抗B型肝炎病毒治療性疫苗及其佐劑的製作方法
2023-07-11 05:23:36 2
專利名稱：抗B型肝炎病毒治療性疫苗及其佐劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的治療性疫苗，具體涉及抗B型肝炎病毒(HBV)治療性疫苗抗原與佐劑，以及抗原與佐劑的重量比。
B型肝炎是由HBV傳染的發病率極高的疾病。抗病毒治療是治療慢性HBV感染的主要手段。
20世紀90年代至今，研製出許多核苷類似物抗病毒藥，其中拉咪呋叮(Lamivudine)已於1998年被美國FDA批准，用於治療慢性B肝。
此外，一種新的特異性抗HBV療法(抗HBV治療性疫苗)也已研製出來，其中HBV前S與S片段蛋白與T細胞表位多肽治療性疫苗也已問世，並已用於臨床治療慢性HBV感染患者。2001年Merck研究所研究人員Hilleman在Vaccine雜誌上簡要綜述了現今國際上治療慢性HBV感染的主要治療方法。文章中敘述了目前國際上治療慢性HBV感染的最主要抗病毒療法包括抗病毒化學療法、幹擾素類抗病毒藥、生物學療法、特異性免疫學療法等。其中抗病毒化學療法使用核苷類似物抗病毒藥。幹擾素類抗病毒藥有IFN-α1、2a和2b。生物學療法是影響HBV複製後轉錄過程，該療法使用細胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12)、胸腺激素(Thymosinα1)、反義核苷酸與反義核酸等物質。特異性免疫學療法使用抗HBV特異性免疫球蛋白、抗HBV治療性疫苗。目前已有的抗HBV治療性疫苗主要有三種前S與S片段蛋白治療性疫苗、T細胞表位脂多肽治療性疫苗和DNA質粒疫苗。前兩種抗HBV治療性疫苗已有臨床應用報告，DNA質粒疫苗則由於存在尚未解決的安全問題而仍處在體外與動物實驗的階段。
根據目前發現的HBV免疫學機理，慢性HBV感染患者的轉歸與抗病毒治療的效果有密切關係。極少數病例在抗病毒治療過程中，肝內與循環血液內HBV被清除，臨床上表現為HBsAg、HBeAg及HBV DNA消失，甚至最終產生抗HBs，取得根治性治療效果；而大部分病例則只是在用藥期間HBV複製被抑制，臨床上表現為HBeAg及HBV DNA在循環血內達到檢測不出的水平。然而，停藥後一段時間內復發，返回到治療前的狀況。抗病毒治療療效的這種現狀表明，慢性HBV感染的根除性治療問題還遠未解決。
在上述的三種已有抗HBV治療性疫苗中，第一種抗HBV治療性疫苗由兩種製劑構成，其一是HBV特異性抗原。國際上通用HBV S片段或Pre S與S片段蛋白為HBV特異性抗原；其二是免疫佐劑。兩種成分都會影響抗HBV治療性疫苗的臨床療效。
慢性HBV感染病人免疫系統存在的重要問題是免疫耐受。由於免疫耐受使患者的抗HBV免疫反應淋巴細胞對HBV及其抗原不產生免疫應答，因此使HBV在體內呈持續感染狀態。現代免疫學的研究提示，解決這種狀態的唯一途徑是通過應用抗HBV治療性疫苗進行治療，來打破免疫耐受。故此，用抗HBV治療性疫苗打破慢性HBV感染病人的免疫耐受，重建其正常抗HBV免疫應答，不僅是當前一種新治療途徑，而且也是當前最新的治療思路。
在上述三種抗HBV治療性疫苗中，現今被認為安全而且有療效者是抗HBVPre S與S片段蛋白治療性疫苗。在這個領域內，國際間競爭極為激烈。競爭的重點在於對這種治療性疫苗佐劑的研製上。可以說，誰搞出最好的佐劑，誰就在國際競爭中佔上峰。
在佐劑的研究方面，絕大多數人常用脂多糖類物質或舊結核菌素。由於我們在多年研究中發現，慢性HBV感染患者之所以對HBV呈免疫耐受狀態，很重要的原因之一是患者的抗原處理細胞(APCs)上缺乏免疫第二信號(稱為B7.1與B7.2或稱CD80與CD86多肽)。正由於這種免疫信號缺乏，使得啟動抗HBV免疫應答的兩種細胞，即HBV抗原特異性細胞毒T淋巴細胞(簡稱特異性CTL)與輔助性T淋巴細胞(簡稱CD4+細胞或HTL)不能活化，進而使體內的HBV不能被清除。
鑑於上述原因，本發明人研究的重點是研製出具有免疫第二信號功能的多肽物質作為抗HBV治療性疫苗的佐劑。經過多年研究之後，我們有了很大的發現，即基因重組白細胞介素-2(IL-2)、基因重組GM-CSF與破傷風類素(TT)衍生多肽按特定比例組合在一起，加一定劑量的Pre S與S片段蛋白疫苗，能表現兩個作用①替代患者APCs缺乏的免疫第二信號；②重建患者失去的抗HBV免疫應答。這種研製抗HBV治療性疫苗佐劑的新思路，以及在這種新思路基礎上研製出來的新佐劑，到目前為止，在國際上仍然是獨一無二的。
本發明的目的是提供新的佐劑，特別是提供適用於抗HBV治療性疫苗的佐劑。
本發明的目的是提供新的用於治療慢性HBV感染的抗B型肝炎病毒(HBV)治療性疫苗。
本發明的一個實施方案是提供一種新的疫苗佐劑，其中所述佐劑由白細胞介素-2(IL-2)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、破傷風類毒素衍生多肽(TT)組成。IL-2與GM-CSF可以是天然蛋白，也可以是重組蛋白。IL-2、GM-CSF以及TT均有市售，IL-2可以從北京四環生物工程製品廠以注射用重組人白細胞介素-2的產品名獲得；GM-CSF可以從Schering-Plough(Brinny)Co.以Leucomax的商品名獲得；TT可以從蘭州生物製品研究所以破傷風類毒素的商品名獲得。另外，IL-2、GM-CSF以及TT的生產方法也是本領域已知的，例如參見Wong GG，witek JS，Temple PA，et al，Molecular cloning ofhuman and givvon GM-CSF cDNA’s and purification of the natural and recombinanthuman proteins.Cancer Cells 1985；3235-242。
本發明的另一實施方案是提供由白細胞介素-2(IL-2)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、破傷風類毒素衍生多肽(TT)組成的新佐劑，其中所述IL-2、GM-CSF和TT的比例(重量比)為50-600∶10-200∶6-20，優選IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為56∶16∶6。所述三種組分的含量以所得的佐劑不會產生毒性為準。
本發明的佐劑可用於疫苗，特別是用於抗HBV治療性疫苗。
按上述比例取IL-2、GM-CSF和TT混合在一起，即可製成本發明所述的佐劑。按照本領域熟知的方法，可將上述組分按比例組合後製成水劑或者凍幹製劑。
本發明的另一個實施方案是提供一種新的抗HBV治療性疫苗。這種抗HBV治療性疫苗由兩種主要成分構成。即1.HBV特異性抗原蛋白，取用HBV基因結構中的S片段主蛋白(含226個胺基酸)或S片段主蛋白加前S1(含108胺基酸)與前S2(55個胺基酸)基因表達的蛋白(見
圖1)。2.佐劑採用本發明人發明的細胞因子佐劑。該佐劑由白細胞介素-2、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)與破傷風類毒素(TT)按一定重量比組成(本發明人已申請的有關佐劑專利，專利號為02159913.0)。
本發明的另一實施方案是提供由HBV基因結構中S片段主蛋白或S片段主蛋白加前S1或S片段主蛋白加前S1與前S2基因表達的蛋白為HBV特異性抗原加上上述細胞因子佐劑組成的新HBV治療性疫苗。其中所述的抗原與細胞因子佐劑的重量比為S片段蛋白或S片段加前S1與前S2蛋白(簡稱HBV特異性抗原蛋白)IL-2∶GM-CSF∶TT＝5-100∶50-600∶10-200∶4-10，優選HBV特異性抗原、IL-2、GM-CSF和TT的重量比為60∶56∶16∶6。本發明所用的B型肝炎病毒表面抗原可以從市場上購買，例如北京天壇生物製品公司、康泰公司。
按上述比例取HBV特異性抗原蛋白、IL-2、GM-CSF和TT混合在一起，即可製成本發明所述的抗HBV治療性疫苗。按照本領域熟知的方法，上述組分按比例組合後製成水劑或者凍幹製劑。
權利要求
1.一種抗B型肝炎病毒(HBV)治療性疫苗，由HBV表面抗原和佐劑組成。
2.權利要求1的HBV治療性疫苗，其中所述HBV表面抗原選自(1)HBVS片段；(2)HBVS片段+前S1片段；或(3)HBVS片段+前S1+前S2片段。
3.權利要求1或2的HBV治療性疫苗，其中所述佐劑由白細胞介素-2(IL-2)、人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、破傷風類毒素衍生多肽(TT)組成。
4.根據權利要求3的疫苗，其中所述佐劑中IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為50-600∶10-200∶6-20。
5.根據權利要求3的疫苗，其中所述佐劑中IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為56∶16∶6。
6.根據權利要求1-4的任一疫苗，其中所述HBV表面抗原與IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為5-100∶50-600∶10-200∶6-20。
7.根據權利要求6的疫苗，其中所述HBV表面抗原與IL-2、GM-CSF和TT的重量比例為60∶56∶16∶6。
全文摘要
本發明涉及一種新的治療性疫苗及其佐劑。本發明的佐劑特別適用於抗HBV治療性疫苗。所述疫苗佐劑由白細胞介素－2(IL－2)、人粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子(GM－CSF)、破傷風類毒素衍生多肽(TT)組成。本發明的疫苗由上述佐劑和B型肝炎病毒表面抗原組成。
文檔編號A61P1/00GK1454668SQ0310469
公開日2003年11月12日 申請日期2003年2月21日 優先權日2002年12月30日
發明者蘇盛 申請人:北京市希波醫學技術開發公司