。本實施方式步驟一所述的產朊假絲酵母JTW-I (Candida utilis JTW-1)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2011年3月21日，保藏編號為CGMCC No. 4700。製得的汙染菌抗血清可以稀釋1 1024倍使用，使用時將稀釋後的抗血清與培養基按體積比1 4 20混合。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
八不同的是步驟二中將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為 15%的戊二醛水溶液中。其它與具體實施方式
八相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
八不同的是步驟二中將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為5% 10%的戊二醛水溶液中。其它與具體實施方式
八相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
八不同的是步驟二中將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為8%的戊二醛水溶液中。其它與具體實施方式
八相同。
具體實施方式
十二 本實施方式與具體實施方式
八至十一之一不同的是步驟二中產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 10 80mL。其它與具體實施方式
八至十一之一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
八至十一之一不同的是步驟二中產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 30 60mL。其它與具體實施方式
八至十一之一相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
八至十一之一不同的是步驟二中產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 50mL。其它與具體實施方式
八至十一之一相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
八至十四之一不同的是步驟四中按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 10 90mL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌。其它與具體實施方式
八至十四之一相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
八至十四之一不同的是步驟四中按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 30 70mL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌。其它與具體實施方式
八至十四之一相同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
八至十四之一不同的是步驟四中按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 50mL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌。其它與具體實施方式
八至 十四之一相同。
具體實施方式
十八本實施方式用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中， 於28°C培養3天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物；二、將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為10%的戊二醛水溶液中，產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 1 IOOmL,然後在室溫下於 100r/min的搖床上振蕩16h，收集產物；三、然後將產物用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾，濾去液體部分，再以抽濾方式用去離子水洗滌，然後濾去水分，得到交聯酵母菌；四、按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 1 IOOmL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌，震蕩混勻後形成的懸液即為免疫原。將4mL麥芽汁培養基高溫滅菌，涼至40 50°C，將上述汙染菌抗血清稀釋200倍， 無菌操作取0. 5mL稀釋後抗血清加入到4mL麥芽汁培養基中，混勻，製成斜面培養基；將產朊假絲酵母JTW-I溶解於無菌水中製成密度為1 X IO7 1 X IO9個/mL的菌懸液，挑取一環菌懸液接種於斜面培養基，劃線28°C培養2天之後，未有汙染酵母菌落出現；而未加入汙染菌抗血清的斜面培養基，接種上述菌懸液一環，劃線28°C培養2天，則出現汙染酵母菌落。將20mL麥芽汁培養基高溫滅菌，涼至40 50°C，將上述汙染菌抗血清稀釋200 倍，無菌操作取2. 5mL稀釋後的抗血清加入到20mL麥芽汁培養基中，混勻，製成平板培養基；將產朊假絲酵母JTW-I溶解於無菌水中製成密度為1 X IO7 1 X IO9個/mL的菌懸液， 挑取一環菌懸液接種於平板培養基，劃線28°C培養2天之後，未有汙染酵母菌落出現；而未加入汙染菌抗血清的平板培養基，接種上述菌懸液一環，劃線28°C培養2天，則出現汙染酵母菌落。
權利要求
1.用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、製備菌懸液將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，然後放置於80 300r/min的搖床上，於28°C培養3 天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物，將產朊假絲酵母JTW-I培養物溶於無菌水中製成密度為1 X IO7 1 X IO9個/mL的菌懸液；二、製備免疫原將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比1 1 4混均，得混合液，然後按每 ImL混合液加入Ig羊毛脂的比例向混合液中加入羊毛脂混勻，形成乳化液即為免疫原。
2.根據權利要求1所述的用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於步驟一中放置於100 250r/min的搖床上。
3.根據權利要求1或2所述的用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於步驟一中製成密度為1 X IO8個/mL的菌懸液。
4.根據權利要求3所述的用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於步驟二中將步驟一製得的菌懸液與液體石蠟按體積比12混均。
5.用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，按以下步驟進行一、將產朊假絲酵母JTW-I接種在經過滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，於28°c培養3天，用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾除去培養基，收集到產朊假絲酵母JTW-I培養物；二、將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為0. 5% 20%的戊二醛水溶液中，產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為 Ig 1 IOOmL,然後在室溫下於80 300r/min的搖床上振蕩16h，收集產物；三、然後將產物用孔徑0. 45 μ m的濾膜過濾，濾去液體部分，再以抽濾方式用去離子水洗滌，然後濾去水分，得到交聯酵母菌；四、按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 1 IOOmL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌，震蕩混勻後形成的懸液即為免疫原。
6.根據權利要求5所述的用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於步驟二中將產朊假絲酵母JTW-I培養物加入到體積濃度為 15%的戊二醛水溶液中。
7.根據權利要求5或6所述的用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於步驟二中產朊假絲酵母JTW-I培養物的重量與戊二醛水溶液的體積比為Ig 30 6 OmL ο
8.根據權利要求7所述的用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，其特徵在於步驟四中按交聯酵母菌重量與去離子水體積比為Ig 30 70mL的比例向去離子水中加入交聯酵母菌。
全文摘要
用於生成汙染菌抗血清的免疫原的製備方法，涉及免疫原的製備方法。本發明是要解決目前無菌操作中常被一株汙染菌汙染的問題。方法一、製備菌懸液；二、將菌懸液與液體石蠟混均得混合液，向混合液中加入羊毛脂，形成乳化液即為免疫原。另一種方法一、得到產朊假絲酵母JTW-1培養物；二、將培養物加入到戊二醛水溶液中，搖床振蕩收集產物；三、將產物過濾，洗滌，去水分得到交聯酵母菌；四、向去離子水中加入交聯酵母菌，震蕩混勻後形成的懸液即為免疫原。利用本發明製備的免疫原生成抗血清，將抗血清加入到易受汙染的培養基中，可有效抑制產朊假絲酵母JTW-1的汙染，解決了目前無菌操作中常被雜菌產朊假絲酵母JTW-1汙染的問題。
文檔編號C12R1/72GK102226153SQ20111012009
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月10日 優先權日2011年5月10日
發明者金濤 申請人:黑龍江大學