人導向糖原蛋白及其編碼序列,以及製法和用途的製作方法

2023-07-21 22:55:46

專利名稱：：人導向糖原蛋白及其編碼序列,以及製法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發明涉及人導向糖原蛋白(HumanProteinTargetingtoG1ycogen，簡稱為「HPTG」)的cDNA序列，該蛋白是鼠PTG的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。大量證據表明，蛋白質的可逆磷酸化調節著細胞功能的諸多方面。蛋白磷酸酶和蛋白激酶的作用使磷酸化過程可逆。蛋白磷酸酶-1(PP1)是一類絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶，它存在於所有真核細胞中，參與許多細胞功能的調控，包括糖原的代謝、肌肉收縮、有絲分裂的停止一類被稱為引導亞基(也被稱為結合亞基)的蛋白在蛋白磷酸酶細胞調控過程中起著重要的作用。蛋白磷酸酶及其底物的多樣性表明酶活性需要嚴格調控。引導亞基可引導蛋白磷酸酶到特定的亞細胞位點，調節底物特性和催化特性，並使該酶對細胞外信號作出正確反應，保證蛋白磷酸酶的忠實性(Trends.Biochem.Sci.1993，18172-177)。一種結合亞基GM可引導PP1到橫紋肌的糖原顆粒和肌質網，GM的Ser-46磷酸化會增加PP1的脫磷酸速率，從而激活糖原合成酶。與此相反，Ser-45的磷酸化會抑制PP1，使糖原合成受抑制，從而刺激糖原再生。另一種結合亞基GL可引導PP1到肝糖原，與PP1結合後增加PP1的脫磷酸速率，從而激活糖原合成酶。它們有共同的參與與PP1結合的基序RVXF，這一基序在其它許多結合亞基中也存在(EMBOJ.1997；16(8)1876-1887；Adv.Prot.Phosphatases1996；8371-376)。GL和GM結合亞基中與PP1結合的結構域已被發現(Eur.J.Biochem.1996；239317-325)。在哺乳動物中也發現了許多其它PP1的結合亞基，其中包括平滑肌肌球蛋白結合引導複合物(由M110和M21組成)(Eur.J.Biochem.1992；2101023-1035)，p53結合蛋白(53BP2)(FEBSLett.1995；377295-300)，核蛋白NIPP-1(J.Biol.Chem.1995；270；28068-28074)，RNA剪接因子PST1(FEBSLett.1996；389183-189)。還有報導另外的一些蛋白與PP1反應，例如成視網膜細胞瘤產物(GenesDev.1993；7555-569)，核糖體蛋白L5(J.Biol.Chem.1995；27019786-19790)等。最近，在小鼠中發現又一個36.4kDa的PP1結合亞基，它被稱為導向糖原蛋白(PTG，proteintargetingtoglycogen)(Science1997；2751475-1478)，該蛋白在人中被稱為PPP1R5(Proteinphosphatase1bindingsubunitR5，蛋白磷酸酶1結合亞基R5)(FEBSLett.1996；399339-343)。該蛋白可在不依賴於激素的情況下激活糖原合成，而且廣譜表達，受磷酸酶的調控也不明顯。進一步的研究表明，PTG的增強表達會影響糖原代謝。實驗結果顯示，PTG在小鼠肝細胞中的過度表達會明顯活化糖原合成酶的活性，激活糖原合成，甚至不依賴於葡萄糖和胰島素；PTG的過度表達還會阻止cAMP介導的糖原分解作用。這些結果表明，PTG的過度表達把細胞鎖定在糖原生成模式(J.Biol.Chem.1998；273(41)26421-26425)。實驗還表明，在過度表達胰島素受體的中國倉鼠卵巢細胞中，PTG的過度表達能明顯增加基礎糖原合成和胰島素刺激下的糖原合成，這提示PTG在糖原代謝中有重要作用，可能作為一種分子支架將糖原合成酶、磷酸化酶α、磷酸化激酶和PP1裝配於糖原顆粒上，形成代謝複合體，就地接受胞內信號(Science1997；2751475-1478)。本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼蛋白磷酸酶結合亞基家族的一個新成員，本發明的蛋白磷酸酶結合亞基家族成員被命名為HPTG。本發明的另一個目的是提供一種新的人蛋白磷酸酶結合亞基家族成員，該蛋白被命名為HPTG蛋白。本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人HPTG多肽的方法。本發明還提供了這種人HPTG核酸序列和多肽的應用。在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HPTG蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQIDNO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列。在本發明的另一方面，提供了一種分離的人HPTG蛋白多肽，它包括具有SEQIDNO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人HPTG蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人HPTG蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人HPTG蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人HPTG蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人HPTG蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人HPTG蛋白活性的多肽。在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為965個核苷酸，其詳細序列見SEQIDNO.3，其中開放讀框位於10-960位核苷酸。在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。在本發明中，術語「人HPTG蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有人HPTG蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中10-960位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQIDNO.3序列的編碼框10-960位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQIDNO.3中10-960位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQIDNO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與人HPTG相同功能的蛋白的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。在本發明中，術語「人HPTG蛋白多肽」指具有人HPTG蛋白活性的SEQIDNO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人HPTG相同功能的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人HPTG蛋白的活性片段和活性衍生物。本發明的多肽變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人HPTGDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人HPTG多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人HPTG多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人HPTG多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人HPTG多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。發明還提供人HPTG蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HPTG多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，「人HPTG保守性變異多肽」指與SEQIDNo.4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。表1本發明還包括人HPTG多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內人HPTG的表達。本發明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人HPTG多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼人HPTG的核酸分子。本發明還包括檢測人HPTG核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於人HPTG多肽的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。另一方面，本發明還包括對人HPTGDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人HPTG基因產物或片段。較佳地，指那些能與人HPTG基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人HPTG蛋白的分子，也包括那些並不影響人HPTG蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人HPTG基因產物結合的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人HPTG基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人HPTG或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人.InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人HPTG功能的抗體以及不影響人HPTG功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人HPTG基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人HPTG基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。本發明的人HPTG核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。在本發明的一個實施例中，HPTG的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15』-CTTTGCCTAATGAGCTGCACCAG-3′為正向引物，寡核苷酸A25′-TTAATTCACGAAAAGGGCCAGTTC-3』為反向引物，進行PCR。測序後得到SEQIDNO.3的全長cDNA序列。研究表明，在哺乳動物中與PP1結合的亞基中，導向糖原蛋白(PTG，proteintargetingtoglycogen)(Science1997；2751475-1478)或PPP1R5(FEBSLett.1996；399339-343)可在不依賴於激素的情況下激活糖原合成，而且廣譜表達，受磷酸酶的調控也不明顯。PTG的增強表達會影響糖原代謝。PTG在大鼠肝細胞中的過度表達可以明顯活化糖原合成酶的活性而激活糖原合成，此外還可以阻止cAMP介導的糖原分解作用。PTG的過度表達把細胞鎖定在糖原生成模式(J.Biol.Chem.1998；273(41)26421-26425)。實驗還表明，在過度表達胰島素受體的中國倉鼠卵巢細胞中，PTG的過度表達能明顯增加基礎的和胰島素刺激的糖原合成(Science1997；2751475-1478)。因此，PTG類蛋白在糖原代謝中起著重要作用。在附圖中，圖1為本發明的人HPTG與人PP1R5的胺基酸序列的同源比較圖。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用「|」標出，相似的胺基酸用「·」標出。相似的胺基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。圖2為本發明的人HPTG與鼠PTG的胺基酸序列的同源比較圖。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用「|」標出，相似的胺基酸用「·」標出。相似的胺基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。圖3為本發明人HPTG與人PP1R5和鼠PTG之間3種蛋白的胺基酸序列同源比較圖。其中，相同的胺基酸在序列下方用「*」標出，相似的胺基酸用「·」標出。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1人HPTG的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15』-CTTTGCCTAATGAGCTGCACCAG-3』(SEQIDNO1)為正向引物，寡核苷酸A25』-TTAATTCACGAAAAGGGCCAGTTC-3』(SEQIDNO2)為反向引物，進行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、66℃1分鐘和70℃1分鐘進行35個循環，最後70℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約1kb的目的片段。2.PCR產物的測序將上述PCR擴增產物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(EpicentreTechnologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共965bp，詳細序列見SEQIDNO3，其中開放讀框位於10-960位核苷酸。根據得到的全長編碼序列推導出人HPTG的胺基酸序列，共316個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQIDNO4。實施例2同源比較用本發明的人HPTG的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中，用BLAST程序進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現，它與人PPP1R5基因及其編碼蛋白具有同源性，在蛋白水平上的同一性達到93％，相似性為94％(圖1)。另外，與鼠的PTG具有較高同源性，同一性為81％，相似性為86％(圖2)。對胺基酸保守區分析表明，本發明的人HPTG蛋白與其同系物在蛋白結構上存在一個與PP1結合作用相關的基序RVXF(圖3中下劃線部分，其中X表示任意胺基酸)，因此，本發明的人HPTG蛋白可歸入PP1結合蛋白家族。蛋白磷酸酶-1(PP1)是絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶中的一類，存在於所有真核細胞中，參與許多細胞功能的調控。一類被稱為引導亞基(也被稱為結合亞基)的蛋白在蛋白磷酸酶細胞調控過程中起著重要的作用。這類亞基會引導蛋白磷酸酶到特定的亞細胞位點，調節底物特性和催化特性，並使該酶對細胞外信號作出正確反應，保證蛋白磷酸酶的忠實性(Trends.Biochem.Sci.1993，18172-177)。進一步的研究表明，PTG的增強表達會影響糖原代謝。實驗表明，在過度表達胰島素受體的中國倉鼠卵巢細胞中，PTG的過度表達能明顯增加基礎糖原合成和胰島素刺激下的糖原合成，這提示PTG在糖原代謝中有重要作用，可能作為一種分子支架將糖原合成酶、磷酸化酶α、磷酸化激酶和PP1裝配於糖原顆粒上，形成代謝複合體，就地接受胞內信號(Science1997；2751475-1478)。實驗還結果顯示，PTG在小鼠肝細胞中的過度表達明顯活化糖原合成酶的活性，激活糖原合成，甚至不依賴於葡萄糖和胰島素；PTG的過度表達阻止cAMP介導的糖原分解作用，這些結果表明，PTG的過度表達把細胞鎖定在糖原生成模式，提示PTG能用於提高肝細胞中葡萄糖的儲備，可能用於治療不依賴於胰島素的糖尿病引起的低血糖(J.Biol.Chem.1998；273(41)26421-26425)。本發明的人HPTG除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人HPTG還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人HPTG的N端與鼠PTG的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對本發明人HPTG的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。此外，本發明人HPTG核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人HPTG的表達水平或者抑制人HPTG的過度表達。本發明的人HPTG蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人HPTG缺失、無功能或異常而導致的有關病症。由本發明HPTG與人PPP1R5及小鼠PTG的高度同源性提示，本發明可能作為一種分子支架參與糖原的代謝，對某些激素，如胰島素傳遞的信息反應，從而可能在治療不依賴於胰島素的糖尿病引起的低血糖時有一定的效果。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。實施例3人HPTG在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼人HPTG的cDNA序列(實施例1的PCR擴增產物A1/A2)用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人HPTGcDNA作為插入片段。PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGAGCTGCACCAGAATGAT-3′(SEQIDNO.5)，該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的人HPTG編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5』-TTGCAAGCTTTCACGAAAAGGGCCAGTTC-3』(SEQIDNO.6)，該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人HPTG的部分編碼序列。引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(QiagenInc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證人HPTG的cDNA片段已正確插入了載體。在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人HPTG。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人HPTG。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化後的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為約36KDa。此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQIDNO.4的序列一致。實施例4人HPTG在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人HPTG的cDNA序列(實施例1的PCR擴增產物A1/A2)用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人HPTGcDNA作為插入片段。PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGAAGCTTATGAGCTGCACCAGAATGAT-3′(SEQIDNO.7)該引物含有HindIII限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的人HPTG編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5』-TTGCGGATCCTCACGAAAAGGGCCAGTTC-3』(SEQIDNO.8)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人HPTG的部分編碼序列。引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1ori)、一個病毒複製起點(SV40ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。用HindIII和EcoRI消化pcDNA3載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coliDH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，PstI酶切鑑定插入片段大小及方向，測序驗證人HPTG的cDNA片段已正確插入了載體。質粒轉染CHO細胞是採用脂轉染法，用Lipofectin(GiBcoLife)進行的。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mMTris-HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris-HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1MNaCl的50mMTris-HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為36kDa。此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQIDNO.4的序列一致。實施例5製備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱人HPTG基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白特異性地發生沉澱。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表(1)一般信息(i)申請人復旦大學(ii)發明名稱人導向糖原蛋白及其編碼序列，以及製法和用途(iii)序列數目8(2)SEQIDNO.1的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO.1AGATTACTATGGAGATCTGGCTG23(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO2TTAATTCACGAAAAGGGCCAGTTC24(2)SEQIDNO.3的信息(i)序列特徵(A)長度965bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)序列描述SEQIDNO.3CTTTGCCTAATGAGCTGCACCAGAATGATCCAGGTTTTAGATCCACGTCCTTTGACAAGT60TCGGTCATGCCCGTGGATGTGGCCATGAGGCTTTGCTTGGCACATTCACCACCTGTAAAG120AGTTTCCTGGGCCCGTACGATGAATTTCAACGACGACATTTTGTGAATAAATTAAAGCCC180CTGAAATCATGTCTCAATATAAAACACAAAGCCAAATCACAGAATGACTGGAAGTGCTCA240CACAACCAAGCCAAGAAGCGCGTTGTGTTTGCTGACTCCAAGGGCCTCTCTCTCACTGCG300ATCCATGTCTTCTCCGACCTCCCAGAAGAACCAGCGTGGGATCTGCAGTTTGATCTCTTG360GACCTTAATGATATCTCCTCTGCCTTAAAACACCACGAGGAGAAAAACTTGATTTTAGAT420TTCCCTCAGCCTTCAACCGATTACTTAAGTTTCCGGAGCCACTTTCAGAAGAACTTTGTC480TGTCTGGAGAACTGCTCGTTGCAAGAGCGAACAGTGACAGGGACTGTTAAAGTCAAAAAT540GTGAGTTTTGAGAAGAAAGTTCAGATCCGTATCACTTTCGATTCTTGGAAAAACTACACT600GACGTAGACTGTGTCTATATGAAAAATGTGTATGGTGGCACAGATAGTGATACCTTCTCA660TTTGCCATTGACTTACCCCCTGTCATTCCAACTGAGCAGAAAATTGAGTTCTGCATTTCT720TACCATGCTAATGGGAAGTCTTTCGGGGACAACAATGATGGTCAGAATTATTGGATTGTT780CATGTTCAATGGAAGCCTGATGGGGTGCAGACACAGGTGGAACCCCAGGACTGTGAATTC840CACCAGACGCCTTCTAAGACAGAGATAGGGTCAACAATCTTTGGCAGGCCAAGGCTTGCT900TACGGGCTCTCCCCAGAGTGGAAAGGTTTGGGGGGAGTTGAGAACTGGCCCTTTTCGTGA960ATTAA(2)SEQIDNO.4的信息(i)序列特徵(A)長度316個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQIDNO.4MetSerCysThrArgMetIleGlnValLeuAspProArgProLeu15ThrSerSerValMetProValAspValAlaMetArgLeuCysLeu30AlaHisSerProProValLysSerPheLeuGlyProTyrAspGlu45PheGlnArgArgHisPheValAsnLysLeuLysProLeuLysSer60CysLeuAsnIleLysHisLysAlaLysSerGlnAsnAspTrpLys75CysSerHisAsnGlnAlaLysLysArgValValPheAlaAspSer90LysGlyLeuSerLeuThrAlaIleHisValPheSerAspLeuPro105GluGluProAlaTrpAspLeuGlnPheAspLeuLeuAspLeuAsn120AspIleSerSerAlaLeuLysHisHisGluGluLysAsnLeuIle135LeuAspPheProGlnProSerThrAspTyrLeuSerPheArgSer150HisPheGlnLysAsnPheValCysLeuGluAsnCysSerLeuGln165GluArgThrValThrGlyThrValLysValLysAsnValSerPhe180GluLysLysValGlnIleArgIleThrPheAspSerTrpLysAsn195TyrThrAspValAspCysValTyrMetLysAsnValTyrGlyGly210ThrAspSerAspThrPheSerPheAlaIleAspLeuProProVal225IleProThrGluGlnLysIleGluPheCysIleSerTyrHisAla240AsnGlyLysSerPheGlyAspAsnAsnAspGlyGlnAsnTyrTrp255IleValHisValGlnTrpLysProAspGlyValGlnThrGlnVal270GluProGlnAspCysGluPheHisGlnThrProSerLysThrGlu285IleGlySerThrIlePheGlyArgProArgLeuAlaTyrGlyLeu300SerProGluTrpLysGlyLeuGlyGlyValGluAsnTrpProPhe315Ser(2)SEQIDNO.5的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO.5TCAGGGATCCATGAGCTGCACCAGAATGAT30(2)SEQIDNO.6的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi序列描述SEQIDNO.6TTGCAAGCTTTCACGAAAAGGGCCAGTTC29(2)SEQIDNO.7的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO.7TCAGAAGCTTATGAGCTGCACCAGAATGAT30(2)SEQIDNO.8的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO.8TTGCGGATCCTCACGAAAAGGGCCAGTTC29權利要求1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人HPTG蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列雜交。2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQIDNO.4所示的序列。3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列。4.一種分離的人HPTG蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQIDNO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。10.一種產生具有人HPTG蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有人HPTG蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人HPTG蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人HPTG蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人HPTG蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人HPTG蛋白活性的多肽。11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQIDNO.3中從核苷酸10-960位。12.一種能與權利要求4所述的人HPTG蛋白多肽特異性結合的抗體。13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。全文摘要本發明提供了一種新的人蛋白質即人導向糖原蛋白(HumanProteinTargetingtoGlycogen,簡稱為「HPTG」),該蛋白是鼠PTG和人PP1R5的同系物。本發明還提供了相應的編碼該蛋白多肽的多核苷酸序列,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。文檔編號C12N15/12GK1261103SQ99101238公開日2000年7月26日申請日期1999年1月22日優先權日1999年1月22日發明者餘龍,屠強,張宏來,趙勇,傅強申請人:復旦大學