蛋白質組學產前診斷方法

2023-08-11 14:54:16 3

專利名稱：蛋白質組學產前診斷方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質組學產前診斷方法，主要用於各醫療單位的產前診斷實驗室。
為了提高出生人口素質，1994年10月27日中華人民共和國主席令公布「自1995年6月1日起施行產前診斷的有關法規標準」。1999年國務院辦公廳又轉發了衛生部關於「產前診斷管理辦法」的通知，各地前後成立了各級產前診斷實驗中心和行政管理機構，使我國產前診斷工作逐漸走向規範化。產前診斷又稱「出生前診斷」或「宮內診斷」，是指在妊娠期的特定階段，在胎兒出生之前，應用影像學、生物化學、細胞遺傳學以及分子生物學等技術，了解胎兒宮內的發育狀態，對先天性疾病和遺傳性疾病(包括出生後發病的遺傳性疾病)等的出生缺陷病作出診斷。所謂的先天性疾病是指未出生之前或生下來就存在的疾病，其中大多數表現為身體外部形態及內臟器官發育不正常，常與遺傳有關，可以是遺傳病，如腦積水、無腦兒、脊柱裂、先天性無肛門等。但還包括母體環境因素引起的胎兒疾病，如懷孕頭三個月母親感染風疹病毒、巨細胞病毒、弓形體或接觸致畸物質所引起的胎兒先天性心臟病、先天性白內障等各種先天畸形或出生缺陷，雖然是先天的，但是由環境因素造成的，這類疾病不會傳給後代。遺傳性疾病是指完全或部分由遺傳因素決定的疾病，為精子或卵子或精子和卵子結合時就帶有的遺傳信息，常為先天性的，也可後天發病。如先天愚型、多指(趾)、先天性聾啞、血友病等，這些遺傳病完全由遺傳因素決定發病，並且出生時就患病。但有些完全由遺傳因素決定的遺傳病也可能在出生一定時間後才發病，有時要經過幾年、十幾年甚至幾十年後才能出現明顯症狀。如假肥大型肌營養不良要到兒童期才發病；慢性進行性舞蹈病一般要在中年時期才出現疾病的表現。有些遺傳病需要遺傳因素與環境因素共同作用才能發病，如哮喘病，遺傳因素佔80％，環境因素佔20％；胃及十二指腸潰瘍，遺傳因素佔30％-40％，環境因素佔60％-70％。遺傳病常在一個家族中有多人發病，為家族性的，但也有可能一個家系中僅有一個病人，為散發性的，如苯丙酮尿症，因其致病基因頻率低，又是常染色體隱性遺傳病，只有夫婦雙方均帶有一個導致該疾病的基因時，子女才會成為這種隱性致病基因的純合子(同一基因座位上的兩個基因都不正常)而得病。遺傳病分為單基因病(包括常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、X連鎖顯性遺傳病、X連鎖隱性遺傳病、Y連鎖遺傳病和線粒體病)、多基因病(包括冠狀動脈病、原發性高血壓病、原發性糖尿病、先天性巨結腸、尿道下裂、室間隔缺損、顎裂、脊柱裂等)、染色體病(包指染色體易位、缺失、倒位、等臂、重複等的結構異常和21-三體、18-三體、13-三體等的數目異常)、體細胞遺傳病(包括體細胞中遺傳物質改變所致的各種腫瘤和一些先天畸形等)。產前診斷是預防有嚴重遺傳性疾病或先天性缺陷胎兒出生的有效而可靠的措施，是優生和提高人口素質的重要保障。目前的產前診斷，基本上還只限於孕婦B超檢查以診斷胎兒神經管缺陷和胎兒羊水細胞染色體檢查以診斷各類染色體病(主要是表現為智力低下的21-三體綜合症和18-三體綜合症，其次是性染色體等其他染色體的結構或數目異常)。在羊水染色體檢查中，需抽取孕5個月左右孕婦的羊水，然後進行羊水細胞培養、製片、顯帶、染色、染色體核型分析等步驟，該過程約需3周。可見羊水染色體檢查有不足之處抽取羊水為有創手術，有傷及胎兒、導致流產、穿刺羊水失敗、致孕婦和胎兒發生手術併發症、實驗失敗、操作繁瑣費時、難以全自動化、工作效率很低而難以滿足每個孕婦均作羊水染色體檢查的需求，作產前診斷的孕婦需多次往返醫院就診、取血作產前篩查、取報告單、預約、抽羊水、數周后取報告單就診，給孕婦造成較長時間(數個月)的精神負擔等負面影響。為此，為了避免胎兒正常可能性較大的孕婦冒羊水染色體檢查的風險以及減輕羊水染色體檢查工作負荷，國內沒有採取國外有的國家每個孕婦均作羊水染色體檢查的規定，而是根據國情，對羊水染色體檢查作了限定，規定了羊水染色體檢查高危人群的指徵即孕婦35周歲以上、有反覆流產史、曾有遺傳性疾病(染色體病)的家族史、夫婦一方患有染色體病或已生育過染色體病兒者、胎兒發育遲緩者、血清學產前篩查為(NTD高風險者通過B超確診)21-三體或18-三體高風險者、超聲檢查發現與染色體疾病有關的標記或畸形者。上述限定雖解決了產前診斷工作的一些問題，但其不良後果是，不具有上述指徵的孕婦因未作羊水染色體檢查，有可能生育染色體病患兒，造成漏診，而且「血清學產前篩查為(NTD高風險者通過B超確診)21-三體或18-三體高風險者」的指徵，是一種已廣泛應用於臨床的產前篩查指標，即檢測妊娠12周至18周的早、中期孕婦血清中甲胎蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、游離雌三醇(UE3)、妊娠相關血漿蛋白A(PAPP-A)的含量來計算產篩高風險或低風險，懷21-三體症候群孕婦妊娠中期血清AFP濃度比正常低約25％、HCG濃度比正常至少高2倍，UE3水平低於正常約2％，妊娠早期PAPP-A降低，利用上述3個指標(AFP、HCG、UE3)結合孕婦年齡和遺傳風險評估，在孕早、中期約有65％21-三體或18-三體症候群胎兒被檢出，較多研究認為，用上述3個指標和2個指標(AFP和HCG)篩選出患病胎兒的比例無顯著差異，目前常用AFP和HCG兩聯法，對妊娠15周-18周孕婦進行產前篩查，大約有12％-15％的孕婦，經篩查後會被歸為懷21-三體症候群高風險孕婦，產前篩查不同於產前診斷，篩查的目的是用較經濟、簡便、對胎兒無創傷性的檢查方法在表面上正常的孕婦中篩選出21-三體和18-三體症候群的高風險個體，供進一步作羊水染色體檢查確診，但篩查有假陽性或假陰性，對於一般的篩查方法而言，篩查結果為陰性(低風險)的孕婦仍有0.05％的可能性懷21-三體症候群患兒(群體總體發病率為0.1-0.15％)，篩查結果為陽性的孕婦懷21-三體症候群胎兒的可能性是1％，假陽性率99％，產篩只能防止約65％的21-三體症候群患兒出生，其靈敏度和特異性還不理想，從而導致較多的實際上屬產前篩查結果為低風險而不需作羊水染色體確診檢查的孕婦卻因產前篩查結果為「高風險」而做了羊水染色體檢查，而實際上屬產前篩查結果為高風險而應作羊水染色體確診檢查的孕婦卻因產前篩查結果為「低風險」而未做羊水染色體檢查，導致產前診斷誤診率增高。綜上所述，目前的產前篩查方法、產前診斷指徵的限定範圍以及產前診斷方法，在靈敏度、特異性、風險性、操作簡便性、報告時間、操作自動化程度、工作效率、項目種類等方面均不理想，且各種基因病等的產前診斷幾乎沒有開展，為了解決上述問題，就迫切需要尋找一種簡便、快速、靈敏、準確、高效、自動化、無風險、無痛苦、早期診斷、診斷項目全面、使每個孕婦都享有優質產前診斷的更先進的產前診斷方法。
產前診斷的方法同樣會在前人的基礎上取得進步。1953年美國科學家詹姆斯·沃森和英國科學家弗朗西斯·克裡克一起，在英國《自然》雜誌上發表了一篇僅兩頁的論文，提出了「DNA的結構和自我複製機制」，獲得諾貝爾獎。1985年美國科學家Mullis等根據前人發明的「DNA的結構和自我複製機制」，將其機制應用於體外試管中，只是模仿DNA的結構和體內自我複製機制，在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件，能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷，此即為Mullis發明的PCR技術，獲發明專利和1993年度的諾貝爾化學獎；PCR可從一根毛髮、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑑定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和裡程碑。其原理類同於1953年克裡克和沃森發明的DNA的體內複製。PCR技術的發明，加速了人類基因組計劃的實施和完成，至2002年，人類DNA框架基本明確，人類基因組計劃宣告完成，使生命科學進入了後基因時代，在這個時代，生命科學的主要研究對象是功能基因組學，包括結構基因組研究和蛋白質組研究等。儘管現在已有多個物種的基因組被測序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所採用的策略，如基因晶片、基因表達序列分析(Serial analysis of geneexpression，SAGE)等，都是從細胞中mRNA的角度來考慮的，其前提是細胞中mRNA的水平反映了蛋白質表達的水平。但事實並不完全如此，從DNA mRNA蛋白質，存在三個層次的調控，即轉錄水平調控(Transcriptional control)，翻譯水平調控(Translational control)，翻譯後水平調控(Post-translational control)。從mRNA角度考慮，實際上僅包括了轉錄水平調控，並不能全面代表蛋白質表達水平。實驗也證明，組織中mRNA豐度與蛋白質豐度的相關性並不好，尤其對於低豐度蛋白質來說，相關性更差。更重要的是，蛋白質複雜的翻譯後修飾、蛋白質的亞細胞定位或遷移、蛋白質—蛋白質相互作用等則幾乎無法從mRNA水平來判斷。毋庸置疑，蛋白質是生理功能的執行者，是生命現象的直接體現者，對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。蛋白質本身的存在形式和活動規律，如翻譯後修飾、蛋白質間相互作用以及蛋白質構象等問題，仍依賴於直接對蛋白質的研究來解決。雖然蛋白質的可變性和多樣性等特殊性質導致了蛋白質研究技術遠遠比核酸技術要複雜和困難得多，但正是這些特性參與和影響著整個生命過程。自1995年Williams和Wilkins首次提出蛋白質組學(proteome)的概念以來，蛋白質組學的研究頗受重視，2001年，國際最權威的雜誌《自然》和《科學》對此作了高度的評價，將蛋白質組命名為是一個基因組、一個細胞或組織或一種生物體所表達的全部蛋白質，把蛋白質組學列為六大研究熱點之一，其「熱度」僅次於幹細胞研究，名列第二。自此以後，蛋白組學成為生命科學研究的新領域和核心內容之一。國際上蛋白質組研究進展十分迅速，不論基礎理論還是技術方法，都在不斷進步和完善。相當多種細胞的蛋白質組資料庫已經建立，相應的國際網際網路站也層出不窮。1996年，澳大利亞建立了世界上第一個蛋白質組研究中心Australia Proteome Analysis Facility(APAF)。丹麥、加拿大、日本也先後成立了蛋白質組研究中心。在美國，各大藥廠和公司在巨大財力的支持下，也紛紛加入蛋白質組的研究陣容。2002年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白質組資料庫「SWISSPROT」著稱的蛋白質組研究人員成立的，以應用蛋白質組技術開發新藥物靶標為目的，建立了配備有上百臺質譜儀的高通量技術平臺。而當年提出Human Protein Index的美國科學家Normsn G Anderson也成立了類似的蛋白質組學公司。2001年4月，在美國成立了國際人類蛋白質組研究組織(Human Proteome Organization，HUPO)，隨後歐洲、亞太地區都成立了區域性蛋白質組研究組織，試圖通過合作的方式，完成人類基因組計劃(Human Proteome Project)。早期蛋白質組學的研究範圍主要是指蛋白質的表達模式，隨著學科的發展，蛋白質組學的研究範圍也在不斷完善和擴充。蛋白質翻譯後修飾研究已成為蛋白質組研究中的重要部分和巨大挑戰。蛋白質-蛋白質相互作用的研究也已被納入蛋白質組學的研究範疇。而蛋白質高級結構的解析即傳統的結構生物學，雖也有人試圖將其納入蛋白質組學研究範圍，但目前仍獨樹一幟。蛋白質組學的發展既是技術所推動的也是受技術限制的。蛋白質組學研究成功與否，很大程度上取決於其技術方法水平的高低。蛋白質研究技術遠比基因技術複雜和困難。不僅胺基酸殘基種類遠多於核苷酸殘基(20/4)，而且蛋白質有著複雜的翻譯後修飾，如磷酸化和糖基化等，給分離和分析蛋白質帶來很多困難。此外，通過表達載體進行蛋白質的體外擴增和純化也並非易事，從而難以製備大量的蛋白質。蛋白質組學的興起對技術有了新的需求和挑戰。因此，發展高通量、高靈敏度、高準確性的研究技術平臺是現在乃至相當一段時間內蛋白質組學研究中的主要任務。利用蛋白質的等電點和分子量通過雙向凝膠電泳的方法將各種蛋白質區分開來是一種很有效的手段。它在蛋白質組分離技術中起到了關鍵作用。如何提高雙向凝膠電泳的分離容量、靈敏度和解析度以及對蛋白質差異表達的準確檢測是目前雙向凝膠電泳技術發展的關鍵問題。國外的主要趨勢有第一維電泳採用窄pH梯度膠分離以及開發與雙向凝膠電泳相結合的高靈敏度蛋白質染色技術，如新型的螢光染色技術。質譜技術是目前蛋白質組研究中發展最快，也最具活力和潛力的技術。它通過測定蛋白質的質量來判別蛋白質的種類。當前蛋白質組研究的核心技術就是雙向凝膠電泳—質譜技術，即通過雙向凝膠電泳將蛋白質分離，然後利用質譜對蛋白質逐一進行鑑定。對於蛋白質鑑定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個關鍵指標。一般的質譜技術難以將三者合一，而最近發展的質譜技術可以同時達到以上三個要求，從而實現對蛋白質準確和大規模的鑑定發展可替代或補充雙向凝膠電泳的新方法已成為蛋白質組研究技術最主要的目標。目前，二維色譜(2D-LC)、二維毛細管電泳(2D-CE)、液相色譜—毛細管電泳(LC-CE)等新型分離技術都有補充和取代雙向凝膠電泳之勢。另一種策略則是以質譜技術為核心，開發質譜鳥槍法(Shot-gun)、毛細管電泳-質譜聯用(CE-MS)等新策略直接鑑定全蛋白質組混合酶解產物，上述方法仍存在重複性差、無法檢出佔很大比例的低豐度蛋白質和跨膜蛋白質、分離的蛋白質鑑定困難、耗時長等缺點，2002年，日本學者田中(Tanaka)因發明了表面增強雷射解吸飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS技術，國內稱飛行質譜)而獲2002年度諾貝爾化學獎，從而基本上解決了上述問題。飛行質譜由蛋白質晶片、質譜儀和分析軟體組成，蛋白質晶片是在載體表面製作成一個個點狀芯池，每個芯池用探針修飾，這種探針包括結合特定蛋白質的抗體或受體、結合某些陽離子或陰離子的化學基團、吸水或疏水物質、酶、免疫複合物等。根據晶片表面的不同化學成分，可將其分為化學表面晶片和生物表面晶片。化學表面晶片包括疏水表面晶片(hydrophobic surface，H4)、親水表面(normal phase，NP)晶片、強陰離子交換表面(stronganion exchange，SAX)晶片、弱陽離子交換表面(weak cationexahange，WCX)晶片、金屬離子螯合(inunobilized metalafinity capture，IMAC)表面晶片等五種，主要用於檢測未知蛋白。生物化學表面晶片包括受體一配體晶片、酶一底物晶片、抗原一抗體晶片及DNA一蛋白質晶片等，通過特異性結合機制檢測樣本中的靶蛋白，基於飛行質譜所開發的蛋白質晶片，可以非特異性的結合併測定被測樣本中的各種蛋白質，有研究報導，公認的人體內重要蛋白質有8000-10000種，也有人估計約有12000-15000種甚至達10萬種，目前能被檢測者近2000種；晶片閱讀儀是在一個相對簡單的飛行質譜儀上裝備一個脈衝uv氮雷射，雷射激惹樣本後樣本霧化，其中的蛋白質解析/電離，這種離子化的分子先在一個高壓電場中被加速後進入一個真空無電場區(即飛行時間管，TOF管)飛向離子檢測器，不同質荷比(m/z)的蛋白質依據其通過TOF管的時間長短被記錄，記錄結果被相關軟體分析，最終找出不同病變樣本差異表達的蛋白質；在這些分析軟體中，蛋白質組資料庫是蛋白質組研究水平的標誌和基礎。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質組資料庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質組資料庫。生物信息學的發展已給蛋白質組研究提供了更方便有效的計算機分析軟體；特別值得注意的是蛋白質質譜鑑定軟體和算法發展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學、UCSF等都有自主的搜索軟體和數據管理系統。最近發展的質譜數據直接搜尋基因組資料庫使得質譜數據可直接進行基因注釋、判斷複雜的拼接方式。隨著基因組學的迅速推進，會給蛋白質組研究提供更多更全的資料庫。另外，人工神經網絡(artificial neural network.ANN)聯合飛行質譜在蛋白組學研究中也被普遍應用。人工神經網絡(ANN)是以計算機網絡系統模擬生物神經網絡的一種智能化信息處理系統，人的大腦是由神經元網絡體系構成的，感覺神經元通過感受器接受周圍環境的各種變化(即刺激)，並把刺激能量轉化為神經衝動，經傳入神經傳至中樞，經過中樞的分析綜合，然後將信息沿傳出神經傳至效應器，以支配和調節各器官的活動。一些神經元接受來自其它神經元的信號輸入而產生興奮或抑制，當興奮達到一定的閾值時，神經元就產生衝動，而且這一過程本身可以重複。正因為如此，一個神經元的輸出總是與其輸入是一對一的關係。同樣，人類的適應和學習過程也是如此，必須通過神經元之間聯繫強度的改變來誘導。一個神經元使另一神經元興奮的能力不是恆定的，可以隨「經驗」而變化，在一個神經元網絡中，其輸出仍然可以通過輸入的相關函數來計算。由於網絡中的關聯強度是可變的，網絡的輸出與其輸入的相關性可以隨「經驗」而改變，這就是Hebb[海布]最早提出的生物神經細胞之間的作用規律。神經網絡有許多類型，在醫學上，最常見的是多層前向感知器(Multilayerfeedforward perceptron)(MLP或MU、F)，這種類型的網絡體現了大多數網絡的一般原理。一旦設計出了ANN軟體，就必須對其進行訓練和有效化。ANN的工作原理實際是一種有效的學習算法，根據ANN類型及其應用目的，有多種學習算法可以採用，而最常用的學習算法是反向傳播(Back-Propagation。BP算法)，BP算法屬於一種監督式的學習算法，其主要思想為對於q個輸入學習樣本P1，P2，……，Pq，已知與其對應的輸出樣本為T1，T2，……，Pt，學習的目的是用網絡的實際輸出A1，A2，……，Aq與其目標矢量T1，T2，……，Pt之間的誤差來修改其權值，使(n＝1，2，……，q)與期望的1rn儘可能接近，即使網絡輸出層的誤差平方和達到最小。它是通過連續不斷地在相對於誤差函數斜率下降的方向上計算網絡權值和偏差的變化而逐漸逼近目標的。每一次權值和偏差的變化都與網絡誤差的影響成正比，並以反向傳播的方式傳遞到每一層。神經元的第一層代表預選輸入參數，中層稱之為隱含層，因為它們不直接與數據接觸，而只是輸入與輸出神經元之間的通路。BP算法包括信息的正向傳遞與誤差的反向傳播。在正向傳播過程中，輸入信息從輸入經隱含層逐層計算傳向輸出層，每一層神經元的輸出作用於下一層神經元輸入。如果在輸出層沒有得到期望的輸出，則計算輸出層的誤差變化值，然後轉向反向傳播，通過網絡將誤差信號沿原來的連接通路反傳回來修改各層神經元的權值直至達到期望目標。反向傳播可通過整個訓練過程使網絡輸出的均方誤差最小化(即達到數據的最佳適應性)。每次學習訓練允許修正的值必須在訓練期前確定。一般來講，問題越複雜，允許修正的值就越小。對於一些複雜的問題，BP算法可能要進行幾小時甚至更長時間的訓練。這主要是由於學習速率太小所造成的。對於複雜的網絡，其誤差函數為多維空間的曲面，就像一個碗，其碗底是最小值點。但是這個碗的表面是凹凸不平的，因而在對其訓練過程中，可能陷入某一小谷區，而這一小谷區產生的是一個局部極小值。由此點向各方向變化均使誤差增加，以至於使訓練無法跳出這一局部極小值。為防止ANN陷入局部極小值和丟失最低誤差值，則需要給網絡提供一個學習動量。
飛行質譜技術曾獲2002年度諾貝爾化學獎，該技術是在細胞水平上對生命功能直接執行體蛋白質進行大規模的平行分離和分析，往往要同時處理成千上萬種蛋白質，找出與疾病相關的特異蛋白質組即特異的疾病生物標誌物，是對疾病的特異生物標誌物作直接鑑定，是直接對疾病作出診斷、治療、預防和預後觀察，故優於酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫螢光試驗等間接測定生物標誌物的方法，甚至優於1993年諾貝爾化學獎的基因診斷技術(PCR)。飛行質譜技術目前已廣泛用於癌症、老年病、感染性疾病、心血管病和神經系統疾病的蛋白質組學研究分析，認為應用飛行質譜技術可以提高這些疾病的診斷率，其中應用於癌症的最多。國外研究人員應用飛行質譜檢測了轉移性黑色素瘤、肉瘤和腎癌，敏感性達87％。他們認為，該方法根據獨特的8～24條蛋白指紋圖可以用於多種癌症的診斷，如肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、食道癌，其檢測限量為飛摩爾/升。據報導，美國華盛頓伊莉莎白醫院利用該技術檢測肺癌，敏感性達98％，特異性97％；美國霍普金斯醫學院檢測了卵巢癌敏感性82％，特異性98％；霍普金斯醫學院、美國國立癌症研究所合作檢測乳腺癌，敏感性93％，特異性91％。國內研究也成績斐然，結果十分驚人，各項統計指標均遠好於經典的腫瘤標誌。總之，只要具有特異生物標誌物即能引起蛋白質組特異變化的疾病，均可用飛行質譜蛋白質組學的方法來診斷，雖然目前已開展產前診斷的幾種疾病(遺傳病)均有蛋白質變化的標誌如蛋白質以mRNA為模板翻譯，兩者有相關性(r＝0.5)，基因的突變會引起對應蛋白質的改變；懷患有神經管缺陷類多基因病遺傳病胎兒的孕婦血漿中甲胎蛋白異常；懷患有染色體病(染色體數目異常如21-三體綜合症、18-三體綜合症)胎兒的孕婦血漿中甲胎蛋白及妊娠相關蛋白異常；在生物信息資料庫類的功能資料庫中，TRANSFAC的擴展庫S/MART-DB收集了與染色體結構異常相關的蛋白因子和位點信息，說明了染色體結構異常與特定蛋白的關係；但目前尚未見與產前診斷相關的蛋白質組研究的報導；雖然國內外對飛行質譜的蛋白質組學臨床應用作了一些研究，並建立了一些可用於臨床疾病診斷的方法，但尚未見國內外建立基於飛行質譜技術的蛋白質組學產前診斷方法的報導。
本發明的目的是要提供一種通過分析被檢產前診斷標本中出生缺陷病表達的蛋白質譜(或稱為特異生物標誌物、特異蛋白質組學圖譜、一個或一組差異蛋白、蛋白質荷比數)從而作出出生缺陷病產前診斷或患出生缺陷病風險率評估的蛋白質組學產前診斷方法及其相關生物信息分析軟體如人工神經網絡產前診斷模型。
本發明的目的是這樣實現的從蛋白質組學的角度，基於飛行質譜等蛋白質組分析鑑定原理，成批分析被檢產前診斷標本或對照標本的蛋白質譜，以定性或定量分析出生缺陷病特異蛋白質譜為原理建立蛋白質組學產前診斷方法，主要按以下操作實現，用飛行質譜蛋白晶片結合被檢標本中的蛋白，經選擇性清洗，晶片保留了高解析度的蛋白譜，加能量吸收分子(EAM)後，晶片上保留的蛋白形成晶體，經特異雷射照射，晶體發生解離使蛋白形成離子化分子，經高壓電場加速後進入真空無電場區(飛行管)飛向離子檢測器，不同質荷比(m/z)的蛋白質依據其通過飛行管的時間長短被記錄，並經高速模擬數字轉化器轉化後，被測蛋白以一系列蛋白質荷比峰即蛋白質譜的形式呈現，以相關分析軟體或人工神經網絡篩選出疾病表達的差異蛋白質譜作為出生缺陷病產前診斷或患病風險率評估的標準，或通過人工神經網絡Matlab-NNTools軟體將被檢標本作訓練集和交叉驗證後，以篩選出的差異蛋白利用反向傳播算法建立人工神經網絡預測模型，再經相應出生缺陷病標本盲法驗證後，建立人工神經網絡飛行質譜蛋白質組學產前診斷模型。
本發明可以不考慮成千上萬種出生缺陷病的具體病種，只通過直接分析研究孕婦尿液、外周血液等標本(或胎兒、胚胎組織、羊水、絨毛、精子、卵子、受精卵等相關標本)中幾種危害性最大的出生缺陷病的綜合性特異生物標誌物即分析其綜合特異蛋白質譜、以所發現的一組綜合性差異蛋白作為胎兒或胚胎各類出生缺陷病的產前診斷標準，以此建立起新的飛行質譜蛋白質組學產前診斷標準和方法，取代經典的羊水穿刺胎兒染色體核型分析以及產前篩查等方法。本發明與經典方法相比具有對胎兒無創性、無風險，操作簡便、快速、靈敏、準確、高效、自動化、早期診斷、診斷項目全面等優點，可使孕婦產前診斷率達到100％，解決了目前的羊水染色體核型分析因手工操作繁瑣費時致工作量太大使大部份孕婦無法作產前診斷而冒生育產前缺陷病患兒風險等諸多問題，減輕了孕婦及其家人的精神負擔，方便了孕婦就診，提高了工作效率及產前診斷的醫療質量。
下面詳細說明實現本發明的總的實施方法和具體的實施方法。
本發明實現各類出生缺陷病蛋白質組學產前診斷方法的總的實施方法是1、分析標本的選擇與處理分析標本可選用孕婦的尿液、外周血液、體液、分泌物、呼氣成份、組織、細胞、出生缺陷病患者或疑似患者或胎兒組織、胚胎組織、臍血、羊水、絨毛、精子、精液、卵子、受精卵等，其中細胞和組織標本應先作裂解處理，具體方法有溫和裂解法(滲透裂解主要用於組織培養細胞和血細胞，通常用低滲溶液懸浮細胞；凍融裂解常用於組織培養細胞，通常用液氮迅速冷凍細胞，隨後在37℃融化，反覆幾次；去汙劑裂解用去汙劑溶解細胞膜，裂解細胞，釋放其內容物，常用於組織培養細胞，通常用含去汙劑的裂解液懸浮細胞；酶裂解法某些細胞含有細胞壁，需要首先用酶來消化細胞壁，如溶菌酶等，通常這些酶在等滲溶液中處理細胞)和劇烈裂解法(超聲裂解超聲儀可產生超聲波，通過切應力來裂解細胞；弗氏壓碎器裂解在高壓下迫使細胞穿過小孔徑而產生剪切力，從而裂解細胞；研磨法用研缽或研杵研磨細胞，此法常用於固體組織，組織細胞通常凍存於液氮中，隨後研磨成粉狀；機械勻漿法常用於固體組織，通常將組織切成小片，加入預冷的勻漿緩衝液，通過過濾或離心獲得裂解液；玻璃珠勻獎法常用於細胞懸液，通常劇烈振蕩的玻璃珠可以打破細胞壁釋放細胞內容物)。2、蛋白質晶片的製作包括(1)上樣檢測裂解組織細胞的提取液及血清、尿液等標本經變性處理，再用相應的結合緩衝液稀釋後即可用於上樣檢測；(2)晶片的處理主要是用對應的結合緩衝液激活晶片，但金屬螯合晶片等則需加入相關金屬鹽溶液使金屬離子先結合在晶片表面後再激活；(3)上樣後，樣本與晶片充分結合反應，分別用結合緩衝液和去離子水洗去未結合的物質；(4)加入能量吸附分子(EAM)微幹後即可上機檢測。3、晶片的閱讀包括(1)在Ciphergen Software 3.1.1支持下，建立一個新資料庫和一個新項目；(2)使用All-in-one標準蛋白質晶片校正質譜儀；(3)放入晶片，設最高分子量(50000Da)和最佳檢測範圍(2000-20000Da)，選擇最佳雷射強度和最佳檢測靈敏度及數據收集方法和數據收集參數；(4)建立兩個點閱讀程序，即可進行晶片閱讀和數據收集。4、資料分析對收集的數據和譜圖資料在Biomarker Wizard軟體支持下首先進行基線幹擾消減和噪音過濾，通常設置初始的噪音過濾值為5，允許分子量偏差為0.5％，以10％為最小閾值(在總樣本中要出現的比率大於10％)，然後再作第二次的噪音過濾值為2來增加較小豐度的峰值統一標準化處理後的資料蛋白分子質量精確度校正和自動波峰檢測，分子量相同的信號被綜合聚類，結果輸出到EXCEL表中。初步篩選的結果，做同一質荷比處的蛋白峰相對強度組間平均數比較t檢驗，按照P值的大小確定在不同組別樣本中上調或下調的質荷比蛋白質。篩選出的組間蛋白質表達存在統計學差異的蛋白質哪些具有分類意義，哪一種蛋白或哪幾種蛋白質組合能將兩組病變較好的區分開，這通常要在Biomarker PatternsTM Software支持下通過特殊算法完成。常用的方法有決策樹法、人工神經網絡和支持向量機法。決策樹法是將待測樣本分成訓練組和測試組，先是決策樹的訓練和學習，依據決策樹生成算法形成基本決策樹，再以樹的剪裁算法輸出改良的決策樹，提取分類規則；其次是按已提取的分類規則對雙盲測試組進行分類預測，根據測試組分類誤差的大小評估該分類規則對兩組樣本的分類能力。人工神經網絡信息的處理由類似人腦功能的神經元之間的相互作用完成，網絡的學習和計算決定各神經元連接權系的動態演化過程，用於處理一些環境信息十分複雜，背景知識不清楚，推理規則不明確的醫學診斷問題。支持向量機方法是建立在統計學習理論的VC維理論和結構風險最小原理基礎上的，根據有限的樣本信息在模型的複雜性和學習能力之間尋求最佳折衷，以期獲得最好的概括分析能力。採用人工神經網絡或支持向量機在分類決策過程中均採用訓練方式和分類決策方式進行。訓練方式是指在已確定的特徵空間中，對作為訓練樣本的量測數據進行特徵選擇與提取，得到它們在特徵空間的分布，依據這些分布決定分類器的具體參數。由於各類樣本分布呈現出聚類狀態，因此可以將該特徵空間劃分成由各類佔據的子空間，確定相應的決策分界。在三類算法中，決策樹法更易理解且每個樣本都能在決策樹中顯示(此外，還可採用傳統的微陣列蛋白質晶片、二維電泳(2-DE)、基質輔助的雷射解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化來實施本發明)。5、蛋白質(組)的鑑定對被分析的蛋白質譜，分析軟體結合國際上建立的資料庫檢索作出鑑定(1)鑑定蛋白質的方法及其軟體包括①肽質量指紋圖譜鑑定蛋白質蛋白質經過酶解成為長短不一的肽段後，同一時間獲得所有肽段分子質量而形成一個肽段分子質量圖譜，這一圖譜對蛋白質是專一而特異的，稱肽質量指紋圖譜(PMF)，將實驗所得PMF與蛋白質資料庫中蛋白質的理論PMF比對，就可鑑定蛋白質，所用資料庫軟體名稱為Mascot、Profound、PeptIdent、Proteinprospector、PepSea；②一級質譜(MS)結合串聯質譜(MS/MS)肽鑑定蛋白質根據MS測得精確分子質量和MS/MS所得序列信息，通過蛋白質資料庫檢索鑑定蛋白質，所用資料庫軟體為SEQUEST、Mascot、PepFrag。(2)鑑定蛋白質的資料庫包括①蛋白質資料庫SWISS-PROT/TrEMBL、Protein information Resource、NCBInr、dbEST、OWL、UniGene；②蛋白質組資料庫AAindex.GELBANK.Predictome.profeomeAnalysis Database、REBASE；③蛋白質序列資料庫Blocks、CDD、cluSTr、INterPro、Pfam、PROSITE；④其他蛋白質序列資料庫EMOTIF、PRINTS、iPROClASSO-GLYCBASE、PIR-ALN、Proclass、ProDom、ProtoMaP、SBASE、SMART、suPFAM、sysTERSE、GeneNest、spliceNest；⑤蛋白質三維結構相關資料庫PDB、MMDB；⑥在線蛋白工具軟體名MCB search、lanncher、DAS、Topred2、SOSUI、PSIpred-MEM-SAT2、HMMTOP、SOSUI、CoPreThi、PSIpred-MEM-SAT2、HMMTOP、TMHMM、The predictProtein Server、SMART、SPLIT、PRED-TMR、TMAP、multalin、Protein Sequence Analysis、PSA、PRS、AAA。(3)蛋白質的其他鑑定方法先純化或至少濃縮標本以備鑑定，在蛋白質具有明顯的理化性質或樣本成分相對簡單時可以直接從晶片表面獲得蛋白，或選擇抗體與預先已活化的晶片表面結合選擇性捕獲蛋白，在其他情況下採用mini-spin柱或titre plate formatted層析裝置分離蛋白，經純化或濃縮的蛋白質鑑定前要先行消化裂解，得到的肽片段分子經晶片閱讀器檢測後結果查閱肽指紋圖譜資料庫鑑定，要對蛋白進行準確鑑定和測序則應將晶片在高可靠性的Tandem-MS下閱讀。(4)質譜儀配套軟體直接鑑定蛋白質包括質譜數據直接搜尋基因組資料庫、蛋白質質譜鑑定軟體和算法、人工神經網絡(artificial neural network ANN)聯合飛行質譜。6、新建出生缺陷病蛋白質組資料庫或人工神經網絡產前診斷模型如果檢測到相關資料庫中所沒有的出生缺陷病表達的差異蛋白質譜，可能為新發現的蛋白，需進一步經多個資料庫鑑定，並與相對應的出生缺陷病及相關臨床症狀作對比分析後，記錄結果，建立出生缺陷病蛋白質組資料庫，作為產前診斷的新標準。或取大批量經臨床確診的出生缺陷病及正常孕婦的待檢產前診斷標本，在相同的條件下進行實驗檢測，以相關軟體篩選出出生缺陷病表達的特異蛋白質譜，建立新的出生缺陷病蛋白質組資料庫或人工神經網絡產前診斷模型用於產前診斷。
本發明涉及的其他生物信息軟體和器材包括PBS-II表面加強雷射解吸電離一飛行時間質譜儀(SELDI-TOF-MS)、能量吸收分子CHCA、H4型蛋白質晶片以及相應的基礎分析軟體ProteinChiD Software3.0、人工神經網絡軟體Matlab-NNTools、Ciphergen Software 3.1.1支持下建立的新資料庫、All-in-one標準蛋白質晶片Cibcron blue3GA、BiomarkerWizard軟體、Biomarker PatternsTM Software、Tandem-MS、白蛋白親和樹脂、HEPES緩衝鹽、CHAPS緩衝鹽等，上述器材可根據醫學科技的發展以及具體實驗的需要作出適當的更改。
本發明實現各類出生缺陷病蛋白質組學產前診斷方法的具體的實施方法是取待作產前診斷孕婦的外周血液(可取孕婦的尿液、體液、羊水、死胎、胚胎組織、精子、卵子、受精卵等標本，但標本的處理方法不同)，以適當速度離心分離血清，-20℃凍存，實驗時取出成批的凍存血清標本(可同時取若干份正常孕婦對照血清或質控血清標本在同等條件下檢測)在冰浴中解凍後，以3000r/min離心5min，取10ul加入90ul 0.5％CHAPS(pH7.4)溶液中充分混勻10min。白蛋白親和樹脂Cibacron Blue3GA(Sigma公司)預先用0.5％CHAPS平衡3次，每次5min，將Cibacron Blue3GA與血清樣本混和，在4℃搖床上振搖60min，12000r/min離心5min(4℃)，取上清溶液40ul，應用免疫散射比濁法測定處理後血清白蛋白的含量(以去除99％以上為標準)，H4晶片預先用20mmol/L HEPES(pH 7.4)平衡2次，每次5min，將去除白蛋白後的血清標本用20mmol/L HEPES稀釋至200ul，加至96孔的Bioprocessor(Ciphergen)，振蕩平臺上振蕩60min，甩去血清標本，20mmol/L HEPES 200ul清洗晶片3次，每次5min，再用去離子水清洗晶片2次，每次1min，乾燥後加入0.5ul能量吸收分子(CHCA，Ciphergen公司)於已結合上蛋白質的H4晶片上級。乾燥後再重複加1次CHCA。上機檢測。數據收集和生物信息學處理設定SELDI-TOF-MS的雷射強度為150，靈敏度為6，收集數據的質荷比範圍為1000～200000，收集位置20～80，平均每點收集20次，收集總點數為140次，在收集每次實驗數據前用已知分子量的標準蛋白晶片校正儀器測定分子量，誤差＜0.1％，以質控蛋白晶片做重複性檢測，其峰值大小及其強度的變異係數(CV)均控制在0.05％和15％以下，具有很好的重複性。所有原始數據先用Proteinchip Software 3.0做校正(總離子強度及分子量的均一化)，對位於2000～20000的質荷比峰值，用Biomarker Wizard過濾噪音，設置初始的噪音過濾值為5，第2次的噪音過濾值為2，以10％為最小閾值進行聚類，得到初步篩選結果後，對初步篩選出來的質荷比峰做懷出生缺陷兒(如21-三體症)孕婦與正常孕婦的成組數據的統計學分析，以尋找兩組之間表達有差異的蛋白質，進一步將上述訓練集數據初步分析結果利用反向傳播算法通過Matlab-NNTools軟體建立人工神經網絡產前診斷模型，人工神經網絡參數的設置人工神經網絡採用反向傳播算法，用共軛梯度學習函數改進Trainscy函數，具體設置共有4層，為輸入、輸出層和兩個隱含層，每個隱含層有20個神經元。每一層都採用正切s形傳遞函數(tansig)，權重與偏值隨機初始化，訓練次數最大為1000次，最小下降梯度為1×10-6，輸出神經元為1個，對應健康孕婦和懷出生缺陷兒(如21-三體症)孕婦的期望輸出值分別設為-1和1(即輸出值接近-1被判為懷健康兒孕婦，接近1則被判為懷出生缺陷兒孕婦)。
人工神經網絡是國際上公認的較先進的計算機網絡系統模擬生物神經智能化信息處理系統。本發明按上述方法建立起人工神經網絡產前診斷模型後，對於同類同質的產前診斷標本，就可按上述方法對出生缺陷病的生物標誌物即蛋白質譜進行高通量的自動化分析，分析儀及其軟體分析系統會自動給出是否患出生缺陷病的報告以及是否終止妊娠等的提示，由於在不同的實驗等條件下，蛋白質組值的分析結果會有所不同，所以各實驗室在進行出生缺陷病蛋白質組分析時，因根據各自實驗條件，按標準操作規範，統一操作步驟和方法，在相同的實驗條下，從常見病開始，按病種用本發明介紹的蛋白質組學分析方法及人工神經網絡產前診斷模型建立方法，建立系列的診斷模型，同時，本發明也可以不考慮具體的出生缺陷病病種，通過對比分析大量常見的、嚴重的幾種出生缺陷病及正常人的蛋白質組學，得出一組特異的蛋白質譜，建立產前診斷標準，如果在被檢的標本中出現這組蛋白質譜，就作出終止妊娠的診斷或患出生缺陷病高風險的預告，如臨床上最常見、危害最嚴重的產前診斷類疾病是21-三體綜合症和18-三體綜合症，按本發明的方法進行大批量的蛋白質組學分析，並與正常對比，分析不同條件下所測得的蛋白質譜特點或蛋白質荷比(m/z)數值，作為21-三體症和18-三體症的診斷標準，在具體的產前診斷標本檢測中，一旦出現這種蛋白質荷比峰或蛋白質譜，即作出21-三體症和18-三體症的診斷，或作出患病高風險的評估。
本發明在上述闡述的實施本發明的具體方法中，其本質是採用蛋白質組學分析方法分析產前診斷標本中蛋白質組的變化作出出生缺陷病的產前診斷，用同質同類的正常或已知出生缺陷病或人工製作或相關標準資料庫中對應的標準蛋白質譜作為實驗室質量控制，其所用的儀器、試劑以及實驗條件等可因標本種類、疾病種類等不同而在一定的範圍內變動，其中蛋白質組分析方法還可採用基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜、液相色譜-電噴霧-串聯質譜、肽質量指紋譜鑑定蛋白質技術、串聯質譜數據鑑定蛋白質技術以及蛋白質組相關資料庫鑑定蛋白質譜；此外，還可採用螢光染料蛋白質組定量分析、質譜法蛋白質組定量分析和蛋白質晶片技術對出生缺陷病特異的蛋白質組作定量分析，作為產前診斷的指標。
權利要求
1.一種用於醫療領域的蛋白質組學產前診斷方法，其主要特徵是從蛋白質組學的角度，基於飛行質譜等蛋白質組分析鑑定原理，成批分析被檢產前診斷標本或對照標本的蛋白質譜，以定性或定量分析出生缺陷病特異蛋白質譜為原理建立蛋白質組學產前診斷方法，主要按以下操作實現，用飛行質譜蛋白晶片結合被檢標本中的蛋白，經選擇性清洗，晶片保留了高解析度的蛋白譜，加能量吸收分子(EAM)後，晶片上保留的蛋白形成晶體，經特異雷射照射，晶體發生解離使蛋白形成離子分子，經高壓電場加速後進入真空無電場區(飛行管)飛向離子檢測器，不同質荷比(m/z)的蛋白質依據其通過飛行管的時間長短被記錄，並經高速模擬數字轉化器轉化後，被測蛋白以一系列蛋白質荷比峰即蛋白質譜的形式呈現，以相關分析軟體或人工神經網絡篩選出疾病表達的差異蛋白質譜作為出生缺陷病產前診斷或患病風險率評估的標準，或通過人工神經網絡Matlab-NNTools軟體將被檢標本作訓練集和交叉驗證後，以篩選出的差異蛋白利用反向傳播算法建立人工神經網絡預測模型，再經相應出生缺陷病標本盲法驗證後，建立人工神經網絡飛行質譜蛋白質組學產前診斷模型。
2.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是通過定性或定量分析對出生缺陷病產前診斷有特殊意義的生物標誌物或差異蛋白或特異的蛋白質譜(峰)或蛋白質荷比(m/z)以及新的蛋白質譜作出產前診斷或作出患出生缺陷病風險率評估預告。
3.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是出生缺陷病包括出生前或出生時發病的先天性疾病和出生前、出生時或出生後發病的遺傳病以及精子、卵子和受精卵遺傳因素，臨床最常見的出生缺陷病是神經管缺陷、21-三體綜合症、18-三體綜合症、性染色體異常。
4.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是產前診斷標本種類包括孕婦尿液、外周血液、體液、分泌物、呼氣成份、組織、細胞、出生缺陷病患者或疑似患者或胎兒組織、胚胎組織、臍血、羊水、絨毛、精子、精液、卵子、受精卵、血液、體液。
5.根據權利要求1、4所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是細胞和組織類產前診斷標本的裂解處理方法採用溫和裂解法和劇烈裂解法。
6.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是蛋白質晶片按出生缺陷病蛋白質組學分析原理設計，晶片表面經物理、化學、生物處理，其種類包括疏水表面晶片(hydrophobic surface，H4)、親水表面(normal phase，NP)晶片、強陰離子交換表面(stronganion exchange，SAX)晶片、弱陽離子交換表面(weakcationexahange，WCX)晶片、金屬離子螯合(IMAC)表面晶片的化學表面晶片和受體一配體晶片、酶一底物晶片、抗原一抗體晶片及DNA一蛋白質晶片的生物表面晶片、All-in-one標準蛋白質晶片以及按出生缺陷病蛋白質組分析需要設計的特種晶片。
7.根據權利要求1、6所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是蛋白質晶片特異性或非特異性地結合未知或已知蛋白或其他相關物質。
8.根據權利要求1、6、7所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是晶片閱讀軟體涉及Ciphergen Software 3.1.1、Tandem-MS等配套軟體支持下建立的資料庫。
9.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是出生缺陷病特異蛋白質組的分析原理涉及表面增強雷射解吸飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS技術，國內稱飛行質譜)、二維色譜(2D-LC)、二維毛細管電泳(2D-CE)、液相色譜-毛細管電泳(LC-CE)、二維電泳法(2-DE)、基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化技術(ESI)、傳統的微陣列蛋白質晶片技術以及更新蛋白質組分析方法。
10.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是出生缺陷病特異蛋白質譜的篩選與鑑定涉及相關生物信息軟體分析系統、相關資料庫以及其他方法。
11.根據權利要求1、10所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是出生缺陷病特異蛋白質譜的篩選與鑑定的相關生物信息軟體分析系統涉及人工神經網絡及其軟體Matlab-NNTools、支持向量機、決策樹、飛行質譜配套軟體、ProteinChiD Software3.0、CiphergenSoftware 3.1.1支持下建立的新資料庫、Cibcron blue3GA、Biomarker Wizard軟體、Biomarker PatternsTM Software、Tandem-MS、在線蛋白工具軟體及更新或配套軟體。
12.根據權利要求1、10所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是相關生物信息軟體分析系統的功能主要涉及數據採集、記錄、轉化、消除幹擾、噪音過濾、分子偏差和閾值設置、信號聚類與轉化、統計分析、差異蛋白篩選和分類鑑定方面。
13.根據權利要求1、10所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是出生缺陷病特異蛋白質譜的篩選與鑑定的相關資料庫涉及已建立或新建立的蛋白質資料庫、蛋白質序列資料庫、蛋白質序列基序資料庫、蛋白質三維結構資料庫、蛋白質(峰)譜資料庫、蛋白質荷比(m/z)資料庫、蛋白質組或蛋白質組相關資料庫、基因組或基因資料庫。
14.根據權利要求1、10所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是出生缺陷病特異蛋白質譜的篩選與鑑定的其他方法涉及肽質量指紋圖譜鑑定蛋白質、一級質譜(MS)結合串聯質譜(MS/MS)肽鑑定蛋白質、蛋白質組分析配套軟體鑑定蛋白質及其新方法鑑定蛋白質。
15.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是實驗中所發現的出生缺陷病相關的新的蛋白質可採用直接從晶片表面選擇性捕獲蛋白、mini-spin柱或titre plate formatted層析裝置鑑定、在Tandem-MS下閱讀晶片鑑定。
16.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是所用器材採用飛行時間質譜儀(SELDI-TOF-MS)、能量吸收分子CHCA、Tandem-MS、白蛋白親和樹脂、HEPES緩衝鹽、CHAPS緩衝鹽、基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)以及新的蛋白質組分析器材。
17.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是人工神經網絡產前診斷模型利用反向傳播算法、基於Matlab-NNTools人工神經網絡軟體經訓練集和交叉驗證以及盲法試驗構建，用於出生缺陷病的產前診斷或產前篩查。
18.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是將在蛋白質組學產前診斷中發現的新的特徵性出生缺陷病蛋白質譜建立出生缺陷病蛋白質譜資料庫或製成成組(或單一)出生缺陷病對應的綜合性(或單一)特異蛋白質譜標準作為蛋白質組學產前診斷標準。
19.根據權利要求1、2、18所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是通過分析成組出生缺陷病對應的綜合性特異蛋白質譜或單一出生缺陷病對應的特異蛋白質譜及相關因素作出產前診斷。
20.根據權利要求1所述的蛋白質組學產前診斷方法，其特徵是用同質同類的正常或已知出生缺陷病或人工製作或相關標準資料庫中對應的標準蛋白質譜作為蛋白質組學產前診斷方法實驗室質量控制。
全文摘要
本發明涉及一種用於醫療領域的蛋白質組學產前診斷方法，其主要特徵是從蛋白質組學的角度，基於飛行質譜等蛋白質組分析原理，以成批分析出生缺陷病特異蛋白質譜為原理建立蛋白質組學產前診斷方法，分析時用蛋白晶片結合被檢出生缺陷病蛋白，經選擇性清洗，晶片保留了高解析度的蛋白譜，加能量吸收分子後，保留的蛋白形成晶體，經特異雷射照射，解離出蛋白離子，經高壓電場加速後進入真空無電場飛行管，飛向離子檢測器，不同質荷比的蛋白質依據其通過飛行管的時間長短被記錄，並經高速模擬數字轉化器轉化後，被測蛋白以一系列蛋白質荷比峰或蛋白質譜形式呈現，以相關分析軟體或以基於人工神經網絡建立的產前診斷模型篩選出疾病表達的特異蛋白質譜作為出生缺陷病產前診斷或患病風險率評估。
文檔編號G01N33/48GK1928548SQ200510096869
公開日2007年3月14日 申請日期2005年9月11日 優先權日2005年9月11日
發明者翁炳煥 申請人:翁炳煥