納米生物機器人及其應用的製作方法

2023-07-13 13:35:31

專利名稱：納米生物機器人及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於納米生物新技術領域，涉及旋轉式ATP馬達構建的光碟機動納米機器人 的設計，組裝及在輔助藥物擴散(溶栓)中的應用。
背景技術：
傳統溶栓治療方法包括藥物溶栓、器械輔助溶栓。在急性心肌梗死的搶救治療中， 溶栓治療是快速恢復心肌血流的有效方法，早期使用溶栓劑治療可使急性心肌梗塞患者的 病死率降低30% [FEBS. Lett. 2005,579(15) :3303-3309]。目前溶栓藥物中效果較好的是 重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)，該藥的主要優點是與纖維蛋白的親和力很高，溶栓速 度快；缺點是易被肝臟清除，半衰期短(4分鐘-5分鐘)，需要持續靜脈滴注，因而用藥劑量 大、價格昂貴(高達4000-5000元/治療單位劑量)，當劑量超過150mg時，可因導致血小板 聚集而誘發再栓塞、顱內出血等併發症[N.Engl. J.Med. ，1995,333(24) :1581-1587.]。
器械輔助溶栓方面，介入治療引人關注[Nat. Clin.Pract. Neurol. 2007， 3(1): 45-53.]，隨著Greenf iedl首次運用靜脈切開導管介入技術治療肺栓塞，近年來介入技術 逐漸進入血管栓塞的治療領域。在心血管疾病的介入治療中，通過在股靜脈處開一個小口 ， 插入中空的導絲，在X光機、核磁共振儀等成像設備的導引下，通過體外操縱導絲到達血管 栓塞或狹窄部位，導絲前端可配置球囊、機械穿剌碎栓、血管內膜旋切和旋磨裝置，對血栓 或狹窄的血管內膜進行治療，其特點是創傷小、安全可靠，對其適應症療效明顯。但由於傳 統加工技術在器件尺寸方面固有的局限，因此在導絲前端的可配置器件的設計原理、尺寸 大小、動力學特性等方面存在著難以突破的技術障礙，介入治療的應用範圍僅局限於相對 較大的血管，技術本身存在一些局限性，例如機械碎栓過程中會產生大量的血栓碎片，其在 血管內的四散可能引發其他部位的小血管栓塞，儘管目前在碎栓的同時採取了吸栓的相應 措施，但實際尚需進一步完善；而血管內膜旋切和旋磨裝置在治療過程中，可能會導致血管 內膜的損傷，從而導致血栓的原位再形成，限制了該技術在臨床上的進一步應用。因此美國 醫學會規定rt-pA是目前唯一許可的溶栓治療措施。

發明內容
本發明從納米生物機器人的角度，構建分子馬達驅動的，以血栓抗體為導向的輔 助快速溶栓的納米機器人，通過分子馬達在血栓局部的快速旋轉，產生類似於微動力攪拌 器的效應，並採用光碟機動分子馬達，實現納米生物機器人的可調控性，加快藥物與纖維蛋白 的接觸，實現納米生物機器人的生物機械力學效應與藥物酶解作用的協同，加速纖維蛋白 溶解。
具體地，本發明提供以下各項 1. —種納米生物機器人，其包括載色體，該載色體上含有分子馬達F。F「ATPase， 其中所述F。F「ATPase不含S亞基，並且所述F。F「ATPase的a或|3亞基上連接有納米蛋 白粒子。
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2.根據以上1的納米生物機器人，其中所述a或|3亞基是經由抗a或|3亞基 抗體與所述納米蛋白粒子連接，其中所述抗a或P亞基抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
3.根據以上2的納米生物機器人，其中所述抗a或|3亞基抗體是通過生物素-鏈 酶抗生物素_生物素與所述納米蛋白粒子連接。 4.根據以上1的納米生物機器人，其中所述納米蛋白粒子的粒徑在10nm至lOOnm 範圍內，優選在20nm至50nm範圍內。 5.根據以上1的納米生物機器人，其中所述納米蛋白粒子進一步與一個DNA片段 連接。在一個實施方案中，一個納米蛋白粒子上的DNA片段與另一個納米蛋白粒子上的DNA 片段互補(或部分互補)結合，由此抑制納米蛋白粒子的運動(旋轉)。
6.根據以上1的納米生物機器人，其中所述納米蛋白粒子進一步與一個DNA片段 連接，所述DNA片段與另一個DNA片段在該另一個DNA片段的5'或3'端互補結合，所述另 一個DNA片段的5'和3'端的序列分別與所述納米蛋白粒子上的所述DNA片段互補。在一 個實施方案中，納米蛋白粒子上的所述DNA片段與另一個游離DNA片段(部分或完全)互 補結合，該游離DNA的5'和3'末端分別可以與相鄰的兩個納米生物機器人上的納米蛋白 粒子上的DNA片段(部分或完全)互補結合，由此抑制納米蛋白粒子的運動(旋轉)。
7.根據以上1的納米生物機器人，其中所述載色體進一步與導向分子連接。
8.根據以上7的納米生物機器人，其中所述導向分子是抗體或核酸，優選所述導 向分子是纖維蛋白原抗體，該纖維蛋白原抗體是多克隆抗體或單克隆抗體、或人工抗體、或 重組抗體。 9.根據以上8的納米生物機器人，其中所述纖維蛋白原抗體是纖維蛋白原多抗， 並且通過生物素_鏈酶抗生物素_連接脂質的生物素與所述載色體連接。
10.根據以上1-9任一項所述的納米生物機器人在製備輔助藥物中的應用，所述 輔助藥物用於促進活性藥物在目標區域的擴散。 本發明還提供應用於疾病治療的納米生物機器人的構建方法，該方法包括如下步 驟 (1)載色體(chromatophores)的製備 培養光合作用細菌(R. C即sulatus 120，(保藏號1. 2359)商購於中科院微生物所 細胞庫)。培養基KH2P04， 1. Og， MgCl20. 5g， CaCl2，0. lg， NaCll. Og，醋酸鈉1. Og，琥珀酸鈉 lg，酵母膏，1. 0g，NaHC030 . 5g，蛋白腖0. 5g(0X0ID英國)，微量元素1. Oml，維生素液1. Oml， 蒸餾水1.0L，pH 6.8，8磅，高壓滅菌30分鐘。維生素液成分生物素0. lg(進口分裝)， 煙酸0. 35g，煙酸硫胺素(Thiamine dichloride) 0. 3g，泛酸牽丐(Ca-panthothenate) 0. lg， 維生素B12(Vitamin B12，0. 05g，鹽酸妣多胺(PyridoxoliumHydrochloride， Fluka)O.lg， 蒸餾水1. OL ;微量元素成分FeCl2 4H20 1. 8g ;CoCl2 6H20 0. 25g ;NiCl2 6H20，0. Olg ; CuCl2 2H20 0. Olg， MnCl2 4H200. 07g ;ZnCl2 0. lg， B3P04 0. 5g， Na2Se03 5H20 0. Olg， NaMo04 H20 0. 03g，蒸餾水1. OL)溫度30_35°C。收穫細菌的培養溫度為28°C，在光照 (4，000Lx)下培養5-7天，5000g離心收集。載色體(Chromatophores)的提取樣品用TS 緩衝液(50mM，Tricine(三(羥甲基)甲基甘氨酸，Amresco進口分裝)pH 8. O，O. 25M蔗糖； 5mM MgCl2)洗滌一次，然後再加入15ml的TS緩衝液，懸浮後，加入lmg/ml的溶菌酶(Sigma 分裝)，在冰中孵育30分鐘，超聲(20X振幅，Cole Parmer CPX 600超聲儀13#探頭)10分
4鍾，25， 000g離心30分鐘，保留上清，再將上清180， OOOg在fC離心90分鐘，沉澱為載色體 (Chromatophores)。此複合物為含一個分子馬達F。F「ATPase，多個光轉換載體。
(2)60 ii l，O. 5ii g/ii 1的chromatophores (帶有分子馬達)與0. 5ii 1，5. 5mM的 lipid-biotin在4。C連接25分鐘；然後加入95 iil， 29 ii M的avidin，室溫連接5分鐘，形 成(分子馬達-lipid-biotin-avidin)，備用； (3)50iil，17iiM的纖維蛋白原多抗，與4. 25iil，lmM N-biotin室溫連接60分鐘， 形成(N-biotin-纖維蛋白原多抗)，備用； (4) 50 iil， 350 ii g/ml的納米蛋白粒子(粒徑為23nm)，與85 yl， 100 y M的 N-biotin室溫連接60分鐘，形成(N-biotin-納米蛋白粒子)，備用； 納米蛋白粒子的製備方法為納米蛋白粒子為SV40主要衣殼蛋白VPl，重組VPl 通過其N末端融合的組氨酸標籤(histag)被純化。攜帶質粒pET32a-hisVPl的大腸桿菌 表達菌株在500mL LB培養基中37。C長至0D6。。約0. 6，加入ImM的IPTG並轉入25。C繼續 培養9h。將菌體離心收集並重懸於40mL緩衝液B(25mM Tris-HCl pH 7.8，500mM NaCl， 5mMimidazole，和5% glycerol)中超聲破碎。菌體殘渣通過12000rpm離心30min除去。 將上清上樣至鎳親和層析柱；再先後用含有40mM和80mM咪唑(imidazole)的緩衝液B洗 柱；最後用含500mM咪唑的緩衝液B將VPl洗脫。所得VPl對緩衝液D (10mM Tris-HCl pH 8.8，200mM NaCl，2mM EDTA，30mM P-mercaptoethanol，禾口 5% glycerol)透析20h，然後在 4°C 55000rpm離心lh，取上清即得解聚狀態的VPl。蛋白濃度用考馬斯亮藍G250染色法測
定。製備好的納米顆粒保存於4t:。 (5)50iil，17iiM的分子馬達P亞基多抗，與4. 25 iU， ImM N-biotin室溫連接60 分鐘，形成(N-biotin-P亞基多抗)，然後加入147iil，29iiM的avidin，室溫連接5分鐘， 形成亞基多抗-N-biotin-avidin)，備用; (6)取20 ii 1的(分子馬達-lipid-biotin-avidin)，與4. 4 ii 1 (N-biotin-纖維 蛋白原多抗)室溫連接5分鐘，形成(分子馬達-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纖維蛋 白原多抗)； (7)取48iil(e亞基多抗-N-biotin-avidin)，與10 ii 1 (N-biotin-納米蛋白粒 子)室溫連接5分鐘，形成亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白粒子);
(8)取17ii 1，29iiM的avidin，與100ii 1， 10 ii M的biotin-DNAl，室溫連接5分鐘， 形成(avidin—biotin—DNAl);然後力口入5u l(P亞基多抗一N—biotin—avidin—N—biotin—糹內 米蛋白粒子)，室溫反應5分鐘，形成(13亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白 粒子_N_biotin_avidin_biotin_DNAl); (9)取24. 4ul(分子馬達_1 ipid_biotin_avidin_N_biotin_纖 維蛋白原多抗)，與29. 3iil(P亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納 米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNAl)室溫反應60分鐘，形成(纖 維蛋白原多抗-N-biotin-avidin-lipid-biotin-分子馬達-P亞基多 抗一N—biotin—avidin—N—biotin—糹內米蛋白粒子一N—biotin—avidin—biotin—DNAl);然後力口 入13iU，10iiM的DNA2，室溫反應2h，完成分子馬達剎車片的安裝。 其中在步驟(3)中加入纖維蛋白抗體以實現納米生物機器人與血栓的特異性結
在上述方法中，加入納米蛋白粒子(直徑約為23nm)，其中將該納米粒子用於納米 生物機器人螺旋槳的構建，用於產生足夠的生物機械效應。 在上述方法中，加入DNA1和/或DNA2，利用DNA序列互補的效應，實現納米生物機
器人的剎車制動，從而實現在體內血栓局部也可以進行光照儲能的目的。 本申請還包括將納米生物機器人應用於體內輔助藥物溶栓及納米動力裝置輔助
藥物治療的其他醫學應用。 相對於常規溶栓治療技術的上述局限，納米生物技術在疾病治療領域體現出強勁 的活力，構建納米生物機器人，利用納米機械力學特性協同傳統藥物的生化酶解效應溶栓， 並利用納米在器件尺寸方面的優勢，將納米生物機器人與血栓抗體相結合，在血栓局部發 揮促溶作用，這將為血栓性疾病的治療提供了新的思路。 本發明用光碟機動旋轉式分子馬達構建的生物納米機器與血栓抗體結合，是一種全 新的納米生物機器人；該納米生物機器人具備對血栓具有靶向結合能力和輔助藥物快速溶 栓能力，鑑於血栓性疾病中的腦血管疾病和心血管疾病目前位列全球人類疾病死因譜的第 1位和第3位，而且據世界衛生組織預測，這兩類疾病仍將是未來人類健康的首要威脅，而 目前的治療手段僅僅依賴於藥物溶栓和介入治療，因此本發明構建的能與血栓特異性結合 的光碟機動納米機器人具有廣闊的國內外應用前景及巨大的市場價值，是納米生物機器人輔 助藥物溶栓的一個較大的技術突破，潛在的用戶包括各大中型醫院的腦血管及心血管病治 療的臨床科室，產品投入使用後將產生直接的經濟效益。在社會作用方面，納米生物機器人 輔助傳統的單一藥物溶栓，將極大的降低心腦血管疾病的死亡率和致殘率，提高臨床搶救 與治療的成功率及康復程度，減少病殘，恢復一定的勞動能力，提高生活自理能力，提高病 人的生活質量，為廣大中風患者家庭及心肌梗死家庭減輕生活負擔，具有很大的社會效益。
發明詳述 本發明是對中國專利申請號200410098929. 9 (
公開日2006年6月21日， CN1789425，已授權)的進一步改進，區別在於在本發明中，分子馬達不僅僅是作為一種生 物傳感器使用，而是將其作為納米生物機器人的動力裝置，構建了納米生物機器，並將其應 用於醫學治療中。 藉助於分子馬達的結構，功能與原理的研究進展，提出了 Ff。-ATP馬達全旋轉式 納米機器人的新概念與新技術；提供一種巳13 (或巳a )亞基作為血栓抗體連接的靶位點的 新技術；提出了 DNA鏈作為剎車片在分子馬達旋轉啟動控制中的新技術。
本發明內容的要點(l)變靜態溶栓為動態溶栓，即將傳統的藥物溶栓轉變為藥 物在納米生物機器人輔助下的溶栓；(2)實現納米生物機器人與血栓的靶向結合，即製備 纖維蛋白抗體，通過生物素_親和素_生物素連接體系與分子馬達相連，實現納米生物機器 人在血栓表面的固定；(3)為分子馬達增加制動裝置，將DNA互補雙鏈的結合與解鏈兩種狀 態作為分子馬達的剎車控制裝置的制動與去制動，解決調控納米生物機器人旋轉啟動控制 的關鍵問題，為納米生物機器人應用於臨床治療提供控制技術。 以下對本發明的技術方案做進一步詳細闡述。應當指出，本發明的各實施方案可 以根據需要以任何方式組合。 在本發明的一個實施方案中，提供一種納米生物機器人( 一種改進的生物載色體 體系)，其包括載色體(chromatophore，脂囊泡)，該載色體上含有分子馬達F。F「ATPase，其中所述F。F「ATPase不含S亞基，並且所述F。F「ATPase的a或|3亞基上連接有納米蛋白 粒子。 F。F「ATP合酶是由多亞基組成的複合體，包括膜內的F。部分，基本組成是ab2cn ;膜 外親水巳部分亞基的基本組成是a3|33Y e S。這兩部分分別由2個柄連接中心的柄為 Y e複合物，連接巳的a 313 3亞基和F。的c亞基；偏心柄為插入膜區的a亞基與膜外b2亞 基，b2的另一端與S亞基的C端連接，而S亞基的N端與Fl部分a亞基聯接(圖1A)。
本發明通過生物工程技術將S亞基去掉[方法參見Biochem.Biophys. Res. Commun. 2006， 350 (4) :1013-1018.]，對天然的F。F「ATP合酶進行重構，得到去S的 F。F「ATP合酶，在重構體中，分子馬達的定子為alv轉子為a 313 3 Y e cn(圖IB)，經此改造 後，分子馬達成為一種理想的納米動力裝置。天然分子馬達中，可轉動部分僅為活動範圍非 常有限的Y e和 (圖1A中的深色部分)，且包涵在酶分子內部，該結構大大限制了其作 為分子馬達的應用。而重構的分子馬達，可轉動部分為a3P3Y e ，轉子暴露在表面，方便 進一步的工程化改造，例如在a或|3亞基上接上各種生物材料構成的"螺旋槳"，那麼可充 分利用F。F「ATP合酶這一旋轉分子馬達的特性，廣泛應用於生物、醫學、納米材料等領域。
在本發明中，將所述納米粒子用於納米生物機器人螺旋槳的構建，用於產生足夠 的生物機械效應。所述納米粒子隨著F。F「ATPase的a或P亞基旋轉，對載色體周圍產生 攪拌效應，可以促進載色體周圍環境的生物或化學物質(包括藥物)的擴散。如CN1789425 所述，分子馬達F。F「ATPase的旋轉可以由ATP水解驅動，也可以由光能轉換的跨膜電化學 電位差驅動的，優選所述跨膜電化學電位差是由光能或化學能轉換的。 在本發明的另一個實施方案中，所述a或|3亞基是經由抗a或|3亞基抗體與 所述納米蛋白粒子連接，其中所述抗a或P亞基抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
在本發明的另一個實施方案中，所述抗a或13亞基抗體是通過生物素_鏈酶抗 生物素_生物素與所述納米蛋白粒子連接。 在本發明中，對於納米蛋白粒子的粒徑沒有特別限制(也可以是磁性的材料)，只 要其作為"螺旋槳"能夠產生攪拌作用即可。在本發明的一個優選實施方案中，所述納米蛋 白粒子的粒徑在10nm至lOOnm範圍內，更優選在20nm至50nm範圍內。
在本發明的另一個實施方案中，所述納米蛋白粒子進一步與一個DNA片段(在本 文中也稱為DNA1)連接。該DNA片段是起"剎車片"的作用，控制納米蛋白粒子的旋轉。在 一個實施方案中，該DNA片段是通過生物素-鏈酶抗生物素_生物素與所述納米蛋白粒子 連接。對於該DNA片段的序列沒有特別限制。優選地，一個納米蛋白粒子上的DNA片段與 另一個納米蛋白粒子上的DNA片段互補(或部分互補)結合，由此抑制納米蛋白粒子的運 動(旋轉)(示意圖參見圖4B和5B)。 在另一個實施方案中，對DNA1的序列沒有特別要求，可以另外加入一個游離DNA 片段(在本文中也稱為DNA2) ，DNA2的設計原理為序列的兩側為對稱序列，且5'和3'端的 序列分別與DNA1互補，其長度按照設計要求，可以進行相應調整。由此，DNA2可以分別與 相鄰的兩個載色體F。F「ATPase上的DNAl互補結合，形成部分DNA雙鏈，由此使得分子馬達 不能旋轉(參見圖4A和5A)。 在本發明的另一個實施方案中，所述載色體進一步與導向分子連接。與導向分子 連接的目的是為了將包含帶有"螺旋槳"的分子馬達的納米生物機器人導向需要"螺旋槳"攪拌的區域。所述區域可以是需要給藥的任何生物體內或體外部位，例如腫瘤部位，病毒感 染部位，炎症部位，血栓形成部位等任何病灶部位。相應地，所述導向分子可以是蛋白質抗 體(例如，生物大分子、病毒分子特異性抗原、炎性因子、趨化因子、腫瘤因子、血栓形成因 子的抗體)或核酸(如反義RNA，探針、核酸適體等)。在本發明的一個優選實施方案中，所 述導向分子是纖維蛋白原抗體，該纖維蛋白原抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。在本發明 的另一個優選實施方案中，所述導向分子是通過生物素-鏈酶抗生物素-連接脂質的生物 素與所述載色體連接。本發明使用的生物素可以是N-生物素的形式。 在本發明的另一個實施方案中，將上述納米生物機器人在製備輔助藥物中的應 用，所述輔助藥物用於促進活性藥物在目標區域(各種病灶區域或給藥區域)的擴散。
在本發明的另一個實施方案中，本發明提供一種試劑盒，該試劑盒包含根據本發 明的納米生物機器人和活性藥物，其中所述納米生物機器人可以促進所述活性藥物在目標 區域的擴散。 鑑於血栓性疾病中的腦血管疾病和心血管疾病目前位列全球人類疾病死因譜的 第1位和第3位，而目前的治療手段僅僅依賴於藥物溶栓和介入治療，因此本發明構建的能 與血栓特異性結合的光碟機動納米機器人具有廣闊的國內外應用前景及巨大的市場價值，是 納米生物機器人輔助藥物溶栓的一個較大的技術突破，潛在的用戶包括各大中型醫院的腦 血管及心血管病治療的臨床科室，產品投入使用後將產生直接的經濟效益和巨大的社會效
.、 目前腫瘤位列人類疾病死因譜的第2位，而目前化療由於全身大劑量用藥導致的 副作用，限制了抗腫瘤藥物的效果。因此本發明構建的能與腫瘤特異性結合的光碟機動納米 機器人具有廣闊的國內外應用前景及巨大的市場價值，是納米生物機器人輔助藥物抗腫瘤 治療的一個較大的技術突破，潛在的用戶包括各大中型醫院的腫瘤治療的臨床科室，產品 投入使用後將產生直接的經濟效益和巨大的社會效益。


圖1是分子馬達的重構(去S亞基的F。F「ATP合酶)示意圖；
F。F「ATP合酶是由多亞基組成的複合體，包括膜內的F。部分，基本組成是ab2cn ;膜 外親水巳部分亞基的基本組成是a3|33Y e S。這兩部分分別由2個柄連接中心的柄為 Y e複合物，連接巳的a 313 3亞基和F。的c亞基；偏心柄為插入膜區的a亞基與膜外b2亞 基，b2的另一端與S亞基的C端連接，而S亞基的N端與巳部分a亞基聯接(圖1A)。
本發明通過生物工程技術將S亞基去掉[參見Biochem. Biophys. Res. Co匪n. 2006， 350 (4) :1013-1018.]，對天然的F。F「ATP合酶進行重構，得到去S的 F。F「ATP合酶，在重構體中，分子馬達的定子為alv轉子為a 313 3 Y e cn(圖IB)，經此改造 後，分子馬達成為一種理想的納米動力裝置。天然分子馬達中，可轉動部分僅為活動範圍非 常有限的Y e和 (圖1A中的深色部分)，且包涵在酶分子內部，該結構大大限制了其作 為分子馬達的應用。而重構的分子馬達，可轉動部分為a3P3Y e ，轉子暴露在表面，方便 進一步的工程化改造，例如在a或|3亞基上接上各種生物材料構成的"螺旋槳"，那麼可充 分利用F。F「ATP合酶這一旋轉分子馬達的特性，廣泛應用於生物、醫學、納米材料等領域。
圖2是納米生物機器人的光碟機動實現；
F。F「ATP酶位於載色體(也稱為脂囊泡，chromatophore)上，脂囊泡相當於一個 質子(H+)的貯存庫，脂囊泡來自於光合細菌，脂囊泡上有光合反應中心。光照時，通過光合 反應中心，質子由脂囊泡外進入囊泡內，隨光照時間增加囊泡內的質子濃度增高，質子勢能 儲存在脂囊泡中。經一定時間儲能後，升高溫度至37t:，用質子梯差啟動F。F「ATP酶的旋 轉，在這個過程中，質子的流動推動分子馬達的旋轉，即質子能轉化為生物機械能。在此過 程中，實現納米生物機器人的光控制。 本發明的實驗中光照儲能方式包括兩種，第一種為在體外冰上進行光照，光照儲
能後升溫至37t:後注入體內促進藥物溶解，第二種為體內原位光照，此時分子馬達的旋轉
的制動與啟動依靠DNA雙鏈剎車進行控制，當DNA雙鏈處於結合狀態時，分子馬達處於制動 狀態，脂囊泡中的質子無法流出，在這種狀態下，原位光照可以增加囊泡內的質子梯度，儲 存質子勢能，當質子勢能儲存到一定程度，DNA雙鏈打開，分子馬達開始旋轉，從而實現分子 馬達在體內的光碟機動。 圖3.微混合器加速溶纖的工作原理示意圖(注A :溶栓藥物；^flftft:血栓中的纖
維蛋白；纖維蛋白碎片)； A為實驗組，為微混合器加速溶栓工作原理，經過光照，微混合器中分子馬達儲能；
約37t:熱啟動後，分子馬達開始旋轉，通過攪拌作用，藥物快速與纖維蛋白結合，作用時間
大大縮短，溶栓依靠藥物的生化酶解及生物機械效應的協同作用，溶栓過程明顯加快。
B為對照組，為常規的藥物治療，在溶栓藥物的作用下，纖維蛋白降解為碎片，進入 溶液，血栓分解，溶栓效應僅僅依靠藥物被動擴散作用，藥物與纖維蛋白之間也是單一的生 化酶解效應，藥物與纖維蛋白之間接觸靠彌散作用，作用時間相對較長，效應單一 ；
圖4為納米生物機器人安裝剎車裝置； 利用生物素末端修飾的短的DNA互補雙鏈作為分子馬達的剎車裝置，DNA鏈通過 末端的生物素與分子馬達相連，而DNA雙鏈的結合與解聚兩種狀態對應分子馬達的制動與 去制動，設計、合成適當長度及GC含量的DNA雙鏈，實現在室溫狀態下分子馬達不啟動，到 達血栓部位後，通過局部原位光照儲能，能量儲存到一定程度足以克服DNA雙鏈的制動作 用，DNA雙鏈解開，啟動分子馬達旋轉，輔助藥物溶栓，從而達到降低溶栓藥物用量，加快血 栓溶解的目的。 (1)體外光照，儲存質子梯度。在冰上光照時，質子由脂囊泡外通過光合反應中心 進入囊泡內，形成質子勢能，配合低的環境溫度，低溫可以限制馬達的旋轉，可以實現脂囊 泡內質子勢能的儲存。 (2)納米生物機器人與特定部位的固定技術。納米生物機器人進入血栓局部，環境 溫度為37°C ，相鄰分子馬達螺旋槳上連接的DNA雙鏈呈互補結合狀態，限制了分子馬達的 旋轉，這種狀態(分子馬達不旋轉)有利於纖維蛋白抗體導引納米生物機器人與纖維蛋白 特異性結合。 (3)血栓局部原位短時間光照，質子驅動力大於DNA雙鏈結合力時，啟動納米生物 機器人旋轉。 圖5剎車裝置示意圖； 採用光照設備，在血栓對應的局部進行光照，適當增加血栓局部的脂囊泡內的質 子勢能，使其達到納米生物機器人啟動所需的質子驅動力，此時限制分子馬達旋轉的DNA
9雙鏈解鏈，納米生物機器人開始旋轉，在血栓局部，輔助溶栓藥物快速溶栓。
圖6剎車裝置解除前後的螢光變化圖； 對照組螢光強度無變化；光照30分鐘組，螢光強度依然無變化，顯示在此光照條 件下，剎車片處於制動狀態，無分子馬達的旋轉及其伴隨的質子的膜內外轉運；光照60分 鍾組，螢光強度明顯上升，顯示經過較長時間的光照儲能，能量已經足以克服剎車片的束 縛，納米機器人攜帶的分子馬達開始旋轉，質子由chromatophore膜內泵到膜外，膜內pH升 高，經過超聲標記及離心洗滌，F1300標記在膜內，膜內pH升高將引起對pH敏感的F1300的 螢光強度變化，螢光強度升高，表明分子馬達已啟動，開始旋轉。
圖7納米機器人剎車裝置解除前後的溶栓效果示意圖； 首先，採用DNA互補鏈使納米機器人的旋轉裝置處於制動狀態(處於剎車狀態)， 然後，實驗組採用冰上光照1小時，然後短時原位局部光照，儲存的質子勢能突破剎車的制 動作用，啟動納米機器人工作，加入低濃度溶栓藥物，觀察溶栓效果。對照組冰上光照30分 鍾，光照儲能不足以解除剎車裝置。結果可見剎車狀態解除組，血栓的溶解明顯加快。
圖8分子馬達與溶栓藥物協同作用加快溶栓的示意圖； 兔耳緣靜脈取血，24小時4°C自然凝血，取6mg栓體與20 y 1連接有血栓抗體的分 子馬達室溫反應60分鐘，塞入毛細玻璃管中，加入10iil，4500U/ml的蚓激酶，封閉毛細管 末端，對照組不光照，實驗組冰上光照60分鐘後，37t:反應6小時後觀察試驗結果。其中光 照組毛細管末端以綠色封閉，對照組毛細管末端以白色封閉，可見兩組初始狀態一致，反應 後光照組栓體溶解速度明顯快於對照組，柱體長度約為對照組的50% 。
圖9納米生物機器人進入血栓； 光照組毛細管末端以綠色封閉，對照組毛細管末端以白色封閉。毛細玻璃管中的 血栓在10iil，4500U/ml的頓激酶作用下，血細胞首先從血栓中游離出來(圖9A)，血細胞 在血栓中佔據的空間騰出來之後，納米機器人通過連接的血栓抗體，進入到血栓內部(圖 9B)，可見光照組血栓的顏色比對照組深，這是納米生物機器人進入血栓柱體所致。實驗在 毛細玻璃管中進行，體內實驗數據見圖13。
圖10納米生物機器人進入血栓的微觀圖像； 毛細玻璃管中的血栓在10iil，4500U/ml的蚓激酶作用下，血細胞首先從血栓中 游離出來(圖IOA)，血細胞在血栓中佔據的空間騰出來之後，納米機器人通過連接的血栓 抗體，進入到血栓內部(圖IOB)，加快溶栓藥物的溶栓作用。結果見圖10。
圖11納米生物機器人進入血栓的微觀圖像； 納米機器人用量子點進行螢光標記，在螢光顯微鏡下可見納米機器人通過連接的 血栓抗體，逐步進入到血栓內部。結果見圖ll。圖中螢光點為納米機器人。圖11與圖10 的區別在於圖11中對納米機器人進行了螢光標記。
圖12小鼠肺動脈栓塞模型示意圖； 小鼠眼球取血lml，注入1. 5ml的聚乙烯管中，置於冰箱中，4。C保存24h，形成血 栓，PBS洗滌後備用。臨用前用剪刀處理成小血栓，然後冰上超聲5分鐘，進一步將血栓破 碎，形成血栓混懸液。取2月齡BALB/c小鼠1隻，尾靜脈注射血栓混懸液250 iil ，構建小鼠 急性肺動脈栓塞模型(見圖12)。圖12A可見，肺組織中多處血栓栓塞；圖12B可見單個肺 動脈管腔中的血栓，血栓由箭頭指示。
10
圖13納米生物機器人對血栓耙向結合的體內試驗； 通過尾靜脈注射F1300標記的納米生物機器人溶液100 iU， 1小時後斷頸處死小鼠，冰凍切片觀察肺動脈栓塞情況，可見螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。結果見圖13(血栓由箭頭指示)。圖13A是可見光下的肺血管栓塞圖像，圖13B是螢光下的肺栓塞圖像，血栓沒有標記螢光，螢光物質F1300標記在納米生物機器人上，血栓部位呈現螢光圖像，而周圍血管及肺組織中未見螢光物質，說明納米生物機器人高度特異的靶向結合到血栓上。 圖14.螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。血栓形態為附壁血栓，管腔未全部堵塞，是一個血管橫切的圖像； 圖15.螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。血栓形態是一個血管縱切的圖像； 圖16.螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。血管橫切的圖像；
圖17.螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。將圖16對應血管經過共聚焦雙螢光成像掃描後構建的雙螢光疊加圖像；
圖18.動物體內血栓溶解實驗。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述，但不應理解為是對本發明進行限定。 本發明的目的是通過下面的技術方案實現的 1.分子馬達及光合作用的複合物(Chromatophores)製備 載色體(Chromatophores)的製備與中國專利申請號200410098929. 9相同。具體地，培養光合作用細菌(R.C即sulatus I 20，(保藏號1.2359)，商購於中科院微生物所細胞庫)。培養基KH2P04， 1. 0g， MgCl20. 5g， CaCl2，0. lg， NaCl 1. 0g，醋酸鈉1. 0g，琥珀酸鈉lg，酵母膏，1. 0g，NaHC030 . 5g，蛋白腖0. 5g(0X0ID英國)，微量元素1. 0ml，維生素液1. 0ml，蒸餾水1.0L，pH 6.8，8磅，高壓滅菌30分鐘。維生素液成分生物素0. lg(進口分裝)，煙酸0. 35g，煙酸硫胺素(Thiamine dichloride) 0. 3g，泛酸牽丐(Ca-panthothenate) 0. lg，維生素B^ (Vitamin B12， 0. 05g，鹽酸吡多胺(Pyridoxolium Hydrochloride, Fluka) 0. lg，蒸餾水1. 0L ;微量元素成分FeCl2 4H20 1. 8g ;CoCl2 6H20 0. 25g ;NiCl2 6H20，0. Olg ;CuCl2 2H20 0. 01g， MnCl2 4H20 0. 07g ;ZnCl20. lg， B3P040. 5g， Na2Se035H20 0. 01g，NaMo04 H20 0. 03g，蒸餾水1. 0L)溫度30_35°C。收穫細菌的培養溫度為28。C，在光照(4，000Lx)下培養5-7天，5000g離心收集。載色體(Chromatophores)的提取樣品用TS緩衝液(50mM，Tricine(三(羥甲基)甲基甘氨酸，Amresco進口分裝)pH 8. O，O. 25M蔗糖；5mM MgCl2)洗滌一次，然後再加入15ml的TS緩衝液，懸浮後，加入lmg/ml的溶菌酶(Sigma分裝)，在冰中孵育30分鐘，超聲(20X振幅，Cole Parmer CPX600超聲儀13#探頭)10分鐘，25， OOOg離心30分鐘，保留上清，再將上清180， OOOg在fC離心90分鐘，沉澱為載色體(Chromatophores)。此複合物為含一個分子馬達F。F「ATPase，多個光轉換載體。
2.納米生物機器人的組裝 Q)60ii 1，0. 5ii g/ii 1的分子馬達與0. 5ii 1，5. 5mM的lipid-biotin(Avanti公司，貨號870285， 1-油醯-2- (12-生物素基(氨基十二烷醯))-sn-甘油_3_磷酸乙醇胺，l_01eoyl_2_(12-biotinyl(aminododecanoyl))_sn_Glycero_3_Phosphoethanolamine)在4。C連接，連接方式為lipid—biotin與月旨囊泡chromatophore相連[Biochem. Biophys. Res.Co匪n. 2006,350(4) :370-374.]，連接25分鐘；然後加入95ii 1，29iiM的avidin，室溫連接5分鐘，形成(分子馬達-lipid-biotin-avidin)，備用; (2)50iU，17iiM的纖維蛋白原多抗[製備方法參見首都醫科大學學報，1998，19(1) :63-64]，與4. 25iil，lmM N-biotin (Fluka公司，貨號14405)室溫連接(生物素通過噻吩環戊酸側鏈上的羧基與蛋白共價結合)[參見復旦學報(自然科學版)，2003，42(6) :1020-1024]， 60分鐘，形成(N-biotin-纖維蛋白原多抗)，備用;
(3)50iil，350iig/ml的納米蛋白粒子(所用納米蛋白粒子為SV40主要衣殼蛋白VPl(胺基酸序列的GenBank Accession no. AF316139. 1)，重組VPl通過其N末端融合的組氨酸標籤(histag)被純化。攜帶質粒pET32a-hisVPl的大腸桿菌表達菌株在500mL LB培養基中37。C長至0D6。。約0. 6，加入ImM的IPTG並轉入25。C繼續培養9h。
pET32a-hisVPl質粒的詳細構建過程如下 SV40VP1基因(GenBankAccession no. AF316139. 1)片段以SV40基因組為模板，以5' TACTTCTGCTCTAAAGATCTATGAAG(P1)和5' ACAACTCGAGCAATAGCATCACAAA(P2)為引物擴增獲得，BglII-XhoI雙酶切後插入載體pQE30 (Qiagen)的BamHI-SalI位點，從而獲得載體pQEVPl 。然後以pQEVPl為模板，以5' GAAATTACATATGAGAGGATCGC (P3)禾P P2為弓|物擴增獲得5'端融合了 histag的VP1編碼序列，該片段經Ndel-Xhol雙酶切後，與Ndel-Xhol完全酶切的pET32a(+) (Novagen，美國)載體片段連接，獲得載體pET32hisVPl，用於VPl的表達。 將菌體離心收集並重懸於40mL緩衝液B(25mM Tris-HCl pH 7.8，500mM NaCl，5mM imidazole,和5% glycerol)中超聲破碎。菌體殘渣通過12000rpm離心30min除去。將上清上樣至鎳親和層析柱；再先後用含有40mM和80mM咪唑(imidazole)的緩衝液B洗柱；最後用含500mM咪唑的緩衝液B將VPl洗脫。所得VP1對緩衝液D(10mM Tris-HClpH8.8，200mM NaCl，2mM EDTA，30mM P-mercaptoethanol ，禾口 5% glycerol)透析20h，然後在4°C 55， OOOrpm離心lh，取上清即得解聚狀態的VP1。蛋白濃度用考馬斯亮藍G250染色法測定。製備好的納米顆粒保存於4°C 。粒徑為23nm)，與85 yl， 100 y M的N-biotin室溫連接(生物素通過噻吩環戊酸側鏈上的羧基與蛋白共價結合)60分鐘，形成(N-biotin-納米蛋白粒子)，備用； (4)50iil，17iiM的分子馬達P亞基多抗，與4. 25iil，lmM N-biotin室溫連接(生物素通過噻吩環戊酸側鏈上的羧基與蛋白共價結合)60分鐘，形成(N-biotin-P亞基多抗)，然後加入147iU，29iiM的avidin，室溫連接5分鐘，形成(P亞基多抗_N_biotin_avidin)，備用； (5)取20 ii 1的(分子馬達-lipid-biotin-avidin)，與4. 4 ii 1 (N-biotin-纖維蛋白原多抗)室溫連接5分鐘，形成(分子馬達-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纖維蛋白原多抗)； (6)取48iil(P亞基多抗-N-biotin-avidin)，與10 ii 1 (N-biotin-納米蛋白粒子)室溫連接5分鐘，形成(P亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白粒子);
(7)取17ii 1，29iiM的avidin，與100ii 1， 10 ii M的biotin-DNAl，室溫連接5分鐘，
形成(avidin—biotin—DNAl);然後力口入5u l(P亞基多抗一N—biotin—avidin—N—biotin—糹內
米蛋白粒子)，室溫反應5分鐘，形成(13亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白
粒子_N_biotin_avidin_biotin_DNAl); DNA1的鹼基序列為(21bp): 5' —3' :biotin-ATTCGTAATCGTTTAAAGATC 其中DNA1序列與biotin的連接為北京奧科生物公司完成。 DNA1序列與biotin的連接方法為 1.將0. 1 ii mol氨基修飾核苷酸溶於0. 7ml無菌蒸餾水中。
2.加入0. lml的1. 0M NaHC03/Na2C03緩衝液，pH值為9. 0。 3.將10mg/ml的酯類試劑Biotin-X-NHS-Ester溶液溶於二甲基甲醯氨中。取配好的此溶液0. 2ml加入反應混合物中。
4.室溫放置2小時。 5.用反相HPLC法純化生物素化寡核苷酸。 該DNA序列與下述的DNA2序列的一側序列為互補序列，按照設計要求，兩者達到互補的要求即可，序列可以替代，DNA長度可根據設計要求進行調整，長度非嚴格限定。
(8)取24.4ul(分子馬達_lipid_biotin_avidin_N_biotin_纖維蛋白原多抗)，與29. 3iil(P亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNAl)室溫反應60分鐘，形成(纖維蛋白原多抗-N-biotin-avidin-lipid-biotin-分子馬達-P亞基多抗一N—biotin—avidin—N—biotin—糹內米蛋白粒子_N_biotin_avidin_biotin_DNAl);然後力口入13iU，10iiM的DNA2，室溫反應2h，完成分子馬達剎車片的安裝。
DNA2的鹼基序列為 5' -TAAgCATTAgCAAATTTCTAgACTACATCgTCATAgTAgATCTTTAAACgATTACgAAT-3'
DNA2序列的設計原理為序列的兩側為對稱序列，且5'和3'端的序列分別與DNA1互補，其長度按照設計要求，可以進行相應調整。
本發明的分子馬達應用於方法包括以下步驟 (1)旋轉馬達的重組對F。F「ATP酶進行結構改造，得到去S的F。F「ATP酶；
(2)血栓抗體與分子馬達進行連接；
(3)完成旋轉馬達的剎車片安裝。
實施例l納米機器人的組裝 在剎車裝置制動有效性的觀測指標方面，採用pH敏感的螢光物質F1300標記脂囊泡(chromatophore，帶有分子馬達)，當剎車裝置起作用時，分子馬達不能旋轉，膜內外無質子流動，那麼膜內外無pH變化，螢光強度不出現變化；當光照儲能達到一定程度時，分子馬達開始旋轉，掙脫了DNA雙鏈的束縛，剎車裝置被解除，質子由膜內泵到膜外，引起膜上標記的F1300螢光的變化，從而驗證短鏈DNA互補雙鏈作為剎車裝置的有效性。以下組裝的詳細過程，除非另外指出或明顯不符，與以上在具體實施方式
中所述相同。
1.F1300標記載色體(chromatophore) 60iil，0. 5ii g/iU載色體(chromatophore)(帶有分子馬達的脂囊泡)，加入0. ImM 540ii 1的Tricine(三(羥甲基)甲基甘氨酸，Amresco進口分裝)(pH = 8. 0)，充分混勻，加入liil，lmg/ml的F1300(螢光探針，購自美國Molecular Probes公司，產品名:fluorescein reference standard,產品編號F1300)，冰水中超聲5分鐘，15， OOOrpm， 30分鐘，洗兩遍，去掉游離的F1300，重懸於60iil，0. ImM的Tricine(pH = 6. 5)，備用。
2.納米機器人安裝DNA雙鏈剎車片 (l)60iil，0. 5ii g/iil的F1300標記的chromatophore(帶有分子馬達的脂囊泡)與O. 5ii 1，5. 5mM的lipid-biotin在4。C連接25分鐘;然後加入95ii 1， 29 ii M的avidin，室溫連接5分鐘，形成(分子馬達-lipid-biotin-avidin)，備用； (2)50iil，17iiM的纖維蛋白原多抗，與4. 25iil，lmM N-biotin室溫連接60分鐘，形成(N-biotin-纖維蛋白原多抗)，備用； (3) 50 iil， 350 ii g/ml的納米蛋白粒子(粒徑為23nm)，與85 yl， 100 y M的N-biotin室溫連接60分鐘，形成(N-biotin-納米蛋白粒子)，備用；
(4)50iil，17iiM的分子馬達P亞基多抗，與4. 25iU， lmM N-biotin室溫連接60分鐘，形成(N-biotin-P亞基多抗)，然後加入147iil，29iiM的avidin，室溫連接5分鐘，形成(P亞基多抗-N-biotin-avidin)，備用; (5)取20iil的(分子馬達-lipid-biotin-avidin)，與4. 4ii l(N-biotin-纖維蛋白原多抗)室溫連接5分鐘，形成(分子馬達-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纖維蛋白原多抗)； (6)取48iil(P亞基多抗-N-biotin-avidin)，與10ii l(N-biotin-納米蛋白粒子)室溫連接5分鐘，形成(P亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白粒子);
(7)取17ii 1，29iiM的avidin，與100ii 1， 10 ii M的biotin-DNAl，室溫連接5分鐘，形成(avidin—biotin—DNAl);然後力口入5u l(P亞基多抗一N—biotin—avidin—N—biotin—糹內米蛋白粒子)，室溫反應5分鐘，形成(13亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白粒子_N_biotin_avidin_biotin_DNAl);
DNA1的鹼基序列為(21bp):
5' —3' :biotin-ATTCGTAATCGTTTAAAGATC (8)取24.4ul(分子馬達_lipid_biotin_avidin_N_biotin_纖維蛋白原多抗)，與29. 3iil(P亞基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-納米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNAl)室溫反應60分鐘，形成(纖維蛋白原多抗-N-biotin-avidin-lipid-biotin-分子馬達-P亞基多抗一N—biotin—avidin—N—biotin—糹內米蛋白粒子一N—biotin—avidin—biotin—DNAl);然後力口入13iU，10iiM的DNA2，室溫反應2h，完成分子馬達剎車片的安裝。
DNA2的鹼基序列為 3.剎車片打開後，螢光變化的觀察 螢光變化的觀察在螢光顯微鏡下進行(Olympus 1X71，日本)，螢光圖像信號的記錄由低溫數字高速照相機完成(iXon CCD，ANDORTechnology，英國)。 結果可見，對照組螢光強度無變化；光照30分鐘組，螢光強度依然無變化，顯示在此光照條件下，剎車片處於制動狀態，無分子馬達的旋轉及其伴隨的質子的膜內外轉運；光
14照60分鐘組，螢光強度明顯上升，顯示經過較長時間的光照儲能，能量已經足以克服剎車片的束縛，納米機器人攜帶的分子馬達開始旋轉，質子由chromatophore膜內泵到膜外，膜內pH升高，經過超聲標記及離心洗滌，F1300標記在膜內，膜內pH升高將引起對pH敏感的F1300的螢光強度變化，螢光強度變化方向為升高。結果見附圖6。 實施例2納米生物機器人在DNA雙鏈剎車裝置的結合與解開狀態下的溶栓效果。
纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉變成纖維蛋白，纖維蛋白是血栓的主要成分，血栓的形成過程是纖維蛋白首先形成網狀結構，結合血細胞，構成血栓。
1.纖維蛋白原的FITC螢光標記和纖維蛋白的形成 纖維蛋白原(10mg/ml， 0. 03mM，購自Sigma公司，商品目錄號F8630，美國)溶於PBS緩衝溶液中(137mM NaCl，3mM KCl，8mM Na2HP04， lmMKH2P04， pH 8. 5)，力口入FITC (Fluorescein isothiocyanate，終濃度為50mg/ml，購自Molecular Probes公司，美國)，振蕩混勻，置搖床上慢速混勻反應l小時。轉入透析袋中，以PBS為透析液，將未標記上的FITC透析乾淨。取FITC標記的纖維蛋白原500 ill (lOmg/ml)，加入凝血酶250U(0. 5unit/iil，購自Sigma公司，美國)，37。C孵育30分鐘，得到纖維蛋白沉澱。
2.取纖維蛋白lmg，與3. 3iU上述實施例製備的連接有血栓抗體的，帶有DNA剎車裝置的分子馬達室溫反應60分鐘，置入毛細玻璃管中，加入10iU，4500U/ml的蚓激酶(北京百奧藥業有限責任公司，溶栓藥)，封閉毛細管末端。對照組冰上光照30分鐘，實驗組冰上光照60分鐘後(對照組僅光照30分鐘，30分鐘和60分鐘是根據光能轉換效率及DNA雙鏈的結合力確定的)在加溫設備4(TC環境中啟動納米機器人旋轉，螢光顯微鏡下間隔IO分鐘進行拍照觀測。結果見附圖6，可見實驗組光照時間長，質子勢能儲備多，在4(TC時打開了DNA雙鏈的剎車裝置，啟動了分子馬達旋轉，加快了溶栓作用，圖中可見螢光標記的纖維蛋白溶解。而對照組光照時間短，儲備的質子勢能不足以打開DNA雙鏈剎車裝置對納米機器人的制動，因此溶栓效果明顯不如實驗組。結果見附圖7-8 (附圖7為螢光下觀測結果，附圖8為可見光下觀測結果，附圖中由箭頭標出血栓)。圖中可直接觀察到血栓溶解的情況。 實施例3兔血栓溶解實驗 兔耳緣靜脈取血，24小時4t:自然凝血，取6mg栓體(該栓體為血液自然凝血而成，其主要成分為纖維蛋白，除纖維蛋白之外，還包括了血細胞)，與20iU上述實施例製備的連接有血栓抗體的分子馬達室溫反應60分鐘，塞入毛細玻璃管中，加入10iil，4500U/ml的蚓激酶，封閉毛細管末端，對照組不光照，實驗組冰上光照60分鐘後，37t:反應6小時後觀察試驗結果，其中光照組以綠色封泥封閉，對照組以白色封泥封閉，可見兩組初始狀態一致，反應後光照組栓體溶解速度明顯快於對照組，柱體長度約為對照組的50% 。結果見附圖9。 實施例4螢光標記兔血栓溶解實驗 毛細玻璃管中的血栓在10iil，4500U/ml的蚓激酶作用下，血細胞首先從血栓中游離出來(圖IOA)，血細胞在血栓中佔據的空間騰出來之後，納米機器人通過連接的血栓抗體，進入到血栓內部(圖IOB)，加快溶栓藥物的溶栓作用。結果見附圖10。
上述實施例製備的納米機器人用量子點進行螢光標記[參見Anal.Biochem. 2007,364(2) :122-127]，在螢光顯微鏡下可見納米機器人通過連接的血栓抗體，
15逐步進入到血栓內部。結果見附圖ll。圖中螢光點為納米機器人。實施例4與實施例3的區別在於實施例4中對納米機器人進行了螢光標記。 實施例5動物體內納米機器人與血栓的靶向結合實驗(單螢光標記)
小鼠眼球取血O. 5ml，注入1.5ml的聚乙烯管中，置於冰箱中，4。C保存24h，形成血栓，無菌生理鹽水洗滌後備用。臨用前用剪刀處理成小血栓，加入1ml生理鹽水，然後冰上超聲5分鐘，進一步破碎形成血栓混懸液。取2月齡BALB/c小鼠1隻，尾靜脈注射血栓混懸液250iU，構建小鼠急性肺動脈栓塞模型(見圖12)。圖12A可見(血栓由箭頭指示)，肺組織中多處血栓栓塞；圖12B可見單個肺動脈管腔中的血栓。 通過尾靜脈注射F1300標記的上述實施例製備的納米生物機器人溶液100 iU， 1小時後斷頸處死小鼠，冰凍切片觀察肺動脈栓塞情況，可見螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。結果見圖13。圖13A是可見光下的肺血管栓塞圖像，圖13B是螢光下的肺栓塞圖像(血栓由箭頭指示)，血栓沒有標記螢光，螢光物質F1300標記在納米生物機器人上，血栓部位呈現螢光圖像，而周圍血管及肺組織中未見螢光物質，說明納米生物機器人高度特異的靶向結合到血栓上。 實施例6動物體內納米機器人與血栓的靶向結合實驗(雙螢光標記)取1. 5ml的聚乙烯管1支，加入0. lml FITC標記的纖維蛋白原(10mg/ml)[製備
參見Biochem. Biophys. Res. Co匪n. 2008,377(1) : 191-194]，小鼠眼球取血0. 5ml，注入聚
乙烯管中，充分混勻，避光4t:保存24h，形成FITC標記的血栓，無菌生理鹽水洗滌後備用。
臨用前用剪刀處理成小血栓，加入lml無菌生理鹽水，然後冰上超聲5分鐘，進一步破碎形
成血栓混懸液。取2月齡BALB/c小鼠1隻，尾靜脈注射血栓混懸液250 iU，構建小鼠急性
肺動脈栓塞模型。 通過尾靜脈注射580nm的量子點[參見J. Phys. Chem. B. 2007， 111 (41):12024-12031.]標記的上述實施例製備的納米生物機器人溶液lOOiU，l小時後斷頸處死小鼠，冰凍切片觀察肺動脈栓塞情況，可見螢光標記的納米生物機器人與血栓的靶向結合。結果見圖14-圖17。圖14中的血栓形態為附壁血栓，管腔未全部堵塞，是一個血管橫切的圖像。圖15中的血栓形態是一個血管縱切的圖像。圖16是一個血管橫切的圖像。圖14A-圖16A是可見光下的肺血管栓塞圖像，圖14B-圖16B是520nm螢光下的圖像，圖14C-圖16C是580nm螢光下的圖像。圖17是圖16對應血管經過共聚焦雙螢光成像掃描後構建的雙螢光疊加圖像。血栓標記的螢光物質為FITC，呈現為綠光，分子馬達標記的螢光物質為580nm的量子點，呈現為紅色。血栓部位在不同波長(520nm和580nm)的螢光下，分別呈現綠色和紅色螢光圖像，而周圍血管及肺組織中未見螢光物質，說明納米生物機器人高度特異的靶向結合到血栓上。圖17中清晰可見纖維狀的纖維蛋白發出的綠色螢光附在血管壁上，指示出血栓的位置，而分子馬達攜帶的量子點紅色螢光與纖維狀的血栓綠色螢光交織在一起，充分說明了納米生物機器人與血栓的高度特異性結合，體現了靶向性。
實施例7動物體內血栓溶解實驗 取1.5ml的聚乙烯管l支，加入0. lml FITC標記的纖維蛋白原(10mg/ml)，小鼠眼球取血0. 5ml，注入聚乙烯管中，充分混勻，避光4t:保存24h，形成FITC標記的血栓，無菌生理鹽水洗滌後備用。臨用前用剪刀處理成小血栓，加入lml無菌生理鹽水，然後冰上超聲5分鐘，進一步破碎形成血栓混懸液。取2月齡BALB/c小鼠9隻，每隻尾靜脈注射血栓混懸液250 ，構建小鼠急性肺動脈栓塞模型。 取以上實施例製備的納米生物機器人分成3組，每組3個樣本，每個樣本取100 ill ，共900 ill 。第1組冰上光照60分鐘，第2組冰上光照45分鐘，第3組不光照。通過尾靜脈注射，將納米生物機器人分別注入上述9隻形成了急性肺動脈栓塞的小鼠體內，每隻注射100 iU。隨後，每隻小鼠注入尿激酶(Sigma) 5U。 設置6個時間點，分別為注射後0分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘，150分鐘，在每個時間點取血10iil，取血方式為眼眶取血。血取出後置於已預先放入100 iU，0. 04%的Na2EDTA的印管中，避光保存。4。C，4000g離心30分鐘除去血細胞，採用微螢光測定儀[參見J.Phys.Chem.B. 2007,111(41) :12024-12031.]對小鼠各個時間點的血漿螢光值進行測定，結果見圖18。 由圖18可見，分子馬達輔助藥物溶栓組中小鼠血液中的螢光強度值高峰前移，與單純藥物溶栓組比較，螢光強度高峰前移30分鐘，說明分子馬達促進了溶栓藥物的作用，加速了血栓溶解，而血栓的快速溶解具有重要的臨床治療意義。(注數據進行了歸一化處理，樣本例數N = 3)。
權利要求
一種納米生物機器人，其包括載色體，該載色體上含有分子馬達F0F1-ATPase，其中所述F0F1-ATPase不含δ亞基，並且所述F0F1-ATPase的α或β亞基上連接有納米蛋白粒子。
2. 根據權利要求1的納米生物機器人，其中所述a或|3亞基是經由抗a或|3亞基 抗體與所述納米蛋白粒子連接，其中所述抗a或P亞基抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
3. 根據權利要求2的納米生物機器人，其中所述抗a或|3亞基抗體是通過生物素-鏈 酶抗生物素_生物素與所述納米蛋白粒子連接。
4. 根據權利要求1的納米生物機器人，其中所述納米蛋白粒子的粒徑在10nm至100nm 範圍內，優選在20nm至50nm範圍內。
5. 根據權利要求1的納米生物機器人，其中所述納米蛋白粒子進一步與一個DNA片段 連接。
6. 根據權利要求l的納米生物機器人，其中所述納米蛋白粒子進一步與一個DNA片段 連接，所述DNA片段與另一個DNA片段結合，所述另一個DNA片段的5'和3'端的序列分別 與所述納米蛋白粒子上的所述DNA片段互補。
7. 根據權利要求l的納米生物機器人，其中所述載色體進一步與導向分子連接。
8. 根據權利要求7的納米生物機器人，其中所述導向分子是抗體或核酸，優選所述導 向分子是纖維蛋白原抗體，該纖維蛋白原抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
9. 根據權利要求8的納米生物機器人，其中所述纖維蛋白原抗體是纖維蛋白原多抗， 並且通過生物素_鏈酶抗生物素_連接脂質的生物素與所述載色體連接。
10. 根據權利要求l-9任一項所述的納米生物機器人在製備輔助藥物中的應用，所述 輔助藥物用於促進活性藥物在目標區域的擴散。
全文摘要
本發明從納米生物機器人的角度，構建分子馬達驅動的，以血栓抗體為導向的輔助快速溶栓的納米機器人，通過分子馬達在血栓局部的快速旋轉，產生類似於微動力攪拌器的效應，並採用光碟機動分子馬達，實現納米生物機器人的可調控性，加快藥物與纖維蛋白的接觸，實現納米生物機器人的生物機械力學效應與藥物酶解作用的協同，加速纖維蛋白溶解。
文檔編號A61K9/00GK101744645SQ20081024036
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者樂加昌, 張先恩, 李峰, 陶寧 申請人:中國科學院生物物理研究所;中國科學院武漢病毒研究所