沙拉沙星的偶聯物及其製備方法與應用的製作方法

2023-07-11 20:04:56

專利名稱：沙拉沙星的偶聯物及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種喹諾酮類抗生素的偶聯物及其製備方法與應用，尤其涉及一種沙拉沙星(sarafloxacin)的偶聯物及其製備方法與應用。
背景技術：
本發明涉及的下列名稱適用於整個說明書和權利要求書BSA＝牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，Sigma公司產品PBS＝磷酸緩衝液(Phosphate Buffered Saline)(0.01M，pH＝7.40)Sephadex-G75＝葡聚糖凝膠，Sigma公司產品Sarafloxacin-EDC＝沙拉沙星與碳二亞胺形成的活性中間體Glutar＝(Glutaraldehyde)戊二醛，上海化學試劑公司產品透析膜美國聯合炭化(United Carbide)公司產品沙拉沙星(sarafloxacin)屬於喹諾酮類抗生素。這類抗生素由於其抗菌譜廣，殺菌能力強，是繼土黴素之後在畜禽水產養殖中廣泛應用的藥物。這類藥物可以有效地預防和治療家禽細菌和黴形體疾病。沙拉沙星是其中最常用最有效的藥物之一。但人們通過研究逐漸發現，喹諾酮類抗生素在動物源食品中的殘留對人體有毒害。作為一種人畜共用藥，喹諾酮類抗生素在食品中的殘留通過食物鏈對人體健康危害很大。新英格蘭明尼蘇達州衛生署的KIRK E SMITH為首的研究小組發現，家禽使用喹諾酮類藥物使彎曲桿菌產生了耐藥性。根據美國疾病控制與預防中心的調查，一種由食品引起疾病的彎曲桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性由1998年的13.6％上升到1999年的17.6％。而我國尚未頒布動物源食品中殘留的喹諾酮類藥物的檢測方法和相應標準。美國由於考慮到這類藥物的交叉感染，已經開始在畜禽養殖業中禁用喹諾酮類抗生素。我國雖尚未在畜禽水產養殖業中禁用喹諾酮類抗生素，但有嚴格的停藥期規定。隨著人民生活水平的提高及我國加入WTO，對動物源食品的品質要求也越來越高，食品中藥物殘留的檢測必將法制化，常規化。因此，研究喹諾酮類藥物在食品中的殘留限量和檢測方法是非常必要的。
在抗生素藥物殘留的檢測中，儀器法如液相色譜和質譜以及液相質譜聯用是應用最廣泛的方法。這些方法準確，穩定，可靠，可以作為標準方法。但儀器法價格昂貴，費時較長，且造成有機溶劑汙染，需要大型儀器設備，需要專門的技術人員，所以難於用於現場操作。酶聯免疫檢測法(ELISA)提供了一種極好的掃描手段。該法具有快速，準確，簡易，不需要專門人員操作等優點，這使得ELISA法成為一種理想的，可用於常規掃描的檢測方法。酶聯免疫檢測法的核心是需要高質量的抗體。大多數抗生素包括喹諾酮類藥物都是小分子有機化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以，必須把這些化合物轉變成能引發動物免疫系統產生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。但是，據我們所知，現在世界上尚未有關於沙拉沙星的免疫原的合成及其抗體製備的報導。

發明內容
針對上述現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種沙拉沙星的偶聯物及其製備方法與應用，利用本發明提供的沙拉沙星的偶聯物可以作為免疫原，引發動物免疫系統產生針對沙拉沙星有特異反應的抗體，從而獲得相應的抗體。
本發明的沙拉沙星(Sarafloxacin)的偶聯物，由沙拉沙星半抗原與產生抗原性的載體物質偶聯構成，所述載體物質優選為蛋白質、蛋白質片段、合成多肽或半合成多肽。
上述的沙拉沙星的偶聯物，其中所述的蛋白質優選是牛血清蛋白。
本發明所述的沙拉沙星的偶聯物，其結構通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的沙拉沙星的分子數，n為整數1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量範圍是6.6KDa～6.9Kda。
上述沙拉沙星的偶聯物顯示出如下物化特徵(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜280，323，331nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547上述沙拉沙星的偶聯物，優選n為整數1～10，BSA分子量範圍是6.7KDa～6.8KDa。
上述沙拉沙星的偶聯物的製備方法是將沙拉沙星與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物，並保持該偶聯物的生物活性不變。
上述沙拉沙星的偶聯物的製備方法具體由如下步驟組成(1)溶液A的製備將沙拉沙星，羥基琥珀醯亞胺，碳二亞胺鹽溶液，以摩爾比1∶3～5∶5～7溶解在二甲基甲醯胺中，反應4～6小時，生成沙拉沙星與碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)溶液B的製備把上述BSA溶於磷酸緩衝溶液中，配成9.5～15mg/ml的溶液，備用；(3)在20℃～30℃條件下，以不斷攪拌方式，把溶液A逐漸加入到溶液B中，反應4～6小時，得到溶液C；(4)將溶液C用磷酸緩衝液透析70～78小時，每10～12小時更換一次透析液；(5)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析後的溶液C，取上清液；(6)凍幹上清液，得到沙拉沙星的偶聯物粗品；(7)用葡聚糖凝膠層析作純化分離，PBS緩衝溶液為洗脫液，收集沙拉沙星的偶聯物純品，再經凍幹得到白色固體粉末狀的，具有誘發動物免疫系統產生抗體的沙拉沙星免疫原偶聯物。
其中，步驟(1)所述沙拉沙星，羥基琥珀醯亞胺，碳二亞胺鹽的摩爾比為1∶4∶6。
其中，所述溶液C中沙拉沙星與牛血清蛋白的摩爾數比為6∶1。
其中，所述的磷酸緩衝液pH為7.40，濃度為0.01M；所述的葡聚糖凝膠層析採用Sephadex-G75。
上述沙拉沙星的偶聯物作為免疫原在製備沙拉沙星特異反應抗體中的應用。
利用本發明的技術方案可以成功地把半抗原沙拉沙星與載體蛋白特別是牛血清白蛋白BSA偶聯起來，從而合成了能夠在動物體內引發免疫反應，產生抗體的完全免疫原。利用此免疫原對紐西蘭大白兔進行免疫，可以製得對半抗原沙拉沙星有特異反應的抗體。
經ELISA實驗鑑定，利用本發明方法所合成的沙拉沙星-牛血清蛋白偶合物(Sarafloxacin-BSA Conjugate)對紐西蘭大白兔進行免疫後，其抗血清效價達到1∶51200。這為沙拉沙星的酶聯免疫檢測方法中所用檢測試劑的開發以及製備沙拉沙星的酶聯免疫檢測試劑盒提供了廣闊的應用空間。在實際應用中，只需把該抗體鍍在微孔盤內，就可以用來檢驗動物源食品中沙拉沙星的殘留。由於上述方法具有簡易，快速，特異，準確的特點，所以可以用於食品檢驗檢疫中的初步掃描檢測之用。這樣不但可以節省大量的檢驗時間，還可以便於現場操作，從而彌補了儀器法費時較長，需要大型儀器設備支持，需要專門的技術人員操作，難於用於現場的不足。所以，半抗原沙拉沙星與載體蛋白特別是牛血清蛋白BSA偶聯物的合成及抗血清的成功製備為這種快速檢驗法奠定了基礎。
具體實施例方式
實施例1(1)溶液A的製備在50ml圓形反應瓶內，攪拌中，加入沙拉沙星13.9mg(0.042mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)19.33mg(0.168mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)48.3mg(0.252mmol)，溶解於10ml二甲基甲醯胺(DMF)中。反應4小時。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的製備在100ml圓形反應瓶內，將476mg BSA加入50ml PBS(pH＝7.4，0.01M)中。得到溶液B。備用。
(3)製備沙拉沙星免疫原偶聯物在20℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應4小時。得到沙拉沙星免疫原溶液。用PBS緩衝液透析三天，每12小時更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍幹上清液，得到412mg白色固體粉末，即為沙拉沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集沙拉沙星偶合物純品。凍幹得到沙拉沙星免疫原偶合物固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產物的偶聯和偶聯率。結果為紫外吸收光譜280，323，331nm紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547實施例2(1)溶液A的製備在50ml圓形反應瓶內，攪拌中，加入沙拉沙星20.0mg(0.060mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)19.33mg(0.240mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)69.0mg(0.360mmol)，溶解於15ml二甲基甲醯胺(DMF)中。反應4小時。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的製備在100ml圓形反應瓶內，將685mg BSA加入60ml PBS(pH＝7.4，0.01M)中。得到溶液B。備用。
(3)製備沙拉沙星免疫原偶聯物在25℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應4小時。得到沙拉沙星免疫原溶液。用PBS緩衝液透析78小時，每12小時更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍幹上清液，得到482mg白色固體粉末，即為沙拉沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集沙拉沙星偶合物純品。凍幹得到沙拉沙星免疫原偶合物固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產物的偶聯和偶聯率。
實施例3(1)溶液A的製備在50ml圓形反應瓶內，攪拌中，加入沙拉沙星40.0mg(0.120mmol)，羥基琥珀酸亞胺(NHS)38.66mg(0.480mmol)，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)138.0mg(0.720mmol)，溶解於15ml二甲基甲醯胺(DMF)中。反應6小時。得到溶液A。備用。
(2)溶液B的製備在100ml圓形反應瓶內，將1.2g BSA加入80ml PBS(pH＝7.4，0.01M)中。得到溶液B。備用。
(3)製備沙拉沙星免疫原偶聯物在30℃和攪拌下，逐步把溶液A加入到溶液B中。反應6小時。得到沙拉沙星免疫原溶液。用PBS緩衝液透析70小時，每10小時更換一次透析液。高速離心(20,000g)30分鐘。凍幹上清液，得到762mg白色固體粉末，即為沙拉沙星免疫原粗品。用Sephadex-G75(Sigma)進行純化分離，以PBS(0.01M，pH＝7.4)為洗脫液。收集沙拉沙星偶合物純品。凍幹得到沙拉沙星免疫原偶合物固體粉末。通過紅外和紫外吸收光譜確定產物的偶聯和偶聯率。
實施例4取沙拉沙星-牛血清蛋白偶合物純品，以濃度為0.01M、pH為7.40的磷酸緩衝液稀釋為100mg/ml，按每千克體重100mg的量對4隻紐西蘭大白兔進行免疫，間隔1～2月，如此重複1～2次，取紐西蘭大白兔血清，檢測針對沙拉沙星有特異反應的抗體，經ELISA實驗鑑定，其抗血清效價為1∶51200。
權利要求
1.一種沙拉沙星的偶聯物，由沙拉沙星半抗原與產生免疫原性的載體物質偶聯構成，所述載體物質為蛋白質、蛋白質片段、合成多肽或半合成多肽。
2.如權利要求1所述的沙拉沙星的偶聯物，其中所述的蛋白質是牛血清蛋白。
3.如權利要求2所述的沙拉沙星的偶聯物，其結構通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的沙拉沙星的分子數，n為整數1～20BSA為牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)，分子量範圍是6.6KDa～6.9Kda。上述偶聯物顯示出如下物化特徵(1)外觀白色粉末固體(2)紫外吸收光譜280，323，331nm(3)紅外吸收光譜(cm-1，KBr)3310，2960，1656，1538，1452，1397，1163，1075，948，860，547。
4.如權利要求3所述的沙拉沙星的偶聯物，其中n為整數1～10，BSA分子量範圍是6.7KDa～6.8KDa。
5.權利要求1～4中任一項所述的沙拉沙星的偶聯物的製備方法，其特徵是，將沙拉沙星與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物，並保持該偶聯物的生物活性不變。
6.如權利要求5所述沙拉沙星的偶聯物的製備方法，該方法步驟如下(1)溶液A的製備將沙拉沙星，羥基琥珀醯亞胺，碳二亞胺鹽溶液，以摩爾比1∶3～5∶5～7溶解在二甲基甲醯胺中，反應4～6小時，生成沙拉沙星與碳二亞胺的活性中間體，備用；(2)溶液B的製備把上述BSA溶於磷酸緩衝溶液中，配成9.5～15mg/ml的溶液，備用；(3)在20℃～30℃條件下，以不斷攪拌方式，把溶液A逐漸加入到溶液B中，反應4～6小時，得到溶液C；(4)將溶液C用磷酸緩衝液透析70～78小時，每10～12小時更換一次透析液；(5)以20,000g，30分鐘的條件，離心上述透析後的溶液C，取上清液；(6)凍幹上清液，得到沙拉沙星的偶聯物粗品；(7)用葡聚糖凝膠層析作純化分離，PBS緩衝溶液為洗脫液，收集沙拉沙星的偶聯物純品，再經凍幹得到白色固體粉末狀的，具有誘發動物免疫系統產生抗體的沙拉沙星免疫原偶聯物。
7.如權利要求6所述的沙拉沙星的偶聯物的製備方法，其特徵是，步驟(1)所述沙拉沙星，羥基琥珀醯亞胺，碳二亞胺鹽的摩爾比為1∶4∶6。
8.如權利要求6所述的沙拉沙星的偶聯物的製備方法，其特徵是，所述溶液C中沙拉沙星與牛血清蛋白的摩爾數比為6∶1。
9.如權利要求6所述的沙拉沙星的偶聯物的製備方法，其特徵是，所述的磷酸緩衝液pH為7.40，濃度為0.01M；所述的葡聚糖凝膠層析採用Sephadex-G75。
10.權利要求1～4中任一項所述的沙拉沙星的偶聯物作為免疫原在製備沙拉沙星特異反應抗體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種通式(I)的沙拉沙星的偶聯物，由沙拉沙星半抗原與產生免疫原性的載體物質優選牛血清蛋白偶聯構成。其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的沙拉沙星的分子數，n為整數1～20，BSA為牛血清蛋白，分子量範圍是6.6KDa～6.9KDa。本發明還公開了所述的偶聯物的製備方法，即將沙拉沙星與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物。本發明的方法簡便，快速，特異，用製備的沙拉沙星偶聯物免疫大白兔，其抗血清效價達1∶51200，為進一步製備沙拉沙星的酶聯免疫檢測試劑盒提供了基礎。
文檔編號G01N33/531GK1740792SQ20051004406
公開日2006年3月1日 申請日期2005年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者郗日沫, 盧聖欣, 張玉蘭 申請人:山東大學