豬細小病毒滅活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
2023-07-11 11:57:11
專利名稱：豬細小病毒滅活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種獸用活疫苗的製備方法，尤其涉及一種豬細小病毒滅活疫苗的制 備方法以及由該方法製備得到的豬細小病毒滅活疫苗，屬於豬細小病毒滅活疫苗的製備領 域。
背景技術：
豬細小病毒(Porcin印arvo viurs,PPV)可引起豬的繁殖障礙，主要表現為胎兒和 胚胎的感染和死亡，而母體通常並不表現臨床症狀。血清學陰性母豬主要在妊娠的前半期 經口鼻感染病毒，結果免疫機能不全的胎兒經胎盤受到感染，從而導致發病。經檢查得知在 世界各地的豬群中，該病毒是普遍存在的，在大多數豬場呈地方性流行。此病流行很廣，在 歐、美、亞及大洋洲很多國家均有報導。我國的各省市相繼分離到豬細小病毒，血清陽性率 很高。本病對養豬業的危害極大。由於PPV目前尚無有效的藥物治療方法，因此，該病的預 防免疫就顯得更為重要。體外培養的動物細胞有兩種類型，一種是非貼壁性細胞，培養時不貼附於支持物 上，而呈懸浮狀態生長，胞體為圓形。來源於血液、淋巴組織的細胞，多數腫瘤細胞和部分轉 化細胞屬於這一類型，其培養方式類似微生物培養方式；另一種是貼壁依賴性細胞，培養時 能貼附在支持物表面生長。當細胞貼附在支持物上後，會迅速鋪展，然後開始有絲分裂，進 入對數生長期，數天後可長成緻密的細胞單層。成纖維細胞、上皮細胞以及Vero細胞、BHK 細胞、ST細胞等大多數動物細胞都屬於此類型。目前中國生物製品生產上培養貼壁依賴性 細胞如Vero、ST細胞等多採用傳統轉瓶培養或靜置培養，該工藝因具有技術成熟投資量小 的特點而被廣泛應用，但其生產中細胞所能增殖的區域僅限於培養瓶的有限面積，培養的 環境條件難以監測和控制，因此細胞密度低，而且勞動強度大，操作過程不易控制，發生汙 染，疫苗產量及質量受到極大限制。1967年，Van Wezal首次開發了微載體系統，創建了生物反應器微載體培養細胞 工藝，使動物細胞培養進入高密度培養階段。微載體是直徑為60-50 μ m的微珠。由於微載 體本身所佔體積和質量不大，但有很大的有效面積可供細胞附著，大大提高了生產效率。微 載體最早使用的材料是離子交換凝膠(DEAE-S印hadexA-50)，輕微攪動即可懸浮於培養基 中。這種載體對細胞具有一定毒性，並且對培養液PH值也有一定影響。後來根據細胞生長 特點，對微載體進行了改良，使其帶有電荷或其它介質，更利於細胞的附著和生長。目前微 載體己有葡聚糖微載體、聚苯乙烯微載體、中空玻璃微載體、交聯明膠微載體、纖維素微載 體、聚苯烯酞胺微載體等多種不同製造材料類型。其中，使用較多的是Cyotdex型系列微載 體(Cytodexl，Cytodex2, CytodeX3)，它們都是帶有不同基團的葡聚糖交聯而成的大分子。 Cytodexl整個載體帶有正電荷，用於傳代細胞如Vero、CH0細胞的培養；CytodeX2僅表面帶 有正電荷；CytodeX3不帶電荷，其外表被膠原層包裹，膠原是豚鼠皮膚的提取物，同樣適於 細胞的附著生長。第一個工業化應用微載體的是1980年Meignier等用於口蹄疫病毒疫苗 的製造，及後來的小兒麻痺疫苗的生產製造。
採用生物反應器/微載體系統培養動物細胞，細胞貼附於微載體上，懸浮於培養 基中，逐漸分裂生長成單層細胞。該培養模式把單層培養和懸浮培養融合起來，具有以下優
點(1)表面積/體積比大，單位體積培養細胞的產率高。如Img Cytodexl微載體表 面積可達5-6cm2，較傳統的單層細胞培養面積大大增加。(2)改良後的微載體無毒性，其大小和表面性質更適宜細胞生長，而且具有一定的 透明度，便於顯微鏡觀察細胞生長情況。(3)微載體懸浮於培養基中，細胞生長環境均一，簡化了培養條件的監測和控制， 同時培養基利用率高。(4)採樣重演性好，收穫過程不複雜，勞動強度小，佔用空間小，操作簡便，所需人 員少，工藝容易放大生產。目前通過ST細胞靜態培養增殖豬細小病毒(PPV)病毒液，已被廣泛應用，然而目 前所用轉瓶系統培養ST細胞生產疫苗的工藝，雖技術簡單，但勞動強度大，即使簡單的換 液都需付出巨大的勞動，且染菌風險大。應用生物反應器系統和微載體培養貼壁細胞具有 高比表面積、細胞產量高，懸浮培養系統便於監測、控制和取樣，生產規模容易放大，不易染 菌等優點，工業上被廣泛應用於生產如狂犬病毒、脊髓灰質炎病毒等疫苗。但是，利用生物反應器系統和微載體培養ST細胞生產PPV疫苗存在著豬細小病毒 液培養產量偏低、不易規模放大、成本過高、疫苗質量不穩定等缺陷，這些缺陷嚴重影響或 制約了該方法在實際生產中的應用，有待改進。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有的豬細小病毒滅活疫苗的製備方法中所 存在的豬細小病毒液培養產量偏低、不易規模放大、成本過高、疫苗質量不穩定等缺陷，提 供一種新的豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，該製備方法利用生物反應器微載體懸浮培養 ST細胞高效生產豬細小病毒液，對生產工藝參數進行了優化，該方法具有所生產的豬細小 病毒液病毒滴度高，能夠規模化工業生產、成本低、疫苗質量穩定等優點。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，包括(1)將豬細小病毒弱毒株接種ST細 胞，培養得到生產種毒；( 將處理後的微載體加入到生物反應器的細胞生長液中，攪拌； (3)將ST細胞接入到生物反應器的微載體中進行攪拌，進行細胞的繁殖培養；(4)將豬細小 病毒生產種毒感染生物反應器中懸浮培養的ST細胞，進行病毒的繁殖培養；(5)收穫繁殖 的病毒液，滅活，配苗，即得。本發明製備方法中，所述的豬細小病毒弱毒株可以是豬細小病毒弱毒L株，其微 生物保藏號是CGMCC No. 3352 ；其中，步驟⑵中所述的微載體可以是Cyotdex型系列微載體，更優選為 Cytodex-I型微載體，所述的預處理方式包括矽化、水化和平衡；優選的，步驟( 中將預處理後的微載體按照每升細胞生長液中含有5_7g的微載 體的配比比例加入到細胞生長液中；步驟( 中所述的攪拌速度優選為40rpm;所述的攪拌 時間為20-40min，優選為30min。
本發明考察了 ST細胞的不同培養方式對細胞密度的影響，實驗結果發現，採用灌 注培養的細胞密度明顯高於批式培養的細胞密度，本發明在進行ST細胞培養時優選採用 灌注培養的細胞培養方式。此外，在灌注培養中，本發明發現細胞接種濃度對於細胞的生長 速度和穩定性等有顯著影響，本發明通過大量的實驗最終發現，當ST細胞以IXio5AiL濃 度接種到生物反應器中的微載體上時，第7天細胞密度就可達1 X IOVmL,細胞狀態穩定，維 持時間長，利於病毒繁殖。本發明人通過大量的實驗發現，攪拌速度對於細胞的貼壁影響非常大。本發明通 過大量的實驗發現，步驟(3)中所述的攪拌採用以下攪拌速度時最有利於細胞的貼壁首 先在轉速為SOrpm的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉速調整為50-60rpm ；更優選為首先在轉 速為SOrpm的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉速調整為50rpm。其中，步驟(3)中所述的培養溫度優選為37°C，培養液的pH值優選為7. O。本發明還發現，步驟中豬細小病毒生產種毒感染細胞的劑量對於病毒液的病 毒滴度有著一定的影響，本發明通過實驗篩選發現，將豬細小病毒生產種毒以感染複數為 0. OOlMOI、0. OlMOI、0. 05M0I感染生物反應器中懸浮培養的ST細胞有利於提高病毒液的病 毒滴度，尤其是將豬細小病毒毒生產種毒以感染複數為0. OlMOI感染生物反應器中懸浮培 養的ST細胞進行灌注培養法培養可以有效提高病毒液的病毒滴度。其中，所述步驟(4)中 所述的灌注培養溫度優選為35°C，培養液的pH值優選為7. 4，所述的攪拌速度為50-60rpm。本發明根據ST細胞生長代謝及病毒增殖的特點，對攪拌式生物反應器灌注培養 技術應用於豬細小病毒疫苗生產進行研究，對各技術參數進行優化和篩選，使細胞增殖時 培養環境穩定，並在接種病毒後細胞仍能得到足夠的營養和平衡的環境；同時乳酸和氨 等有毒代謝產物得以不斷排除，本發明方法的細胞維持時間長，細胞活力高(> 90% )、 活細胞密度大(彡lX107cellS/mL)，有利於病毒的持續繁殖，所製備的豬細小病毒 TCID50 ^ 108_°。生產過程銜接緊密、順暢，規模放大容易，生產周期短，佔用場地小，環境汙 染少且易於處理，豬細小病毒的收穫方便質量易於實現均衡穩定，可顯著降低生產成本、提 高疫苗產量和質量。
圖1本發明生物反應器微載體培養ST細胞生產豬細小病毒病毒液的工藝流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實驗材料1.細胞ST細胞(購自中國獸醫藥品監察所)。2.毒種豬細小病毒L株，保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，微生物保藏號CGMCC No. 3352。3.微載體Cytodex-l，Pharmacia 公司產品。
4.試劑活細胞計數試劑盒(CCK-8)，日本同仁化學研究所產品。實施例1 微載體的處理1.矽化取數ml矽油，將攪拌瓶內壁浸溼，回收多餘的矽油，烘乾攪拌瓶後，用自 來水洗九次，雙蒸水洗三次，烘乾備用。2.水化按培養的終體積稱取微載體適量，使微載體Cytodexl的終濃度為^ig/ ml，放入攪拌瓶中，用無Ca2+、Mg+2-PBS 100ml/g，室溫浸泡過夜或37°C浸泡!3hr，棄去PBS， 再用無Ca2+、Mg2+-PBS 50ml/g洗一次，棄去，最後加入無Ca2+、Mg2+-PBS 50ml/g，高壓滅菌， 115°C,IOpsi,15min。3.平衡棄去攪拌瓶中的PBS，加入高糖細胞生長液100ml/g，室溫過夜，臨用前再 用上述培養液洗一次。實施例2 生物反應器微載體培養ST細胞1、細胞復甦從液氮罐中取出ST細胞凍存管，迅速放入盛有36°C -37°C水中，搖 動凍存管，儘快解凍；用吸管吸出細胞懸液，裝入無菌離心管中，補加IOmL細胞生長液(含 5%小牛血清的MEM培養液)，吹打使細胞懸浮；將細胞懸液離心，IOOOrpm離心10分鐘，棄 上清；加入細胞生長液適當稀釋後，移入細胞培養瓶中，置37°C培養箱培養，6小時後更換 細胞生長液一次，再繼續培養。2、細胞的傳代與培養取生長良好的緻密單層ST細胞，吸出細胞生長液，用PBS洗 滌1-2次；再加入濃度為0. 25%的胰酶消化液，37°C消化5分鐘，待細胞層鬆散、細胞圓縮 時，吸出細胞消化液，加入少量細胞生長液吹打細胞，製成均勻細胞懸液，將適量細胞懸液 移入滅菌細胞瓶，每瓶補加適量生長液，置37°C恆溫培養，形成良好細胞單層時，用於繼續 傳代或接種於生物反應器中進行微載體懸浮培養。3、細胞毒種的繁殖用維持液(1%小牛血清的MEM培養液)將豬細小病毒L株毒 種按1-5%比例接種到步驟2形成的細胞單層培養，細胞70-100%病變時收穫病毒液；再將 此病毒液作為種毒，在細胞上繼續進行傳代復壯，作為生產種子。4、ST細胞在生物反應器中的微載體懸浮培養生物反應器(B. Braun公司， BiostatUD50生物反應器)按總體積的50-70%加入無菌細胞生長液(5%小牛血清的MEM 培養液)，且每升無菌細胞生長液中按5-7g/L濃度加入微載體，啟動生物反應器，40rpm攪 拌30min後，取步驟2中培養好的ST細胞單層，用EDTA-胰酶細胞消化液製備細胞懸液，細 胞計數後按IX IO5個/ml的密度接種到生物反應器中，調整轉速為SOrpm攪拌1_3分鐘， 再將轉速保持為50rpm，反應器溫度逐步調整至37°C，反應液的pH值控制為7. 0，一直保持 該條件進行細胞培養。應用活細胞計數試劑盒(CCK-8)測定細胞活力，經測定活細胞密度 彡lX107cells/mL，細胞活力彡90%。5、制苗毒液的繁殖接種後的第7天，微載體上的細胞長滿80-90%，空球率低於 5 %，滿球率大於85%，培養細胞處於對數生長期，且細胞計數達到IX Kfcells/mL以上； 此時，將罐體溫度調整為35°C，用正壓排出罐中液體，加入2L PBS洗滌細胞，攪拌10分鐘後 排出，重複洗滌2次。再用蠕動泵加入適量毒種，並補足維持液至工作體積。將步驟3中獲得的豬細小病毒病毒液以感染複數為0. 01M0I直接感染ST細胞，控 制攪拌速度為50-60rpm。接毒後每隔一定時間取生物反應器中的微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，並檢測樣品TCID50 ；當為載體上的細胞全部脫落，且OD值呈明顯上升趨勢，停 止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部後，收穫上清和微載體。經檢測，本實施收穫 的豬細小病毒TCID50彡IO8 0 ；作為對照，應用細胞轉瓶生產豬細小病毒TCID50 ( 107_°。6、收穫病毒液的處理病毒液和微載體經3次凍融後，離心去除細胞碎片， 置-20°C保存備用。上述方案中，生物反應器參數調節1)溫度ST細胞增殖培養時控制溫度設定為37°C，接種PPV後控制溫度設定為 35 "C。2)pH值ST細胞增殖培養時控制pH設定為7. 0，接種病毒液後控制pH設定為7. 4。 PH波動為士0. 1。3)溶氧培養初期使用壓縮空氣調節溶氧值，控制溶氧設定為60%。溶氧波動為 士 10%;培養中後期，當細胞密度大於IO6ceIlsAiL時，使用氧氣和氮氣調節溶氧值，控制溶 氧設定為50%。溶氧波動範圍為30%-80%。4)灌流量每天取樣測定罐體收集液的葡萄糖濃度，以葡萄糖殘餘濃度為參考調 整液體的灌流量。實施例3 豬細小病毒病滅活苗的製備1、收穫病毒液毒價測定將實施例2中收穫的細胞病毒液混合後取樣，測定 毒價，收穫的豬細小病毒TCID50彡108_°;而應用細胞轉瓶生產(對照)豬細小病毒 TCID50 ( IO7 002、滅活按病毒液總量的0.02%向病毒液中加入二乙烯亞胺溶液，充分振蕩後， 於30°C、100r/min搖床上滅活72h，然後加入1 %硫代硫酸鈉溶液，終止滅活。並作無菌檢 驗及滅活檢驗。3、油佐劑滅活疫苗的配製按照注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁1. 5 份的比例配製油相；按照96ml抗原加入吐溫-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配製水 相；水相和油相按照1 1. 5比例進行乳化，製成油包水單相苗。試驗例1生物反應器微載體培養ST細胞生產豬細小病毒病毒液的各工藝參數的 優化試驗(1)攪拌速度對細胞貼壁的影響設置了 6組試驗試驗1組將ST細胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應器的微載體中進行培 養，首先在轉速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉速調整為40rpm ；試驗2組將ST細胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應器的微載體中進行培 養，首先在轉速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉速調整為50rpm ；試驗3組將ST細胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應器的微載體中進行培 養，首先在轉速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉速調整為60rpm ；試驗4組將ST細胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應器的微載體中進行培 養，首先在轉速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉速調整為SOrpm ；試驗5組將ST細胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應器的微載體中進行培 養，首先在轉速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉速調整為IOOrpm ；
試驗6組將ST細胞按密度1 X IO5個/ml接入到生物反應器的微載體中進行培 養，首先在轉速為SOrpm的速度下攪拌3分鐘，再將轉速調整為150rpm ；對6組的細胞貼壁情況進行監測，取樣進行細胞計數，結果顯示，攪拌速度對細胞 貼壁影響很大，試驗2組(50rpm)最有利於細胞貼壁，當攪拌速度達150rpm左右時，細胞幾 乎不貼壁。表1不同轉速的游離細胞數比較
權利要求
1.一種豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，包括(1)將豬細小病毒(Porcin印arvo viurs)弱毒株接種ST細胞，培養得到生產種毒；(2)將處理後的微載體加入到生物反應器 的細胞生長液中，攪拌；C3)將ST細胞接入到生物反應器的微載體中，攪拌，進行細胞的繁 殖培養；(4)將豬細小病毒生產種毒感染生物反應器中懸浮培養的ST細胞，進行病毒的繁 殖培養；( 收穫繁殖的病毒液，滅活，配苗，即得。
2.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的豬細小病毒弱毒株是豬細小 病毒弱毒L株，其微生物保藏號是CGMCC No. 3352。
3.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)中所述的微載體是Cyotdex 型系列微載體，優選為Cytodex-I型微載體；所述的預處理方式包括矽化、水化和平衡。
4.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟中將預處理後的微載體按 照每升細胞生長液中含有5_7g的微載體的配比比例加入到細胞生長液中。
5.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟中所述的攪拌速度為 40rpm ；所述的攪拌時間為20_40min，優選為30min。
6.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟⑶中所述的攪拌包括首先在 轉速為SOrpm的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉速調整為50_60rpm ；優選的，在轉速為SOrpm 的速度下攪拌1-3分鐘，再將轉速調整為50rpm。
7.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)採用灌注培養法進行細胞 的繁殖培養，包括將培養溫度逐步調整至37°C，培養液的pH值控制為7. O。
8.按照權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟中將豬細小病毒生產種毒 以感染複數為0. 001M0I、0. 01M0I、0. 05M0I感染生物反應器中懸浮培養的ST細胞進行培 養；優選的，步驟(4)中將豬細小病毒生產種毒以感染複數為0. OlMOI感染生物反應器中懸 浮培養的ST細胞，攪拌，採用灌注培養法進行病毒的繁殖培養。
9.按照權利要求8所述的製備方法，其特徵在於步驟中所述的灌注培養溫度為 350C，培養液的pH值為7. 4，所述的攪拌速度為50-60rpm。
10.權利要求1-9任何一項製備方法製備得到的豬細小病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發明公開了豬細小病毒滅活疫苗的製備方法，包括(1)將豬細小病毒弱毒株接種ST細胞，培養得到生產種毒；(2)將處理後的微載體加入到生物反應器中的細胞生長液中，攪拌；(3)將ST細胞接入到生物反應器中的微載體中進行細胞的繁殖培養；(4)將豬細小病毒生產種毒感染生物反應器中懸浮培養的ST細胞進行病毒的繁殖培養；(5)收穫繁殖的病毒液，滅活，配苗，即得。本發明方法細胞維持時間長，細胞活力高、活細胞密度大，有利於病毒的持續繁殖，所製備的病毒液病毒滴度高。本發明方法的生產過程銜接緊密、順暢，規模放大容易，豬細小病毒的收穫方便，質量穩定，可顯著降低生產成本、有效提高疫苗產量和質量。
文檔編號A61P31/20GK102091329SQ201110032529
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月30日 優先權日2011年1月30日
發明者任德強, 姜力, 張婷婷, 張明豔, 張智明, 戴秀莉, 柴華, 武佳斌, 王彬, 王琪, 藏玉婷 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司