玉米絲黑穗病菌pcr檢測試劑盒及其製備方法

2023-07-22 09:20:56

專利名稱：：玉米絲黑穗病菌pcr檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
：本發明公開一種玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒及其製備方法，是採用PCR方法檢測玉米絲黑穗病菌(5Jwn;yoWwwm7/a做m)的技術，屬於玉米真菌病害檢測
技術領域：
。
背景技術：
：玉米絲黑穗病成為中國春玉米產區的重要病害，隨著感病品種的種植，造成絲黑穗病逐年蔓延，一般造成減產達10%，嚴重的可減產30%以上。目前鑑定由玉米絲黑穗病菌所致病苗的方法有幼苗的褪綠斑點鑑定；乳酚油棉蘭玉米生長錐鑑定；質壁分離鑑定。上述方法鑑定的準確性不高，而且不能直接證明玉米是否受到玉米絲黑穗病菌的侵染。
發明內容本發明公開一種玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒，用於玉米絲黑穗病菌的檢測。本發明還提供上述檢測試劑盒的製備方法，適用於工業化生產。本發明公開了一對特異的PCR擴增引物，用於擴增玉米絲黑穗病菌基因。序列如下-引物A:5'-GCTCTACCCATTCCCCACC-3'，引物B:5'-AACTTACCTCTTAGTGTTGG誦3'。本發明還公開一種玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒，用於診斷玉米絲黑穗病。試劑盒內含PCR擴增反應液，權利要求1中的引物A和引物B用於PCR特異擴增，含pra3基因的陽性對照DNA作為檢測的陽性指示和滅菌水。本發明玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒的製備方法如下1.陽性對照DNA的製備陽性對照認A為玉米絲黑穗病菌基因組DNA，將培養的玉米絲黑穗病菌提取基因組DNA，然後稀釋為50ng/uL裝配試劑品.;2.PCR試劑2xMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號KT205-01或KT205-02。3.試劑盒的組裝每個試劑盒按檢測IOO個樣品的量設計。按下表內容組裝試劑盒(整個操作要求無菌環境)。試劑名稱體積~2xMasterMix125pL引物A(20mM)25pL引物B(20mM)25pL陽性對照DNA5(HiL滅菌水2mL本發明試劑盒的使用方法如下取待檢標本提取基因組DNA後，用本試劑盒內試劑進行PCR擴增。PCR反應加樣體系如下，總反應體積為25pL(標本DNA的用量根據提取的基因組DNA濃度決定，最後用滅菌水補足25pL;陽性對照DNA用量為0.5pL):試劑名稱體積2xMasterMix12.5(xL引物A(20mM)0.25^L引物B(20mM)0.25pL標本DNA根據提取基因組DNA的量決定滅菌水用滅菌水補足25^L擴增反應應設陽性對照和陰性對照。加樣後按如下反應程序進行PCR擴增95。C3分鐘；9fC30秒，56t:30秒，72。C30秒，25個循環；72°C5分鐘。PCR擴增後，經瓊脂糖凝膠電泳分析(凝膠濃度為1.5%)，紫外燈下可見259bp條帶(見圖l)為陽性結果，不出現259bp條帶則為陰性結果。如果陽性對照未出現259bp條帶或陰性對照出現259bp條帶，則檢測結果無效。本發明的積極效果在於PCR擴增玉米絲黑穗病菌基因某一特異分子片段，用於玉米絲黑穗病的鑑定和病害診斷；本發明涉及的pra3基因是玉米絲黑穗病菌特有基因，因此用PCR法擴增待檢玉米樣品中pm3基因部分片段可以用於玉米絲黑穗病菌的分子檢測及由該菌造成玉米病苗的早期快速診斷。根據玉米絲黑穗病菌基因組設計特異擴增引物，並構建玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒，並擬應用于田間檢測，可準確、快速地鑑定矮化型、矮化叢生型和多分櫱型等症狀的玉米病苗是否由玉米絲黑穗病菌侵染所致，本試劑盒也可用於玉米絲黑穗病菌的分子鑑定。本試劑盒為玉米絲黑穗病菌的田間監測及預測預報提供依據，具有重大的社會意義和廣闊的應用前景。本發明的試劑盒及測定方法，具有先進性、特異性和高準確率，而且在測定時簡便和易於操作。圖1.玉米絲黑穗病菌PCR檢測結果判定12，陽性樣品；M,100bpDNALadder;圖2試劑盒的靈敏度試驗結果1,500pg4iL;2,250pg4iL;3,50pg爾L;4,25pg^iL;5，陰性對照;M，markerIII;具體實施例方式通過以下實施例進一步舉例描述本發明，並不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求範圍之內。實施例l本發明根據PCR擴增原理，設計併合成一對特異擴增玉米絲黑穗病菌基因的引物，並委託上海生工生物工程有限公司合成引物。引物合成後，用滅菌蒸餾水配製成100mM原液(儲藏液)，然後再用滅菌蒸餾水稀釋到20mM做為使用液，每管分裝25pL裝配試劑盒。引物序列如下引物A:5'-GCTCTACCCATTCCCCACC-3'弓I物B:5'-AACTTACCTCTTAGTGTTGG國3'實施例2試劑盒的組裝1.陽性對照DNA的製備陽性對照DNA為玉米絲黑穗病菌基因組DNA，將培養的玉米絲黑穗病菌提取基因組DNA，然後稀釋為50ng/"L裝配試劑盒；2.PCR試劑2xMasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號KT205-01或KT205-02。3.試劑盒的組裝每個試劑盒按檢測100個樣品的量設計。按下表內容組裝試劑盒(整個操作要求無菌環境)。試劑名稱體積2xMasterMix125nL引物A(20mM)25(xL引物B(20mM)25|JL陽性對照DNA50)xL滅菌水2mL實施例3本發明試劑盒的使用方法1.取待檢標本至少約500mg提取基因組DNA(建議用植物基因組提取試劑盒提取DNA)，DNA提取後應立即進行PCR擴增。2.用本試劑盒內試劑進行PCR擴增。PCR反應加樣體系如下，總反應體積為25pL(標本DNA的用量根據提取的基因組DNA濃度決定，大約5ng，最後用滅菌水補足25pL;陽性對照DNA用量為0.5pL):試劑名稱體積~2xMasterMix12.5(xL引物A(20mM)0.25nL引物B(20mM)0.25|iL標本DNA根據提取基因組DNA的量決定滅菌水用滅菌水補足25HL擴增時應同時設置陽性對照和陰性對照。加樣後按如下反應程序進行PCR擴增95。C3分鐘；94。C30秒，56。C30秒，72。C30秒，25個循環；72°C5分鐘。4.PCR產物的檢測PCR擴增後，經瓊脂糖凝膠(凝膠濃度為1.5%)電泳分析，紫外燈下可見259bp條帶(見圖l)為陽性結果，不出現259bp條帶則為陰性結果。如果陽性對照未出現259bp條帶或陰性對照出現259bp條帶，則檢測結果無效。實施例4本發明試劑盒的靈敏度試驗1.取陽性對照DNA進行倍比稀釋，稀釋後DNA濃度分別為500pg&L、250pg/pL、50pg/jxL、25pg/|xL。2.用本試劑盒內試劑進行PCR擴增。PCR反應加樣體系如下，總反應體積為25pL:tableseeoriginaldocumentpage8擴增時應同時設置陰性對照。加樣後按如下反應程序進行PCR擴增95°C3分鐘；94°C30秒，56°C30秒，72°C30秒，25個循環；72°C5分鐘。4.PCR產物的檢測PCR擴增後，經瓊脂糖凝膠(凝膠濃度為1.5%)電泳分析，紫外燈下可見259bp條帶(見圖2)為陽性結果，不出現259bp條帶則為陰性結果。權利要求1、用於擴增玉米絲黑穗病菌基因的PCR擴增引物，具有以下序列如下引物A5′-GCTCTACCCATTCCCCACC-3′，引物B5′-AACTTACCTCTTAGTGTTGG-3′。2、一種玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒，包含PCR擴增反應液，權利要求1中的引物A和引物B用於PCR特異擴增，含pra3基因的陽性對照DNA作為檢測的陽性指示。3、權利要求2所述的PCR檢測試劑盒的製備方法如下1)陽性對照DNA的製備陽性對照DNA為玉米絲黑穗病菌基因組DNA，將培養的玉米絲黑穗病菌提取基因組DNA，然後稀釋為50ng/UL裝配試劑盒；2)PCR試劑PCR擴增反應液；3)試劑盒的組裝每個試劑盒為檢測100個樣品；按下列內容組裝試劑盒PCR擴增反應液125pL、20mM引物A25pL、20mM引物B25^L、陽性對照DNA5(HiL、滅菌水2mL。全文摘要本發明公開一種玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒及其製備方法，根據玉米絲黑穗病菌基因組設計特異擴增引物，並構建玉米絲黑穗病菌PCR檢測試劑盒，並擬應用于田間檢測，用本試劑盒可準確、快速地鑑定矮化型、矮化叢生型和多分櫱型等症狀的玉米病苗是否由玉米絲黑穗病菌侵染所致，本試劑盒也可用於玉米絲黑穗病菌的分子鑑定。本試劑盒為玉米絲黑穗病菌的田間監測及預測預報提供依據，具有重大的社會意義和廣闊的應用前景。文檔編號C12Q1/68GK101575644SQ20091006692公開日2009年11月11日申請日期2009年5月8日優先權日2009年5月8日發明者任林柱,莉李,白容霖申請人:吉林大學