一種快速高通量的腸源致病菌檢測方法

2023-07-11 03:26:46

一種快速高通量的腸源致病菌檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速、靈敏、高通量的腸源致病菌檢測方法。本發明的檢測方法整合了聚合酶鏈式反應PCR和微陣列這兩種強大的分子生物學技術，把PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應室在同一張晶片上；檢測方法包括：標本進行增菌處理，DNA液提取，PCR擴增，雜交，清洗，結果判讀。本發明能對副溶血弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌基因進行快速高通量的檢測，通過本發明可大幅度提高進出口口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止主要食品安全事故的發生。
【專利說明】一種快速高通量的腸源致病菌檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及體外診斷試劑【技術領域】，具體涉及一種腸源致病菌快速、高通量的檢測方法。
【背景技術】
[0002]食源性致病菌引起的感染性腹瀉是世界範圍內發病率和死亡率僅次於心血管疾病的第二大疾病。以20世紀90年代後我國法定報告傳染病的發病數來看，腸道傳染病發病率一直名列前茅。霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、彎曲桿菌、產氣莢膜梭菌、阪崎菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、出血性大腸桿菌0157和.諾如病毒1、諾如病毒I1、輪狀病毒A、輪狀病毒B、輪狀病毒C等十八種病原體是引起食源性感染的重要病原體，常常在特定範圍內引起大規模暴發流行。
[0003]入出境食品安全是國際關心的重大問題，由上述致病菌引起的食物中毒事件不僅直接影響口岸衛生安全，而且影響著我國的進出口貿易。研究表明:在加工環境中存在的某種微生物能有70%的機會進入到食品。而由於食品產品中致病菌出現的機率低，樣品中致病菌的數量少，致病菌的分布不均勻，可能出現樣本本底幹擾，法規要求的檢測限很低(lcFu/25g或更低)等限制因素，導致食源性致病菌的檢測難度較大。
[0004]食源致病菌的檢測方法主要有常規檢驗方法、生物學方法和分子生物學方法等幾大類，但常規檢驗方法(直接鏡檢和細菌分離培養)和生物學方法(各種實驗動物模型和細胞方法)均存在檢測時間長，操作流程多，技術要求高，通量小等缺點，不適合用於廣泛應用。
[0005]以PCR技術為代表的分子生物學手段是現在廣泛應用於致病微生物快速檢測的技術。而由PCR技術發展起來的實時螢光PCR技術以及基因晶片技術等是目前在腸道致病菌檢測中使用最廣泛的分子生物學方法。實時螢光PCR技術是一種新的PCR方法，是在常規PCR反應的基礎上增加了能與擴增模板特異性結合的探針，與傳統PCR相比，該方法無需對PCR產物進行再處理，完全是在封閉狀態下完成檢測的全過程，具有實時、準確、快速等特點，但是由於對設備要求較高，對工作人員的操作技術難度大，同時每次只能檢測少量致病菌，所以不適合快速，高通量的檢測。
[0006]基因晶片是20世紀90年代發展起來的全新的微量分析技術，它採用微加工和微電子技術將大量的人工設計好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上而得到的一種信息檢測晶片。基因晶片可以同時固定大量的探針分子，理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病原，也可以用同一張晶片檢測某一致病原的各種遺傳學指標，這為平行檢測多個菌種或同菌種內多個菌株提供了一條便捷的途徑；同時檢測的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析檢測中有很好的發展前景。
[0007]高通量基因晶片 技術利用待檢測微生物的基因組序列設計針對各種微生物的特異探針，將該探針(寡核苷酸)點樣於晶片表面，同時在探針兩側設計PCR引物，在引物合成過程中對其5』端進行螢光標記或在PCR過程中加入螢光標記的dNTP，這樣利用PCR擴增的方法即可得到標記有螢光染料的待檢測微生物靶標，然後用含有待檢測樣品特異探針的微陣列晶片與標記的靶標雜交，螢光標記的DNA分子與晶片上相匹配的DNA序列發生雜交反應，使得晶片上的點呈現出螢光信號，最後通過掃描儀定量和分析螢光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物。
[0008]當前用於致病菌檢測的基因晶片檢測已經有些應用於研究，但是這些基因晶片的探針點樣多採用手工模式，操作複雜，並且增加了很多假陽性的機會。
[0009]本發明整合了聚合酶鏈式反應(PCR)和微陣列這兩種強大的分子生物學技術，把PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應室在同一張晶片上。PCR反應結束後可以直接加入雜交液進行雜交，操作簡單，節省時間，另外靈敏度可以達到幾百個Copy的DNA分子。不同菌之間的多重PCR引物之間不會差生交叉反應。
[0010]本發明的檢測方法可廣泛運用於副溶血弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌基因快速高通量的檢測，作為血清學試驗及細菌分離培養法的可靠補充，提高檢測的準確性和時效性，可大大地降低檢測的周期。

【發明內容】

[0011]本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏、高通量的腸源致病菌檢測方法，本發明能對副溶血弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門氏菌基因進行快速高通量的檢測，通過本發明可大幅度提高進出口口岸一線檢驗檢疫人員的檢測效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統檢測方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止主要食品安全事故的發生。
[0012]本發明針對志賀氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌各自特有基因，設計引物，在引物擴增區內設計能夠區別其他菌株的特異性探針，通過探針特異性驗證、探針靈敏度實驗、方法特異性實驗等證明該方法可以特異性多種腸源性致病菌，與常規PCR方法比較，檢測靈敏度明顯高於常規方法多重PCR擴增產物的檢測最低檢出限為l-10CFU/ml，不僅可以滿足日常食品安全檢測的要求，甚至可以滿足臨床樣品的檢測要求。
[0013]本發明所提供的快速、靈敏、高通量的腸源致病菌檢測方法，包括如下步驟:
[0014](1)標本進行增菌處理；
[0015](2) DNA 液提取；
[0016](3) PCR 擴增:
[0017]a.PCR反應體系包括:PCR反應緩衝液，待測菌基因特異性正、反向引物，PCRGradeH2O, PCRControl, DNA 提取液；
[0018]b.將PCR反應液加入已含有待測菌基因特異性探針的晶片內，將晶片放入反應室內進行擴增反應；
[0019](4)雜交:PCR擴增完後，將雜交反應液加入晶片，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內雜交反應；
[0020](5)清洗:雜交後的晶片用洗液衝洗，直接用螢光掃描儀檢測；
[0021](6)結果判讀。
[0022]步驟(2)中所述的DNA提取可使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。取1.5mL增菌液,12000rpm離心2min,棄去上清液,重懸沉澱,按照試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA ；
[0023]步驟(3)中所述的PCR 反應體系為:2XMatermix6.25ul, PrimerA/Blul, PCRGradeH200.75ul, PCRControl2ul, Sample2.5ul ;所述的 PCR 擴增的反應條件是:94 °C 預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，8個循環，每個循環退火溫度降低1°C。8個循環完成後941:變性303，561:退火30S，72°C延伸lmin，30個循環；72°C，8min。
[0024]步驟(3) 中所述的待測菌基因為志賀氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌各自特有基因，分別是副溶血弧菌的gyrB、toxR、tl、Vp-23s基因，單增李斯特菌的16s、HlyA基因，沙門氏菌的invA、FimY, muts、TTr，金黃色葡萄球菌的nuc基因，志賀氏菌的gtrB1、gtr1、proA、Oac、gtrV、gtrX ;對細菌的幾個特有基因同時設計引物和探針可提高細菌檢出的特異性。所述的特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計能夠區別其他菌株的，特異性引物和探針為:
[0025]副溶血弧菌
[0026]gyrB 基因
[0027]VPl-F:CGGCGTGGGTGTTTCGGTAG(SEQ ID N01)
[0028]VP1-R:TCCGCTTCGCGCTCATCAAT(SEQ ID N02)
[0029]Probe:TTCTCACCCATCGCCCATTCAACCG (SEQ ID N03)
[0030]或
[0031]toxR 基因
[0032]Vp2-F:GTCTTCTGACGCAATCGTTG(SEQ ID N04)
[0033]Vp2-R:ATACGAGTGGTTGCTGTCATG (SEQ ID N05)
[0034]Probe:CGGCAAATCGGTAGTAATAGTGCCG (SEQ ID N06)
[0035]單增李斯特菌
[0036]16s
[0037]Lml-F:CGACACCAGCTGACGACA(SEQ ID N07)
[0038]Lml-R:GGCCTAACACATGCAAGT(SEQ ID N08)
[0039]Probe:GTTTCGGCTATCGCTTACAGATGGC (SEQ ID N09)
[0040]或
[0041]HlyA 基因
[0042]Lm2-F:CGGAGGTTCCGCAAAAGATG (SEQ ID NOlO)
[0043]Lm2-R:AACATCGATCACTCTGGAGG (SEQ ID NOlI)
[0044]Probe:AAATCATCGACCGGCAACCTC (SEQ ID N012)
[0045]沙門氏菌
[0046]invA 基因
[0047]Sal-F:CGTTCTACATTGACAGAAT(SEQ ID N013)
[0048]Sal-R:CGAACGTGGCGATAATTTC(SEQ ID N014)
[0049]Probe:CAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT (SEQ ID N015)
[0050]或
[0051]FimY 基因
【權利要求】
1.一種快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:包括如下步驟: (1)標本進行增菌處理； (2)DNA液提取； (3)PCR 擴增: a.PCR反應體系包括:PCR反應緩衝液，待測菌基因特異性正、反向引物，PCRGradeH2O, PCRControl, DNA 提取液； b.將PCR反應液加入已含有待測菌基因特異性探針的晶片內，將晶片放入反應室內進行擴增反應； (4)雜交:PCR擴增完後，將雜交反應液加入晶片，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內雜交反應； (5)清洗:雜交後的晶片用洗液衝洗，直接用螢光掃描儀檢測； (6)結果判讀。； 所述的待測菌基因為志賀氏菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌各自特有基因。
2.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:所述的特有基因分別是副溶血弧菌的gyrB、toXR、tl、Vp-23s基因，單增李斯特菌的16s、HlyA基因，沙門氏菌的invA、FimY、muts、TTr,金黃色葡萄球菌的nuc基因，志賀氏菌的gtrB1、gtrl、proA、Oacλ gtrV、gtrX。
3.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:所述的特異性探針是根據特異性引物擴增區內設計能夠區別其他菌株的，特異性引物和探針為: 副溶血弧菌 gyrB基因 VPl-F:CGGCGTGGGTGTTTCGGTAG(SEQ ID N01) VP1-R:TCCGCTTCGCGCTCATCAAT(SEQ ID N02)
Probe:TTCTCACCCATCGCCCATTCAACCG (SEQ ID N03) 或 toxR基因 Vp2-F:GTCTTCTGACGCAATCGTTG(SEQ ID N04) Vp2-R:ATACGAGTGGTTGCTGTCATG(SEQ ID N05)
Probe:CGGCAAATCGGTAGTAATAGTGCCG (SEQ ID N06) 單增李斯特菌
16s Lml-F:CGACACCAGCTGACGACA(SEQ ID N07) Lml-R:GGCCTAACACATGCAAGT(SEQ ID N08)
Probe:GTTTCGGCTATCGCTTACAGATGGC (SEQ ID N09) 或 HlyA基因 Lm2-F:CGGAGGTTCCGCAAAAGATG(SEQ ID NOlO)
Lm2-R:AACATCGATCACTCTGGAGG(SEQ ID NOlI)
4.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的DNA提取可使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。取1.5mL增菌液，12000rpm離心2min,棄去上清液,重懸沉澱,按照試劑盒說明書中的提取步驟提取DNA。
5.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:步驟(3)中所述的 PCR 反應體系為:2XMatermix6.25ul, PrimerA/Blul, PCRGradeH200.75ul, PCRControl2ul, Sample2.5ul。
6.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:所述的PCR擴增的反應條件是:94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，8個循環，每個循環退火溫度降低TC。8個循環完成後94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸Imin, 30 個循環；72°C, 8min。
7.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:步驟(3)所述的PCR擴增與步驟(4)所述的雜交在晶片儀上完成。
8.根據權利要求1所述的快速高通量的腸源致病菌檢測方法，其特徵在於:晶片系統直接檢測細菌 的裂解液，檢測的靈敏性為IO4-1O5水平。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898208SQ201310617757
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】田楨幹, 張子龍, 張曉航, 李深偉, 王俐, 李平 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局