用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法

2023-07-22 08:59:06 1

專利名稱：：用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，特別涉及一種通過控制染色的金屬離子的電遷移時間，選擇性地檢測蛋白質經過電泳分離後聚丙烯醯胺凝膠上的目標蛋白斑點的方法。
背景技術：
：在諸多的蛋白質電泳分離方法中，聚丙烯醯胺凝膠電泳是應用最為廣泛的一種分離技術。之後又由傳統的一維電泳逐漸發展成了雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳技術，並廣泛的應用於蛋白質組學的研究中，成為了蛋白質組學研究領域中的核心技術之一。它是目前解析度最高、重複性最好的蛋白質分離技術。但雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳技術只對蛋白質實現分離，隨後還須釆用染色技術將分離後的蛋白質斑點顯示出來以便進行隨後的分析。染色方法應不幹擾蛋白質點隨後進行的質譜分析以便作蛋白質測序或者鑑定的目的。至今為止，凝膠上微量蛋白質的顯色以及定量分析仍然是聚丙烯醯胺凝膠電泳面臨的主要問題。在眾多的凝膠染色方法中，現在比較常用的是考馬斯亮藍(CBB)染色法及其改進，如膠體考馬斯藍染色法。但是這種方法受到其檢測靈敏度的限制，無法檢測到低豐度蛋白，並且染色脫色的過程比較費時，其他的有機染料對凝膠進行染色也存在類似的問題。銀染是另外一種傳統的染色方法，它的檢測靈敏度雖然可達lng以下，然而它的缺點是染色過程十分複雜、對操作人員的要求也比較高、容易受到諸多因素的幹擾、背景顏色較深，並且由於固定試劑甲醛或者戊二醛的使用造成其常常很難與後續的質i普分析相兼容。近年來也出現了一些利用人工合成的螢光試劑或是具有螢光的天然產物來進行凝膠上蛋白質染色的方法。這些螢光染色方法的靈敏度較高並且也可以與質鐠分析兼容，然而現有的螢光染色方法的局限在於其費用昂貴、操作技術複雜、染色時背景容易產生螢光幹擾，並且螢光漂白作用會使染色後的凝膠不易長期保存結果。放射性標記的方法一般是在蛋白質中加入放射性同位素，通過同位素示蹤的方法以達到檢測的目的。由於不受空白背景的幹擾，這種方法也能夠達到很低的檢測限，但同時也存在同位素元素放射性衰減的問題，並且放射性物質的操作和處理都需要很好的保護措施以保證安全，這也大大提高了實驗的費用。利用金屬離子對凝膠進行負染色(Reversestaining)也是一種常用的染色方法。這種方法主要基於金屬離子會選擇性的在不含蛋白質的空白凝膠處產生沉澱，而在含有蛋白的凝膠處則是相對透明的。利用咪唑-鋅鹽對蛋白質進行^^全測最先報導於1990年，其後又利用這種染色方法對凝膠電泳後的生物分子進行分析和微量製備；銅離子染色最初報導於1987年，整個染色過程只需5min，是一種方便快捷的染色方法，蛋白與金屬的結合是可逆的，同一塊凝膠也可以用其他方法進行復染，並且金屬離子可以通過絡合劑除去從而不影響後續的質譜分析，所得凝膠能夠長期保存後蛋白質點不發生擴散不影響成像質量，但其檢測限大約為80ng,這在很大程度上限制了該方法在蛋白質研究領域中的應用。其它的金屬離子如鐵、金、釕等均可用於凝膠染色。蛋白質組學發展到今天，一種理想的蛋白染色方法應該是既可以非特異性地與蛋白質有較高的親和力、不受其他生物分子和常用試劑的幹擾；在需要時又可以選擇性的標記出所需的同一類蛋白，這樣可以免去對凝膠上的所有蛋白質點逐個進行分析，大大節省實驗時間。同時染色過程還應該方便快捷以便於不同的操作人員進行操作，更重要的要具有較高的靈敏度以及在需要的時候能夠方便的除去染色試劑以達到與後續的各種蛋白分析手段相兼容的目的。由前所述可見，目前還沒有一種理想的方法可以大體滿足上述的要求，特別是不能對特定類型的蛋白質斑點加以標記，這使得例如含硒蛋白的分析中，缺少一種手段從成千上萬的蛋白質斑點中挑出所需研究的對象進行分析，從而增加了分析的成本和幹擾的可能性。
發明內容為了解決上述技術問題，本發明的目的在於提供一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法及裝置。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案本發明提供一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其步驟包括(1)採用金屬離子對蛋白質電泳分離得到的斑點進行選擇性染色；(2)釆用一電遷移方法，將與進行選擇性染色的蛋白質以外的位置上結合的金屬離子除去；(3)採用能與用來染色的金屬離子結合的染料對蛋白質進行顯色，在電泳膠片上將蛋白質斑點取下後，採用絡合劑將結合在蛋白質斑點上的金屬離子除去，以便進行後續的質鐠分析。所述步驟(1)是將分離的蛋白質電泳凝膠從電泳池中取出後，用水反覆清洗，再用金屬離子的鹽溶液浸泡凝膠，取出後用水清洗；所述金屬離子的鹽溶液其濃度範圍為0.1至1.0mol/L,浸泡時間為0.5至3小時。其中，所述電泳可以是一維電泳，也可以是雙向電泳。優選的，所迷凝膠為聚丙烯醯胺凝膠；所迷金屬離子為具有高檢測靈敏度的，並且容易在陰極上析出從而除去的過渡金屬離子，例如銅離子、鋅離子、鐵離子、鈷離子等，更優選為銅離子；所述金屬離子的鹽中的酸根可以為任何無機酸根或有機酸根，無機酸根可以為氯離子、石克酸根或磷酸根，有機酸根可以為曱酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、蘋果酸根、枸椽酸根、抗壞血酸根、苯曱酸根或水楊酸根。當所述步驟(l)中的選擇性染色是指選擇對所有的蛋白質斑點染色時，所述步驟(2)可以通過調整遷移時間，使得凝膠上無蛋白質斑點的基底上的金屬離子全部遷移掉，留下與蛋白質斑點結合的金屬離子以便隨後對其檢測。所迷遷移時間的調整，是在平行實驗中，該遷移時間導致用金屬離子檢測染料顯色時，凝膠上沒有蛋白質斑點處和蛋白質斑點上所結合的金屬離子顯色結果對比度達到最大。優選的，遷移的恆定直流電壓為2V至50V,遷移時間為lh至3h。當所述步驟(l)中的選擇性染色是指選擇對目標蛋白質斑點染色時，所述步驟(2)包括首先採用電遷移方法除去與凝膠基質結合的金屬離子，留下與蛋白質斑點結合的金屬離子，提高對蛋白質斑點進行檢測時的信噪比，提高檢測的靈敏度；進一步採用電遷移方法除去與非目標蛋白質結合的金屬離子。由於與非目標蛋白結合的金屬離子在電場的作用下可以較快遷移到溶液中，並繼續遷移到陰極上還原為金屬單質而被除去，而與目標蛋白結合的金屬離子由於其與蛋白結合得較牢固，不易解離，所以通過延長遷移時間可以使只與目標蛋白結合的金屬離子保留在凝膠上，再對其進行顯色，即可以選擇性的使目標蛋白質顯色。所述遷移時間的延長是在平行實驗中，該遷移時間導致非目標蛋白質斑點處的金屬離子在採用檢測染料顯色時觀察不到。在本發明的較佳實施例中，優選的，所述的目標蛋白質為含硒蛋白質或硒蛋白，所述金屬離子為銅離子。當選擇對含硒蛋白質斑點染色時，由於與非含硒蛋白結合的銅離子在電場的作用下可以較快遷移到溶液中，並繼續遷移到陰極上還原為銅而被除去，而與含硒蛋白結合的銅離子由於其與蛋白結合得較牢固，不易解離，所以通過延長遷移時間可以使只與含硒蛋白結合的銅離子保留在凝膠上，再對其進行顯色，即可以選擇性的使含硒蛋白質顯色。所述遷移時間的延長是在平行實驗中，該遷移時間導致非含硒蛋白質斑點處的銅離子在採用檢測染料顯色時觀察不到。優選的，電遷移的恆定直流電壓為2V至50V,遷移時間為4h。優選的，所述電遷移的過程中用冰浴冷卻，以免產生的電熱效應使蛋白質發生變化。所述電遷移方法是在包括電極和緩衝液的電遷移池中進行，且包括隨時更換電極緩沖液及清洗電極的過程。所述步驟(3)是在電遷移已經除去進行選擇性染色的目標蛋白質以外的其它位置的金屬離子後，採用能與金屬離子結合的染料(如三羥基水楊基螢光酮、雙縮脲、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀及二曱酚橙等)使蛋白質斑點顯色，在電泳膠片上將蛋白質斑點取下後，採用絡合劑(常用絡合劑，例如EDTA、檸檬酸鈉、枸櫞酸鈉、Tris、NH3等)將結合在蛋白質斑點上的金屬離子除去，以便進行後續的質譜分析。當所述金屬離子為銅離子時，所述染料例如可以為三羥基水楊基螢光酮、雙縮脲、亞鐵氰化鉀等。本發明還提供一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的裝置，其包括電泳池和電遷移裝置。所述電遷移裝置為玻璃板和玻璃膠構製成的電遷移池，所述電遷移池有兩塊中間鏤空的玻璃板，一塊採用玻璃膠封固在電遷移池中間，另一塊可以移動，需要電遷移的電泳凝膠夾緊在兩塊中間鏤空的玻璃板中間，在電遷移池的兩邊中充入鹽類溶液構成的緩衝液。所述電遷移池的兩邊緩衝液中分別放置了一塊鉑電極，鉑電極上施加的直流電壓範圍為2至50V之間。優選的，所述的緩衝液中的鹽類濃度為0.01至0.5mol/L範圍內。所述鹽類可以為無4/L酸銨鹽，有機酸銨鹽，有機鹼的無機酸鹽或有機鹼的有機酸鹽。所述無機酸才艮可以為氯離子、硫酸根或磷酸根；所述有機酸根可以為曱酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、蘋果酸根、枸椽酸根、抗壞血酸根、苯甲酸根或水楊酸根；所述有機鹼可以為RNH2、RR，NH、RR，R，，N或三羥甲基氨基甲烷，其中的R，R，，R，，可以選自CH3-、C2H5-、C3H7-、0^9-中的任一種。所述緩衝液的pH值用無機酸調節至2~11範圍內；所述無機酸可以為鹽酸、碌b酸、磷酸。在本發明的實施例中，優選的，所述電遷移池在遷移過程中用水浴冷卻。本發明採用了雙向電泳技術將蛋白質分離後，對這些蛋白質點進行選擇性染色的方法，並以電場力作為動力，利用金屬離子與凝膠基質、非含硒蛋白、含硒蛋白結合能力有很大的差別，使得凝膠基質上結合的金屬離子最容易在電場力的作用下遷移出凝膠並且鍍在陰極上，從而被徹底除去；而非含硒蛋白質斑點上的金屬離子需要長得多的時間才能除去，含硒蛋白斑點上的金屬離子在更長的時間內也還保留在其上，這樣，在其後用金屬離子檢測染料對留下的金屬離子顯色時，就可以通過選4奪電遷移的時間達到可以按需要檢測出雙向電泳後分離的所有蛋白質斑點，或者僅檢測含硒蛋白質的斑點。另外，本發明方法也適用於一維電泳後非含硒蛋白質的染色，可以作為一種常規的聚丙雄醯胺凝膠分離後蛋白質染色的方法。本發明方法大大簡化了硒蛋白的分離分析過程，為硒蛋白的研究提供了一種有力的工具。並且由於本發明提高了蛋白質斑點所顯色的深度與背景相比的對比度，因此提高了檢測的靈敏度。與其他染色技術相比，本發明具有需要的費用4艮少，操作簡便，費時相對較少，與後續的質譜分析完全兼容等優點。圖1為本發明設計的電遷移結構簡圖2為本發明用於牛血清白蛋白經SDS-PAGE後，凝膠上蛋白質點的檢測結果圖3a-3d分別為利用本發明方法分別對等量的BSA和富硒酵母蛋白進行凝膠上染色比較的掃描結杲圖4a為利用本發明方法對富硒酵母蛋白雙向電泳分離後的凝膠進行染色所得到的掃描結果圖4b為經傳統的考馬斯亮藍染色法對富硒酵母蛋白雙向電泳分離後的凝膠進行染色的掃描結果圖5a-5b分別為本發明用於富硒酵母蛋白質雙向電泳分離凝膠上含硒蛋白點進行選擇性染色後對任選一蛋白點進行序列測定的質鐠圖。附圖標記說明1-電源；2-金屬柏電極；3-玻璃板；4-聚丙烯醯胺凝膠；4601-PDQuest分析軟體對蛋白點進行的編號。具體實施例方式以下結合附圖，對本發明上述的和另外的技術特徵和優點作更詳細的說明。實施例1圖l所示為本發明用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的電遷移池的示意圖，整個遷移池由1.5mm厚的玻璃板組成，其包括檢測池本體，其是由玻璃板和玻璃膠構成，其中，在所述的檢測池本體中間有兩塊中間鏤空的玻璃板3，一塊採用玻璃膠封固在電遷移池中間，另一塊不固定以便隨時移動。池體與中間鏤空的玻璃板的尺寸須適應所處理的聚丙烯醯胺膠片4的尺寸，聚丙烯醯胺凝膠的厚度為lmm;在進行電遷移過程時，將所處理的膠片緊夾在兩片鏤空玻璃板之間，池的兩邊充入緩衝液，使得通過電遷移池的電流全都是由於膠片和溶液中離子的遷移實現。其中玻璃板鏤空的面積稍小於凝膠面積，以便將凝膠固定於兩塊玻璃板中間，類似於一個三明治的結構，以使遷移池的左右兩邊不相連通，可以防止離子自由移動。還包括，在池的兩邊插入的輛電極2，該兩電極分別與電源的正負極相連，且鉑電極面積略小於凝膠面積，兩鍋電極通過直流電源1施加恆定的離子遷移電壓。以下給出一具體的實施過程，在電遷移池的實施過程中，首先用玻璃膠將合適尺寸的玻璃板粘成一個封閉的長方體池子，另將兩塊玻璃板中間鏤空，鏤空的面積根據實驗中用到的凝膠大小而定，鏤空面積稍、於凝膠面積，以兩塊板恰好可以夾住凝膠片以使兩邊能夠不相連通為宜，其中一塊玻璃板用玻璃膠封固在遷移池的中間位置，另一塊與之尺寸相同但不固定以便移動。兩個鉑金電極的尺寸相同，分別固定於遷移池兩側壁的內側，並通過兩才艮與之一體的鉑金引線分別與電源的正負極相連。應用時，將電泳後的凝膠夾在兩塊鏤空玻璃板中間，用夾子將其固定，保證兩邊液體不相流通，連通電源後即可在電場力的作用下迫使凝膠中的金屬離子遷移到溶液中，最終在陰極板上以金屬單質的形式析出。實施例2圖2所示是應用實施例l中的電遷移池，利用本發明方法對不同量的牛血清白蛋白(BSA)電泳後的凝膠進行染色。圖中一系列條帶為一維電泳後利用本發明方法對其進行電遷移後再染色所標記出的蛋白質條帶。各個條帶的上樣量不同，均標記於各帶的正上方，所使用的單位為ng,由圖可知本發明方法對BSA的檢測限可達到39ng。可見本發明方法可以作為一種檢測靈敏度很高的一維聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後蛋白質染色的方法。具體操作過程將電泳後的凝膠取出，用水反覆清洗三次除去表面大量的電泳緩衝液，再用0.3MCuCl2溶液浸泡凝膠lh,取出後用水清洗兩次，以除去表面大量的Cu2、再將凝膠置於電遷移池中進行遷移。遷移電壓為40V,時間為2h,所用的電極緩衝液為0.05MNH4Ac,用1MH2S04調其pH為3.5。電遷移完成後，用水衝洗凝膠兩次，將其浸泡於0.05%的三羥基水楊基焚光酮(以50%甲醇溶解)中進行顯色，顯色時間約為3-4h，再以20。/。的甲醇作為脫色劑進行脫色lh，以脫去凝膠基質上的有色物質。經過試驗發現，遷移開始10min後，陰極板上鍍有大量金屬Cu,溶液中也黑色的銅屑懸浮，所以此時需更換溶液並清洗陰極鉑金板，具體方法是拆下陰極端電極，用稀酸除去表面鍍上的大量金屬銅，用水衝洗乾淨後繼續遷移，以後每半小時清洗一次陰極電極。在遷移過程中，由於Cu"不斷地鍍到陰極上，溶液中電流便不斷減小，所以每隔lh需更換電極緩衝液一次。遷移過程中整個池子需置於冰浴中後再連通電源，以免產生的電熱效應使蛋白質發生變化。實施例3圖3a-3d所示分別為利用本發明方法分別對等量的BSA和富硒酵母蛋白進行凝膠上染色的比較圖。每張圖的左側兩個點均為不含硒的BSA點，右側兩點均為富硒酵母蛋白質點，所有點的蛋白量均相同。圖a、b、c、d的電遷移時間分別為lh,2h,3h,4h。上樣方法配濃度為lmg/ml的BSA和富硒酵母蛋白溶液，灌制lmm厚、濃度為12%的聚丙烯醯胺凝膠，先使其乾燥，再用加樣槍分別加上述兩種蛋白溶液，點樣量均為2pl，待蛋白溶液被吸收進凝膠基質後，用水浸泡凝膠使其充分溶脹。電泳後將凝膠取出，其餘操作步驟參照實施例2。隨著遷移時間的延長，可以發現BSA點逐漸減淡，到4h時已經完全沒有顏色，而硒酵母蛋白點則能夠一直保持比較深的顏色，直到4h時才稍有減弱，4h後與BSA結合的Cu"全部遷移到了陰極上，經染色後不再顯示蛋白點，而與硒蛋白結合的012+仍大量保留，所以仍顯示出較深的顏色，這就證明了在相同電場力作用下含硒蛋白與不含硒蛋白對Cu"的保留是有很大差異的，含硒蛋白與Cu"的相互作用力要大得多，這就可以通過控制遷移時間實現選擇性檢測。實施例4圖4a所示為本發明用於富硒酵母蛋白雙向電泳分離後凝膠進行染色的結果圖。雙向電泳的條件和參數如下取100^11.71mg/ml富硒酵母蛋白質樣品溶液，加入40jil水化上樣緩沖液(8M尿素，4。/。CHAPS,65mMDTT,0.2%兩性電解質，0.001%溴酚藍)，渦旋混勻，上樣至7cm、pH3-10的IPG膠條上，進行等電聚焦，聚焦程序如表l所示。表1等電聚焦程序tableseeoriginaldocumentpage11聚焦完成後將膠條取出進行平衡使蛋白質發生還原和曱基化，分別用緩沖液I(8M尿素，2%SDS,0.375MTris-HCl(pH8.8),20%甘油，2%DTT)和緩衝液II(8M尿素，2%SDS,0.375MTris-HCl(pH8.8)，20%甘油,2.5%IAA)平衡膠條各15min。繼續用SDS-PAGE進行第二向的分離，採用12%的聚丙烯醯胺分離凝膠(厚度為lmm)。所用的溶液均為新鮮配製。初始電壓為80V,待樣品在分離H交部分濃縮成一條線時，將電壓增大到120V直到電泳完成。電泳後將凝膠取出，其餘操作步驟參照實施例2,電遷移的遷移時間為3h。根據PDQuest軟體分析結果，共得到了48個蛋白質點，並——對其進行了編號，例如4601就是PDQuest分析軟體對蛋白點進行的編號。為了證實本方法對含硒蛋白的選擇性，可以將染色後凝膠上的所有蛋白質點切下，在濃HN03/H202(1:l)的作用下將凝膠消解成溶液狀態，利用原子吸收光譜法測定其中硒的含量，在測定過程中加入了Ni(N03)2作為基改劑，得到了比較好的線性，測得的數據如表2所示。表2扣除空白後各個點的硒含量值tableseeoriginaldocumentpage12a:PDQuest軟體對各個蛋白質點的編號b:面積為1.5mn^的空白處(是指兩塊玻璃板除鏤空部分外周圍所夾的凝膠部分)凝膠點的硒含量3.88ng根據數據可知，所檢測到的點全部為含硒蛋白點，但是其硒含量有比較大的差異。這跟酵母在富硒過程中其生物合成硒蛋白的方式有關，不可能所有的蛋白中都含有較大量的硒。這就有力的證明了本發明方法可以對含硒蛋白進行選擇性檢測。作為比較，還利用傳統的考馬斯亮藍法對同樣條件下電泳得到的凝膠進行了染色，所得結果圖如圖4b所示，根據PDQuest軟體分析結果，共得到了103個蛋白質點。經比較，a圖左上方部分所出現的蛋白質點明顯多於b圖，這就可以證明本發明方法對蛋白質染色的靈敏度要高於傳統方法。實施例5為了進一步證實在實施例4中標記出的蛋白點的確為含硒蛋白，選取其中一個含有蛋白質的凝膠點(4601),切下以後利用膠內酶切的方法進行酶解，再利用ESI-QTOF對其進行測序。酶解方法切下凝膠點置於1.5ml離心管中，首先用500^1水洗2次，每次10分鐘，再加0.25MEDTA/0.25MTris-HC1(pH9.0)溶液對膠片進行脫色，37。C溫育20分鐘，重複上述步驟，直到凝膠的顏色褪去。加CH3CN50^1脫水至膠粒變白，真空抽乾10min。力p10mMDTT/25mMNH4HC03混合溶液20^1(其中NH4HC03的作用是給蛋白質酶解提供一個偏鹼性環境，又不會使蛋白質結構受到石皮壞)，56。C水浴lh。冷至室溫，吸乾，快速加50mMIAA/25mMNH4HC03混合溶液20^1,置於暗室45min。依次用下列溶液進行超聲清洗25mMNH4HC03(2次)、25mMNH4HCO3+50%CH3CN(2次)、CH3CN(1次)，每次10min。CH3CN脫水至膠粒變白，真空抽乾10min。將O.liag/^1胰蛋白酶液用25mMNH4HC03稀釋10-20倍，每管加4)al，稍農i離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4'C放置30min。待酶液被膠粒完全吸收，力o25mMNH4HC03至總體積15^1,37。C過夜。加入50。/。CH3CN(含0.5%曱酸)停止反應，冰浴超聲提取肽段。再將全部樣品進行微量凝膠透析，以除去其中的雜質和鹽類，便於進行質譜分析。將處理好的樣品用50o/。CH3CN(含0.5%曱酸)稀釋10倍，進行Q-TOF分析。圖5a為4601蛋白點酶解後樣品的質譜圖，插圖為質荷比(m/z)為896.4985的峰附近出現的一系列同位素峰；圖5b為m/z896.4985峰的二級質譜碎片峰，標記出的為b和y系列離子以及由此推算出的該蛋白中的一段胺基酸序列。所得的m/z896.4985峰的二級質語數據如表3所示。表3ESI-MS/MS所得m/z896.4985峰的二級質譜數據tableseeoriginaldocumentpage143091.65274.178213.9922.2126384.300713193.40722.879219.00333.7127388.24662.63296.90363.680226.52642.8128395.16251.73399.87263.281234.73522.8129399.02391.734101.34513.482241.32562130401.43880.935102.63522.883241.94730.7131401.94810.736105.28542.684242.28321.2132402.81480.937106.77741585242.84682.9133410.20571.638108.161186243.02492.3134419.8480.839110.82761887243.133157.3135420.13440.740112.28412488243.36582136422.01170.441113.27623689244.14773.3137422.37721.442114.29310890244.67071.2138439.1223143115.951691246.29232.7139446.690.544118.72422192250.62653140455.52861.445120.80372393255.80111.3141458.44861.246121.95892694256.72642142464.01571.247124.01682195257.75551143467.2513148126.18481196259.20571.8144471.8220.8#m/zS/N#m/zS/N#m/zS/N145481.25034.1184592.93331.3223828.62771.2146482.11790.8185601.35831224834.91031.3147491.34130.5186604.25450.7225837.73870.7148498.28070.8187614.00920.6226840.62720.5149504.08411188619.63131.1227852.17511.2150508.08630.3189629.16880.9228863.33510.7151508.18650.6190638.15711.4229868.86750.4152508.6291191641.31911.1230876.55960.3153508.69550.9192651.77430.9231883.19071imageseeoriginaldocumentpage16從所得到的質譜峰數據中可以推斷出一段含硒的胺基酸序列，這就更好的證明了利用本發明方法所標記出的蛋白質點均為含竭蛋白點。本發明所設計的電遷移池在應用過程中，可以隨時更換電極緩沖液，防止由於金屬還原造成的溶液導電能力下降，並且方便隨時清洗電極。整個池子以玻璃為材料製成，既可以防水又耐腐蝕，不易發生各種化學變化。電遷移完成後，由於其中的一塊鏤空玻璃板可以隨時移動，就可以很方便地將遷移完成的凝膠取出，進行清洗以及下一步的染色。遷移過程採用金屬鉑作為電極，可避免電極本身發生腐蝕，也避免了電極腐蝕溶解後對凝膠和其中的蛋白質造成汙染。本發明方法採用銅離子作為遷移離子，由於其比較廉價易得，電極電位又比較合適，可以很容易地鍍到陰極上。利用本發明方法，可以對二維凝膠上的含硒蛋白質點進行選擇性檢測，並且已經經過了實驗的證實。另外，本方法也適用於一維電泳後非含硒蛋白質的染色，可以作為一種常規的聚丙烯醯胺凝膠分離後蛋白質染色的方法。以上所述僅為本發明的較佳實施例，對本發明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。本專業技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和範圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效，但都將落入本發明的保護範圍內。權利要求1、一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，其步驟包括(1)採用金屬離子對蛋白質電泳分離得到的斑點進行選擇性染色；(2)採用一電遷移方法，將與進行選擇性染色的蛋白質以外的位置上結合的金屬離子除去；(3)採用能與用來染色的金屬離子結合的染料對蛋白質進行顯色，在電泳膠片上將蛋白質斑點取下後，採用絡合劑將結合在蛋白質斑點上的金屬離子除去，以便進行後續的質譜分析。2、根據權利要求1所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述步驟(1)是將分離的蛋白質電泳凝膠從電泳池中取出後，用水反覆清洗，再用金屬離子的鹽溶液浸泡凝膠，取出後用水清洗；所述金屬離子的鹽溶液其濃度範圍為0.1至1.0mol/L,浸泡時間為0.5至3小時；所述電泳是一維電泳或雙向電泳。3、根據權利要求2所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述凝膠為聚丙烯醯胺凝膠；所述金屬離子是具有高檢測靈敏度的，並且容易在陰極上析出從而除去的過渡金屬離子，包括銅、鋅、鐵或鈷；所述金屬離子的鹽中其酸根為氯離子、硫酸根、磷酸根、甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、蘋果酸根、枸椽酸根、抗壞血酸根、苯曱酸根或水楊酸才艮。4、根據權利要求1所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述步驟(l)中的選擇性染色是指選擇對所有的蛋白質斑點染色時，所述步驟(2)可以通過調整遷移時間，使得電泳凝膠上無蛋白質斑點的基底上的金屬離子全部遷移掉，留下與蛋白質斑點結合的金屬離子以便隨後對其檢測；其中所述遷移時間的調整，是在平行實驗中，該遷移時間導致用金屬離子檢測染料顯色時，凝膠上沒有蛋白質斑點處和蛋白質斑點上所結合的金屬離子顯色結果對比度達到最大。5、根據權利要求1所述的用於蛋白質雙向電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中的選擇性染色是指選擇對目標蛋白質斑點染色時，所述步驟(2)包括首先釆用電遷移方法除去與凝膠基質結合的金屬離子，留下與蛋白質斑點結合的金屬離子；進一步採用電遷移方法，通過延長遷移時間使只與目標蛋白結合的金屬離子保留在凝膠上，再對其進行顯色；其中所述遷移時間的延長是在平行實驗中，該遷移時間導致非目標蛋白質斑點處的金屬離子在採用檢測染料顯色時觀察不到。6、根據權利要求5所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述的目標蛋白質為含硒蛋白質和/或硒蛋白，所述金屬離子為銅離子，所述電遷移的恆定直流電壓為2V至50V,遷移時間為4h。7、根據權利要求1所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述電遷移方法是在包括電極和緩沖液的電遷移池中進行，且包括隨時更換電極緩沖液及清洗電極的過程，以及電遷移的過程中用冰浴冷卻。8、根據權利要求1所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中，所述染料為三羥基水楊基焚光酮、雙縮脲、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀或二甲酚橙；所述絡合劑為EDTA、檸檬酸鈉、枸櫞酸鈉、Tris或NH3。9、一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的裝置，其特徵在於，其包括電泳池和電遷移裝置，所述電遷移裝置為玻璃板和玻璃膠構製成的電遷移池，所述電遷移池有兩塊中間鏤空的玻璃板，一塊釆用玻璃膠封固在電遷移池中間，另一塊可以移動，需要電遷移的電泳凝膠夾緊在兩塊中間鏤空的玻璃板中間，在電遷移池的兩邊中充入鹽類溶液構成的緩衝液，所述電遷移池的兩邊中分別;改置了一塊鉑電極，鉑電極上施加的直流電壓範圍為2至50V之間。10、根據權利要求9所述的用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的裝置，其特徵在於所述緩衝液是pH值在2~11、濃度為0.01至0.5mol/L的鹽類溶液，所述鹽類為銨鹽和有機鹼類鹽的溶液，其中鹽的酸根為氯離子、硫酸根、磷酸根、甲酸、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、蘋果酸根、枸椽酸根、抗壞血酸根、苯甲酸根或水楊酸根，其中的有機鹼為RNH2、RR，NH、RR，R"N或三羥甲基氨基曱烷，所述R,R，，R，，分別選自CH3-、C2H5-、C3H7-、C4H9-中的一種。全文摘要本發明提供一種用於蛋白質電泳分離後選擇性染色的方法，其主要步驟包括採用金屬離子對蛋白質電泳分離得到的斑點進行選擇性染色；然後採用電遷移方法將選擇性染色的蛋白質斑點以外的其他位置所結合的金屬離子除去；接著，採用能與用來染色的金屬離子結合的染料對蛋白質進行顯色，在電泳膠片上將蛋白質斑點取下後，採用絡合劑將結合在蛋白質斑點上的金屬離子除去，以便進行後續的質譜分析。本發明方法檢測的靈敏度高、所需費用少、操作簡便、省時省力、且與後續的質譜分析完全兼容。文檔編號G01N27/62GK101539496SQ20091008203公開日2009年9月23日申請日期2009年4月17日優先權日2009年4月17日發明者周麗麗,唐靜成,孫正圓,徐秉玖申請人:首都醫科大學