一種提高擬南芥幼苗保存效果的方法

2023-08-11 16:29:31 2

一種提高擬南芥幼苗保存效果的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高擬南芥幼苗保存效果的方法，為採用含有碳納米材料的玻璃化溶液處理擬南芥幼苗以提高其保存效果，具體包括：裝載液處理、玻璃化溶液處理和液氮保存步驟，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L碳納米管。本發明中公開的方法對擬南芥幼苗的保存效果優化顯著，通過添加碳納米管作為外源物質對植物玻璃化超低溫保存起到促進作用。
【專利說明】一種提高擬南芥幼苗保存效果的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物或其局部的保存領域，具體涉及一種提高擬南芥幼苗保存效果的 方法。

【背景技術】
[0002] 超低溫保存是上世紀70年代發展起來的一項現代種質資源離體保存技術。通常 在液氮中保存，被保存材料細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止，處在相對穩定的 生物學狀態，達到長期保存種質的目的，超低溫保存是目前唯一不需要連續繼代的中長期 保存方式。玻璃化法超低溫保存是將細胞或組織置於由一定比例的滲透性和非滲透性保護 劑組成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下固化成非結晶的玻 璃化態，並以這種玻璃態在低溫下保存。玻璃化法因操作簡單快捷，成本低，適宜保存種類 廣泛，保存材料遺傳性穩定，保存效果好等優點，是近十年來用於優良種質資源中長期保存 的首選方法。
[0003] 在植物及其組織的玻璃化超低溫保存的方法中，採用一些保存方法時，植物及其 組織恢復培養後成活率不高或者根本不能成活；另外採用相同的保存方法時候，不同的植 物及其組織恢復培養後是否能成活及成活率的高低也不盡相同。現有技術中添加一定的外 源物質有利於提高超低溫保存成活率，但是對於特定的植物和組織選擇何種外源物質才能 提1?其保存效果卻是未知的。
[0004] 擬南芥屬於被子植物門，雙子葉植物綱，其為兩年生草本，擬南芥作為模式植物的 優點是植株小、結子多，其還為自花受粉植物，基因高度純合。在超低溫保存領域的研究中， 擬南芥具有重要的地位和研究意義。擬南芥幼苗是非常好的研究材料，在已有的研究中發 現，擬南芥萌發60h幼苗可以篩選不同的外源添加物質對於超低溫保存效果的影響，同時 可以作為保存材料研究超低溫保存過程中的分子機理，是一種很重要的生理學和分子生物 學研究材料。


【發明內容】

[0005] 鑑於以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在於提供一種新的提高擬南芥保存 效果的方法，以克服現有技術中擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長率低的缺點，進一步地完 善其為植物玻璃化法超低溫保存過程中的生理生化響應提供研究基礎
[0006] 為了實現上述目的或者其他目的，本發明是通過以下技術方案實現的。
[0007] 一種提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，採用玻璃化超低溫保存的方 法對擬南芥幼苗進行保存，具體步驟如下：
[0008] 1)裝載液處理：室溫下，將擬南芥幼苗在裝載液中浸泡處理20?30分鐘後移除 裝載液；
[0009] 2)玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡處理擬南芥幼苗40?60 分鐘；
[0010] 3)液氣保存：保持擬南介幼苗在玻璃化溶液中浸泡的狀態，並直於液氣中保存；
[0011] 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L碳納米管的玻璃化冷凍保護液。
[0012] 本發明中所述 MS 培養液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 · 7H20,440mg/L CaCl2 · 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/LFeS04 · 7H20, lOOmg/L肌醇，0· 5mg/L煙酸，0· 5mg/L鹽酸批咳醇，0· lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnS04.4H20,8.6mg/LZnS04.7H20,0.25mg/L Na 2MoO4 · 2H20,0. 025mg/L CuSO4 · 5H20,0. 025mg/LCoCl2 · 6H20,餘量為水。所述 MS 培養液 的pH為5. 8。
[0013] 優選地，所述擬南芥幼苗為擬南芥種子在預培養基上培養1-5天的擬南芥幼苗。
[0014] 更優選地，所述擬南芥幼苗為擬南芥種子在預培養基培養60h的擬南芥幼苗。
[0015] 優選地，所述擬南芥幼苗為在MS固體培養基上培養60h後的擬南芥幼苗，在MS培 養基上培養的方法為：將擬南芥種子置於MS固體培養基上，每天先進行光照培養8?12h， 光強100?200 μ mol/m2,溫度20?27°C，每天光照培養剩餘時間進行黑暗培養，黑暗培養 溫度為20?25°C，循環每天光照培養和黑暗培養至60h。
[0016] 本發明中所述 MS 固體培養基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/ LKH2PO4, 370mg/L MgSO4 · 7H20,440mg/L CaCl2 · 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/ LFeSO4 · 7H20, lOOmg/L肌醇，0· 5mg/L煙酸，0· 5mg/L鹽酸批卩多醇，0· lmg/L鹽酸硫胺素， 2mg/L 甘氨酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 ·4Η20,8·6π^/1 ZnSO4 ·7Η20， 0· 25mg/L Na2MoO4 · 2H20,0· 025mg/L CuSO4 · 5H20,0· 025mg/L CoCl2 · 6H20, 30g/L 蔗糖，IOg/ L瓊脂粉，餘量為水。所述MS固體培養基的pH為5. 8。
[0017] 本發明中所述擬南芥幼苗在MS培養基上培養的方法為每天採用光照培養和黑暗 培養交替的形式直至達60h。如，每天先進行8h的光照培養，然後進行16h的黑暗培養，如 此循環直至第三天再培養12h，第三天的12h為光照培養。
[0018] 優選地，室溫下，將擬南芥幼苗在裝載液中浸泡處理20分鐘後移除裝載液。
[0019] 優選地，在0°C下使用玻璃化溶液浸泡處理擬南芥幼苗50分鐘。
[0020] 更優選地，所述擬南芥幼苗在MS培養基上培養的方法為：先進行8h光照培養，光 強100?200 μ mol/m2,溫度25°C;再進行16h黑暗培養，黑暗培養溫度為20°C。更優選地， 光強為 150ymol/m2。
[0021] 優選地，所述擬南芥種子為先經春化處理過的擬南芥種子，所述春化處理為將所 述擬南芥種子在〇?KTC下放置24?72h。
[0022] 優選地，所述春化處理為將所述擬南芥種子在4?6°C下放置40?50h。
[0023] 更優選地，所述春化處理為將所述擬南芥種子在4°C下放置48h。
[0024] 優選地，所述擬南芥種子在春化處理前先經消毒處理，消毒處理工藝為：將擬南芥 種子用65?75%乙醇浸泡10?30s，再使用無菌水衝洗，然後使用含15?25wt %的NaClO 和0?0. 03wt%的吐溫20的水溶液浸泡5?15分鐘，並使用無菌水衝洗。本發明中所述 的65?75%乙醇是指含乙醇的水溶液，其中的百分含量為體積百分含量。
[0025] 更優選地，所述消毒處理工藝為：將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無菌水衝洗 4?6遍，然後使用含15?25wt %的NaClO和0?0. 03wt %的吐溫20的水溶液浸泡10分 鍾，並使用無菌水衝洗5?6遍。
[0026] 更優選地，所述消毒處理工藝為：將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無菌水衝洗 4遍，然後使用含20wt %的NaClO和0. Olwt %的吐溫20的水溶液浸泡10分鐘，並使用無菌 水衝洗6遍。
[0027] 優選地，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇和0· 3?0· 5mol/L蔗糖的MS培養 液。
[0028] 更優選地，所述裝載液為含有1?2mol/L丙三醇和0· 3?0· 5mol/L蔗糖的MS培 養液。
[0029] 本發明中所述擬南芥種子可以為現有技術中所有類型的擬南芥種子類型。
[0030] 優選地，所述擬南芥種子為哥倫比亞生態型擬南芥種子，如：Arabidopsis thaliana ecotype Col-Ο 型。
[0031] 優選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞 碸、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳納米管的MS培養液。
[0032] 更優選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞碸、0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 3g/L碳納米管的MS培養液。
[0033] 更優選地，所述玻璃化溶液為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基 亞碸、0. 4mol/L蔗糖和0. lg/L碳納米管的MS培養液，或所述玻璃化溶液為含有300g/L丙 三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞碸、0. 4mol/L蔗糖和0. 3g/L碳納米管的MS培養液。 [0034] 本發明還公開了一種擬南芥幼苗的解凍及再培養方法，所述擬南芥幼苗為採用上 述所述方法保存的擬南芥幼苗，所述擬南芥幼苗的解凍及再培養方法為將擬南芥幼苗從液 氮中取出，先水浴解凍，然後去除玻璃化溶液後用洗滌液洗滌，最後轉入MS固體培養基中 恢復培養。
[0035] 優選地，水浴解凍的條件為在30?40°C的水浴中解凍60?120s，用洗滌液洗滌 的工藝為：用洗滌液在室溫下浸泡30?50分鐘，並每隔5?10分鐘換一次洗滌液，所述洗 滌液為含有1. 〇?I. 5mol/L蔗糖的MS培養液。
[0036] 更優選地，水浴解凍的條件為在40°C的水浴中解凍90s，用洗滌液洗滌的工藝為： 用洗滌液在室溫下浸泡40分鐘，並每隔10分鐘換一次洗滌液，所述洗滌液為含有I. 2mol/ L蔗糖的MS培養液。
[0037] 優選地，所述恢復培養工藝為將擬南芥幼苗每天先光照培養8?12h，光強100? 200 μ mol/m2,培養溫度為20?27°C，每天中剩餘時間採用黑暗培養，黑暗培養溫度為20? 25。。。
[0038] 更優選地，所述恢復培養工藝為將擬南芥幼苗每天先光照培養8h，光強 15(^111〇1/111 2，培養溫度為251：，每天中剩餘時間採用黑暗培養，黑暗培養溫度為201：
[0039] 更優選地，為了證明本發明中方法的保存效果，採用恢復生長率來統計，具體地， 在恢復培養的第15天統計成活的擬南芥幼苗的數量，並計算恢復生長率，所述恢復生長率 為：成活的幼苗數量/幼苗總數量X 100%。
[0040] 根據納米科學原理，向冷凍保護劑中添加納米材料能夠有效提高冷凍保護劑的粘 度和熱導率，改變冰晶的形成狀況、減少對細胞的傷害。本發明對擬南芥幼苗，特別是擬南 芥種子萌發60h幼苗的在玻璃化超低溫條件下保存，先用裝載液處理，然後採用玻璃化溶 液處理，最後在液氮中超低溫保存，其中玻璃化溶液又為添加了碳納米管的玻璃化溶液，這 種外源物質的添加配合方法中的其他工藝，能夠有效的提高擬南芥幼苗的保存效果。按照 本發明公開的保存方法，採用濃度為0. 1?0. 5g/L的碳納米管作為外源物質使用時，將60h 擬南芥幼苗玻璃化超低溫保存後的恢復生長率顯著提高，本發明中公開的方法對擬南芥幼 苗的保存效果優化顯著，通過添加碳納米管作為外源物質對植物玻璃化超低溫保存起到促 進作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1為實驗組和對照組中60h擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長照片。
[0042] 其中，圖1中：
[0043] 左列為對照組中60h擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長照片；
[0044] 右列為實驗組中60h擬南芥幼苗超低溫保存恢復生長照片； 第一排到第三排中玻璃化溶液中添加的碳納米管的含量分別為〇. Ig/L、0. 3g/L和 0.5g/L〇

【具體實施方式】
[0045] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基於不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0046] 本發明實施例中所用的擬南芥種子為擬南芥哥倫比亞生態型種子，Arabidopsis thaliana ecotype Col-Ο 型。
[0047] 本發明實施例中所用實驗試劑的配方為：
[0048] I) MS 培養液為：MS 培養液含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4 · 7H20,440mg/L CaCl2 · 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/L FeSO4 · 7H20， lOOmg/L肌醇，0· 5mg/L煙酸，0· 5mg/L鹽酸批咳醇，0· lmg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨 酸，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3B03,22.3mg/L MnSO4 ·4Η20,8·6π^/1 ZnSO4 ·7Η20,0·25π^/ LNa2MoO4 · 2H20,0· 025mg/L CuSO4 · 5H20,0· 025mg/L CoCl2 · 6H20,餘量為水，所述 MS 培養液 的pH為5. 8。
[0049] 2)MS 固體培養基為：MS 固體培養基含有 1900mg/L KNO3,1650mg/L NH4NO3, 170mg/LKH2P04,370mg/L MgSO4 · 7H20,440mg/L CaCl2 · 2H20, 37. 3mg/L Na2-EDTA, 27. 8mg/ LFeSO4 ·7Η20, lOOmg/L 肌醇，0· 5mg/L 煙酸，0· 5mg/L 鹽酸批卩多醇，0· lmg/L 鹽酸硫胺素，2mg/ L甘氨酸,〇· 83mg/L ΚΙ，6· 2mg/L Η3Β03,22· 3mg/L MnSO4 ·4Η20,8· 6mg/LZnS04 ·7Η20,0· 25mg/ L Na2MoO4 · 2Η20,0· 025mg/L CuSO4 · 5Η20,0· 025mg/L CoCl2 · 6H20,30g/L 蔗糖，lOg/L 瓊脂 粉，餘量為水，所述MS固體培養基的pH為5.8。
[0050] 3)裝載液為：含有2mol/L丙三醇和0. 4mol/L蔗糖的MS培養液。
[0051] 4)玻璃化溶液為：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞碸、 0. 4mol/L蔗糖和0. 1?0. 5g/L碳納米管的MS培養液。
[0052] 5)洗滌液為含有I. 2mol/L蔗糖的MS培養液。
[0053] 實施例1
[0054] 1)擬南芥幼苗的獲得：將擬南芥種子用70%乙醇消毒15s，無菌水衝洗4遍後再 用含20wt% NaClO和0. Olwt% Tween20的水溶液消毒lOmin，無菌水衝洗6遍；然後將消 毒後的種子在4°C春化48h，置於MS固體培養基上培養，培養條件為每天光照培養8h，光強 150 μ mol/m2,培養溫度25°C ;然後黑暗培養16h，培養溫度為20°C，總共將種子培養60h，獲 得60h苗齡的擬南芥幼苗。
[0055] 2)將60h擬南芥幼苗分為實驗組和對照組，每個組分別設3個平行實驗，將50株 幼苗放入裝有ImL裝載液的2mL冷凍管中，室溫處理20min ;將裝載液吸除，加入玻璃化溶 液，(TC處理50min ;將冷凍管投入液氮中保存lh。
[0056] 實驗組的玻璃化溶液中分別含有0. Ig/L、0. 3g/L、0. 5g/L的碳納米管。
[0057] 具體地，實驗組組1的玻璃化溶液中含有0. lg/L的碳納米管。
[0058] 實驗組組2的玻璃化溶液中含有0. 3g/L的碳納米管。
[0059] 實驗組組3的玻璃化溶液中含有0. 5g/L的碳納米管。
[0060] 對照組中不同之處在於玻璃化溶液不含有碳納米管，其他與實驗組相同。
[0061] 3)冷凍管於液氮中保存Ih後，取出冷凍管，快速放入40°C水浴鍋中，解凍90s，並 不時輕輕搖動；將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液，室溫處理40min，每隔IOmin換一次洗滌 液；洗滌後的幼苗移到MS固體培養基中，放入植物培養箱，培養箱各項參數同種子萌發條 件，即每天光照培養8h，光強150 μ mol/m2,培養溫度25°C ;然後黑暗培養16h，培養溫度為 20°C ;擬南芥幼苗恢復培養第15天，計算並比較實驗組和對照組內60h擬南芥幼苗的恢復 生長率。
[0062] 實驗組與對照組60h苗齡的擬南芥幼苗的恢復生長率見表1。
[0063] 表 1

【權利要求】
1. 一種提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，採用玻璃化超低溫保存的方法 對擬南芥幼苗進行保存，具體步驟如下： 1) 裝載液處理：室溫下，將擬南芥幼苗在裝載液中浸泡處理20?30分鐘後移除裝載 液； 2) 玻璃化溶液處理：在0?25°C下使用玻璃化溶液浸泡處理擬南芥幼苗40?60分 鍾； 3) 液氮保存：保持擬南芥幼苗在玻璃化溶液中浸泡的狀態，並置於液氮中保存； 所述玻璃化溶液為含有〇. 1?〇. 5g/L碳納米管的玻璃化冷凍保護液。
2. 如權利要求1所述提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，所述擬南芥幼苗 為在MS固體培養基上培養60h後的擬南芥幼苗，在MS培養基上培養的方法為：將擬南芥 種子置於MS固體培養基上，每天先進行光照培養8?12h，光強100?200 μ mol/m2,溫度 20?27°C，每天光照培養剩餘時間進行黑暗培養，黑暗培養溫度為20?25°C，循環每天光 照培養和黑暗培養至60h。
3. 如權利要求2所述提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，所述擬南芥種子 為先經春化處理過的擬南芥種子，所述春化處理為將所述擬南芥種子在〇?l〇°C下放置 24 ?72h。
4. 如權利要求3所述提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，所述春化處理為 將所述擬南芥種子在4?6°C下放置40?50h。
5. 如權利要求3所述提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，所述擬南芥種子 在春化處理前先經消毒處理，消毒處理工藝為：將擬南芥種子用65?75%乙醇浸泡10? 30s，再使用無菌水衝洗，然後使用含15?25wt%的NaCIO和0?0. 03wt%的吐溫20的水 溶液浸泡5?15分鐘，並使用無菌水衝洗。
6. 如權利要求1所述提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，所述裝載液為含 有1?2mol/L丙三醇和0· 3?0· 5mol/L蔗糖的MS培養液。
7. 如權利要求1所述提高擬南芥幼苗保存效果的方法，其特徵在於，所述玻璃化溶液 為含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亞碸、0· 4mol/L蔗糖和0· 1?0· 5g/L 碳納米管的MS培養液。
8. -種擬南芥幼苗的解凍及再培養方法，所述擬南芥幼苗為採用如權利要求1?7任 一權利要求所述方法保存的擬南芥幼苗，所述擬南芥幼苗的解凍及再培養方法為將擬南芥 幼苗從液氮中取出，先水浴解凍，然後去除玻璃化溶液後用洗滌液洗滌，最後轉入MS固體 培養基中恢復培養。
9. 如權利要求8所述解凍及再培養方法，其特徵在於，水浴解凍的條件為在30?40°C 的水浴中解凍60?120s，用洗滌液洗滌的工藝為：用洗滌液在室溫下浸泡30?50分鐘， 並每隔5?10分鐘換一次洗滌液，所述洗滌液為含有1. 0?1. 5mol/L蔗糖的MS培養液。
10. 如權利要求8所述解凍及再培養方法，其特徵在於，所述恢復培養工藝為將擬南芥 幼苗每天先光照培養8?12h，光強100?200 μ mol/m2,培養溫度為20?27°C，每天中剩 餘時間採用黑暗培養，黑暗培養溫度為20?25°C。
【文檔編號】A01N3/00GK104273119SQ201410468211
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】陳冠群, 任麗, 張荻, 申曉輝 申請人:上海交通大學