紫杉醇及多西紫杉醇的用途的製作方法

2023-07-21 22:43:51 4

專利名稱：：紫杉醇及多西紫杉醇的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及紫杉醇及其多西紫杉醇用於製備疫苗的佐劑用途。
背景技術：
：疫苗是控制人類和動物傳染病的重要手段。一個理想的疫苗用於免疫接種後，不僅可以在被免疫的個體中產生足夠的免疫反應強度，而且可以產生適宜的免疫反應類型，發揮免疫保護作用。在疫苗生產階段，通常採用增加抗原用量或在疫苗中加入佐劑的方法來保障疫苗的有效性。增加抗原的用量使疫苗的生產成本提高，以及潛在著增加抗原依賴性毒副作用的缺點。純化抗原可以減少疫苗的毒副作用，但這又使生產疫苗的成本增加。在疫苗中加入佐劑可以在保障疫苗有效性的同時，減少抗原的用量，減少生產抗原所需的成本，並可在免疫注射時降低抗原依賴性毒副作用的產生，如注射局部紅腫、疼痛，頭暈等。如果所用的佐劑足夠安全，則疫苗中加了佐劑後，在保障疫苗有效性的同時，既可降低疫苗的生產成本，又可提高疫苗的安全性。具有佐劑作用的物質雖然很多，但迄今被美國食品和藥物管理局(FDA)準許的人用疫苗中，氫氧化鋁是唯一的一種佐劑。鋁佐劑在疫苗中吸附抗原而形成複合物，注射後在局部形成抗原貯存庫，緩慢釋放出抗原發揮佐劑作用。鋁佐劑主要促進體液免疫應答，適用於以抗體為保護性免疫的疾病疫苗，如白喉、破傷風、B肝、麻疹等。鋁佐劑雖然在人用或獸用疫苗上廣泛應用，仍存在許多缺點，如輕度局部反應，形成肉芽腫，甚至發生局部無菌性膿腫；人的一種肌肉的局部組織損傷可能和鋁佐劑有關；此外，鋁膠冷凍後膠體狀態被破壞，不能發揮佐劑作用，因此不能冷凍保存；不同製備批次的鋁膠佐劑，膠體狀態不同，難以獲得相同佐劑效果。綜上所述，現有的鋁膠佐劑存在著以下缺陷1)現有的鋁膠佐劑主要促進體液免疫反應，而對細胞免疫反應的效果弱；2)現有的鋁膠佐劑引起的注射部位局部剌激反應大；3)現有的鋁膠佐劑疫苗不能冰凍保存，貯存期短。1963年美國化學家瓦尼(M.C.Wani)和沃爾(MonreE.Wall)首次從一種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉(PacificYew)樹皮和木材中獲得紫杉醇的粗提物。在篩選實驗中，Wani和Wall發現紫杉醇粗提物對離體培養的鼠腫瘤細胞有很高的抑制作用，並開始分離這種活性成份。由於該活性成份在植物中含量極低，直到1971年，他們才同杜克(Duke)大學的化學教授姆克法爾(AndreT.McPhail)合作，通過X-射線分析確定了該活性成份的化學結構是一種四環二萜化合物，並把它命名為紫杉醇(taxol)。純品紫杉醇呈白色結晶性粉末狀，相對分子質量為853.9，熔點為213216t:，無臭，無味，化學結構式如圖1所示。由於其天然含量極低，在當時未引起人們的注意。1977年，Horwitz博士發現其抗癌機理是能夠與癌細胞的微管蛋白結合，促進微管蛋白聚合裝配成微管二聚體，從而抑制微管的正常生理解聚，使細胞有絲分裂停止在G2期及M期，阻止了癌細胞的快速繁殖。紫杉醇抗癌機理的發現推動了它在臨床方面的研究。已有報導，紫杉醇可有效治療卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、食管癌、精原細胞瘤和何金氏淋巴瘤等。目前，紫杉醇製劑已被美國FDA批准作3為抗癌新藥在臨床應用，在我國臨床上也廣泛用於癌症治療。最近的研究發現，紫杉醇有具有脂多糖(LPS)樣作用，能夠激活天然免疫系統，上調一些細胞因子和相關基因的表達。多西紫杉醇(docetaxel)是在紫杉醇的基礎上人工合成的，在C4和C5位置上含有一個帶有氧四環的紫杉烷環結構，並在C13位置上含有一個龐大的酯側鏈，化學結構式如圖2所示。純品多西紫杉醇為白色粉末，相對分子質量為807.88，熔點為232°C。雖然發現紫杉醇和多西紫杉醇的抗癌作用迄今已有40多年，但將上述2者作為疫苗佐劑的使用尚未見報導。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種紫杉醇以及多西紫杉醇的新用途能作為疫苗佐劑。為了解決上述技術問題，本發明提供紫杉醇作為疫苗佐劑的應用。本發明還同時提供了多西紫杉醇作為疫苗佐劑的應用。上述疫苗為蛋白質疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或全病毒疫苗。本發明實際應用中，是在製造疫苗的過程中加入紫杉醇或多西紫杉醇；使每毫升疫苗中含紫杉醇或其多西紫杉醇0.110毫克。本發明充分運用了紫杉醇和多西紫杉醇能夠激活天然免疫系統的原理，以紫杉醇和多西紫杉醇作為疫苗佐劑應用於疫苗的製備，可以大幅度提高疫苗誘導的細胞和體液免疫反應強度，減少注射部位的局部剌激反應，且可以冰凍保存疫苗，延長疫苗貯存期。紫杉醇及其多西紫杉醇用於疫苗生產，方法簡便，無需過多改變現有生產工藝。此外，由於紫杉醇及其多西紫杉醇已經被批准用於人醫臨床，用紫杉醇及其多西紫杉醇作為佐劑開發新型疫苗避免了針對佐劑進行的繁雜的安全性試驗。下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是紫杉醇的化學結構式；圖2是多西紫杉醇的化學結構式；圖3是一免後兩周和二免後兩周各組小鼠血清0VA特異性IgG和IgM抗體效價對比圖；圖3中A代表IgG抗體效價，B代表IgM抗體效價；圖4是一免後兩周和二免後兩周各組小鼠血清OVA特異性IgG亞類水平(血清1:100稀釋)；圖5是二免後兩周各組小鼠脾細胞在特異性抗原0VA和有絲分裂源ConA以及LPS剌激後的增殖情況對比圖；圖6是二免後兩周各組小鼠脾細胞在特異性抗原0VA剌激後細胞因子IL-12,IFN-y，IL-4和IL-10的mRNA表達情況對比圖;圖7是二免後兩周各組小鼠脾細胞在特異性抗原OVA剌激後T-bet/GATA3mRNA表達情況對比圖；圖8是紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)對模式抗原OVA的佐劑作用。4圖9是紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)對全病毒抗原滅活口蹄疫病毒的佐劑作用。上述圖39中，具有a、b不同字母的組表示有統計學差異(P<0.05);圖10是一免後兩周和二免後兩周各組小鼠血清H1N1特異性IgG抗體水平對比圖；圖11是凍融實驗前後的IgG水平的對比圖。具體實施例方式為驗證本發明的紫杉醇及其多西紫杉醇疫苗佐劑作用，用卵清白蛋白(OVA)作為模式抗原進行動物試驗。實例1:不同劑量的紫杉醇對小鼠注射模式抗原卵清白蛋白(OVA)的佐劑作用—、材料和方法1.實驗動物雌性ICR小鼠60隻，購自上海實驗動物中心。2.抗原模式抗原卵清白蛋白(OVA)購自Sigma公司。OVA通過內毒素去除柱(Pierce公司)去除兩次，除去內毒素，然後用BCA試劑盒法定量(Pierce公司)。3.紫杉醇(Taxol)購於上海和氏璧生物技術有限公司(ShanghaiTautoBiotechCo.，Ltd.)。4.氫氧化鋁鋁膠購於浙江萬馬有限公司。5.試驗疫苗製備先將紫杉醇溶解在無水乙醇中(40mg/ml)，OVA溶解在生理鹽水中(0.25mg/ml)。向一試管內加入吐溫_80、無水乙醇、OVA生理鹽水溶液、生理鹽水、紫杉醇溶液或者氫氧化鋁鋁膠，每100微升的實驗疫苗中所含0VA、Taxel和鋁膠的含量如表1所示。表1、各組實驗疫苗所含成分(/1001)tableseeoriginaldocumentpage5tableseeoriginaldocumentpage66.免疫方法60隻小鼠隨機分成6組，每組10隻。每隻小鼠每次皮下注射疫苗0.1ml，注射2次，間隔3周。佐劑及抗原劑量見表1。7.血樣採集—免後和二免後2周分別採血。血樣靜置於4t:冰箱過夜，600g，離心，吸取血清，分裝於0.2ml塑料離心管中，-S(TC保存。8.OVA特異性IgM和IgG的檢測IgM和IgG抗體效價檢測步驟如下(1)用5iig/mlOVA(溶於碳酸鹽緩衝液，pH9.6)包被96孔聚酯板，置於4。C過夜。(2)用PBST(含0.05%吐溫-20的PBS)洗3次。(3)用含5%小牛血清的PBS封閉96孔板1小時，PBST清洗3次。(4)向孔內加入100iii血清(一免後的血清i:ioo稀釋；二免後血清i:1000稀釋)，然後倍比稀釋。(5)將含上述血清的96孔板孵育1小時，再次用PBST洗三次。(6)向孔內加入HRP標記的二抗(山羊抗鼠IgG或IgM，l:5000)100iU，孵育1小時，用PBST洗三次。(7)加入100ii1TMB底物(ExalphaBiologicals，Inc)顯色10-20分鐘。(8)最後用50ill的2MH2S04終止顯色反應，用酶標儀上在450nm處讀取OD值。(9)陽性滴度的終點為OD值高於同等稀釋度的陰性血清(生理鹽水組)平均值的2.1倍。9.OVA特異性IgG亞類的檢測檢測步驟如下(1)用5iig/mlOVA(溶於碳酸鹽緩衝液，pH9.6)包被96孔聚酯板，置於4。C過夜。(2)用PBST(含0.05%吐溫-20的PBS)洗3次。(3)用含5%小牛血清的PBS封閉96孔板1小時，PBST清洗3次。(4)向孔內加入100yi血清(一免後的血清1:100稀釋；二免後血清1:1000稀釋)。(5)將含上述血清的96孔板孵育1小時，再次用PBST洗三次。(6)加入生物素(biotin)標記的二抗IgGl，IgG2a，IgG2b或IgG3(1:1000)，孵育1小時，用PBST清洗3次。(7)加入抗生物素標記的辣根過氧化酶(1:5000)，孵育30分鐘，用PBST洗三次。(8)加入100ii1TMB底物(ExalphaBiologicals，Inc)顯色10-20分鐘。(9)最後用50iil的2MH2S04終止顯色反應，用酶標儀上在450nm處讀取OD值。(10)陽性滴度的終點為OD值高於同等稀釋度的陰性血清(生理鹽水組)平均值的2.1倍。10.淋巴細胞增值試驗淋巴細胞增值試驗步驟如下(1)二免後兩周從小鼠脾臟分離出脾細胞，細胞懸浮在RPMI1640培養液(含10%小牛血清(HyClone)，100UI/ml青黴素和100iig/ml鏈黴素)。若有紅細胞混雜，用O.OlMTris-HCl(含O.83%NH4C1，pH=7.2)裂解，用完全Hank's液清洗細胞，計數，調節細胞濃度至5X106個細胞/ml。(2)向96孔板上每孔加入5X106個細胞。(3)向細胞懸液中加入ConA，LPS或者OVA溶液，使其最終濃度分別為5yg/ml，8iig/ml或100iig/ml。(4)培養板置37°C，5%C02培養。ConA和LPS培養孵育48小時；OVA培養板孵育4天。(5)向細胞培養液內加入50ii1MTT溶液(2mg/ml)，孵育24小時。(6)離心培養板(1400g，5min)，小心倒去細胞培養液。(7)每孔加入150ii1DMSO(含4%的1MHC1)溶解結晶染料。(8)用酶標儀上在450nm處讀取OD值。剌激指數(SI)的計算公式如下SI=(剌激的細胞OD值)/(非剌激細胞OD值)。11.細胞因子與T-bet/GATA-3轉錄因子檢測(1)細胞製備二免後兩周從小鼠脾臟分離出脾細胞，細胞懸浮在RPMI1640培養液(含10%小牛血清(HyClone)，100UI/ml青黴素和100yg/ml鏈黴素)。若有紅細胞混雜，用O.01MTris-HCl(含O.83%NH4C1，pH=7.2)裂解，用完全Hank's液清洗細胞，計數，調節細胞濃度至5X106個細胞/ml。(2)抗原剌激在細胞懸液加入OVA溶液，在5%C02、37。C條件下，培養15小時。(3)總RNA提取將上述細胞培養板離心(500Xg，5min)，小心的除去細胞培養液。向每孔加入1mlRNA提取試劑(RNAisoTMPlus，TaKaRaCo.，Ltd)提取細胞總RNA。在提取的總RNA中加入30ill去RNase和DNase的水溶解。保存提取物於液氮中。(4)cDNA合成反轉錄試劑在200的PCR管(Axygen，USA)中進行，反應總體系為15illRNA+4iil5XiScriptreactionmix+1u1iScriptreversetranscriptase(Bio-RadLaboratories,Inc.USA)。反轉錄在MyCycler(Bio-RadLaboratories,Inc.USA)設備上進行，程序為25。C保溫5分鐘，42。C保溫30分鐘，85。C保溫5分鐘。反轉錄獲得cDNA保存在-20°C。(5)實時雙重PCR法檢測目的基因的表達採用兩重TagMan探針來檢測目的基因的表達，其中P-actin作為內參基因，另外的為一條目的基因。內參基因P-actin探針(Probe)的5'端標記螢光信號HEX和3'端標記螢光淬滅集團BHQ-1;所有待定量的目基因探針的5'端標記螢光信號FAM和3'端標記螢光淬滅集團BHQ-1。PCR反應體系為20iil，其中2ii110XPCRbuffer與0.4iiITag酶(5U/ii1，TakaRa，Co，LTD.DaLian，China)、2iUdNTPmix(2.5mM)、P-actin上下遊引物各2(5yM)、目的基因上下遊引物各2ill(5iiM)、P-actin的探針1(5yM)、目的基因的探針1yl(5yM)、cDNA模板2ii1、去離子水3.6ii1。在ABI7500(PEAppliedBiosystems，Warrington,U.K.)設備上檢測，PCR程序為2步法95t:預變性3分鐘，95t:變性15秒，6(TC退火與延伸30秒，共45個循環。(6)PCR擴增效率的計算通過普通PCR分別擴增內參基因P-actin和目的基因IL-4、IL-IO、IFN-y、IL-12、GATA-3和T-bet擴增，PCR使用的模板為上述反轉錄的cDNA，引物就是實時雙重PCR的引物；PCR反應體系為50iU:其中5iU10XPCRbuffer與0.4iUTag酶(5U/ii1，TakaRa，Co，LTD.DaLian，China)、4ii1d證mix(2.5mM)、P-actin上下遊引物各4iU(5iiM)或目的基因上下遊引物各4iil(5iiM)、cDNA模板2ia、去離子水30.6iU。PCR擴增在MyCycler設備上進行，程序為:95。C預變性3分鐘，95。C變性15秒，6(TC退火與延伸30秒，共35個循環。PCR產物經過電泳分離(3%瓊脂糖)目的基因片段，通過膠回收試劑盒(TakaRaAgaroseGelDNAPurificationKit，DaLian，China)純化出目的DNA並送上海生物工程有限公司測序(SangonCo，Ltd.Shanghai,China)。將上述純化出來的內參基因P-actin和目的基因的片段DNA進行多次的10倍稀釋作為實時雙重PCR反應的模板，每次模板從標準內參基因P-actin和目的基因的片段DNA各取lul。PCR採用的反應體系、設備及其程序完全與步驟(5)—樣。優化PCR，從標準的內參基因13-actin和目的基因中選出8個稀釋梯度，使得其PCR的Ct值在15至45個循環內。每次目的基因的檢測都要同時做該內參基因P-actin和目的基因的8個不同稀釋度雙重PCR。通過其Ct值獲得該條件下內參基因和目的基因的擴增效率。(7)引物設計與目的基因的相對表達計算方法所有檢測的目的基因與內參基因P-actin的引物與探針都參考軟體PrimerExpress3.0(PEAppliedBiosystems,Warrington,U.K.)設計，並且所有目的基因的引物都跨內含子設計，在該雙重PCR反應條件下不能從脾細胞基因組上擴出目的片段。雙重PCR所獲得的每組樣本的內參基因和檢測的目的基因Ct值輸入軟體REST2005(E卯endorf公司獲得)，同時輸入用標準模板做的雙重PCR的內參基因和檢測的目的基因的實際擴增效率。其中設置13-actin為內參基因；生理鹽水組為校正組，最後獲得每組樣本中檢測的目的基因相對於生理鹽水組的表達倍數值。二、結果1.OVA特異性IgG及其亞類模式抗原OVA中加入佐劑(紫杉醇或氫氧化鋁膠)後進行免疫，動物於一免和二免後所產生的IgG效價均高於不加佐劑的對照組。紫杉醇的佐劑作用呈量效關係。紫杉醇的劑量在IOO微克時，動物於一免和二免後產生的IgG應答均高於其它各組產生的IgG效價，並分別為對照組的4.8倍和14.9倍(P<0.05)，如圖3A所示。模式抗原OVA中加入佐劑(紫杉醇或氫氧化鋁膠)後進行免疫，動物於一免和二免後所產生的IgG亞類IgGl，IgG2a，IgG2bandIgG3均高於不加佐劑的對照組。在含紫杉醇的三組中，IgG亞類的變化依賴紫杉醇的劑量。IgGl的應答水平在紫杉醇200微克劑量8組高於50微克劑量組；lgG2a的應答水平在紫杉醇為50微克劑量組高於200微克的劑量組；紫杉醇的劑量為100微克時，IgG各亞類高於其它各組。佐劑顯著促進了IgGl的產生(P0.05)(見圖4)。2.OVA特異性IgM模式抗原OVA中加入100微克或200微克紫杉醇後免疫動物，一免後動物產生的IgM水平是不加佐劑的對照組的4.7倍(P0.05)(見圖3B)。3.淋巴細胞增殖試驗模式抗原OVA中加入佐劑(紫杉醇或氫氧化鋁膠)後免疫動物，加佐劑各組的淋巴細胞剌激指數均高於不加佐劑的對照組。其中以ioo微克紫杉醇組的淋巴細胞剌激指數為最高(見圖5)。4.細胞因子mRNA的表達模式抗原OVA中加入佐劑(紫杉醇或氫氧化鋁膠)後免疫動物，脾淋巴細胞對細胞因子mRNA的表達產生了顯著的變化。這種變化取決於佐劑的種類以及紫杉醇的劑量。紫杉醇在高劑量(200微克)時促進較高的IL4和IL10mRNA表達以及較低的IFNy和IL12mRNA表達；紫杉醇在低劑量(50微克)時促進較低的IL4和IL10mRNA表達以及較高的IFNy禾PIL12mRNA表達。100微克紫杉醇組產生最高的IL4，ILIO，IFNy禾PIL12mRNA表達。鋁膠顯著促進IL4和IL10mRNA的表達，但對IFNy和IL12mRNA無促進作用(見圖6)。5.轉錄因子T-bet和GATA-3mRNA表達轉錄因子T-bet和GATA-3mRNA的表達依賴於佐劑的種類和劑量。高劑量紫杉醇(200微克)比低劑量紫杉醇(50微克)促進更高的DATA-3和更低的T-betmRNA表達；低劑量紫杉醇(50微克)比高劑量紫杉醇(200微克)促進更高的T-bet和更低的GATA-3mRNA表達。鋁膠顯著促進GATA-3(P0.05)(見圖7)。實例2紫杉醇和多西紫杉醇對小鼠注射模式抗原卵清白蛋白(OVA)的佐劑作用—、材料和方法1.實驗動物雌性ICR小鼠30隻，購自上海實驗動物中心。2.抗原模式抗原卵清白蛋白(OVA)購自Sigma公司。OVA通過內毒素去除柱(Pierce公司)去除兩次，除去內毒素，然後用BCA試劑盒法定量(Pierce公司)。3.紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)購於上海和氏璧生物技術有限公司(ShanghaiTautoBiotechCo.，Ltd.)4.試驗疫苗製備先將紫杉醇或多西紫杉醇溶解在無水乙醇中(40mg/ml)，OVA溶解在生理鹽水中(0.25mg/ml)。向一試管內加入吐溫-S(K無水乙醇力VA生理鹽水溶液、生理鹽水、紫杉醇溶液或多西紫杉醇，使每100微升的實驗疫苗中所含物質如表2所示。表2、各組實驗疫苗所含成分(/100iU)9tableseeoriginaldocumentpage105.免疫方法30隻小鼠隨機分成3組，每組10隻。每隻小鼠每次皮下注射疫苗O.1ml—次。佐劑及抗原劑量見表2。6.血樣採集—免後2周採血。血樣靜置於4t:冰箱過夜，600g，離心，吸取血清，分裝於0.2ml塑料離心管中，-8(TC保存。7.OVA特異性IgG的檢測IgG抗體效價檢測步驟如下(1)用5iig/ml0VA(溶於碳酸鹽緩衝液，pH9.6)包被96孔聚酯板，置於4t:過夜。(2)用PBST(含0.05%吐溫-20的PBS)洗3次。(3)用含5%小牛血清的PBS封閉96孔板1小時，PBST清洗3次。(4)向孔內加入lOOiU血清(1:50稀釋)。(5)將含上述血清的96孔板孵育1小時，再次用PBST洗三次。(6)向孔內加入HRP標記的二抗(山羊抗鼠IgG，l:5000)100iU，孵育1小時，用PBST洗三次。(7)加入100ii1TMB底物(ExalphaBiologicals，Inc)顯色10-20分鐘。(8)最後用50ill的2MH2S04終止顯色反應，用酶標儀上在450nm處讀取0D值。二、結果紫杉醇組和多西紫杉醇組的IgG水平均顯著高於對照組，說明紫杉醇和多西紫杉醇有佐劑作用(見圖8)。實例3紫杉醇和多西紫杉醇對小鼠注射全病毒抗原滅活口蹄疫病毒(FMDV)的佐劑作用—材料和方法1.實驗動物雌性ICR小鼠24隻，購自上海實驗動物中心。2.抗原和佐劑抗原為滅活O型口蹄疫病毒(FMDV)，由內蒙古金宇生物製品有限公司提供。紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)購於上海和氏璧生物技術有限公司(ShanghaiTautoBiotechCo.，Ltd.)。103.實驗疫苗的製備先將紫杉醇或多西紫杉醇溶解在無水乙醇中(40mg/ml);FMDV用生理鹽水1:4(體積比)稀釋，向一試管內加入吐溫-S(K無水乙醇.FMDV生理鹽水溶液、生理鹽水、紫杉醇或多西紫杉醇溶液，使每200微升的實驗疫苗中所含物質如表3所示。表3各組實驗疫苗所含成分(/2001)tableseeoriginaldocumentpage114.免疫方法24隻小鼠隨機分成3組，每組8隻。每隻小鼠每次肌肉注射疫苗0.2ml，注射2次，間隔3周。5.血樣採集二免後2周採血。血樣靜置於4。C冰箱過夜，600g，離心，吸取血清，分裝於0.2ml塑料離心管中，-2(rC保存。[OH2]6.特異性IgG檢測(1)在ELISA板上每孔加入50y1經碳酸鹽緩衝液(pH9.6)稀釋的牛抗0型口蹄疫病毒抗體(l:1000)(內蒙古金宇生物製品有限公司)，封板，4t:過夜。(2)用洗滌液洗滌5次，每次300iU，拍幹。每孔加入300ia磷酸鹽緩衝液(含5%脫脂奶+0.05%吐溫-20)封閉，37t:孵育2小時。(3)用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，每次300yl，拍幹。每孔加入50iU經1:3稀釋的0型口蹄疫病毒抗原，振蕩混勻，4t:孵育2小時。(4)用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，每次300yl，拍幹。每孔加入50y1經磷酸鹽緩衝液(含0.05%吐溫-20)1:50稀釋的待檢血清，37。C孵育1小時。(5)用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，每次300ii1，拍幹。每孔加入經1:1000稀釋的山羊抗小鼠IgG(h+l)抗體(美國BetheylLaboratory公司)。37。C孵育1小時。(6)用磷酸鹽緩衝液洗滌5次，每次300yl，拍幹。每孔加入經1:10000兔抗山羊IgGFC-HRP，37t:孵育1小時。用洗滌液洗滌5次，每次300yl，拍幹。(7)每孔加入100ii1TMB底物溶液。室溫孵育15分鐘，每孔加入50iU2MH2S04終止反應，並輕輕振蕩混勻。在15分鐘內，用酶標儀測定在450nm波長的0D值。二結果紫杉醇或多西紫杉醇和口蹄疫病毒混合注射比口蹄疫病毒單獨注射可以誘導出更高的抗FMDV抗體(見圖9)(P<0.05)。實例4多西紫杉醇對小鼠注射滅活H1N1流感裂解病毒抗原的佐劑作用—材料和方法1.實驗動物雌性ICR小鼠64隻，購自上海實驗動物中心。2.抗原和佐劑抗原為滅活H1N1流感裂解病毒，由浙江省疾病控制中心提供。多西紫杉醇(Docetaxel)購於上海和氏璧生物技術有限公司(ShanghaiTautoBiotechCo.，Ltd.)。3.實驗疫苗的製備先將多西紫杉醇溶解在無水乙醇中(40mg/ml)，滅活H1N1流感裂解病毒溶解在生理鹽水中(0.25mg/ml)。向一試管內加入吐溫_80(5%體積比)、無水乙醇(5%體積比)、H1N1流感抗原生理鹽水溶液、生理鹽水、多西紫杉醇溶液，使每100微升的實驗疫苗中所含物質如表4所示。表4各組實驗疫苗所含成分組別H1N1(ng/100u1)Docetaxel(tig/100u1)110250310041000511006510071010081001004.免疫方法64隻小鼠隨機分成8組，每組8隻。每隻小鼠每次肌肉注射疫苗0.2ml，注射2次，間隔3周。5.血樣採集首免和二免後2周採血。血樣靜置於4t:冰箱過夜，600g，離心，吸取血清，分裝於0.2ml塑料離心管中，-2(TC保存。6.間接ELISA法檢測抗流感病毒IgG(1)在96孔酶標板中每孔加入100ii1包被液(含流感病毒1yg/ml的0.05mol/L碳酸鹽緩衝液)，4t:過夜；(2)用含O.05%(v/v)Tween-20的PBS洗滌液(簡稱PBST)洗滌3次，每孔30QiU，12每次3min。每孔加入300ill含3%(w/v)脫脂乳的PBS封閉液，37。C孵育lh;(3)洗板，加入待檢血清和陰性血清，每孔lOOiU。血清經l:500稀釋後加入，37。C孵育30min;(4)洗板，加入1:10000辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG抗體，100ii1/孔，37。C孵育30min;(5)洗板，加入TMB底物溶液顯色，100iil/孔，37。C孵育15min;(6)每孔加50ill2NH2S04終止反應；(7)酶標儀測定0D45。值。二結果多西紫杉醇和H1N1流感裂解病毒抗原混合注射比流感病毒抗原單獨注射可以誘導出更高的抗流感病毒抗體(見圖10)(P<0.05)。實例5凍融對紫杉醇、多西紫杉醇和氫氧化鋁鋁膠佐劑作用的影響—、材料和方法1.實驗動物雌性ICR小鼠32隻，購自上海實驗動物中心。2.抗原模式抗原卵清白蛋白(OVA)購自Sigma公司。OVA通過內毒素去除柱(Pierce公司)去除兩次，除去內毒素，然後用BCA試劑盒法定量(Pierce公司)。3.紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)購於上海和氏璧生物技術有限公司(ShanghaiTautoBiotechCo.，Ltd.)4.氫氧化鋁鋁膠購於浙江萬馬有限公司.5.試驗疫苗製備先將紫杉醇或多西紫杉醇溶解在無水乙醇中(40mg/ml)，OVA溶解在生理鹽水中(0.25mg/ml)。向一試管內加入吐溫-80(5%)、無水乙醇(5%)、OVA生理鹽水溶液、生理鹽水、紫杉醇或多西紫杉醇溶液或者氫氧化鋁鋁膠，使每ioo微升的實驗疫苗中所含物質如表5所示。表5各組實驗疫苗所含成分(Pg/100iU)組別OVATaxolDocetaxel鋁膠1100002101000031001000410002006.實驗疫苗的凍融步驟5製備的實驗疫苗在室溫至-2(TC反覆凍融3次，備用。7.免疫方法32隻小鼠隨機分成4組，每組8隻。每隻小鼠每次皮下注射疫苗O.lml，注射2次，間隔3周。佐劑及抗原劑量見表5。8.血樣採集二免後2周採血。血樣靜置於4t:冰箱過夜，600g，離心，吸取血清，分裝於0.2ml塑料離心管中，-8(TC保存。9.OVA特異性IgG的檢測IgM和IgG抗體效價檢測步驟如下(1)用5iig/mlOVA(溶於碳酸鹽緩衝液，pH9.6)包被96孔聚酯板，置於4。C過夜。(2)用PBST(含0.05%吐溫-20的PBS)洗3次。(3)用含5%小牛血清的PBS封閉96孔板1小時，PBST清洗3次。(4)向孔內加入lOOiil血清(1:100稀釋)。(5)將含上述血清的96孔板孵育1小時，再次用PBST洗三次。(6)向孔內加入HRP標記的二抗(山羊抗鼠IgG或IgM，l:5000)100iU，孵育1小時，用PBST洗三次。(7)加入100ii1TMB底物(ExalphaBiologicals，Inc)顯色10-20分鐘。(8)最後用50iil的2MH2S04終止顯色反應，用酶標儀上在450nm處讀取OD值。(9)陽性滴度的終點為OD值高於同等稀釋度的陰性血清(生理鹽水組)平均值的2.1倍。二、結果以鋁膠為佐劑的實驗疫苗經三次凍融後免疫動物，IgG水平比未凍融鋁膠組顯著下降(P0.05)(見圖10)。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。1權利要求紫杉醇作為疫苗佐劑的應用。2.多西紫杉醇作為疫苗佐劑的應用。全文摘要本發明公開了紫杉醇作為疫苗佐劑的應用，還公開了多西紫杉醇作為疫苗佐劑的應用。疫苗為蛋白質疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或全病毒疫苗。本發明充分運用了紫杉醇和多西紫杉醇能夠激活天然免疫系統的原理，以紫杉醇和多西紫杉醇作為疫苗佐劑應用於疫苗的製備，可以大幅度提高疫苗誘導的細胞和體液免疫反應強度，減少注射部位的局部刺激反應，且可以冰凍保存疫苗，延長疫苗貯存期。文檔編號A61K39/39GK101766815SQ20091015568公開日2010年7月7日申請日期2009年12月31日優先權日2009年12月31日發明者胡松華申請人:胡松華