用於疾病治療的嵌合蛋白的製作方法
2023-07-22 01:14:06 1
用於疾病治療的嵌合蛋白的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種嵌合蛋白，其是由(i)來自清道夫受體的病原體識別模塊和(ii)來自不同清道夫受體的錨定域製備得到的。這種嵌合蛋白與特定的病原體相結合，並且可用於許多治療中。
【專利說明】用於疾病治療的嵌合蛋白
【背景技術】
[0001] 本申請要求2012年3月12日提交的、申請號為No. 61/609,523美國臨時專利申 請的優先權。其公開的全部內容以引用的形式併入本申請。
[0002] 本申請包括於2013年3月12日創建的序列表，該文件為ASCII格式，名稱為 "5〇八1?200003_5125411'，大小為123,236位元組。該文件的全部內容以引用的方式併入本申 請。
[0003] 本發明涉及與重組嵌合蛋白的產生和使用相關的方法、材料、組合物、應用以及治 療，這種重組嵌合蛋白在本文中可以被稱為混雜清道夫受體。
[0004] 膿毒症通常被定義為病理感染和生理變化的組合，統稱為全身炎症反應症候群 (SIRS)。相關術語敗血症是指血液中存在病原微生物，會導致膿毒症。在本文中這兩個術 語通常互換使用。
[0005] 膿毒症的死亡率很高，據報導，儘管經過抗生素的治療，在受嚴重影響的患者中仍 有20%至50%的死亡率。膿毒症是非冠脈重症監護病房（"I⑶"）患者的第二大死亡原 因，還是美國的第十大死亡原因，歐洲的數據與此類似。此外，膿毒症是幼年個體死亡的主 要原因，並且對於倖存的人來說其終生的生活質量也降低了。目前膿毒症的治療主要包括 廣譜抗生素和器官支持治療，並且往往是無效的。隨著病原體之間抗生素抗性的增加，治療 的功效則會減少。
[0006] 儘管整體住院死亡率下降，在過去22年中膿血症的發病率已經大幅上升並且死 亡數目仍在增長。根據醫院的出院記錄，使用ICD-9編碼創建了美國的膿毒症記錄，並且據 估計，每年超過751，000例重症膿毒症發生，佔住院的2. 1 %至4. 3%和所有接診的重症監 護病房的11%。據估計，在過去的20年裡，膿毒症在美國的發生率已經顯著地增加。發病 率增加的可能原因包括侵入性操作應用的增加，免疫抑制藥物、化療和移植，人類免疫缺陷 病毒（HIV)感染疫情的出現，以及微生物抗性的增加。隨著時間的推移，具體的致病微生物 的相對頻數發生了轉變，最近革蘭氏陽性菌特別明顯。令人擔憂的是，膿毒症導致的器官衰 竭越來越多，並且成為死亡的主要原因。在歐洲可能有類似的情況。
【發明內容】
[0007] 本文公開了可用於與病原體結合的多種嵌合蛋白。簡單地說，每種蛋白包含來源 自哺乳動物清道夫受體的病原體識別模塊。每種蛋白還包含用於將所述嵌合蛋白固定在適 當位置的錨定域。
[0008] 本文在各種實施方案中公開的重組嵌合蛋白包含：來自哺乳動物清道夫受體的病 原體識別模塊、和錨定域。
[0009] 該蛋白還可包含介於所述病原體識別模塊和所述錨定域之間的連接體。該連接體 可以為約2至約5個胺基酸的序列。該連接體可以包含至少兩種不同的胺基酸。在一些實 施方案中，這兩種不同的胺基酸選自由丙氨酸、組氨酸和甘氨酸組成的組。
[0010] 該蛋白質還可包含親和標記。親和標記可以選自由血凝素、V5、Myc、I7、FLAG、HSV、 VSV-G、6-His、生物素/鏈黴親和素和STREP所組成的組。
[0011] 所述病原體識別模塊可以為病原體結合域，其來自哺乳動物細胞表面受體家族， 例如SCARA3、CD36、CD163、CD68、L0X-1、SREC-I或SCARA5。這些清道夫受體含有病原體結 合域，例如保守SRCR結構域，C型凝集素樣結構域（CTLD)，或膠原序列。
[0012] 所述錨定域可以是免疫球蛋白的Fc段。可替代地，所述錨定域可以是來自哺乳動 物清道夫受體的Ct -螺旋捲曲螺旋域（ctHielical coiled coil domain)。所述錨定域也 可以是親和標記。在本發明的特定實施方案中，獲得病原體識別模塊的哺乳動物清道夫受 體與獲得錨定域的哺乳動物清道夫受體不同。
[0013] 該蛋白還可包含信號肽。
[0014] 本文還公開了編碼所述嵌合受體蛋白的核酸序列、包含該核酸序列的載體、以及 包含該載體的宿主細胞。
[0015] 本文還公開了一種含有嵌合蛋白和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中所述 嵌合蛋白包含來自清道夫受體的病原體識別模塊、和錨定域。
[0016] 本文還公開了一種含有固相和固定在該固相上的嵌合蛋白的親和介質，其中，所 述嵌合蛋白包含來自清道夫受體的病原體識別模塊、任選的連接體、和錨定域，所述錨定域 附著在所述固相上。
[0017] 此外，本發明描述了一種選擇性地再生所公開的親和介質的方法，其中通過對所 述介質進行處理，從而使所結合的病原體或病原體衍生分子脫落，同時使固相之間的連接 以及嵌合蛋白與固相之間的連接保持原狀。
[0018] 本發明還描述了一種用於治療與病原體或病原體衍生分子相關的疾病的方法，其 包括：接收含有固相和固定在該固相上的嵌合蛋白的親和介質，所述嵌合蛋白包含（i)來 自清道夫受體的病原體識別模塊和（ii )錨定域；將所述親和介質與生物樣品接觸，從而使 病原體或病原體衍生分子與親和介質結合。
[0019] 本文還描述了一種用於確定受試親和介質對於病原體的有效性的方法，其包括： 接收含有病原體的生物樣品；使生物樣品與所述受試親和介質的病原體識別模塊接觸；以 及檢測病原體和病原體識別模塊之間結合的量。此方法可進一步包括將病原體和受試親和 介質的病原體識別模塊之間結合的量與參考值進行對比。
[0020] 本文的多個實施方案公開了一種用於預防和治療與病原體或病原體衍生分子相 關的疾病的藥物，包含位於適於局部施用的載體中的嵌合蛋白。
[0021] 本文還公開了一種重組嵌合蛋白，由以下構成：信號肽、至少一種親和標記、任選 的連接體、來自哺乳動物清道夫受體的病原體識別模塊和錨定域。
[0022] 本文還公開了用於診斷患者是否患有與病原體或病原體衍生分子相關的疾病的 方法，其包括：接收包括固相和固定在該固相上的固定空間內的嵌合蛋白的親和介質，所述 嵌合蛋白包含（i)來自清道夫受體的病原體模塊和（ii)錨定域；接收由患者獲得的生物樣 品；使生物樣品與親和介質接觸，從而使病原體或病原體衍生分子結合到固定空間；檢測 固定空間是否存在所結合的病原體或病原體衍生分子。該檢測可通過使任何所結合的病原 體或病原體衍生分子與標記探針雜交來進行。
[0023] 下面將更具體地描述這些和其他非限制性的特徵。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 本專利或申請文件包含至少一個用彩色顯示的附圖。在提出請求並繳納所需費用 的基礎上，官方將會提供包含彩色附圖的本專利或專利申請公布文本的副本。
[0025] 以下提供附圖的簡要說明，其用於說明本發明所公開的示例性實施方案，而不是 為了限制這些實施方案。
[0026] 圖IA和圖IB為示出了不同類別的清道夫受體蛋白在結構上的相似和差異的圖。 通過對 Piatt, N.et al. Trends Cell Biol. Volume 8, Issue 9, ISeptember 1998, Pages 365-372進行修訂得到圖IA和IB。這些圖未精確地顯示這些蛋白質的相對尺寸。
[0027] 圖2為示出本發明的嵌合蛋白一種可能的應用的圖。
[0028] 圖3為用於密度分析的顯微照片，其顯示了與固相（此處為珠子）結合的蛋白。
[0029] 圖4示出用於分析與固相結合的蛋白量的Bradford分析標準曲線。
[0030] 圖5為組圖，其示出當四種不同的細菌暴露在含有第一嵌合蛋白的親和介質下的 結果。這組圖示出在由親和介質洗漆連續級分（consecutive fraction)的過程中活菌的 數量，以及在該實驗過程總存活細菌的計數。
[0031] 圖6為組圖，其示出當四種不同的細菌暴露在含有第二嵌合蛋白的親和介質下的 結果。這組圖示出在由親和介質洗滌連續級分的過程中活菌的數量，以及在該實驗過程總 存活細菌的計數。
[0032] 圖7為組圖，其示出當產超廣譜@ -內醯胺酶（ESBL)的大腸桿菌（E. coli)暴露 在含有第三嵌合蛋白的親和介質下的結果。這組圖示出在由親和介質洗滌連續級分的過程 中活菌的數量，以及在實驗結束時留存在柱子中的存活細菌的計數。
[0033] 圖8為組圖，其示出當產生超廣譜@ -內醯胺酶（ESBL)的大腸桿菌（E. coli)的 暴露在含有第四嵌合蛋白的親和介質下的結果。這組圖示出在洗滌親和介質的連續級分過 程中活菌的數量，以及在實驗結束時留存在柱子中存活細菌的數目。由三個獨立的試驗得 到的平均值和標準偏差如圖所示。
[0034] 圖9A和圖9B示出暴露於來自實施例1的每個柱級分（即第一嵌合蛋白質）的外 周血單個核細胞（PBMC)中的TNF產量。
[0035] 圖IOA和圖IOB示出暴露於來自實施例2的每個柱級分（即第二嵌合蛋白質）的 外周血單個核細胞（PBMC)中的TNF產量。
[0036] 圖11為一組照片，其示出熱滅活的大腸桿菌和乙醯化低密度脂蛋白（acLDL)與兩 種不同的嵌合蛋白質、完整SCARA5以及對照的結合情況。使用anti-SCARA5抗體對表達進 行確認。
[0037] 圖12為一組圖片，其示出與對照Crb2細胞相比，通過SCARA5轉染細胞對細菌脂 多糖（LPS)的內化作用。使用anti-SCARA5和anti-Crb2的抗體對SCARA5和Crb2的表達 進行確認。
[0038] 圖13為組圖，其示出在外周血單個核細胞（PBMC)中誘導的TNF產量，所述外周血 單個核細胞來自於供體並暴露於使混合在人血清中的病原體通過下列柱子所獲得的柱流 過物中，所述柱子包含與不同的嵌合受體蛋白相結合的珠子。對照組包括未與嵌合受體結 合的珠子。
[0039] 圖14為與圖13類似的第二組圖表，但是含有不同的病原體。
[0040] 圖15示出斑點印跡的結果，其中採用與圖13和圖14中相同的設備，但是使用不 同的洗滌溶液將結合的病原體從對照珠子和負載有嵌合受體（SEQ ID NO :35, SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO :41)的珠子上洗脫下來。這種情況下，使用抗生物素 HRP-偶聯抗體（生物 素檢測）使施加到柱子上（加載）的材料（在流過和洗滌後）中的生物素化的MRSA顯示。 洗滌溶液1在任何環境條件下都不能洗脫所結合的MRSA，但洗滌溶液2對於負載有SEQ ID NO :41和SEQ ID NO :43的珠子而言則可以洗脫所結合的MRSA。在使用洗滌溶液3將珠子 上的所有物質都洗脫下來後，在對照珠子或負載有SEQ ID NO :35的珠子中沒有檢測到結合 的細菌碎片（生物素）。
[0041] 圖16為經一組親和標記標記的蛋白的五種免疫組織化學（IHC)照片，用來與圖17 對比。其蛋白存在的量高。
[0042] 圖17為經另一組親和標記標記的蛋白的五個免疫組織化學（IHC)照片，用來與圖 16對比。其蛋白存在的量更低。
[0043] 圖18為一組Western印跡，其示出兩種嵌合受體（由SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :41表達）對三種病原菌菌種或裸露基質的親和性。左圖示出每種受體蛋白在初始溶液 中的存在狀態。右圖示出在添加各種細菌和經過洗滌之後蛋白仍附著在珠子上。對於附著 於TALON珠子上的His-標記蛋白以及附著於經鏈黴親和素包覆的瓊脂糖上的Avi標記的、 生物素化的蛋白而言，也是同樣的。可以看出，對於革蘭氏陽性菌（除革蘭氏陰性的大腸杆 菌或His-標記的蛋白之外），混合後嵌合受體的濃度下降-這表明在病原體分子/瓊脂糖 和嵌合受體之間形成了結合，從而使溶液中不再含有某些蛋白。
[0044] 發明詳述
[0045] 參考附圖，可以更透徹地理解本文公開的組合物和方法。這些圖僅僅是為了方便 和易於說明本發明的示意性表示，因此並非意在限定或限制示例性實施方案的範圍。
[0046] 儘管在以下描述中為清楚起見使用了特定的術語，這些術語僅僅是為了指代附圖 中用於說明的實施方案的具體結構，並非意在限定或限制本公開的範圍。應當理解的是，在 附圖和以下描述中，相似的數字標記指代具有相似功能的組件。
[0047] 此處所涉及的所有出版物、專利和專利申請均以全文引用的方式併入本文。
[0048] 本發明涉及一種基於哺乳動物清道夫受體蛋白（針對本發明的目的簡稱為清道 夫受體，或簡稱SR)的嵌合蛋白。大約有30種人類受體蛋白（都具有可溶性和膜結合性）， 其具有一個或多個古老的、高度保守的蛋白模塊-清道夫受體富含半胱氨酸（SRCR)的結構 域。SRCR結構域大概是90至110個胺基酸長，並具有高的和明確的半胱氨酸含量。基於 SRCR結構域的特徵，曾經報導過兩類SR成員：具有A類結構域的SR(SCARA ;由至少兩個外 顯子編碼並且含有6個半胱氨酸殘基）和具有B類結構域的SR(由一個外顯子編碼並且含 有8個半胱氨酸殘基）。有時也有例外，包括一種呈現截斷的SRCR結構域的SCARA，該SRCR 結構域中含有四個半胱氨酸。同樣的，在B組成員之間也發現含有6個半胱氨酸的分離的結 構域，CD5、CD163、WC1 和 MC16 也有這種情況。另外，Spa/AIM，WC1/T19 以及 CRP-ductin (小 鼠 DMBT1)具有包含7個半胱氨酸的獨立結構域。但是，還沒有報導過在相同清道夫受體上 同時存在A類和B類結構域的情況。序列分析已表明，儘管SRCR結構域具有不同程度的同 源性，但是半胱氨酸的相對位置還是以二硫鍵的形式在結構域中很好的保留下來。因此，序 列分析揭示了半胱氨酸Cl和C4形成二硫鍵，因為它們總是在B類而不是A類中存在。蛋 白水解分析表明其他形成二硫鍵的半胱氨酸對為C2-C7、C3-C8和C5-C6。而這些結果也已 經通過結晶的獨立蛋白結構域的結構分析得以確認。
[0049] 除了所討論的SRCR結構域之外，任何SR通過其在造血譜系的免疫細胞亞群表面 上的位置得以表徵。此外，不同數量和程度的SR表達可以在幾乎所有其他類型的細胞中找 至IJ，並且它們能夠從這些細胞中結合大量的內源性配體。這些包括乙醯化或氧化的低密度 膽固醇（LDL)，以及正常的高密度膽固醇（HDL)、血紅蛋白、鐵和碳水化合物。SR還結合革蘭 氏陽性細菌以及革蘭氏陰性細菌。
[0050] 圖1示出不同類別的清道夫受體（SR)的結構特徵。
[0051] A類SR為三聚體糖蛋白，其有以下幾種亞型：SR-A類I和II (SCARAl)、 嫩尺0)(504狀2)、51?-(^類1和11(504狀4)、和504狀5。此處對504狀3亞型不予說明。三 聚體分子由包含胞漿區A、跨膜結構域B、隔離域C、a螺旋捲曲螺旋域D、膠原三螺旋結構 域E、富含半胱氨酸的結構域F或C型凝集素樣結構域G的模塊構建而成。I類SR-A受體 有6個結構域，而II類受體不含有富含半胱氨酸結構域F。MRCO受體不含有a螺旋捲曲 螺旋域D，而含有相對長的膠原三螺旋結構域E。在SR-CL I類受體中，富含半胱氨酸結構 域F由C型凝集素樣結構域G代替。SCARA5受體與具有6個域的SR-A I類受體相似。在 A類SR，膠原結構域E中，富含半胱氨酸的結構域F或C型凝集素樣結構域G包括結合位點 的乙醯化低密度脂蛋白或細菌和其他的配體，還應當注意的是，在A類SR中，N-末端是在 細胞質中。
[0052] B類SR包括，例如⑶36和⑶163。⑶36採取兩極構型，具有胞外域H，H的兩側與 兩個跨膜結構域B和兩個胞漿結構域A相連接。胞外域包含疏水性結構域、富含脯氨酸結構 域、和幾個結合位點。所述CD163蛋白具有位於其C端的胞漿區A、跨膜結構域B和胞外域， 該胞外域僅包括9個B類SRCR結構域J，通過其N-末端的SRCRl和靠近C-末端的SRCR9 進行編號。B類SRCR結構域有四個雙硫鍵，而A類SRCR結構域有三個雙硫鍵。
[0053] D類SR包括，例如⑶68 (也被稱為巨噬唾液酸蛋白）。⑶68的C-末端在細胞質 中。CD68包括胞漿區A、跨膜結構域B、溶酶體相關膜蛋白（LAMP)樣結構域K和粘蛋白樣結 構域L。
[0054] 現在已知的E類SR是L0X-1。L0X-1的N-末端在細胞質中。L0X-1包括胞漿區A、 跨膜結構域B、和C-類凝集素域G。含有凝集素的C-類凝集素樣結構域（CTLD)是Ca 2+-依 賴性、碳水化合物結合蛋白。此結構超家族還包含Ca2+-非依賴性凝集素、以及具有凝集素 樣結構域但不與碳水化合物結合的蛋白。但是，可以通過它的四個（有時為六個）保守半 胱氨酸殘基來識別CTLD摺疊。具有CTLD的蛋白並非必須為SR，還包括一些可溶性蛋白，例 如甘露糖結合凝集素（MBL)和表面活性蛋白（SP-A和SP-D)。儘管如此，CTLD被公認為存 在於SR甘露糖受體、L0X-1和SCARA4中。
[0055] 目前已知的F類SR為SREC-I。SREC-I的C-末端是在細胞質中。SREC-I包括胞 漿區A、跨膜結構域B和具有5個EFG樣結構域M的胞外域。
[0056] SCARA3蛋白的胺基酸序列是SEQ ID NO :46。SCARA3結構與SCARAl的剪接變體 II相似，其包含N-末端胞漿結構域、跨膜結構域、間隔域、捲曲螺旋結構域和膠原結構域。 C-末端膠原結構域胺基酸殘基440-543和513-572包括與配體結合的位點，例如斷裂和聚 腺苷酸化特異性因子3 (CPSF3)和X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP)。
[0057] CD36蛋白的胺基酸序列是SEQ ID NO :47。CD36蛋白包括在胺基酸155-183、氨基 酸28-93、和胺基酸120-155之間的多個OxLDL結合位點。其他結合位點在胺基酸93-120 之間。胺基酸139-184、胺基酸146-164和胺基酸145-171之間的結構域也被顯示其介導與 PfEMP-I的結合。
[0058] ⑶163蛋白的胺基酸序列是SEQ ID NO :48。每個單獨的SRCR結構域J是結合結 構域，其與相鄰的SRCR結構域組合在一起。SRCRl結構域由胺基酸1-148編碼。SRCR2結 構域由胺基酸149-255編碼。SRCR3結構域由胺基酸256-362編碼。SRCR4結構域由氨基 酸363-469編碼。
[0059] ⑶68蛋白的胺基酸序列是SEQ ID NO :49。LAMP樣結構域K和粘蛋白樣結構域L 都是結合位點。
[0060] L0X-1蛋白質的胺基酸序列是SEQ ID NO :50。C-類凝集素結構域G是結合位點。
[0061] SREC-I蛋白質的胺基酸序列是SEQ ID NO :51。每個EGF樣結構域M都是結合位 點。一個EGF樣結構域包含30-40個胺基酸殘基和2-3個二硫鍵，並且還具有2個P -折 疊。
[0062] 不同於合成抗生素，SR與人類病原體共同進化，其通過作為模式識別受體構成天 然免疫防禦的重要組成部分，特別是在對抗細菌病原體方面。一些SR表達於巨噬細胞和樹 突狀細胞，它們在這些細胞中充當吞噬受體，介導結合併攝取包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰 性細菌、細胞內細菌和病毒RNA的病原微生物。SR也用作Toll樣受體（TLR)的共同受體， 調節對TLR激動劑的炎性反應。已經報導的SR通常結合脂多糖（LPS)和脂磷壁酸（LTA)， LPS和LTA分別存在於革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的表面上。最近，有資料表明細菌表面 蛋白也稱為SR的重要目標分子。此外，細胞內的病原體，包括病毒和惡性瘧原蟲，使用SR 可進入到宿主細胞中，這樣使得它們強制地與SR結合。與非特異性細菌性配體（如硫酸肝 素）不同，SR除了識別多個致病性配體，還表現出與靶向病原體的牢固結合，這樣使得它們 有可能成為用於在體外除去血液中的細菌的候選物質。
[0063] 本發明使用進化上保守的SR系統對病原體進行治療和診斷。已經建立起多種表 達相關哺乳動物和嵌合蛋白SR的重組細胞系。已經開發出將這些SR末端附著至固相（例 如珠子基質、平坦表面或者機械）的技術。因此，創建可以用於治療諸如體外血液處理的親 和介質是可行的。
[0064] 本文所公開的重組嵌合蛋白，其可用於與病原體結合。簡單來說，每種蛋白包含來 自清道夫受體的病原體識別模塊（PRM)。每種蛋白還包含錨定域，其用於將嵌合蛋白固定在 支持物的合適位置。這些蛋白可被稱為嵌合清道夫受體（cSR)。
[0065] 所述病原體識別模塊可能來自哺乳動物清道夫受體的結合域，並且可能由此將 其定製成針對病原體或病原體衍生分子的特定種群。例如，結合域可以是A類清道夫受 體成員2 (SCARA2,已知其與汙泥梭狀芽胞桿菌結合）的結合域，或B類的清道夫受體成員 L0X-1 (已知其與金黃色釀膿葡萄球菌結合）的結合域。結合域與特定的原子或分子結合。 參照圖IA和圖IB所示清道夫受體的該部分，任何上述的結合域可以被認為是病原體識別 模塊。在具體的實施方案中，病原體識別模塊位於該嵌合受體蛋白的C-末端。
[0066] 錨定域直接或間接地附著至病原體識別模塊，並且用於將該蛋白端點固定至固相 或支持物。錨定域也可允許的病原體識別模塊的受限的特定重新配置或允許多個PRM結合 到單個目標分子。在一些實施方案中，錨定域可以是免疫球蛋白的Fe區。在其它具體實施 方案中，所述錨定域是來自哺乳動物SR的捲曲螺旋結構域（圖IA中字母D)。可替代地，所 述錨定結構域可以是親和標記（本文將進一步闡述）。錨定域通常位於嵌合蛋白的一端。 [0067] 在具體設想的實施方案中，所述病原體識別模塊和錨定域來自不同的A類清道夫 受:體蛋白。
[0068] 如果需要，在病原體識別模塊和所述錨定域之間可以存在連接體。該連接體增加 了 PRM和cSR的錨定域之間的距離，使得其具有針對不同病原體的特異性和結合強度。在制 造過程中，該連接體還允許正確的蛋白質摺疊和分泌。在實施方案中，連接體可以是具有大 約2-15個胺基酸的長度的序列。連接體可包括至少兩種不同的胺基酸。在一些實施方案 中，連接體包含選自由丙氨酸（A)、組氨酸（H)和甘氨酸（G)組成的組中的至少兩種不同的 胺基酸。非限制性的五個有用的連接體序列實例是SVEA(SEQ ID N0:1)、DMDF(SEQ ID NO: 2)、GAAGG (SEQ ID NO :11)、AAAGG (SEQ ID NO :12)和 HHK (SEQ ID NO: 14)。
[0069] 此外，cSR可以含有一種或多種親和標記，其與所述蛋白（即在其一端處）串聯或 處於所述蛋白中的一個位置（例如PRM和錨定域之間）。親和標記是一個序列，其通常允 許使用親和技術純化嵌合蛋白和/或將嵌合蛋白附著至具有已知方向的親和表面。現有技 術中已知幾種不同類型的親和標記。在具體的實施方案中，親和標記選自血凝素、Avi標記 (AviTag?)、V5、Myc、17、FLAG、HSV、VSV-G、His、生物素或 STREP 形成的組合。血凝素標記 的序列是SEQ ID N0:22。AviTag?標記的序列是SEQ ID N0:32。V5標記的序列是SEQ ID NO :23。Myc標記的序列是SEQ ID NO :24。FLAG標記的序列是SEQ ID NO :25。HSV標記 的序列是SEQ ID NO :26。VSV-G標記的序列是SEQ ID NO :27。His標記的序列是SEQ ID NO :28。17標記的序列是SEQ ID NO :29。生物素標記的序列是SEQ ID NO :30。STREP標 記的序列是SEQ ID NO :31。當多於一個的親和標記以串聯的方式使用時，可以存在連接體 序列，從而使連接親和標記與病原體識別模塊和錨定域相連接。例如，親和標記His (SEQ ID N0:28)和生物素 （SEQ ID N0:30)之間的連接體序列是SEQ ID N0:13。但是應當注意的 是，錨定域可以是未和標記。
[0070] 嵌合蛋白還可以包括信號肽，其用於指導合成細胞中蛋白的分泌和/或運輸。該 信號肽可以位於嵌合蛋白的一端。這樣的信號肽的兩個例子是來自於TMP2和BM-40蛋白 的肽（分別為 SEQ ID NO : 15 和 SEQ ID NO : 16)
[0071] 但是應當注意的是，由於本文所公開CSR的病原體識別模塊和錨定域各自來自與 不同的哺乳動物SR，本發明無意於涵蓋天然的SR。這可以通過使用術語"重組"和"嵌合" 得以表現出來，"重組"和"嵌合"指的是該蛋白是人工合成並且可以包括功能單元以及不同 的蛋白質片段的事實。圖IA和圖IB中所描繪的SR明確排除在本發明的範圍之外。
[0072] 本文還公開了編碼上述嵌合蛋白的核酸序列。該核酸序列可以是DNA或RNA。本 領域公知，蛋白質中的胺基酸序列是由核酸序列定義，此核酸序列被轉錄和/或翻譯以產 生所述蛋白質。公認的，核酸序列中的每組三聯體的核苷酸表示一個特定的胺基酸，如果蛋 白質是已知的，適當的核酸序列就是已知的，且反之亦然。
[0073] 本發明的嵌合蛋白可以通過將cSR的核苷酸序列插入表達載體中來製備，載體隨 後被轉染到宿主細胞中。示例性載體包括質粒和病毒。然後由宿主細胞產生嵌合蛋白，並 且可以隨後對嵌合蛋白進行分離。這些方法是本領域技術人員所熟知的。
[0074] 嵌合蛋白可用於製備藥物組合物，其包含嵌合蛋白和藥學上可接受的載體。該載 體可以是可注射的載體、局部載體、透皮的載體和類似物。有利地，其製備可以是針對局部 給藥的形式，例如作為軟膏、凝膠、乳膏、噴霧、分散劑、懸浮劑或糊劑的形式。該製劑可以進 一步有利地在組合物中包括防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗氧化劑、滲透劑和類似的材料，且 它們的量是常規的。適合與本發明結合使用的溶液是無菌的，對所提議的應用是無害的， 並且可以經受常規的藥物操作如滅菌和/或可以含有常規的佐劑，如防腐劑、穩定劑、潤溼 齊II、乳化劑、緩衝劑等。可以參照 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed. ,Mack Publishing Co. ,Easton, Pa. (1975)，用於協助配製本發明的組合物。
[0075] 嵌合蛋白可以固定在支持物或固相上以得到親和介質，其在本文中也可以稱為抗 病原體免疫粘附素（API)。嵌合蛋白的錨定域附著於固相，允許病原體識別模塊與它的特定 病原體或病原體衍生分子相互作用。固相可以是（例如）珠子、片或條、褶片等形式。本文 還考慮了使用嵌合蛋白的方法。一種預防或治療與病原體或病原體衍生分子相關的疾病的 方法，其中包括上文所述的親和介質，其構成固相和附著在該固相上的一個或多個cSR。每 種嵌合蛋白（cSR)包括病原體識別模塊和錨定域，以及任選的一個或多個連接體。從患病 個體得到生物樣品（如血液），並使其接觸親和介質，以結合所述樣品中的任何病原體或病 原體衍生分子。然後，將除去已結合粒子的樣品返回到患病個體。這樣可以從所述生物中 去除作為所述嵌合蛋白目標的病原體/病原體衍生分子。任選地，親和介質可以隨後通過 如本文所公開的洗脫所結合分子的方式進行再生，並且隨後重新作為介質用於相同或不同 的目的。
[0076] 嵌合蛋白也可作為藥物用於與病原體或病原體衍生分子相關疾病的預防或治療。 在這樣的實施方案中，一個或多個cSR用於上文所述的藥物組合物中，同時使用或不使用 親和介質。親和介質本身可以進一步直接或間接地影響目標病原體，使得cSR將固相帶給 特定生物或分子。所述藥物組合物為局部施用，或者根據病原體或病原體衍生分子決定其 施用方式。例如，在本發明一個實施方案中，含有對人類免疫缺陷病毒的（HIV)高親和性的 cSR的乳膏可以施用在生殖器區域，以滅活HIV和/或防止其侵入宿主細胞。在本公開的 另一實施方案中，含有一個或多個cSR的凝膠，其可以結合細菌，通過在傷口敷料來固定和 /或破壞幹擾傷口癒合的細菌。所述藥物組合物可用於預防性或治療性應用。
[0077] 本文還考慮了用於確定受試親和介質對病原體功效的方法。接收含有病原體的生 物樣品，然後使其與含有病原體識別模塊的親和介質接觸。檢測/測定病原體和病原體識 別模塊之間結合的量，例如通過使用免疫組化裝置如比色法，相連二級抗體，表面等離子體 共振成像，或高效液相色譜（HPLC)進行。病原體和受試親和介質中的病原體識別模塊之間 的結合量可以與參考相比。配體與親和介質的結合表明親和介質很可能對病原體的固定化 /靶向很有效。可選地，剩餘樣品中存活的病原體的數量，或者所述樣品誘導組織體外反應 (例如分離的PBMC)的能力可以通過樣品對親和介質的傳代進行測定。也可以使用表達病 原體識別模塊的測試細胞進行這種類型的測試。該測試細胞包含信號裝置，其通過病原體 識別模塊運作。然後信號水平會顯示結合的程度。信號下降則說明測試細胞表達的特定 cSR對於固定病原體是好的選擇。
[0078] 圖2示出嵌合蛋白的示例性使用。此處，在標記的SRAl和SRA2柱中，嵌合蛋白結 合到固相上並用於過濾。血漿分離裝置，例如尺寸排阻過濾器，從患者得到血液，並分離血 液，得到含有病原體血漿。然後，血漿通過體外循環泵傳遞到SRAl或SRA2的過濾器中，在 過濾器中病原體與血漿分離。然後血漿返回到血漿分離裝置並回到患者體內。柱切換裝置 的存在使得當一個過濾器在清潔血漿時，另一個過濾器中可以再生。其可以（例如）通過 用低PH甘氨酸-HCl混合物洗脫，接著用PBS洗滌的方式再生。輸入到每個過濾器的可以 是（i)血漿或（ii)清洗溶液。每個過濾器輸出的可以是（a)清洗的血漿或（ii)廢液。抗 凝血劑是可選的，但在這裡已經示出。分離的肝素、檸檬酸鹽和/或其他這樣的抗凝血劑及 方法是本領域普通技術人員所熟知的。
[0079] 可以通過參照下列實施例進一步理解本發明的各方面。這些實施例是說明性的， 並非是為了限制其實施方式。 實施例
[0080] 實施例1?具有部分MARCO錨蛋白的MARCO PRM
[0081] 可以通過已建立的分子生物學方法產生編碼cSR截斷可溶性MARC0(SEQ ID NO: 7)的構建體，其包含位於pcDNA3.1/Zeo(_)哺乳動物表達載體（Invitrogen)中的以下元 素：
[0082] 1)來自BM-40蛋白的分泌信號肽（SEQ ID NO :16);
[0083] 2)用於蛋白質純化的8-組氨酸-長標記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 14)；
[0084] 3)缺失殘基300-419 (核苷酸897-1257)的小鼠 MARCO殘基75-518 (對應於核苷 酸223-1557)的胞外部分（SEQ ID NO :21)。這種形式的MARCO缺少小鼠 MARCO的89-重 復-長的膠原結構域的最後40個Gly-X-Y重複單元；並且作為跨膜蛋白，其已被證明是清 道夫受體配體、熱滅活的E. coli和乙醯化LDL(低密度脂蛋白）的強結合劑。
[0085] 一個類似的cSR截斷可溶性人類MARCO序列可以表示為SEQ ID NO :8。此類似序 列的人類MARCO部分為SEQ ID NO :32。
[0086] 實施例2
[0087] 實施例2?具有SCARA5錨蛋白的SR-A PRM。
[0088] 編碼具有小鼠 SR-Al SRCR (清道夫受體、富含半胱氨酸）結構域（SEQ ID NO :9) 的cSR可溶性小鼠 SCARA5的構建體被克隆進pcDNA3. l/Ze〇(_)載體，並且該構建體包含以 下元素：
[0089] 1)來自TMP2蛋白（SEQ ID NO :15)的分泌信號肽；
[0090] 2)用於蛋白質純化的6-組氨酸-長標記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0091] 3)小鼠 SCARA5的胞外部分，所不同的是該蛋白的SRCR結構域置換為來自小鼠 SR-A的SRCR結構域。換言之，該嵌合形式包含來自SCARA5(核苷酸247-1140)的殘基 83-380,隨後是來自SR-A (殘基345-454對應於核苷酸1035至1362)的SRCR結構域（SEQ ID NO :33)。作為一種跨膜蛋白，這種形式SCARA5的牢固結合熱滅活大腸桿菌和乙醯化 LDL (比完整的SCARA5更強），圖11進一步對此進行了討論。
[0092] 一個類似的cSR截斷可溶性人類SCARA5序列可以表示為SEQ ID NO : 10。此類似 序列的人類SCARA5部分為SEQ ID NO :34。
[0093] 實施例3
[0094] 實施例3?具有SCARA5胞外部分的SCARA5 PRM。
[0095] 通過已建立的分子生物方法產生編碼cSR可溶性小鼠 SCARA5的結構（SEQ ID NO : 5)的構建體，其包括在pcDNA3. l/Zeo(_)哺乳動物表達載體（Invitrogen)中的以下元素：
[0096] 1)來自TMP2蛋白的分泌信號肽（SEQ ID NO :15);
[0097] 2)用於蛋白質純化的6-組氨酸-長標記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0098] 3)小鼠 SCARA5殘基83-491的胞外部分（對應於核苷酸247-1476) (SEQ ID NO : 19)。如圖11和圖12所示，作為胞外蛋白，SCARA5能夠結合熱滅活大腸桿菌和內化的LPS。
[0099] 一個類似的cSR可溶性人類SCARA5序列可以表示為SEQ ID N0:3。所述人類 SCARA5 序列為 SEQ ID NO :17。
[0100] 實施例4
[0101] 實施例4.具有截斷的SCARA5的胞外部分的SCARA5 PRM。
[0102] 通過已建立的分子生物方法產生編碼cSR可溶並截斷的小鼠 SCARA5的構建體 (SEQ ID NO :6)，其包括在pcDNA3.1/Zeo(_)哺乳動物表達載體（Invitrogen)中的以下元 素：
[0103] 1)來自TMP2蛋白的分泌信號肽（SEQ ID NO :15);
[0104] 2)用於蛋白質純化的6-組氨酸-長標記和連接體（SEQ ID NO :28和SEQ ID NO : 13)；
[0105] 3)小鼠 SCARA5殘基341-491的截斷胞外部分（對應於核苷酸1021-1476) (SEQ ID NO :20)。如圖11和圖12所示，作為胞外蛋白，SCARA5能夠結合熱滅活大腸桿菌和內化的 LPS。
[0106] 一個類似的cSR可溶性人類SCARA5序列可以表示為SEQ ID NO :4。人類SCARA5 序列為 SEQ ID NO : 18。
[0107] 實施例5
[0108] 實施例5.所使用的cSR的表達
[0109] 採用I丐磷酸鹽轉染方法將質粒轉染入293/EBNA細胞（Invitrogen)中。轉染後第 一天，細胞以不同密度接種在IOcm組織孵育板中，第二天用硫酸博來黴素（500pg/ml)進行 篩選。兩周後，採用克隆環對克隆進行挑選，並擴大克隆。通過免疫螢光染色和ELISA的重 組蛋白質表達，對克隆進行篩選。第一種方法依賴於假設有較高的表達水平，更多的蛋白還 積聚在細胞內的分泌路徑上。對於ELISA，用細胞孵育上清液塗布96孔板，並且通過單克 隆抗體對抗Marco的SRCR結構域（截斷MARCO-克隆）或多克隆抗體對抗SCARA5的C末 端來進行ELISA方法。對最高表達進行了擴展，並用於生產蛋白。在初始選擇之後，Zeocin 選擇降低至250皮克/毫升。
[0110] 實施例6
[0111] 實施例6.所用的HIS-標記的cSR在HEK-293 EBNA細胞中的製備。
[0112] 在具有Glutamax-I，並補充有10 %胎牛血清（FCS)、青黴素-鏈黴素（PS)和丙酮 酸鈉的DMEM中（這在本文中稱為正常培養基），使得所選擇的細胞系（分泌His-標記的 蛋白到細胞培養基中）以單層形式生長。細胞培養基還包含用於選擇的合適抗生素（保存 EBNA細胞所需的250皮克/毫升的G418、125微克/毫升zeosin、或3皮克/毫升嘌呤黴 素）以及每日添加的100皮克/毫升抗壞血酸（僅用於含膠原序列的蛋白質）。在匯合時， 收穫培養基，並將細胞碎片離心出來（1000轉，5分鐘）。將上清液儲存在4°C或-20°C直到 純化。其中一種細胞板進一步分裂1 :4至1 :6,並在DMEM中生長至融合。
[0113] 在其它板中，所收穫的培養基更換為無血清的DMEM/F-12(1 :1)，其中補充有 Glutamax-1、PS、丙酮酸鈉和抗壞血酸。3天後收穫無血清細胞培養基。如果可能的話，將 細胞用新鮮的無血清培養基覆蓋，以進行進一步的蛋白質生產。
[0114] 實施例7
[0115] 實施例7.所用的HIS-標記的cSR的純化
[0116] 過濾細胞培養基並注入由Talon-matrix填充並用Ix磷酸鹽緩衝液（50mM磷酸 鈉、150mM的氯化鈉 、pH 7.0)平衡的柱中。注射後，將未結合的蛋白用含10-15mM咪唑的 2x磷酸鹽緩衝液洗滌。為了洗脫帶有His標記的蛋白，咪唑濃度增加至200mM。洗脫後，用 SDS-PAGE將含有有用蛋白的級分進行鑑定，收集並用PBS透析以除掉咪唑（3 X 2小時，1000 倍體積的緩衝液）。分離純化具有血清的樣品和無血清樣品。
[0117] 實施例8
[0118] 實施例8.採用實施例1的cSR形成親和介質（API)。
[0119] 在這一組實驗中，Talon超流金屬親和樹脂（Clontech)用作固相以製備親和介 質。珠子的容量為5至20暈克蛋白/暈升樹脂。
[0120] 對於去除細菌試驗，實施例1的嵌合蛋白在2升細胞培養基（普通培養基（NM)或 無血清培養基（SF))中純化，然後將其與Iml樹脂偶聯。產生兩組珠子，一組使用在匪中 產生的蛋白質，而另一組使用SF中產生的蛋白質。
[0121] 用經PBS透析純化的嵌合蛋白與珠子混合，並在+4°C下旋轉過夜。結合後，在重力 作用下使懸浮液經過柱子運動而得到珠子。將珠子洗滌並懸浮在I : 1體積的PBS中。從 該懸浮液得到樣品，用兩種方法分析蛋白結合到珠子的量：對於洗脫的蛋白，用SDS-PAGE 和Bradford法測定染色蛋白帶的密度。10 ill的珠子與SDS上樣緩衝液混合後，將一定量的 珠子加樣在凝膠上。在本實施例中，凝膠上有〇. 125 ill珠子。基於光密度的估計（圖3)， 結合的蛋白的濃度為約8pg蛋白/ii I beads。基於Bradford測定法的標準曲線（圖4)， 洗脫的蛋白的濃度分別為2. 1 (無血清）和2. 8 (正常培養基）pg/ iU珠子。對於洗脫的蛋 白質，0D595s分別為0. 178和0. 239。
[0122] 圖3示出用於密度估計的SDS-PAGE。泳道1-7 (從左邊起）包括標記濃度的蛋白 (BSA)，以pg/泳道為單位。標記SF的泳道用無血清培養基中的嵌合蛋白。標記匪的泳道 使用正常培養基中的嵌合蛋白。標記Std的泳道表示分子量標準。
[0123] 圖4示出Bradford測定法標準曲線。標準曲線是用一式三份不同濃度的BSA、並 基於平均方程而繪製的。0D595指的是在595nm處測量的吸光度。
[0124] 實施例9
[0125] 實施例9.得自實施例8的親和介質（API)的細菌去除能力。
[0126] 將偶聯後的珠子（匪和SF)和空白對照珠子用PBS衝洗並在人血清（沒有滅活的） 中孵育以平衡珠子。將珠子在+4°C旋轉過夜。第二天，使四種細菌（ESBL大腸桿菌、肺炎鏈 球菌、多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA)和腦膜炎奈瑟氏球菌）生長至OD = 0. 5 (?3X10exp 8CFU/ml)。將細菌稀釋到人血清中濃度^ IOexp 3CFU/ml，並保持在冰上。（註："10exp n" 在本文中用於指10的n次冪）。
[0127] 對各種細菌懸液，500 ill的控制量在振蕩器上37°C孵育10分鐘。對所述控制進 行活性計數。
[0128] 然後將500 ill的細菌懸浮液加至5ml柱內100 ill經塗覆的珠子中，在振蕩器上 +37°C下孵育10分鐘。將珠子離心下來（1000轉，1分鐘），並且推動細菌懸浮液通過珠子 (級分1)。然後將珠子用5x200 ill的PBS、lx500 ill的PBS和2x500 ill的pH為8的含 200mM咪唑的PBS (級分2-9)洗滌。最後，將珠子重新懸浮於500 ill的PBS中（級分10)。 每個級分進行活菌計數並繪製在一條曲線上。三種珠子（NM，SF，和對照）中的每一種都進 行這樣的處理。
[0129] 圖5分別示出每種細菌和每組珠子的結果。一共有四排，對應於所述細菌。左邊 一列提供了每個級分的活菌計數。y軸在這些圖表為％應用率，100%對應於對照組的活菌 數。X軸是級分。請注意，y軸在每幅圖中都不同。藍線是對照組珠子。紅線是匪組珠子。 綠線是SF組珠子。這些圖中左欄基本上表明如何能夠快速洗掉珠子中的細菌，這可以用於 度量嵌合蛋白質與細菌結合的緊密程度。如曲線下降到零的情況所示，大腸桿菌、葡萄球菌 和腦膜炎奈瑟氏球菌以相似的速率從珠子中洗掉，而肺炎鏈球菌從SF或匪珠子中除去較 慢。這可以解釋為嵌合蛋白與肺炎鏈球菌的結合十分牢固。如圖中y軸所示，對於大腸杆 菌、葡萄球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌，對照組珠子的應用％更高，這說明幾乎很少的細菌被對 照組珠子殺死。
[0130] 右邊一列提供在500 ill懸浮液中存活的細菌計數。在這些圖中y軸是％存活率， 100%對應於在推壓懸浮液經過珠子前懸浮液中所有的細菌的計數。條形代表在珠子被除 去後仍然存在的細菌的量（％)(假設對照試驗的活菌計數也適用於這些懸浮液）。請注意， y軸在每幅圖中都不同。對於大腸桿菌，與對照實驗相比，嵌合蛋白能夠從懸浮液中除去顯 著更高百分比的存活細菌，而SF中培養的蛋白比匪中培養的蛋白多除去接近50%。對於 MRSA，嵌合蛋白比對照實驗除去更多的細菌。對於肺炎鏈球菌，三組珠子之間的差異並不顯 著。對於腦膜炎奈瑟氏球菌，與對照實驗相比，嵌合蛋白除去更大百分比的細菌。
[0131] 實施例10
[0132] 實施例10.使用實施例2中cSR的親和介質（API)的細菌去除能力。
[0133] 如實施例6-8所述，製備、純化嵌合蛋白，並將其偶聯至珠子。該嵌合蛋白包含具 有SCARA5錨定域的SR-A PRM。基於密度測量法，經測定結合蛋白的濃度為4. 2pg/iil珠 子；基於Bradford分析法，結合蛋白的濃度為I. 5g/ii 1珠子。如實施例9中所述進行除菌 分析。但是，在該實驗中使用了 200iU經塗覆的珠子。對照珠子預先在人血清中孵育。
[0134] 圖6分別示出每種細菌和每組珠子的結果。同樣有四排，其對應於各細菌。左邊 一列提供了在每個級分的活菌計數。y軸在這些圖表中表示％應用率，100%對應於對照實 驗中的活菌數。X軸是級分。請注意，y軸在每幅圖中都不同。藍線是對照珠子。紅線是具 有嵌合蛋白的珠子。同樣地，肺炎鏈球菌的去除比較緩慢。這可以解釋為嵌合蛋白質與肺 炎鏈球菌的結合十分牢固。如圖中y軸所示，相比葡萄球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌，對照珠子 的％應用更高，這說明幾乎很少的細菌被對照珠子殺死。
[0135] 右列提供在500 ill懸浮液中存活細菌的計數。在這些圖中y軸是％存活，100% 對應於在推壓懸浮液經過珠子前懸浮液中所有細菌的計數。條形代表在珠子被除去後仍然 存在的細菌的量（％)(假設對照試驗的活菌計數也適用於這些懸浮液）。請注意，y軸在 每幅圖中都不同。對於MRSA和N. meningtidis，與對照實驗相比，嵌合蛋白除去細菌的百分 比高得多。對於，大腸桿菌和肺炎鏈球菌，除去細菌的量大致相同。
[0136] 實施例11
[0137] 實施例11.使用實施例3中cSR的親和介質（API)的細菌去除能力。
[0138] 如實施例6-8所述，製備、純化嵌合蛋白質，並將其偶聯至珠子。該嵌合蛋白包含 SCARA5錨定域。珠子上蛋白的濃度估計為0. 9pg/iil珠子。
[0139] 偶聯的珠子和空白對照珠子被裝填入具有2ml床體積基質的柱中，並用PBS洗滌。 第二天，ESBL大腸桿菌生長至OD = 0. 5 ( = 3 X IOexp 8CFU/ml)。將細菌稀釋至在PBS中 的濃度為IOexp 4CFU/ml，並保持在冰上。
[0140] 活菌計數是在該懸浮液中進行並且Iml懸浮液被推壓入柱中（級分1)。先用2xlml PBS洗脫（級分2和3)，以除去柱中空的緩衝體積。然後用3x300 ill含有大部分未結合細 菌的PBS洗滌珠子（級分4-6)。然後再用10x100 ill PBS洗滌（級分7-16)，其示出在經 cSR塗覆的柱中結合和/或殺死的細菌。最後用20x300 ill PBS洗滌柱（級分17-36)。最 後，將珠子重新懸浮於Iml PBS中，以獲得柱中殘留的活菌數量（級分37)。對每個級分得 到相應的活菌數並繪製在一條曲線上。對照珠子和經cSR塗覆的珠子也進行這樣的處理。
[0141] 圖7示出每組珠子的結果。左邊一列提供每個級分的活菌計數。在這些圖表中y 軸為菌落形成單位（CFU)/ml。X軸是級分。紅線是對照珠子。綠線是具有嵌合蛋白的珠 子。具有嵌合蛋白的柱的細菌洗脫停止的更早，這說明此實驗中更多的細菌被結合或者被 殺死。
[0142] 右列提供了珠子懸浮液中存活的細菌計數。在這些圖中y軸是％存活率，100%對 應於在推壓懸浮液經過珠子前懸浮液中所有的細菌的計數。條形代表在珠子被除去後仍然 存在的細菌的量（％ )。具有嵌合蛋白的柱中殘留大腸桿菌的量稍稍高些。
[0143] 實施例12
[0144] 實施例12.使用實施例4中cSR的親和介質（API)的細菌去除能力。
[0145] 如實施例6-8所述，製備、純化嵌合蛋白，並將其偶聯到珠子。該嵌合蛋白包含截 斷SCARA5錨定域。珠子上蛋白質的濃度估計為lpg/iil珠子。
[0146] 偶聯的珠子和空白對照珠子被裝填入具有Iml床體積基質的柱中，並用PBS洗漆。 第二天，ESBL大腸桿菌生長至OD = 0. 5 ( = 3 X IOexp 8CFU/ml)。將細菌稀釋到在PBS中 的濃度為IOexp 3CFU/ml，並保持在冰上。
[0147] 將細菌懸浮液在+37°C孵育2分鐘。在實施下一步之前進行活菌計數。
[0148] 在將細菌懸浮液推壓入柱中之前，先用人血清洗滌柱。然後在+37°C孵育500 ill 的細菌懸浮液2分鐘，並推壓入柱中。先用2x300 iU的PBS洗滌（級分1-2)，以除去柱中 空的緩衝體積。然後再用12x100 PBS (級分3-14)洗滌珠子，其顯示經塗覆的柱中細菌 的結合情況。最後，將珠子重新懸浮於ImlPBS中，以得知柱中殘留的活菌數量。每個級分 得到相應的活菌數，並繪製在一條曲線上。對照珠子和經嵌合蛋白塗覆的珠子也進行這樣 的處理。
[0149] 圖8為每組珠子的結果。左邊一列提供了在每個級分的活菌計數。在這些圖表中 y軸為施加濃度的％，100%對應於對照組中的活菌數。X軸是級分。紅線是對照珠子的平 均數。紫線是具有嵌合蛋白的珠子的平均數。從具有重組蛋白的柱中洗脫的細菌的數量稍 高，這說明此實驗中在測試柱中結合或者被殺死的細菌比對照實驗中的少。
[0150] 右列提供了珠子懸浮液中存活的細菌計數。在這些圖中y軸是％存活，100%對應 於在推壓懸浮液經過珠子前懸浮液中所有的細菌的計數。對比左邊柱中的數據，具有嵌合 蛋白的柱中殘留大腸桿菌的量稍稍高些。
[0151] 實施例13
[0152] 實施例13.暴露於來自實施例1和2的流通級分的PBMC中的免疫活性。
[0153] 用實施例9和10中得到的級分處理外周血單核細胞（PBMCs)。將分離的PBMC鋪 板（IOexp 5個細胞/孔），並且第二天用洗脫級分和慶大黴素處理4小時，以防止細菌生 長。收集細胞培養基，並且採用ELISA以脂多糖（LPS)作為陽性對照測定產生的TNF-a的 量。該實驗表明是否是通過該柱的級分導致了 PBMCs的免疫活性。
[0154] 圖9示出實施例1嵌合蛋白質的結果（PRM來自附加了 MARCO錨蛋白的MARCO)。y 軸是TNF-a的量，單位為pg/ml。綠線是對照珠子。紫線是匪珠子。藍線是SF珠子。此 處的級分10是所有洗滌完成後留在柱上的細菌懸浮液。相比於對照珠子，cSR珠子對級分 10中的所有細菌呈現更高的激活（例如，與珠子結合），在第一級分（含游離的細菌）中的 情況也一樣。保存的免疫反應表明，來自cSR柱的級分裡發現大量的免疫活化分子，這與低 含量的細菌量（圖5和圖6)共同說明更多的細菌在這裡被殺死。
[0155] 圖10示出實施例2中cSR的結果（PRM來自附加了 SCARA5錨蛋白的SR-A)。綠線 是對照珠子。紫線是具有嵌合蛋白的珠子。同樣的，此處的級分10是所有洗滌完成後留在 柱上的細菌懸浮液。相比於對照珠子，具有嵌合蛋白的珠子對級分10中的所有細菌呈現更 高的激活（例如，與珠子結合），在第一級分（含游離的細菌）中除了大腸桿菌外其他的情 況也一樣。
[0156] 實施例14
[0157] 實施例14 :大腸桿菌和acLDL通過SCARA5的跨膜形式結合，實施例2中的cSR(具 有SCARAl SRCR結構域作為PRM的SCARA5錨），以及通過使SCARA5錨與作為PRM的SCARA2 SRCR結構域結合所製得的cSR。
[0158] 將三種蛋白全部轉染到CHO細胞中並進行表達。為了進行比較，對照細胞無蛋白 表達。然後將每種細胞類型暴露於熱滅活大腸桿菌和乙醯化低密度脂蛋白中，以對結合進 行測定。使用抗-SCARA5抗體來證實表達蛋白的存在。
[0159] 結果示於圖11。控制細胞與所有三種材料弱結合。具有完整SCARA5的細胞與大 腸桿菌結合，並且與AcLDL弱結合。所述SCARA5/SCARA2 cSR與大腸桿菌和AcLDL兩者強 結合。所述SCARA5/SCARA1 cSR也與大腸桿菌和AcLDL強結合。與受體相比，這兩種cSR 呈現出比完整的SCARA5高的配體結合能力，這說明了本發明是如何改進SR的結合親和力 的。
[0160] 實施例15
[0161] 實施例15 :細菌LPS通過SCARA5的內化。
[0162] 為了 LPS的內化，對小鼠 SCARA5轉染的CHO細胞進行檢測。團粒2 (Crb2)表達的 CHO細胞作為陰性對照。肌動蛋白染色（紅色）表明細胞的存在。結果示於圖12。標記 了 "Ab staining"的行表示成功轉染和表達（抗體識別SCARA5和Crb2得到綠染色）。標 有"LPS internalization"的行顯示內吞後的細胞內LPS(綠色）。這些結果第一次表明 SCARA5能夠結合和內化LPS。
[0163] 實施例16
[0164] 實施例16 :嵌合受體之間對於細菌親和性的差異
[0165] 表達並純化序列為SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43和SEQ ID NO :35的嵌合受體蛋 白（API)，然後參照實施例8將其與珠子偶聯（Talon?, Clontech，U. S. A.)。將不含有蛋 白的空白珠子作為對照試驗。
[0166] 兩種珠子都與嵌合受體偶聯，並且用PBS衝洗空白對照珠子，然後在人血清（未滅 活）中+4°C孵育過夜。第二天，四種細菌（ESBL大腸桿菌、肺炎鏈球菌、多重耐藥金黃色葡 萄球菌（MRSA)和生物素化的/熱殺死的MRSA)生長至OD = 0. 5 ( ^ 3X 10exp8 CFU/ml)。 將細菌稀釋至在人血清中濃度為10exp3 CFU/ml，並保持在冰上。
[0167] 對於對照實驗，100 空白珠子與500 ill人血清在振蕩器上37°C孵育10分鐘。 此對照實驗將得到一個活菌數。
[0168] 然後在5ml柱中的100 ill經塗覆的珠子中，加入500 ill細菌懸浮液，在振蕩器上 37°C孵育10分鐘。將珠子離心下來（1000轉，1分鐘），並且推壓細菌懸浮液通過珠子（級 分1)。用200 ill PBS洗滌珠子5次，然後用500 ill PBS洗滌珠子1次（級分2-7)。最後， 將珠子在500 ill PBS中重新懸浮（級分8)。
[0169] SEQ ID NO :35的嵌合蛋白也被生物素化，並結合到經鏈黴親和素塗覆的珠子基質 (Pierce化學公司，美國）。測試生物素化的蛋白對MRSA的抗性。
[0170] 對每個級分進行活菌計數並繪製在曲線上，並且將每個級分樣品用於PBMC刺激 測定（如上所述）。分別對每個測試API進行上述所有步驟。
[0171] 表1表明，選定病原體在經過含有與不同嵌合受體蛋白偶聯的珠子的柱中，活力 相對下降。從所述柱流過物所得到的菌落數用菌落計數佔進入柱子之前的菌落計數的百分 比表示。整個過程中生物素、死亡的多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA)作為陰性對照。
[0172] 表 1
【權利要求】
1. 一種重組嵌合蛋白，包含： 來自哺乳動物清道夫受體的病原體識別模塊；和錨定域。
2. 如權利要求1所述的蛋白，其在所述病原體識別模塊和所述錨定域之間還包含連接 體。
3. 如權利要求2所述的蛋白，其中所述連接體是約2個至約15個胺基酸的序列。
4. 如權利要求2所述的蛋白，其中所述連接體包括至少兩種不同的胺基酸。
5. 如權利要求4所述的蛋白，其中所述至少兩種不同的胺基酸選自由丙氨酸、組氨酸 和甘氨酸構成的組。
6. 如權利要求1所述的蛋白，還包含親和標記。
7. 如權利要求6所述的蛋白，其中所述親和標記選自由血凝素、Avi標記、V5、Myc、T7、 FLAG、HSV、VSV-G，6-His、生物素和 STREP 構成的組。
8. 如權利要求1所述的蛋白，其中，所述病原體識別模塊為C-末端，並且所述錨定域來 自哺乳動物清道夫受體。
9. 如權利要求8所述的蛋白，其中，所述病原體識別模塊來自哺乳動物A類清道夫受 體。
10. 如權利要求1所述的蛋白，其特徵在於，所述錨定域是免疫球蛋白的Fc區。
11. 如權利要求1所述的蛋白，其特徵在於，所述錨定域來自與所述病原體識別模塊不 同的哺乳動物清道夫受體。
12. 如權利要求1所述的蛋白，其中所述錨定域為來自哺乳動物A類清道夫受體的 α -螺旋捲曲螺旋結構域。
13. 如權利要求8所述的蛋白，其中的病原體識別模塊是SRCR結構域、膠原結構域Ε、 富含半胱氨酸結構域、C型凝集素樣結構域（CTLD)，溶酶體相關膜蛋白（LAMP)樣結構域，粘 蛋白樣結構域或EGF樣結構域。
14. 如權利要求1所述的蛋白，還包含信號肽。
15. -種編碼權利要求1所述的蛋白的核酸序列。
16. -種載體，包含編碼權利要求1所述蛋白的核酸序列。
17. -種宿主細胞，包括載體，該載體含有編碼權利要求1所述蛋白的核酸序列。
18. -種藥物組合物，包含嵌合蛋白和藥學上可接受的載體； 其中，所述嵌合蛋白包含：來自清道夫受體的病原體識別模塊；和錨定域。
19. 一種親和介質，包括固相和固定在該固相上的嵌合蛋白； 其中，所述嵌合蛋白包含：來自清道夫受體的病原體識別模塊；和錨定域，所述錨定域 附著至所述固相上。
20. -種用於治療與病原體或病原體衍生分子相關的疾病的方法，包括： 接收包括固相和固定在該固相上的嵌合蛋白的親和介質，該嵌合蛋白包含（i)來自清 道夫受體的病原體識別模塊和（ii )錨定域； 使生物樣品與所述親和介質接觸，以使得所述的病原體或病原體衍生分子與所述親和 介質結合。
21. -種用於確定受試親和介質對病原劑的有效性的方法，包括： 接收含有所述病原劑的生物樣品； 使所述生物樣品與所述受試親和介質的病原體識別模塊接觸；以及 檢測所述病原劑和所述病原體識別模塊之間結合的量。
22. 如權利要求21所述的方法，還包括將所述病原劑和所述受試親和介質的病原體識 別模塊之間結合的量與參考值對比。
23. -種用於預防或治療與病原體或病原體衍生分子相關的疾病的藥物，包含位於適 合於局部施用的載體中的嵌合蛋白。
24. -種重組嵌合蛋白，由以下組成： 信號肽； 至少一種親和標記； 連接體； 來自哺乳動物清道夫受體的病原體識別模塊；和 錨定域。
25. 如權利要求24所述的重組嵌合蛋白，其中所述病原體識別模塊和錨定域來自於不 同的哺乳動物清道夫受體。
26. -種用於診斷患者是否患有與病原體或病原體衍生分子相關的疾病的方法，包 括： 接收親和介質，該親和介質包括固相和固定在該固相的固定空間內的嵌合蛋白，該嵌 合蛋白包含（i)來自清道夫受體的病原體識別模塊和（ii )錨定域； 接收由所述患者獲得的生物樣品； 使所述生物樣品與所述親和介質接觸，使任何病原體或病原體衍生分子結合至所述固 定空間；以及 檢驗所述固定空間是否存在有任何結合的病原體或病原體衍生分子。
27. 如權利要求26所述的方法，其中所述檢驗通過使任何結合的病原體或病原體衍生 分子與標記探針雜交來進行。
【文檔編號】C07K14/705GK104321339SQ201380024894
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月12日 優先權日:2012年3月12日
【發明者】卡爾·特呂格瓦松, 蒂莫·皮卡賴寧, 尤哈·奧賈拉, 約納斯·艾克賽森 申請人:斯凱拉泰克醫療公司