重組人雌激素α受體配體結合域蛋白及其製備和應用的製作方法

2023-07-11 15:00:21

專利名稱：重組人雌激素α受體配體結合域蛋白及其製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及如何快速、大量地獲取重組人雌激素α受體配體結合域蛋白並將其 固定化於載體表面，用於選擇性純化環境雌激素汙染物的相關方法，屬於生物分析化學領 域。
背景技術：
環境雌激素是一類能夠模仿生物內源性雌激素的功能而對生物內分泌系統產生 幹擾和破壞作用的外源性化合物，它們廣泛存在於環境中，對人類健康造成嚴重的威脅。近 十幾年來針對已發現的各種環境雌激素物質，如雙酚Α、己烯雌酚、烷基苯酚、酞酸酯類化合 物和有機氯農藥等已經建立了各種各樣的分析檢測方法。但這些方法主要依賴於根據化合 物的極性特點進行提取和純化，選擇性不高，經常由於樣品基體的嚴重幹擾而無法準確定 性和定量。免疫親和純化方法特異性好，但局限於識別抗體對應的抗原分子，對雌激素類化 合物並沒有普適性，需要逐一製備各化合物的抗體，使用時也達不到高通量檢測的要求。為 了能夠快速了解環境樣品中雌激素汙染的總體水平，並且及時發現目前未知的其它具有類 雌激素性質的人工化學品，迫切需要開發能同時檢測樣品中所有環境雌激素汙染物的組成 和含量的高通量、通用型檢測技術。研究表明，環境中的雌激素類汙染物對生物體的作用途徑和生物效應雖不完全相 同，但一般都是通過與雌激素受體結合而產生作用。因此，有效利用雌激素受體來構建環境 雌激素類汙染物的檢測方法是解決上述難題的一條重要途徑。現有的環境雌激素汙染物的 高通量預篩選方法有人體乳腺癌細胞增殖法(MCF-7cell proliferation，簡稱Ε-Screen) 和重組酵母檢測系統(Yeast estrogen screen，簡稱YES)。然而，實際體系中的環境雌激 素汙染物與其他物質之間常存在協同效應或拮抗效應，這種相互作用可對上述Elcreen 或YES方法造成嚴重幹擾，從而限制了這兩種方法的廣泛應用。與前述兩種方法相比，基於 雌激素受體蛋白對具有雌激素活性的化合物的特異性識別作用的體外分析法具有快速、可 靠、成本低、重現性好等優點，在實現高通量預篩選方面具有明顯的優勢。目前獲得人雌激素受體的途徑主要有從子宮等組織樣品中提取及採用真核細胞 表達等，這兩類方法都存在過程繁瑣、耗時且產量低的缺點，無法滿足大量使用的需求，嚴 重製約了相關檢測方法的發展。人雌激素α受體蛋白可劃分為六個不同的功能結構域，其 中能夠特異性地與內源或外源性雌激素化合物相結合的配體結合域(LBD)含有約250個氨 基酸殘基，將包含此配體結合域的蛋白片段單獨克隆出來，則有望實現大批量的原核表達 並應用於相關雌激素化合物的體外分析。大規模重組受體配體結合域的表達通常是在酵母和大腸桿菌中進行，例如，1996 年Siackleton等報導了重組人雌激素α受體配體結合域蛋白(rhERα-LBD) (303-553) 在啤酒酵母Mccharomyces cerevisiae BJ M60中的過表達，重組蛋白融合了泛素標 籤(ffitkowska, H. Ε. , Green, B. N. , Carlquist, Μ. , and Shackleton, C. H. L. . Intact noncovalent dimer of estrogenreceptor ligand-binding domain can be detected byelectrospray ionization mass spectrometry. Steroids (1996),61 :433-438.)。1998 年，Greene等報導了 rhER α -LBD (四7_554)在大腸桿菌菌株BL21 (DE3) pLysS中的過表達， 重組蛋白通過雌二醇親和柱和離子交換柱層析得以純化，純化的蛋白用於研究受-配體復 合物的晶體結構(Andrew K. Shiau, Danielle Barstad, PauIaM. Loria, Lin Cheng, Peter J. Kushner, David A. Agard, and Geoffrey L. Greene. The StructuralBasis of Estrogen Receptor/Coactivator Recognition and the Antagonism of This Interaction byTamoxifen. Cell (1998)，95 :927-937.)。2001 年 Ruff 科研組報導了四種 rhERa -LBD,即 (302-552)，(302-595)，(302-531)和(302-567)在大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)中的過表達， 重組蛋白在N端設計有一個6XHis tag，所得可溶性重組蛋白通過親和、離子交換和凝膠 過濾三步層析得以純化(Sylvia Eiler,Monique Gangloff, Sylvie Duclaud，Dino Moras, and Marc Ruff. Overexpression, Purification, and Crystal Structure of Native ERa LBD. Protein Expression andPurification (2001)，22 :165-173.)。該科研組在蛋白 的表達和純化過程中都加入了配體雌二醇，純化後的蛋白用來結晶和分析結構。從上述已報導的重組人雌激素α受體配體結合域蛋白(rhERa-LBD)的組成來 看，都是從LBD對應的起始胺基酸302開始或只向N端延伸了 5個胺基酸(即從297位氨 基酸開始)，這對保護LBD的活性構象是不足的；另外從製備方法上看，上述方法均只在蛋 白的一端融合了標籤，純化過程中需要多個步驟，而且都需加入大量的雌二醇配體來保護 受體蛋白的活性和構象，不僅耗時費力，而且增加了成本；尤其重要的是，到目前為止，國內 外都還沒有研究小組報導利用rhERa LBD製備雌激素受體親和吸附劑並用於環境雌激素 汙染物的選擇性純化富集。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種重組人雌激素α受體配體結合域蛋白，以用於 環境雌激素類汙染物的檢測。本發明的重組人雌激素α受體配體結合域蛋白，包括人雌激素α受體蛋白的 第270位胺基酸殘基至第5M-595位中任一胺基酸殘基的片段，以及連接於該片段N端的 6 X Hi s 標籤(6 X Hi s tag)和 C 端的 Str 印 tag II 標籤(Strep tag II tag)。人雌激素α受體蛋白(hERa (1-595))的胺基酸序列如序列表中SEQ No. 1所 示，其基因序列如序列表中SEQ No. 2所示。優選的，所述片段為下列兩種片段之一 (1)人雌激素α受體蛋白的第270位胺基酸殘基至第5 位胺基酸殘基的片段，即 hERa (270-554) ； (2)人雌激素α受體蛋白的第270位胺基酸殘基至第595位胺基酸 殘基的片段，即hERa (270-595) 0相應的重組人雌激素α受體配體結合域蛋白命名為 rhERa -LBD(270-554)和 rhERa -LBD(270-595)本發明的第二個目的是提供一種製備上述重組人雌激素α受體配體結合域蛋白 的方法，其包括以下步驟1)設計引物，通過PCR將人雌激素α受體蛋白的第270位胺基酸殘基至第 554-595位中任一胺基酸殘基的片段的DNA序列克隆出來；2)將步驟1)得到的DNA序列連接到雙標籤表達質粒載體中，使該DNA序列的5』 端和3』端分別連接6XHis tag和Mi^p tag II tag的編碼序列，得到重組蛋白表達質粒；3)將步驟幻獲得的重組蛋白表達質粒轉入細胞，表達重組人雌激素α受體蛋白 配體結構域蛋白，該蛋白的N端帶有6XHis標籤，C端帶有乂1~印tag II標籤；4)裂解細胞，然後離心取上清5)上清液利用Ni-NTA親和層析柱進行第一步親和純化，收集洗脫物；6)在第一步親和純化的洗脫物中加入親和素(avidin)以屏蔽生物素；7)將步驟6)處理後的樣品用Mi^p-Tactin kpharose凝膠柱進行第二步親和層 析，收集洗脫物，濃縮保存。上述步驟2、所使用的雙標籤表達質粒載體優選德國IBA公司的雙標籤表達質粒 pASK-IBA43plus (大腸桿菌表達載體)或pEXPR_IBA43 (哺乳動物細胞表達載體)。本發明的第三個目的是提供一種環境雌激素汙染物的高通量檢測手段，將上述重 組人雌激素α受體配體結合域蛋白固定化於載體表面，製成雌激素受體親和吸附劑，用於 選擇性純化和富集環境中的雌激素汙染物。上述載體可以是能夠固定化所述重組人雌激素α受體配體結合域蛋白的凝 膠，可以是Ni-NTA親和層析凝膠、Strep-Tactin Sepharose凝膠，也可以是CNBr活化的 Sepharose 4Β凝膠。將重組人雌激素α受體配體結合域蛋白偶聯到其中一種凝膠上，然後 裝柱製成雌激素受體親和柱，利用該雌激素受體親和柱純化和富集環境樣品中的雌激素汙 染物，並可進行定量測定。該方法可檢測的雌激素汙染物包括雌激素和雌激素結構類似物，例如17β_雌 二醇、己烯雌酚、雙酚Α、烷基苯酚、香豆雌酚、大豆苷元、雌三醇和雌酮等。本發明的創新之處包括以下幾個方面(1)選擇克隆的包含人雌激素α受體配體 結合域的片段是從人雌激素α受體蛋白的第270位胺基酸殘基開始的，向LBD的N端延 伸了 32個胺基酸殘基，有效保護了 LBD的活性構象。實驗表明rhERα -LBD(270-595)和 rhERα-LBD(270-554)在穩定性和與雌激素化合物的結合活性方面均優於已經報導過的 rhERa-LBD097-554)。( 本發明的重組人雌激素α受體配體結合域蛋白均帶有雙標籤 (N端的6XHis tag和C端的Mi^p tagll tag)，同時帶有這兩種標籤的重組人雌激素α 受體配體結合域蛋白尚屬首次報導，融合的兩個標籤不僅有利於蛋白純化，也為蛋白的後 續應用提供了更多便利。( 本發明的蛋白表達和純化流程中都不需要另外加入配體來幫 助穩定重組蛋白的結構或幫助洗脫純化，這樣不僅簡化了操作，降低了成本，而且所得到的 重組受體配體結合域蛋白可直接用來測活。(4)本發明首次將重組人雌激素α受體配體結 合域蛋白固定化於載體表面，製成雌激素受體親和吸附劑，並用於環境雌激素汙染物的選 擇性純化和富集，為這類環境汙染物的高通量檢測提供了有力的手段。


圖1是人雌激素α受體蛋白(hERa (1-595))和三個不同的重組人雌激素α受 體配體結合域蛋白 rhER α -LBD (270-595) ,rhER α -LBD (270-554)和 rhER α -LBD (297-554) 的結構示意圖。圖2是ELRA法比較三種不同重組人雌激素α受體配體結合域蛋白配體結合活性 的結果圖，其中(a)三種不同重組人雌激素α受體配體結合域蛋白配體結合活性的比較圖；(b)hER α-LBD (270-595)與全長蛋白的活性比較圖。圖3是通過SDS-PAGE電泳檢驗幾種重組蛋白穩定性的實驗結果。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步描述，但本領域的技術人員應當理解，實施例 不應解釋為對本發明的限制，在本發明的精神和實質範圍內，可以做各種修改和變動，本發 明的保護範圍應視所附權利要求書而定。一、重組蛋白的製備1.構建表達質粒圖1顯示了本實驗克隆的三種包含人雌激素α受體的LBD的不同長度的片段，其 中第三種rhERa-LBD097-554)是現有文獻報導過的，在此用作對照。克隆的具體方案是 以含有人雌激素受體acDNA序列的質粒pcDNA3. l(-)-hERa (北京大學醫學部基礎醫學院 尚永豐院士贈送)為PCR模板，設計特異引物對上述選擇區域進行擴增，合成的四條引物序 列如下正向O70-)引物5 『 -TGGAATTCCAGAGAGATGATGGGGAGGGCAG-3 『
正向 Q97-)引物 1 5 『 -GGAATTCATGATCAAACGCTCTAAGAAGAACAG-3 『反向(-554)引物5『 -ATTAGCTCGAGGCTAGTGGGCGCATGTAGG-3 『反向(-59 引物5 『 -AATGCTCGAGGACTGTGGCAGGGAAACCCT-3 『在引物上設計了兩個限制性內切酶酶切位點EcoR I和)(h0 I，為擴增片段在克隆 載體中的插入準備條件。參照相關軟體計算，我們採用統一的PCR熱循環參數95°C變性 2min ；94°C 30s，60°C退火30s，72°C延伸4min，;35個循環；72°C延伸lOmin，不同長度的三種 克隆片段一起被成功地擴增出來。我們選擇德國IBA公司的雙標籤表達質粒pASK-IBA43plus為克隆載體，利用它克 隆表達的融合蛋白都有一個N端6XHis tag和一個C端Mi^p tag II tag，這兩種標籤 可以用於融合蛋白的純化和識別，所以表達質粒的選擇也基本決定了後續重組蛋白的表達 和純化步驟。克隆片段經電泳和測序等步驟檢驗正確後，再經雙酶切獲得兩個粘性末端，並 在T4連接酶催化下連入上述雙標籤表達載體。以TOP 10為轉化克隆菌，在氨苄青黴素平 板上篩選成功轉化的單克隆，並提取和檢驗質粒。按照上述克隆方法成功構建了重組人雌 激素α受體配體結合域蛋白的系列原核表達質粒，包括pASK-IBA43plus-hERa-LBD(270 -595)，pASK-IBA43plus-hER a -LBD (270-554)和 pASK_IBA43plus_hERa -LBD(297-554)。2.表達重組蛋白將上述成功構建的原核表達質粒經轉化導入表達菌株大腸桿菌BL21，然後進行原 核表達。原核表達過程包括如下步驟(1)將帶有原核表達質粒的大腸桿菌BL21劃線接種於LB (Amp+)平板，37°C過夜培 養( 16h)；(2)從過夜培養平板上挑取一個單克隆並接入3 5毫升新鮮LB (Amp+)液體培養 基中，370C，250rpm,培養6 7小時；然後，吸取1微升該對數生長中期菌液轉接入200毫 升新鮮LB (Amp+)液體培養基中，30°C，220rpm，培養過夜(12 14h)；(3)按(1 50)的體積比將過夜培養物再次進行轉接，接入5. 5升新鮮LB(Amp+)液體培養基中進行培養，370C，250rpm,並小心監測OD55tlnm值；當OD55tlnm = 0. 5 0. 6時，迅速 加入誘導物脫氫四環素O00yg/L)進行誘導表達，此時的表達實驗條件是30°C，200rpm， 3h ；(4)表達結束後，將培養菌迅速降溫，然後離心收集菌體(7000rpm，10min,4°C )， 稱重，低溫凍存。3.純化重組蛋白鑑於重組蛋白兩端各帶有一個可用於純化的標籤N端的6XHis tag和C端的 Strep tag Iltag，我們採用了相應的蛋白純化步驟即兩步親和層析，具體如下(I)^M:將凍存的已表達菌解凍，加入細胞裂解液重懸，然後冰浴中靜置作用 30分鐘；用細胞破碎儀對重懸菌體進行超聲裂解OO 30min)；低溫離心(12，000Xg， 30min, 4°C )，棄沉澱，取上清，並加入DNase I (5 μ g/mL)室溫作用10 15分鐘以降低溶液 的粘稠度。(2)第一步親和層析取步驟(1)處理後上清樣品加入Ni-NTA柱，依次加入結合 緩衝液、洗滌緩衝液和洗脫緩衝液，收集洗脫物。(3)牛物素屏蔽匯集第一步純化洗脫物，加入avidin，混勻並低溫)靜置作 用1小時。(4)第二步親和層析取步驟(3)處理後樣品直接加入Mi^p-Tactin Sepharose 柱，依次加入洗滌緩衝液和洗脫緩衝液，收集洗脫物。(5)蛋白濃縮匯集第二步純化洗脫物，超濾濃縮，最後分裝凍存(_80°C )。上述重組人雌激素α受體配體結合域蛋白的純化過程，除了已特別說明的部分 外，都在0 4°C進行。其中步驟(1)所採用細胞裂解液的基本組成是300mM NaCl, 50mM Na&P04，IOmM咪唑 (imidazole), pH 8. 0，臨用前再加入溶菌酶(lmg/ml)，苯甲磺醯氟(PMSF) (ImM)，β _巰基 乙醇(20mM)和吐溫20(0. 1% ) ο步驟( 利用的是重組蛋白N端所帶6XHis tag。所用各緩衝液的基本組成是 300mMNaCl,50mM NaH2PO4,0. 吐溫20,0.05% β -巰基乙醇，結合緩衝液、洗滌緩衝液和 洗脫緩衝液中還分別加入了 10mM、20mM和250mM咪唑，緩衝液pH值均為8. 0。步驟(3)的目的是用親和素將樣品中混有的生物素醯化蛋白屏蔽，因為這些雜蛋 白不能經步驟(4)去除。步驟(4)利用的是重組蛋白C端所帶乂1~印tag II tag。所有各緩衝液的基本組 成是100mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl, ImM EDTA，其中洗脫緩衝液中還加入了 2. 5mM 脫硫生物素，脫硫生物素將和重組蛋白C端的Mi^p tag II tag競爭結合Mi^p-hctin 蛋白(德國IBA公司)，從而使得重組蛋白被洗脫。步驟( 進行超濾的目的不僅是為了濃縮蛋白，也是為了去掉脫硫生物素和更換 緩衝液，蛋白凍存緩衝液的組成是50mM Tris-HCl pH 8. 0,75mM NaCl，10%甘油。二、重組蛋白性質的檢測1.檢測三種重組蛋白的配體結合活性採用酶聯受體分析法(ELRA)對重組蛋白的配體結合活性進行測定，並結合我們 所構建重組蛋白的特點在已報導的ELRA分析法的基礎上加以了改進，具體步驟如下
(I)^tM 將一定濃度的17 β -雌二醇-BSA偶聯物(E2-BSA)溶液加入96孔酶標 板，37°C保溫(彡2h)或4°C過夜；(2) JMk 用PBST洗板3次，每次5分鐘，在濾紙上拍幹；(3)封閉將新鮮配製的2% BSA溶液加入測試板孔，37°C保溢(彡2h)或4°C過 夜；(4) mH 用PBST洗板3次，每次5分鐘，在濾紙上拍幹；(5)警-配體相互作用分兩種情況若是直接測定與固定配體的結合，則將一定濃度重組受體蛋白溶液 直接加入測試板孔，20°C靜置作用1小時後再進行後續操作；若是通過競爭性結合來間接 比較受-配體親和力大小，則先將一定量不同游離配體分別加入重組受體蛋白溶液，混勻 並靜置作用(20°C，2h)，然後再加入測試板孔，20°C再靜置作用1小時，隨後進行後續操作。(6) mti 用PBST洗板3 4次，每次5 10分鐘，在濾紙上拍幹；(T)JM 將一定稀釋度的識別蛋白Str印Tactin-HRP (辣根過氧化物酶HRP偶聯 的Mi^p-Tactin蛋白)溶液加入測試板孔，20°C靜置作用1小時；(S)JMk 用PBST洗板3 4次，每次5 10分鐘，在濾紙上拍幹；(9)顯餼加入HRP底物四甲基聯苯胺(TMB)，37°C保溫反應15 20分鐘，然後加 入2M H2SO4終止反應。(IO)^M 在酶標儀上，于波長450nm處測定光吸收值。上述重組人雌激素α受體配體結合域蛋白的配體結合活性的測定過程，除了已 特別說明部分，都在20°C進行。其中步驟(1)包被的E2-BSA是採用碳二亞胺法偶聯而成，而包被緩衝液組成是 IOOmMNa2CO3-NaHCO3, pH 9.6。步驟(2)、(4)、(6)、(8)洗板步驟所用PBST洗滌液組成是10mM PBS, pH 7. 4， 0. 05% 吐溫 20。步驟(3)的目的是將測試板孔中的非特異性結合位點進行有效地屏蔽，所採用 BSA濃度為2%，封閉緩衝液組成同步驟(1)中包被緩衝液。步驟(5)受-配體相互作用反應體系所採用緩衝組成是10mM Tris-HCl pH 7. 6， 10%甘油，0. 1% BSAo步驟(7)中所用識別蛋白Str印Tactin-HRP(德國IBA公司生產)不僅可以特異 性地識別重組受體蛋白所帶的Mmp tag，而且可以進行後續酶催化底物反應，從而達到識 別檢測的目的；所用Mi^pTactin-HRP的稀釋緩衝液組成是=IOmM PBS，pH 7.4,0. 1%BSA0步驟(9)中底物TMB反應混和物的組成是100mM Na2HP04pH 6. 0,0. 25mM TMB, 0. 15% H2O2 ；TMB和H2A必須新鮮混和，而且H2A只能在臨用前才混入，隨即將反應混和物 加入測試板孔。步驟(5)、(7)、(9)中靜置作用或保溫反應時都應採取避光措施。圖2是採用ELRA法比較三種不同重組人雌激素α受體配體結合域蛋白配體結合 活性的測試結果。圖3是用SDS-PAGE電泳法檢驗幾種重組蛋白穩定性的實驗結果。從圖2可以看出，rhERα -LBD(270-595)的配體結合活性優於其他兩種重組蛋白 (見圖2 (a))，且接近全長受體蛋白的配體結合活性(見圖2 (b))，說明該重組蛋白片段所含胺基酸序列對保持其活性構象是非常有利的。因此我們選用rhERα-LBD(270-5%)重組蛋 白繼續下面的研究。2.測定重組蛋白與各雌激素化合物的結合活性採用間接競爭ELRA法比較重組人雌激素α受體配體結合域蛋白 rhERα-LBD(270-595)與幾種雌激素化合物及結構類似物的結合活性。待測的配體分子(即雌激素和雌激素結構類似物)包括17β_雌二醇、己烯雌 酚、雙酚Α、大豆苷元、己烯雌酚、萘酚和對苯二酚。各配體分子的測試濃度均為6 μ M ；重組 受體蛋白rhER α -LBD (270-595)的測試濃度為0. 25 μ M0在96孔酶標板中，測試組和對照 組的每孔均用100 μ L 2μ g/mL的E2-BSA包被，然後再用2% BSA封閉。不同配體測試組樣品要進行一定時間預作用，具體操作如後在冰浴上分別加入 各待測配體分子，並與重組受體蛋白溶液充分混和，然後20°C靜置作用2小時。競爭結合 時，不同配體測試組各平行樣品孔中分別加入100 μ L預作用測試樣品，20°C靜置作用1小 時；洗板後，每孔再加入100 μ L合適濃度的Str印Tactin-HRP識別蛋白，又20°C靜置作用1 小時；洗板，加入HRP底物，在37°C溫育15 20分鐘後終止顯色反應。對照組樣品和測試組樣品同時處理。對照組分陰性對照組和陽性對照組，陽性對 照組的各平行樣品孔中加入100 μ L0. 25 μ M重組受體蛋白，而陰性對照組中僅加入100 μ L 受-配體相互作用緩衝溶液。數據處理和分析對不同配體測試組和兩種對照組的測值分別取平均值，然後分 別從陽性對照組平均值和各測試組平均值中扣去陰性對照組平均值，前者所得是無游離配 體競爭情況下重組受體蛋白的相對陽性平均值(包括特異性和非特異性結合兩部分)，以 競爭前0D45(lnm(0D45(lmi, before)表示，後者所得是各游離配體競爭結合組中對保留住重組受體 蛋白的平均測值，以競爭後OD45tlnm(OD45tlmuafto)表示。貝1J，用以下公式計算各待測配體的競爭 抑制百分率(inhibition ratio, IR)IR(% ) = (OD450lmbefore-OD450nm,am,after)/OD450lmbeforeX 100,所得競爭抑制百分率值即反映了該配體分子的受體親和力大小。檢測結果是， 這幾種雌激素及雌激素結構類似物的競爭抑制百分率值如下17β-雌二醇(52.5% 士 2. 7 % )、己烯雌酚(52. 2 % 士 4. 5%)、香豆雌酚3 % 士 3. 7%)、大豆苷元 (38. 5士4. 5% )、雙酚 Α(35·0% 士4.8% )、萘酚(17. 2% ±4. 3% )以及對苯二酚(7.0% 士2. 9% )，測試次數η = 3 ；對它們的受體親和力大小進行比較，如下17β -雌二醇彡己烯 雌酚>香豆雌酚>大豆苷元>雙酚A >萘酚>對苯二酚。三、重組蛋白的利用1.製備受體親和柱並檢測其性質製備受體親和柱可以採用Ni-NTA親和層析凝膠，通過與重組蛋白N端的6XHis 標籤的配位作用使抗體固定化，也可以使用Mi^p-hctin kpharose凝膠，通過與重 組蛋白C端的Mmp tag II標籤間的特異性相互作用使抗體固定化，兩種方法均為非 共價、定向化的受體固定化方法，操作簡便，但存在成本相對較高、可重複使用次數少 等不足之處。為此我們使用成本較低的CNBr活化的kpharose 4B凝膠作為載體，將 hER α-LBD (270-595)通過共價固定化方法製備受體親和柱，步驟如下1)重組受體蛋白與凝膠的準備將純化後的重組受體蛋白(約0. 7mg/mL)對偶
9聯緩衝液(0. ImoVLNaHCO3,0. 5mol/LNaCl, pH 8. 3)透析24小時，其間換4次液，待用；在 20mL小燒杯中加入0. 33g CNBr活化的S印harose 4B凝膠固體和IOmL lmmol/L HC1，使 凝膠完全溶脹、懸浮，並以玻棒輕輕攪拌均勻；然後將凝膠溶液轉移到G4玻璃濾器中，用 200mL lmmol/L HCl溶液配合水泵抽濾，衝洗，接著再用偶聯緩衝液衝洗幾遍，抽至近幹，用 封口膜封住濾器下部出口，待用；2)重組受體蛋白與凝膠的偶聯將重組受體蛋白溶液倒入濾器，混合均勻後將液 體轉入50mL具塞錐形瓶，並以IOmL左右的偶聯緩衝液分三次涮洗濾器，涮洗液一併加入錐 形瓶中，加塞後置於20°C溫箱，100-120rpm振蕩2_3小時；3)填柱將偶聯完畢的凝膠溶液轉入玻璃層析柱中，使凝膠在柱中自然沉降，流 出液用在線紫外檢測儀於^Onm檢測並收集(檢測儀預先用偶聯緩衝液平衡)，用偶聯緩衝 液淋洗凝膠柱至紫外信號回至基線，用量筒量取流出蛋白溶液的體積，並測量該溶液的紫 外吸收值，計算重組受體蛋白的偶聯率；4)封閉用2-3倍凝膠柱床體積的封閉液(0. lmol/L Tris-HCl, pH 8. 0)洗滌柱 子，然後關閉止水閥，使凝膠處於封閉液中，室溫靜置2hr ；5)平衡接著用 0. Imol/LpH 4. 0 的醋酸緩衝液(含 0. 5mol/LNaCl)和 0. Imol/LpH 8. 0的Tris-HCl緩衝液(含0. 5mol/LNaCl)交替衝洗凝膠柱，每次每種緩衝液的用量不少 於5倍柱床體積，共洗3個循環；最後用0. 01mol/L PBS溶液平衡，將柱子置於4°C待用。根據固定化反應前後受體蛋白溶液的濃度差可估算出在0. 33g (約1. 2mL)凝膠載 體上的固定化hER α -LBD (270-595)的量為0. 68mg。利用以上受體親和柱對含雌二醇(E2)、 己烯雌酚(DES)和雙酚A(BPA)的標準混和液(10mL，50ng/mL)進行了親和萃取，上樣和淋 洗溶劑均為純水，之後採用ImL 80%甲醇洗脫，最後使用0. 01mol/L PBS(pH= 7. 4)使親和 柱再生。收集到的上樣流出液、淋洗液和洗脫液均在Agilent 6510Q-T0F LC/MS/MS液質聯 用系統上進行定量測定。確定的色譜條件為色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18, 5 μ m, 3. OX 150mm ；流動相ACN H2O = 1 1，流速0. 4ml/min ；質譜條件負離子模式，E2m/z = 271. 17，DES m/z = 267. 16，BPAm/z = 227. 10。結果發現，在上樣流出液和淋洗溶液中均 未見各化合物的分子離子峰出現，說明都被保留。洗脫溶液中檢出了三種化合物，回收率在 85%以上。為了證實以上實驗中對三種代表性雌激素化合物的保留是由於受體蛋白的特異 性識別作用，我們設計進行了兩組對照實驗，一是以結構類似但無雌激素活性的芳香化合 物萘酚作為參照物進行以上實驗，質譜檢測m/z = 143. 05，結果發現萘酚在上樣時直接 流出，說明所製得的受體親和柱對非雌激素結構類似物的保留可以忽略；另外我們使用 與hER α-LBD (270-595)分子量相近的卵清蛋白分子OVA同時製備了對照柱，並採用與上 述親和純化相同的操作步驟進行測試，上樣0. 50μ g E2，測得在淋洗溶液中氏的含量為 0. 47 μ g，而在洗脫溶液中，E2含量僅約為16ng，表明氏在柱基質上的非特異性吸附是可以 忽略的。上述實驗結果充分證明了本發明製備的重組受體蛋白對雌激素化合物具有高特異 性識別活性，受體親和柱可用於雌激素化合物的高選擇性純化和富集。2.利用受體親和柱測定自來水樣品中的環境雌激素汙染物利用上述方法製備的rhER α -LBD (270-595)受體凝膠親和柱選擇性純化和富 集自來水樣品中的環境雌激素汙染物。收集約IOOmL自來水樣品，取出相同體積(均為40mL)的兩份，一份用於直接檢測，另一份用於測定加標回收率。樣品流過裝載1.2mL固 定化0.68mgrhER α LBD (270-59 的受體親和柱，上樣結束後用IOmL純水淋洗，之後加入 ImL 80%甲醇的水溶液洗脫。洗脫液經氮氣吹乾後定容於0.5mL流動相溶液，在Agilent 6510Q-T0FLC/MS/MS液質聯用系統上進行定量測定。色譜柱Agilent ZORBAX Extend_C18， 5 μ m，3. OX 150mm ；流動相 ACN H2O=I 1，流速 0. ;3ml/min ；質譜條件負離子模式，E2m/ ζ = 271. 17,DES m/z = 267. 16，BPAm/z = 227. 10。測定結果表明，自來水樣品中的雙酚A 含量約為22ng/L，雌二醇和己烯雌酚均未檢出。本方法測定自來水中雙酚A含量的最低檢 出限為9ng/L，回收率大於82%。
權利要求
1.一種重組人雌激素α受體配體結合域蛋白，包括人雌激素α受體蛋白的第270位 胺基酸殘基至第陽4-595位中任一胺基酸殘基的片段，以及連接於該片段N端的6XHis標 籤和C端的Str印tag II標籤。
2.如權利要求1所述的重組人雌激素α受體配體結合域蛋白，其特徵在於，所述片段 選自下述片段之一 1)人雌激素α受體蛋白的第270-5 位胺基酸殘基的片段；幻人雌激 素α受體蛋白的第270-595位胺基酸殘基的片段。
3.—種重組人雌激素α受體配體結合域蛋白的製備方法，包括以下步驟1)通過PCR將人雌激素α受體蛋白的第270位胺基酸殘基至第554-595位中任一氨 基酸殘基的片段的DNA序列克隆出來；2)將步驟1)得到的DNA序列連接到雙標籤表達質粒載體中，使該DNA序列的5』端和 3』端分別連接6XHis標籤和乂1~印tag II標籤的編碼序列，得到重組蛋白表達質粒；3)將步驟幻獲得的重組蛋白表達質粒轉入細胞，表達重組人雌激素α受體蛋白配體 結構域蛋白，該蛋白的N端帶有6XHis標籤，C端帶有Mmp tag II標籤；4)裂解細胞，然後離心取上清；5)上清液利用Ni親和層析柱進行第一步親和純化，收集洗脫物；6)在第一步親和純化的洗脫物中加入親和素以屏蔽生物素；7)將步驟6)處理後的樣品用Str印-Tactinkpharose柱進行第二步親和層析，收集 洗脫物，濃縮保存。
4.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，步驟1)將人雌激素α受體蛋白的第 270-554位或第270-595位胺基酸殘基的片段的DNA序列克隆出來。
5.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，步驟幻所使用的雙標籤表達質粒載體 為 pASK-IBA43plus 或 pEXPR_IBA43。
6.權利要求1所述重組人雌激素α受體配體結合域蛋白在檢測環境雌激素汙染物中 應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，將所述重組人雌激素α受體配體結合域蛋 白固定化於載體表面，製成雌激素受體親和吸附劑，用該雌激素受體親和吸附劑選擇性純 化和富集環境中的雌激素汙染物。
8.如權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述載體是能夠固定化所述重組人雌激素 α受體配體結合域蛋白的凝膠，將重組人雌激素α受體配體結合域蛋白偶聯到凝膠上，然 後裝柱製成雌激素受體親和柱，利用該雌激素受體親和柱純化和富集環境樣品中的雌激素 汙染物。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述載體是M-NTA親和層析凝膠、 Strep-TactinSepharose 疑月交或 CNBr 舌U白勺 Sepharose 4Β 疑月交。
10.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述雌激素汙染物為下列物質中的一種或 多種17 β -雌二醇、己烯雌酚、雙酚Α、烷基苯酚、大豆苷元、香豆雌酚、雌三醇和雌酮。
全文摘要
本發明公開了一種重組人雌激素α受體配體結合域蛋白，以及該重組蛋白的製備方法和應用。該重組蛋白包括人雌激素α受體蛋白的第270位胺基酸殘基至第554-595位中任一胺基酸殘基的片段，以及連接於該片段N端的6×His標籤和C端的Strep tag II標籤，其在穩定性和與雌激素化合物的結合活性方面均優於已經報導過的同類蛋白。且本發明的重組人雌激素α受體配體結合域蛋白帶有雙標籤，便於純化和後續應用。將該重組蛋白固定化於載體表面，製成雌激素受體親和吸附劑，可用於環境雌激素汙染物的選擇性純化和富集，為這類環境汙染物的高通量檢測提供了有力的手段。
文檔編號C12N15/12GK102060922SQ201010554288
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者李金秋, 欒書, 王丹, 謝江碧, 趙美萍 申請人:北京大學