肥胖症的治療的製作方法

2023-08-10 09:23:21

專利名稱：肥胖症的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物肥胖症的治療。儘管，應理解的是本發明還擴展到非人哺乳動物肥胖症的治療，例如，用於改善食物生產中所用的農業動物的肉類質量，本發明特別地涉及人肥胖症的治療。
背景技術：
已充分認識到人生長激素(hGH)在人出生後生長中的重要作用。由於缺乏詳細的分子研究，這種激素對脂類和糖類代謝的調節的影響不太清楚。
充分證實的是hGH的主要形式是分子量為22,000道爾頓(22-KD)的球狀蛋白質，為由191個胺基酸殘基組成的單鏈，通過2個二硫鍵以羧基端殘基182和189之間的小環摺疊。最近，晶體學研究也表明hGH分子含有左手螺旋狀的、緊密排列的螺旋束中的4個反平行的α-螺旋1。一般認為，在hGH分子中存在負責激素的特異代謝作用的不連續功能結構域這樣的概念。已證明氨基端是負責hGH分子的胰島素樣作用的功能結構域2，3。
重組DNA技術為人生長激素的大規模商業生產打通了道路，而且重組的hGH表現出具有等同的生物學效能和藥物代謝動力學特徵4，5。目前這種多功能激素的供應不再限制人和動物中實驗性治療的類型和數目。已確定hGH用於治療兒童和成年人身材矮小的用途6。也已報導了hGH在女性不孕中的治療效果7，8。用hGH治療人肥胖症遇到多種問題。證據表明，此多功能激素經常通過分子中的多種生物活性結構域在體內發揮副作用9，10。
GH調節脂類代謝由Raben和Hollenberg於1959年首次描述11。激素在脂類代謝中的調節作用隨後得到用GH-缺乏的和GH-治療的人12， 13和豬的身體組合物研究支持14，15。Gertner的發現提示，hGH通過一系列已知的「GH-脂肪循環」的相互作用與脂肪組織分布相關。然而，揭示這些生物化學和生理學變化的分子事件大部分不清楚。體內GH對於脂肪和其它組織的代謝作用是多種多樣且複雜的，表面上包括至少兩部分，早期的胰島素樣效應，隨後是晚些的更顯著的抗胰島素效應17。後一效應的結果可包括脂解的刺激作用和脂肪生成的抑制作用。hGH的抗脂肪生成效應已由脂肪細胞中葡萄糖轉運蛋白GLUT4表達下降18、脂肪組織中乙醯-CoA羧化酶活性抑制19，20、和分離的細胞和組織中葡萄糖摻入脂類減少21，22的證據所證實。
鑑於完整hGH的多功能作用和完整激素在臨床應用中遇到的問題，已進行了導致本發明的工作來研究是否能合成保留所需的生物活性而缺少不需要的副作用的hGH衍生物。
用合成的激素片段進行的結構-功能研究已揭示，hGH分子的羧基末端似乎為用於脂類代謝調節的激素的功能結構域20，23，而且已表明具有基於羧基端區域序列的合成肽降低了實驗室肥胖動物模型的體重增加和脂肪組織量。
1994年11月15日的美國專利申請系列號08/340389的全部內容，包括說明書、權利要求書和附圖，在此全文引用作為參考。
發明概述本發明提供了一種包括生長激素的羧基端序列類似物的肽。此肽可包括人生長激素或非人哺乳動物種的生長激素的羧基端序列的類似物。如上述的，生長激素的羧基端序列含有生物活性脂類代謝結構域。在本發明的一個實施方案中，此肽包括含有胺基酸殘基177-191的人生長激素的羧基端序列的類似物，或者非人哺乳動物生長激素的相應序列的類似物。類似物可通過對人生長激素(或非人哺乳動物種的生長激素)的天然羧基端序列進行胺基酸插入、刪除或替代或者化學修飾而獲得。
另一方面，本發明提供用於治療肥胖症的方法，包括給予病人有效量的如上面所述的含有生長激素的羧基端序列類似物的肽。此治療可施用於任何動物，包括人。
本發明還提供用於治療肥胖症的藥物組合物，其包含有效量的上述生長激素的羧基端序列類似物的肽，以及一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。
又一方面，本發明提供含有如上述生長激素羧基端序列類似物的肽的用途，其用於動物肥胖症治療的藥物組合物的生產。優選的實施方案描述根據本發明的一方面，在此提供用於治療動物肥胖症的方法，包括給予動物有效量的含有生長激素羧基端序列類似物的肽。
儘管本發明也擴展到非人哺乳動物的治療，優選地，動物是人。還優選地，此肽包括含有胺基酸殘基177-191的人生長激素的(下文中稱為hGH 177-191)羧基端序列類似物。另外，此肽可包括其它非人哺乳動物種的生長激素，如牛、豬、羊、馬、貓或犬生長激素的羧基端序列類似物，相當於hGH 177-191肽。
如整個說明書中所用的，術語「肥胖症」用於包括動物體重過度和脂肪組織量過度，並且相應地，述及的肥胖症的治療包括肥胖動物體重增加的下降和脂肪組織量的降低。
任何肥胖症治療的期望結果是體重、尤其是身體脂肪組織量的下降。身體脂肪組織量的下降直接受兩種生物化學過程-脂肪生成(脂肪產生)和脂解(脂肪減少)調節，並且一般理解，這些生物化學過程由關鍵的代謝酶，特別是脂肪減少關鍵酶(激素敏感脂酶)和脂肪產生關鍵酶(乙醯-CoA羧化酶)調控。
本發明人已證明hGH 177-191對於刺激脂肪減少關鍵酶、激素敏感脂酶和抑制脂肪產生關鍵酶乙醯-CoA羧化酶有效。這進一步得到根據體外和體內代謝終產物所測定的結果的支持，其表明在hGH 177-191存在情況下，脂肪利用加速而脂肪產生減少。另外，已經明確了這些分子相互作用的機制是細胞第二信使二醯甘油產生活化的結果。
當然，應知曉本發明擴展到比生長激素特定序列177-191更長的胺基酸序列類似物的應用，例如人生長激素序列172-191或者其它非人哺乳動物種的生長激素的相應序列的類似物。
生物科學中已熟知種間胺基酸序列相符合的概念，並且通過對比可相比的序列(包括如果必需的理論缺失)來匹配同功或同構胺基酸，從而使同源性最大化。下面應用標準單個字母符號將公開的所選哺乳動物的生長激素的C末端區域的相應序列製成表格26。
GH種 序列位置 170180190人 FRKDMDKVETFLRIVQCR.SVEGSCGF人的變體FRKDMDKVETFLRIVQCR.SVEGSCGF人CSFRKDMDKVETFLRMVQCR.SVEGSCGF猴子，獼猴 FRKDMDKIETFLRIVQCR.SVEGSCGF大鼠FKKDLHKAETYLRVMKCRRFAESSCAF小鼠FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF倉鼠FKKDLHKAEIYLRVMKCRRFVESSCAF鯨，鰭 FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF鯨，sei FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF狐狸、狗、貓FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF水貂FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF牛 FRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF綿羊FRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF山羊FRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF豬 FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF羊駝FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF馬 FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF大象FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF祖先哺乳動物FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF本發明擴展到天然的人生長激素或其它動物種的生長激素的羧基端序列類似物的肽的用途，以及來自天然或合成(包括重組的)來源的肽的用途，只要得到的肽保留了此處描述的天然羧基端序列的生物學活性，即減少肥胖動物的體重增加和脂肪組織量的能力。尤其是，這些類似物可表現出可能由二硫鍵導致的環狀構型。
本發明的類似物可來自天然羧基端序列中的胺基酸延伸、插入、刪除或置換，或者其化學修飾，或者在其胺基酸側鏈之間導入環醯胺鍵。胺基酸插入類似物包括氨基端和/或羧基端融合，以及單個或多個(例如最多10個，優選地最多5個)胺基酸的序列內插入。儘管對所得產物合適的篩選也可能隨機插入，但是插入的胺基酸序列類似物是其中一個或多個胺基酸殘基導入蛋白質的預定位點的那些。刪除類似物的特徵是一個或多個(例如最多5個、優選最多3個)胺基酸從序列去除。置換胺基酸類似物是那些序列中至少一個胺基酸殘基、優選一個或兩個被二十個基本蛋白質胺基酸中的另外一個或者一個非蛋白胺基酸所取代的。天然羧基端序列的化學修飾包括氨基末端乙醯化，和/或羧基末端醯胺化，和/或天然羧基端序列的側鏈環化。
可期望特殊地保留了與天然羧基端序列相同的構象、結構和帶電特徵的人生長激素(或其它動物種的生長激素)的天然羧基端序列類似物表現出與天然序列相同的或相似的生物學活性，尤其是減少肥胖動物的體重增加和脂肪組織量的能力。
儘管下文的詳細描述具體涉及hGH 177-191的類似物，要理解的是本發明擴展到如上述的非人哺乳動物生長激素的相應肽的相似類似物。
含有天然的人生長激素的胺基酸殘基177-191的肽(hGH 177-191)包括下面的序列(Ref No.9401)Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe(SEQ ID NO1)這種天然肽可是環狀二硫醚(disulfide)形式，並且可包括其有機或無機酸加成鹽。
hGH 177-191肽類似物可通過在沿著天然序列的任意位置刪除或插入一個或多個胺基酸殘基，並保留如上述的抗肥胖症特性而獲得。優選地，類似物是環狀構型。
另外，hGH 177-191肽類似物可通過在沿著天然序列的任意位置置換一個或多個胺基酸殘基而獲得。
採用丙氨酸置換掃描和此處報導的其它方法的體外和體內活性篩選，揭示了在如上述的生物活性中重要的hGH 177-191中胺基酸之間的位置和關係。本發明的優選類似物包括hGH 177-191的肽類似物，其中(i)位於hGH的位置182和189的胺基酸通過鍵連接以促成環狀構象；和/或(ii)位於hGH的位置183和186的胺基酸通過成鹽(salt bridge)或共價鍵連接。
hGH的182和189胺基酸之間的鍵可以是二硫鍵，這種情況時hGH位置182和189的胺基酸可優選地是L-或D-Cys或Pen。
當在hGH位置183和186的胺基酸通過成鹽連接時，這些胺基酸可優選地分別是(X和Y)或(Y和X)，其中X是帶正電荷的胺基酸如L-或D-Arg、Lys或Orn，和Y是帶負電荷的胺基酸如L-或D-Asp或Glu。
當位於hGH位置183和186的胺基酸通過共價鍵連接時，該鍵可以是醯胺鍵，在這種情況時這些胺基酸可分別優選地是(X和Y)或者(Y和X)，其中X選自L-或D-Lys和Orn，和Y選自L-或D-Asp和Glu。
在hGH位置178的胺基酸優選帶正電荷的胺基酸，如L-或D-Arg、Lys或Orn。
類似物也可通過在胺基酸殘基的一端或兩端延伸天然hGH 177-191肽序列來獲得，例如用一個或多個親水胺基酸來增加在水溶液中的溶解度。這些類似物包括下列序列，優選環狀二硫醚形式X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n(SEQ ID NO2)其中X1和X2各自選自L-或D-Arg、His和Lys，而且m和n各自是0、1、2或3，前提是至少m或n是1。[在整個說明書中，下劃線的元素表示與天然的hGH 177-191序列不同，並且除非另有說明，在相當於182和189位置的胺基酸通過二硫鍵連接]。
一種不是用親水胺基酸延伸的但是卻表現出特殊的增強的抗肥胖症特性的延伸類似物如下(Ref No.9604)Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe.
(SEQ ID NO19)類似物也可通過天然hGH 177-191肽序列的化學修飾獲得。這些類似物包括序列Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe(SEQ ID NO3)其中Y1選自脫氨(desamino)形式(H)、乙醯基(CH3CO-)和其它醯基基團；或序列Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2(SEQ ID NO4)其中Y2選自-CONH2和烷醯胺基團。
通過天然hGH 177-191肽序列的胺基酸置換、延伸或化學修飾或者將環醯胺鍵導入胺基酸側鏈之間獲得的特異的hGH 177-191類似物如下，其表現出抗肥胖症特性Ref No. 結構 SEQ ID NO9502 Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe 159405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 89410H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 129404 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH279407 Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 10
9604 Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 199605 Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 209618 Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 339607 Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 229606 Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 219608 Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 239403 Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 69609 Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 249610 Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 259612 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 279613 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe 289615 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe 309616 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe 319602 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe 179501 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe 149601 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala 16其中所用的胺基酸殘基縮寫符合標準的肽命名Gly＝甘氨酸； Ile＝異亮氨酸；Glu＝穀氨酸； Phe＝苯丙氨酸；Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；Gln＝穀氨醯胺；Leu＝亮氨酸；Ser＝絲氨酸； Val＝纈氨酸；Lys＝賴氨酸； Ala＝丙氨酸；Asp＝天冬氨酸；His＝組氨酸；Orn＝鳥氨酸； Tyr＝酪氨酸；Pen＝青黴胺(β，β′-二甲基-半胱氨酸)。
除非作為D-絕對構型指出，除甘氨酸以外的所有胺基酸都是L-絕對構型。上面的所有的肽上都適當地在Cys(182)和Cys(189)或Pen(182)和Pen(189)之間有環狀二硫鍵。
適當地，上面描述的類似物可包含其有機或無機酸加成鹽。
此處所用的術語「有效量」意思是足夠達到治療動物肥胖所期望的效果的肽的量，但不是大到引起嚴重的副作用或不良反應的量。
另一方面，本發明提供含有如上述的生長激素的羧基端類似物的肽的用途，其用在動物肥胖症治療，或用於動物肥胖症治療的藥物組合物生產中。
又一方面，本發明提供用於動物肥胖症治療的藥物組合物，包含有效量的帶有如上述生長激素的羧基端序列類似物的肽，以及一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。
當以對特殊病例合適的量施用時，作為本發明這一方面的藥物組合物的活性成分的肽在治療動物肥胖症中表現出有利的治療活性。例如，可給予每天每千克體重約0.5μg-約20mg。可調節劑量方案以提供最佳的預防或治療效果。例如，一次或多次分開的劑量可每天、每周、每月或以其它合適的時間間隔給藥，或者根據臨床形勢的緊急狀態所指示的按比例減少劑量。
可以任何便利的方式如通過口服、腸胃外的(包括腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內和髓內注射)、鼻內、皮內或栓劑途徑或植入(如應用緩釋裝置)施用活性成分。為方便給藥，優選口服給藥，然而腸胃外給藥也很方便。根據給藥途徑，活性成分可能需要包被到保護該成分免受可能使該成分失活的酶、酸和其它自然條件作用的材料中。例如，成分的低親脂性使其在胃腸道內被能切割肽鍵的酶所破壞，且在胃內被酸水解所破壞。為了以腸胃外給藥方法之外的方法施用組合物，活性成分可用防止其失活的材料包被或與其一起施用。
也可以在甘油、液體聚乙二醇、和/或其混合物以及在油中製備的分散體形式施用活性成分。在貯存和應用的通常條件下，這些製備物通常含有預防微生物生長的防腐劑。
適於注射應用的藥物劑型包括無菌水溶液(當為水可溶的時)或分散體，以及用於無菌注射溶液或分散體的即用即配製備物的無菌粉末。所有情況下，該劑型必須是無菌的，並且必須是可便於注射的液體。在生產和貯存的條件下其必須是穩定的，並且必須在抗微生物(如細菌和真菌)汙染作用的條件下保存。載體可以是溶劑或分散體介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物以及植物油。合適的流動性可通過例如應用包衣(如卵磷脂)、維持就分散體所需的顆粒大小以及使用表面活性劑來維持。多種抗細菌和抗真菌試劑如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thiomorosal等可防止微生物的作用。許多情況下，包含等滲試劑如蔗糖或氯化鈉是優選的。可通過組合物中延緩吸收試劑的使用引起可注射的組合物延緩吸收。
將合適的溶劑中所需量的活性成分與多種上面所列舉的其它成分結合，如需要隨後過濾除菌，製備無菌的可注射的溶液。一般地，分散體的製備是通過將無菌活性成分摻入含有基本分散體介質和所需的上面列舉的那些其它成分的無菌載體。就用於製備無菌可注射的溶液的無菌粉末而言，製備的優選方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從前面其無菌過濾的溶液獲得活性成分以及任何添加的所需成分的粉末。
當按上面所描述的恰當地保護活性成分時，組合物可口服給藥，例如與隋性稀釋劑或可同化的可食載體一起，或者可將其包入硬或軟的外殼明膠膠囊中，或者可壓縮成片劑，或者可直接與飲食食物結合。對於口服給藥，活性成分可與賦形劑結合，並且以可吞服的片劑、含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糖米紙囊劑等劑型應用。這些組合物和製備物可含有重量比至少0.01％的以及更優選地重量比至少0.1-1％的活性成分。當然，組合物和製備物的百分比可有所變化，並且可方便地是單位重量的約5％-約80％。藥物組合物中活性成分的量可以獲得合適的給藥劑量。例如，可製備根據本發明的優選的組合物或製備物以使口服劑量單位形式含有約0.5μg-200mg的以及更優選的10μg-20mg的活性成分。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可包含下面的成分粘合劑如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑如磷酸氫二鈣；崩解劑如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、褐藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；以及可加入甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；或者香味劑如胡椒薄荷、冬青油或櫻桃香料。當劑量單位形式是膠囊時，除了上述類型的物質外，可含有液體載體。多種其它物質可作為包被出現或者用來修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可用紫膠、蔗糖或兩者包被。糖漿或酏劑可含有活性化合物，蔗糖作為糖味劑、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯作為防腐劑、染料和香料如櫻桃或桔子香料。當然，用於製備任何劑量單位形式的任何物質應該是藥物純的，並且在所用的劑量內基本無毒。另外，活性成分可摻入持續釋放製備物和製劑中。
如此處所用的，藥學上可接受的載體和稀釋劑包括任一和所有的溶劑、分散介質、水溶液、包被、抗細菌和抗真菌試劑、等滲和吸收延遲試劑等。本領域熟知用於藥學上活性物質的這些介質和試劑的應用，它的描述見於，舉例如Remington′s製藥科學，第18版，Mack出版公司，Pennsylvania，美國。除外任何與活性成分不相容的傳統介質或試劑，也構思了其在本發明的藥物組合物中的用途。補充的活性成分也可結合到組合物中。
將組合物按方便給藥和劑量一致的劑量單位形式製成製劑有特殊的優點。如此處所用的劑量單位形式指的是作為單位劑量適合於所治療的人受試者的物理分散單位；每單位含有經計算產生期望治療效果的預定量的活性成分，其還結合了所需的藥學上的載體和/或稀釋劑。用於本發明的新的劑量單位形式的詳細說明的確定是根據並直接取決於(a)活性成分的獨特特徵和要達到的特殊治療效果，以及(b)本領域中配成用於肥胖症治療的這種活性成分固有的限制。
在整個說明書和隨後的權利要求書中，除非上下文中需要其它說明，單詞「包含」或其變體如「包含」應理解為用來指包括陳述的整體或整體集團，而不是排除任何其它整體或整體集團。
從下面的實施例和以本發明的舉例說明方式而不是限制的方式包括的附圖看，本發明的更多的細節會顯而易見。
附圖簡述圖中

圖1A和1B表示在18天的治療期間，hGH 177-191肽對雄性(1A)和雌性(1B)C57BL/6J(ob/ob)小鼠累積的體重增加的影響。每天給動物腹膜內注射0.1ml的鹽水或hGH 177-191(200μg/kg體重。每個點代表6隻動物的均值±SEM。
圖2A和2B表示用hGH 177-191治療的C57BL/6J(ob/ob)小鼠在18天治療期間的平均每天食物消耗量(g/小鼠/天)。4組動物的治療如圖1A和1B中所描述的。每個點表示6隻動物的均值±SEM。整個時間未觀察到組間有顯著性。
圖3A和圖3B表明在20或27天的治療期間，hGH 177-191肽對14-15周齡的雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠的體重增加的影響。每天給動物腹膜內注射鹽水或肽(500μg/kg體重)(3A)，或者在動物的下腹部皮內植入緩釋片劑(500μg/天/kg體重)。對照組以同樣方式植入安慰劑片劑。每個點代表6隻動物的均值±SEM。
圖4A和4B表示用hGH 177-191肽治療的Zucker肥胖大鼠在整個治療期間的平均每天的食物消耗量(g/大鼠/天)。4組動物的治療如圖3A和3B中所描述的。每個點代表6隻動物的均值±SEM。整個時間內未觀察到實驗組與合適的對照之間有顯著性。
圖5A和5B表示用hGH 177-191治療18天後對C57BL/6J(ob/ob)雄性小鼠(5A)和雌性小鼠(5B)的脂肪組織脂肪生成的離體影響。資料顯示[C14]-脂類合成速率，並且以摻入脂類的[C14]-葡萄糖表示(pmol/mg組織/分鐘)。數值是來自每組6隻動物的12次測定的均值±SEM。hGH 177-191治療組和鹽水對照組之間的差異有統計學顯著性。
圖6A和6B表示用hGH 177-191治療18天後對C57BL/6J(ob/ob)雄性小鼠(6A)和雌性小鼠(6B)的脂肪組織脂肪生成的離體影響。資料顯示從脂肪組織釋放甘油的速率(pmol/mg組織/分鐘)。數值是來自每組6隻動物的12次測定的均值±SEM。hGH 177-191治療組和鹽水對照組之間的差異有統計學顯著性。
圖7說明用測定從[14C]-棕櫚酸產生[14C]O2的速率表示的C57BL/6J(ob/ob)小鼠分離的脂肪組織中hGH 177-191對脂肪酸氧化的體外影響。[C14]-棕櫚酸氧化以μmol/g組織/小時表示。
圖8說明在40分鐘溫育時間內hGH 177-191對正常大鼠從分離的脂肪細胞釋放二醯甘油的體外影響。二醯甘油的定量採用放射酶學測定，並且結果以基礎水平上增高％表示。
圖9表示根據從[C14]-三油酸甘油酯的水解[C14]-油酸的量測定的hGH 177-191對雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠分離的脂肪細胞中激素敏感的脂酶活性的體外影響。酶用U/mg蛋白質來表示，其中每小時釋放1納摩爾油酸認為是1單位酶活性。
圖10A和10B表示根據[C14]-碳酸氫鹽固定反應測定的hGH 177-191對分離的脂肪細胞(10A)和正常大鼠肝細胞(10B)的乙醯-CoA羧化酶的體外影響，以mU/g細胞乾重表示，其中規定1單位的乙醯-CoA羧化酶為每分鐘1微摩爾乙醯-CoA羧化。
圖11A表明在18天的治療期間，類似物Ref.No.9403(SEQ ID NO6)對26周齡的C57BL/6J(ob/ob)小鼠體重增加的影響。每天給動物腹膜內注射鹽水(作為對照)或肽類似物(500μg/kg體重)。每個點代表6隻動物的均值±SEM。
圖11B表示用類似物RefNo.9403(SEQ ID NO6)治療期間26周齡C57BL/6J(ob/ob)小鼠的平均每日食物消耗量(克/小鼠/天)。兩組動物處理如圖11A中所描述。每個點代表6隻動物的均值±SEM。整個時間內未觀察到試驗組和對照組之間有顯著性。
圖12表示用類似物RefNos.9604(SEQ ID NO19)和9605(SEQ IDNO20)長期治療對16周齡C57BL/6J(ob/ob)小鼠體重增加的影響。
圖13表示類似物RefNo.9604長期口服施用對ob/ob小鼠的影響。
實施例材料與方法動物及處理採用肥胖C57BL/6J(ob/ob)小鼠和肥胖Zucker(fa/fa)大鼠證明合成的hGH 177-191和類似物的生物學效應。同年齡同性別的動物隨機分為兩組，每籠6隻並且在澳大利亞，Clayton，Monash大學生物化學和分子生物學系的動物房中於25℃恆定室溫、正常12小時白天/黑夜周期下飼養。給動物預定量的動物飼料(Clark king，Melbourne，澳大利亞)隨意食水飼養並允許在整個過程中隨意飲水。每天給動物腹膜內(i.p)注射0.1ml的合成肽(200-500μg/kg體重)或者等體積的生理鹽水(0.9％氯化鈉)，注射合適的天數。用1ml一次性結核菌素注射器上的30G×1/2″(0.31×13mm)針進行腹膜內注射，注射部位在動物的左下腹部。為研究hGH 177-191和類似物受控遞送的效果，在麻醉下將直徑3mm的緩釋肽丸植入Zucker大鼠腹部區皮內。監測指定時間期間的體重和食物攝取。肽的合成採用標準9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相技術製備本發明的肽。固相合成，例如可應用α-氨基保護的胺基酸從肽的C端開始。合適的起始物質可通過如將所需α-胺基酸加到Wang樹脂(4-烷氧苄基醇樹脂)或Rink醯胺樹脂(與氨基甲基樹脂連接的2，4-二甲氧基-4′-[羧甲基氧基]-二苯甲基胺)或者PAM樹脂(4-羥甲苯基-乙酸樹脂)上來製備。樹脂可從Auspep Pty.Ltd.，Parkville，Victoria，澳大利亞商業獲得。
固相製備本發明的化合物中，被保護的胺基酸藉助於偶聯劑與樹脂連接。在起初連接之後，於室溫下在有機溶劑中用哌啶去除α-氨基保護基團。去除α-氨基保護基團之後，剩下的被保護胺基酸按期望的順序逐步連接。在二氯甲烷(DCM)-N，N二甲基甲醯胺(DMF)混合物中一般應用四倍過量的每種被保護的胺基酸與合適的羧基基團激活劑如二異丙基碳二亞胺(DIC)和1-羥基苯並三唑(HOBt)反應。
在希望的胺基酸序列完成之後，通過用能從樹脂剪切肽的試劑如三氟乙酸(TFA)或三氟甲磺酸(TFMSA)從樹脂支持物上剪切下肽以及所有側鏈保護基團，除了Cys(Acm)。當使用Wang樹脂時，TFA處理引起游離肽酸形成。當使用Rink醯胺樹脂時，TFA處理引起游離肽醯胺形成。當使用PAM樹脂時，TFMSA處理引起游離肽酸形成。目標肽可能以需要合成後修飾的環狀二硫醚形式存在。
提供下面的實施例僅僅用於進一步說明的目的而不是用來對公開的發明的限制。A.含有天然人生長激素胺基酸殘基177-191的十五肽(被稱為hGH(177-191))(Ref No.9401)的合成Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15(環狀二硫醚)在製備此十五肽中應用了下面的步驟步驟1.將Wang樹脂(0.625g，0.5mmol)置於10ml反應容器內。向反應容器內加入DCM(4ml)。劇烈攪拌2分鐘洗滌Wang樹脂。然後從反應容器中瀝乾DCM溶液。重複洗滌兩次。步驟2.在反應容器中混合2.4ml NMP-DCM(1∶5，v/v)中的Fmoc-L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe，0.388g，1.0mmol)和1.0ml NMP中的DIC(0.135g，1.0mmol)10分鐘。將0.6ml DMF中的4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.074g，0.06mmol)加到此混合物中。在室溫下使溶液中的反應持續68分鐘。然後瀝乾溶液，用NMP(4ml×3)和DCM(4ml×3)徹底洗滌樹脂。在真空中過夜乾燥Fmoc-Phe-Wang樹脂複合物以收穫0.781g物質。應用Fmoc-吡啶加合物分光光度測定法測定的胺基酸與樹脂結合水平為0.80mmol/g樹脂。步驟3.將Fmoc-Phe-Wang樹脂(0.263g，0.20mmol)置於10ml反應容器中。加入DMF(8ml)洗滌並且攪拌2分鐘使樹脂膨脹，然後將溶液排出反應容器。步驟4.將25％哌啶/DMF溶液(4ml)加入反應容器。得到的混合物攪拌2分鐘。從反應器排出溶液。重複此脫保護過程一次，但延長攪拌時間(18分鐘)。從反應容器排出溶液。步驟5.將DMF(8ml)加入反應容器。得到的溶液攪拌2分鐘。從反應容器的樹脂中排出溶液。重複此洗滌過程兩次。將DMF(2ml)加到反應容器中以保持樹脂膨脹。步驟6.將Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly，0.238g，0.8mmol)、HOBt(108mg；0.8mmol)和DIC(128μl；0.8mmol)加到含有2ml DMF的10ml試管中。攪拌混合物10分鐘以起動胺基酸活化。然後將溶液加到最初置於反應容器中的樹脂中。攪拌得到的混合物1.5小時或者直到獲得陰性茚三酮試驗結果。然後從反應容器排出溶液。步驟7.將DMF(8ml)加到反應容器中。劇烈攪拌得到的溶液2分鐘。然後從反應容器排出溶液。此洗滌過程重複兩次。
然後應用下面的胺基酸順序重複步驟4到7Fmoc-Cys(Acm)Fmoc-Ser(t-Bu)Fmoc-GlyFmoc-Glu(O-tBu)Fmoc-ValFmoc-Ser(t-Bu)Fmoc-Arg(Pmc)Fmoc-Cys(Acm)Fmoc-GlnFmoc-ValFmoc-IleFmoc-Arg(Pmc)Fmoc-Leu
目的肽-樹脂的合成完成之後，將含有肽-樹脂的反應容器置於乾燥器中真空下乾燥過夜。肽-樹脂產量為0.635g。從反應容器中移出乾燥的肽-樹脂，置於含有磁力攪拌棒的50ml圓底燒瓶中。用TFA從樹脂剪切肽，方法如下將含有0.75g苯酚、0.5ml H2O、0.5ml茴香硫醚和0.25ml二硫代乙烷的清除劑溶液加到圓底燒瓶中。攪拌得到的混合物5分鐘。在保持劇烈攪拌的同時將10ml TFA逐滴加到燒瓶中。在室溫下攪拌得到的混合物2.5小時。
將此混合物通過中等孔隙度濾器的、多孔玻璃漏鬥過濾。應用真空將TFA-肽溶液吸到含有200mL冷乙醚的另外一個500ml圓底燒瓶中。4℃過夜使肽在乙醚溶液中沉澱，然後通過微細孔隙度濾器的多孔玻璃漏鬥過濾混合物收集肽。用冷乙醚(10ml×3)洗滌濾器上的肽沉澱物以去除清除劑。然後用25％含水乙酸溶解肽沉澱物，凍幹以獲得粗肽(約400mg乾重、純度～80％)。
用反相高效液相層析(RP-HPLC)純化粗肽。在室溫下在製備型21.2×250mm Supelcosil PLC-18(十八烷基，C18)柱(120埃孔大小，12μm顆粒大小，190m2/g表面積；Supelco，Bellefonte，PA，美國)上以5.0ml/分鐘的流速進行純化。採用線性梯度程序，其中溶劑A是含有0.1％TFA的水，溶液B是乙腈-水(50/50體積/體積，含有0.1％TFA)。梯度變化是80分鐘內從20到100％。記錄分離曲線，用Perkin-Elmer LC-100積分儀分析。洗脫所需的肽成分，用Pharmacia Model FRAC-100自動分部收集器(Uppsala，瑞典)收集。合併相同成分的級分並凍幹。在-20℃冷凍保存純化的肽(275mg乾重，純度＞98％)Cys(Acm)6，13-十五肽。
為了肽的二硫鍵環化，利用80％含水乙酸中的碘氧化作用去除半胱氨酸保護基團Acm，同時裝備分子內二硫鍵。在50ml 80％含水乙酸中溶解Cys(Acm)6，13-十五肽(275mg、0.155毫摩爾)。劇烈攪拌下將此溶液緩慢加到含有100ml 80％含水乙酸中的碘(378mg，1.4毫摩爾)的250ml圓底燒瓶中。使反應在室溫下持續2小時，通過向得到的溶液中加入抗壞血酸(維生素C)來終止。然後用旋轉蒸發減少液體體積，採用冷凍乾燥回收肽。然後按線性肽純化中所描述的用RP-HPLC純化環化的肽。冷凍乾燥後，收穫到純度為96％的165mg的環十五肽。合成的總產量約為46％。B.十五肽(Ref No.9404)合成Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15-CONH2(環狀二硫醚)應用實施例A中所述的方法。修飾包括省去Wang樹脂，用Rink醯胺樹脂替代之。C.十五肽(Ref No.9410)合成H-Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15(環狀二硫醚)應用實施例A中所述的方法。修飾包括Fmoc-Leu置換以及用4-甲基-五羧酸，引起脫氨十五肽合成。D.十五肽(Ref No.9405)合成CH3CO-Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15(環狀二硫醚)應用實施例A中所述的方法。在目的去封閉肽-樹脂合成完成之後，加入5ml的DMF中的20％乙酸酐。5分鐘後，加入70μl(0.4mmol)的二異丙基乙胺(DIEA)以中和產生的質子。在室溫下進行肽的乙醯化30分鐘。用DMF洗肽樹脂兩次，用DCM洗兩次，則N-乙醯肽樹脂可用於如實施例A中所示TFA剪切。E.二環-十五肽(Ref No.9408)合成||Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Lys-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15(環狀二硫醚)
應用下面的方法製備此十五肽步驟1.將Boc-L-苯丙氨酸-PAM樹脂(0.400g，0.2mmol；Auspep，Melbourne，澳大利亞；Cat#5290F，Batch#494123)置於10ml反應容器中。用DCM(4ml)劇烈攪拌2分鐘洗滌樹脂。然後將DCM溶液排出反應容器。重複洗滌一次。步驟2.將50％TFA/DCM溶液(4ml)加入反應容器中。攪拌得到的混合物2分鐘。然後將溶液排出反應容器。以18分鐘的攪拌時間再次重複去保護過程。從反應容器中排出溶液將DCM(4ml)加到反應容器中並使內容物放置2分鐘。再次將溶液從樹脂排出。重複兩次洗滌步驟。將10％DIEA/DMF(4ml)加入反應容器得到的混合物放置1分鐘並象以前一樣去除溶液。重複一次去保護方法。將DMF(4ml)加到反應容器中的樹脂複合物上。得到的溶液放置2分鐘，隨後從容器中去除溶液。洗滌步驟重複4次。最後，將DMF(2ml)加到反應容器中以保持樹脂鼓起。步驟3.將Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly，0.238g，0.8mmol)、HOBt(108mg；0.8mmol)和DIC(128μl；0.8mmol)加到含有2ml DMF的10ml試管中。攪拌混合物10分鐘以激活胺基酸。然後將溶液加到反應容器中的樹脂上。攪拌得到的混合物1.5小時或者直到獲得陰性茚三酮試驗。然後將溶液排出反應容器。步驟4.將DMF(8ml)加到反應容器中。劇烈攪拌所得溶液2分鐘，隨後去除上清液。重複洗滌過程兩次。步驟5.將25％哌啶/DMF溶液(4ml)加到反應容器中。攪拌得到的溶液2分鐘。將溶液排出反應容器。攪拌18分鐘重複去保護步驟一次。將溶液排出反應容器。步驟6.將DMF(8ml)加到反應容器中。攪拌得到的溶液2分鐘。將溶液從反應容器樹脂中排出。重複此洗滌過程兩次。向反應容器中加入2mlDMF以保持樹脂膨脹。
然後以下面的胺基酸順序重複步驟3到6Fmoc-Cys(Acm)
Fmoc-Ser(Bzl)Fmoc-GlyFmoc-Glu(O-tBu)Fmoc-ValFmoc-Ser(Bzl)步驟7.重複步驟3和4使Fmoc-Lys(Boc)和Ser在位置184連接。連接完成之後，將含有肽-樹脂的反應容器置於乾燥器中真空下乾燥過夜。然後將肽-樹脂轉移到10ml反應容器。將DCM(4ml)加到反應容器中。劇烈攪拌洗滌樹脂2分鐘。然後將DCM溶液從反應容器排出。重複此洗滌一次。步驟8.利用步驟2分別從賴氨酸和穀氨酸側鏈去除Boc基團和t-Bu基團。步驟9.向反應容器中加入1ml的1.5％DIEA/DMF。將苯並三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)(400mg；0.90mmol)、HOBt(122mg，0.90mmol)和DIEA(400μl，2.25mmol)溶解於3.4ml的1.5％DIEA/DMF中，然後加到反應容器中。在從反應容器中去除上清液之前，攪拌得到的混合物3小時或者直到獲得陰性茚三酮試驗。然後將DMF(8ml)加到反應容器中。劇烈攪拌得到的溶液2分鐘。然後將溶液排出反應容器。重複洗滌過程兩次。步驟10.重複步驟5到6以從肽-樹脂中賴氨酸殘基的α-氨基基團去除Fmoc基團。然後按下面的胺基酸順序重複步驟3到6Fmoc-Cys(Acm)Fmoc-GlnFmoc-ValFmoc-IleFmoc-Arg(Pmc)Fmoc-Leu在目的肽樹脂合成完成之後，重複步驟4以從Leu去除Fmoc基團，得到去封閉的肽樹脂。將含有肽樹脂的反應容器置於乾燥器中在真空下乾燥過夜。收穫到604mg肽樹脂。將乾燥的肽樹脂從反應容器出移出，置於含有磁力攪拌棒的25ml圓底燒瓶中。採用三氟甲磺酸(TFMSA)/TFA剪切方案從PAM樹脂剪切下肽將含有500μl茴香硫醚和250μl二硫代乙烷的清除劑溶液加到燒瓶中。室溫下攪拌得到的混合物10分鐘。維持劇烈攪拌的同時將5ml TFA逐滴加入燒瓶中。室溫下攪拌得到的混合物15分鐘。將燒瓶置於冰浴中，然後在維持劇烈攪拌的同時緩慢加入500ml TFMSA。在冰浴中攪拌得到的混合物10分鐘，在室溫下再攪拌15分鐘。向燒瓶中加入冷乙醚(50ml)以終止反應，沉澱剪切下的肽。將混合物通過微細孔隙度多孔玻璃漏鬥過濾，收集肽並用冷乙醚(10mL×3)洗滌除去清除劑。用30ml 50％乙腈/水溶解肽沉澱物，隨後加入5ml冷的10％NH4HCO3以中和溶液。冷凍乾燥後可獲得粗肽(519mg，純度～69％)。
環狀二硫醚形式肽的製備和純終產物的純化見實施例A中所示。F.十六肽(Ref No.9604)合成Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe(環狀二硫醚)應用實施例A中所述的步驟，經修改，添加應用Fmoc-Tyr(t-Bu)的重複的步驟4-7。累積體重增加和食物消耗根據每三天間隔測定體重和籠中剩餘的未食用食物來測定累積體重增加和食物消耗量。將動物置於覆蓋著的小室中以最低限度地減少在稱量期間的活動。從最初的食物中減去籠中剩餘的未食用的食物量得到食物消耗量的資料。血漿甘油三酯和總膽固醇測定hGH 177-191最後一次劑量施用12小時後用戊巴比妥鈉(80mg/kg體重)麻醉動物。給予麻醉劑45分鐘後從麻醉動物的尾靜脈收集血樣本。2000xg離心5分鐘後，從樣本中移出血漿並用於代謝物測定。採用酶-分光光度法測定血漿中甘油三酯和總膽固醇。試劑是根據修飾的甘油磷酸氧化酶(GPO)-Trinder′s型顏色反應24或膽固醇氧化酶-4-氨基安替比林方法25。用包含自動移液器、離心分析器和記錄分光光度計的CentrifiChem System 400(Union Carbide)進行所有測定。SeronormLipid(Nycomed Pharma Co.，Oslo，Norway)用作標準。脂肪組織重量測定在以前的GH-缺陷(lit/lit)小鼠附睪生長的研究中，建立了用於分離和測定完整的附睪脂肪墊的方法。本研究中，採用以前描述22的相同的技術在處死之後立即從小鼠切除白色脂肪組織，其可以是整個附睪的也可是子宮旁的脂肪墊。在冷的生理鹽水中洗組織，吸乾並稱重。應用不含血管的脂肪組織部分用於離體脂肪生成測定。激素敏感脂酶(HSL)測定利用分離的脂肪細胞的激素敏感脂酶(HSL)活性作為模型來評價hGH 177-191肽和類似物的脂解作用。測定中，用[C14]-三油酸甘油酯作為HSL的底物。測定水解的[C14]-油酸的量並用作HSL活性指數。
用膠原酶消化從雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠的附睪脂肪墊製備脂肪細胞。將脂肪墊(5g)很細地切成小(2-3mm)塊，置於含有10ml消化培養液的矽化玻璃小瓶中。消化培養液含有半Ca2+強度、2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA組分V)的Krebs-Ringer磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中濃度為1mg/ml的微生物膠原酶(II型)。在95％O2/5％CO2的大氣下、37℃消化1小時後，用尖端孔為3-4mm的5.0ml的移液尖輕輕上下吸打懸液，使脂肪細胞從所有剩下的脂肪組織塊釋放出來。然後將從組織釋放出的脂肪細胞通過尼龍薄綢過濾進入矽化玻璃試管，用6ml無膠原的白蛋白緩衝液洗滌兩次。用10ml無膠原緩衝液重新懸浮分離的細胞，根據計數顯微鏡載物片上一部分預定體積的細胞估計脂肪細胞濃度。正常地在Krebs-Ringer磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中有約109個細胞/ml的脂肪細胞。
於37℃，在含有10微摩磷酸鹽緩衝液(pH7.0)、15微摩爾乳化[C14]-三油酸甘油酯和108個細胞的200μl終體積中測定HSL活性1小時。用未標記的三油酸甘油酯預先乳化底物[C14]-三油酸甘油酯，以保證最終乳劑每0.1ml內含有三油酸甘油酯為15微摩爾且cpm為375,000。加入不同濃度的hGH 177-191肽或類似物以評價它們對HSL活性的影響。加入1ml含有50μg油酸的氯仿-甲醇-苯(2∶2∶4∶1)的脂肪酸提取混合物，然後加入67μl 0.5N NaOH，中止反應。為提取和分離游離脂肪酸，渦旋樣本20秒鐘並以1000xg離心5分鐘。將含有脂肪酸的鹼性上層水相的200μl部分轉移到矽化小瓶中。用液閃計數器測定[C14]-放射活性。剩下的細胞懸液用於測定蛋白含量。HSL活性以U/mg蛋白質表示，其中規定每小時釋放1納摩爾油酸為1U的酶活性。乙醯-CoA羧化酶測定乙醯-CoA羧化酶在脂肪酸合成中催化關鍵步驟。測定在hGH 177-191肽或類似物存在時分離的脂肪細胞和肝細胞的乙醯-CoA羧化酶活性，用於評價肽的抗脂肪生成效應。用[C14]-碳酸氫鹽固定反應-乙醯測定乙醯-CoA羧化酶活性，其中乙醯CoA的摻入速度依賴H[14C]O3摻入[14C]-丙二酸單醯-CoA。
用HSL測定中描述的方法製備脂肪細胞。用膠原酶消化從雄性Wistar大鼠肝臟製備的肝細胞。用剪刀將肝臟切得很細，轉移到250ml的含有30ml消化培養液的Erlenmeyer培養瓶中。消化培養液含有無鈣Krebs-Ringer磷酸鹽緩衝液(pH7.4)和葡萄糖(5mM)中的濃度為30mg/ml的微生物膠原酶(IV型)。在95％O2/5％CO2大氣下、於37℃消化15分鐘後，通過尼龍薄綢過濾從組織釋放出來的肝細胞，使進入矽化玻璃管中，用新鮮無膠原消化培養液洗兩次。將分離的細胞重新懸浮於45ml的含有補充的EDTA(0.45毫摩)、明膠(0.7ml)、2-{[三(羥甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)(0.9毫摩)的培養基中，並在使用之前通95％O2/5％CO2氣。
首先將分離的細胞在含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)、10mM枸櫞酸鉀、10mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)和BSA(0.8mg/ml)的混合物中於37℃下預溫育30分鐘。然後向含有50mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)、10mM枸櫞酸鉀、10mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)、BSA(0.8mg/ml)、3.75mM ATP、0.125mM乙醯-CoA和12.5mM NaH[C14]O3(0.44μCi/μmol)的測定混合物(終體積500μl)中加入一部分溫育的細胞以起動反應。37℃下溫育10分鐘後，用0.1ml 6M HCl終止反應。然後將反應混合物置於真空乾燥器中30分鐘以去除未反應的NaH[C14]O3，隨後以1500g離心10分鐘除去不溶物質。取0.5ml的上清液並移至閃爍瓶。用液閃計數器測定[C14]放射活性。剩下的細胞懸液用於蛋白質含量測定。酶的比活性以mU/g細胞乾重表示，其中規定1U乙醯-CoA羧化酶為每分鐘催化1微摩爾乙醯-CoA羧化的量。測定脂解活性用37℃下溫育期間甘油和游離脂肪酸(FFA)釋放到培養基中來表明hGH 177-191和類似物對分離的脂肪組織的脂解作用。
從動物取下脂肪組織並切成每個約200mg的切片。然後在37℃、Carbogen(95％O2/5％CO2)空氣下、含有2ml Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩衝液、4％脫脂BSA和5.5mM葡萄糖的25ml小瓶中預溫育所述組織1小時。然後將組織轉移到含有新鮮培養液的其它小瓶中，向瓶中加入hGH177-191肽或類似物開始溫育。混合物在37℃下溫育90分鐘。溫育之後除去組織，將從培養液中取出的部分樣本(200μl)用於測定甘油或游離脂肪酸(FFA)含量，採用酶測定法(甘油激酶)或者比色(銅染料)光譜測定法。然後分別根據340nm和610nm的吸收監測產生的NADH或顏色。測定游離脂肪酸的氧化根據從C14-棕櫚酸轉化的[C14]O2的測定來評價hGH 177-191或類似物對脂肪組織中游離脂肪酸(FFA)的氧化作用。FFA氧化的終產物[C14]O2用氫氧化季銨鹽捕獲並用液閃計數器測定。然後根據放射活性確定FFA氧化速度。
將從實驗室動物上取出的脂肪組織切成每個約200mg的切片。於37℃、在Carbogen空氣(95％O2/5％CO2)下，含有2ml Krebs-Ringer磷酸鹽(KRP)緩衝液和2％脫脂牛血清白蛋白(BSA)的25ml小瓶中預溫育組織30分鐘。然後將組織轉移到含有0.15mM[C14]-棕櫚酸鈉(終[14C]比活性，0.20μCi/μmol)和hGH 177-191肽或類似物(1-1000nM)的新鮮溫育培養液的Konte瓶內。將濾紙卷置於瓶內部孔中，然後用橡膠隔片瓶塞封瓶。在37℃、Carbogen空氣下持續溫育1小時並且然後用針通過橡膠隔片向培養瓶的培養液中注射250μl的4.5M H2SO4，向中央孔的濾紙卷注射250μl氫氧化季銨鹽來中止溫育。再溫育培養瓶1小時以使[C14]O2完全被氫氧化季銨鹽吸收。然後取出濾紙卷轉移到閃爍瓶中。用液閃計數器測定[C14]放射活性。計算[C14]-棕櫚酸氧化成[C14]O2的速率並以μmol/組織/小時表示。測定脂肪生成活性測定脂肪組織中外源[C14]-葡萄糖摻入總脂的速率作為hGH 177-191抗脂肪生成活性指數。
將脂肪組織切成每個約200mg的切片，然後將其置於含有2％脫脂BSA和葡萄糖(0.1mg/ml)的Krebs-Ringer碳酸氫鹽(KRB)緩衝液(pH7.4)中，在37℃下通95％O2-5％CO2氣。1小時預溫育之後，將組織轉移到另外的2ml含有[C14]-葡萄糖(終比活性0.05μCi/μmol)和0.3μMhGH 177-191、存在或不存在胰島素(0.1mU/ml)的新鮮培養液中繼續溫育90分鐘(條件如上)。然後移出組織，用KRB緩衝液徹底洗滌，並用5ml的氯仿/甲醇(2∶1，體積/體積)提取脂類。用2ml含有0.1％MgCl2的MeOH-H2O溶液洗滌提取物溶液。取出2.5ml的一份洗滌過的提取溶液並將其移至閃爍瓶中。用液閃計數器測定[C14]放射活性。總脂類合成速率以摻入脂類/g組織/小時的μmol[C14]-葡萄糖表示。測定二醯甘油(DAG)釋放用大腸桿菌DAG激酶和用來溶解DAG的混合微團條件以允許其在[33P]-γ-ATP存在時定量轉化成[33P]磷脂酸，採用放射酶學測定法定量從分離的脂肪組織或脂肪細胞釋放的二醯甘油。許多用來去除未反應的[33P]-γ-ATP的提取步驟之後，應用1ml Am-PrepTM微型柱完成[33P]磷脂酸的分離。統計學分析採用Student′st-檢驗分析結果。所有數據以均值±SEM表示。＜0.05的P值認為有統計學顯著性。結果根據大量包括累積體重增加和每天食物消耗量的參數的測定，評價用合成的hGH 177-191和類似物對肥胖小鼠和大鼠的長期治療。治療期間，觀察到當與合適的對照組相比較時，用hGH 177-191治療的雄性以及雌性動物累積體重增加明顯下降(圖1A，1B)。當分析數據並以每天體重增加表示時，治療的雄性動物體重增加下降了0.22±0.03-0.16±0.04g/天，雌性動物下降了0.30±0.02-0.22±0.04g/天。雄性和雌性治療動物的平均每天體重增加都表現出比合適的對照組低約27％。然而，未觀察到4組的平均每天食物消耗量之間有明顯差異(圖2A、2B)。每天500μg/kg/天口服給藥也觀察到相似的陽性結果。肥胖小鼠中觀察到以Ref.No.9403為代表的(圖11A)不同類似物的種種抗肥胖症作用。合成類似物控制體重增加而不影響受治療動物的食慾(圖11B)。在經每天腹膜內注射或者皮內植入緩釋片劑hGH 177-191治療期間的Zucker肥胖(fa/fa)大鼠中也發現相似的體重增加下降(圖3A，3B)。在整個治療期間治療的Zucker大鼠的食物消耗量無變化(圖4A，4B)。這些數據清楚地表明，給予hGH 177-191肽的長期治療降低了體重的增加而不影響食物消耗量。
如附睪和子宮旁脂肪墊的測量所表明的，與同性別的對照組相比，受治療的雄性小鼠的脂肪組織明顯降低達20％，雌性降低達12％(表1)。脂肪生成受前體代謝物如葡萄糖和乙酸的供應影響。因此通過測定分離的脂肪組織中[14C]-葡萄糖摻入脂類來測定hGH 177-191或類似物的作用。與對照肥胖Zucker大鼠的分離的脂肪組織相比，肽hGH 177-191和類似物(表5)使體外脂肪生成活性下降超過25％。從hGH 177-191治療的小鼠分離的脂肪組織的脂肪生成下降是明顯的(圖5A，5B)。雄性小鼠組織脂肪生成活性下降為2.80±0.33-2.33±0.21pmol/mg組織/分鐘，而雌性小鼠下降為3.36±0.13-2.99±0.21pmol/mg組織/分鐘。發現兩種性別的用hGH 177-191治療的肥胖動物脂肪組織中的脂解活性都明顯增高(圖6A，6B)。這些結果與以前觀察到的脂肪組織量和累積體重增加的減少一致。
表2描述了hGH 177-191治療對甘油三酯和膽固醇循環水平曲線的影響。在雄性動物中血漿總膽固醇明顯從4.44±0.56降至3.52±0.39mmol/l，而在受治療的雌性動物中膽固醇血漿水平僅僅輕微低於對照動物的膽固醇水平。另一方面，hGH 177-191不影響兩種性別動物的甘油三脂的血漿水平。在hGH 177-191和不同的類似物存在時，從肥胖動物分離出的脂肪組織中脂肪酸氧化(圖7)和甘油的釋放(表4)增強。這與給予hGH 177-191治療的脂肪組織脂解活性增高相一致。所有這些合成的hGH 177-191和類似物對脂類代謝的體內和體外作用看起來是細胞信使二醯甘油(圖8)釋放的刺激的結果，其又反過來調節目標器官中關鍵的脂解酶激素敏感脂酶(圖9)和脂肪生成酶乙醯-CoA羧化酶(圖10A，10B)。
表6和7表示hGH 177-191和兩種代表性的類似物(Ref Nos.9604和9605)對人脂肪組織的體外抗脂肪生成和脂解的活性。
表8表示對豬脂肪組織的相似的陽性脂解作用。這些結果支持如下論點的可能性，即在一種哺乳動物種中表現有效的hGH 177-191和其肽的變體在所有哺乳動物中均具有功效。因為非人哺乳動物的相應序列是人序列的有效肽變體，因此也期望那些相應序列在其它哺乳動物包括人中是有效的。
圖12表示類似物Ref No.9604和9605累積體重增加結果特別是Ref.No.9604的特殊功效。此體內結果與和表6、7和8中所示的hGH 177-191(RefNo.9401)相比，RefNo.9604和％05的增高的體外活性相一致。
圖13表示通過口服管飼法給ob/ob小鼠每天500μg/kg的類似物RefNo.9604長期口服給藥的結果。
體內和體外測定結果表明，非環狀肽類似物一般是無活性的。(RefNos.9402、9411、9611和9617是非環狀的)。無活性也可由位置178、183和186的丙氨酸置換產生，但對於包括一種帶有兩個D-丙氨酸置換(RefNo.9501)的所有其他受試丙氨酸置換(除了在位置182和189導致非環狀的)活性得以保留。其中位置178的Arg被Lys置換的Ref.No.9606和Arg(183)被Lys置換的Ref No.9407以及另外在Lys(183)和Glu(186)之間具有醯胺鍵的RefNo.9408也保留了活性。
具有位置183和186的丙氨酸置換的肽的無活性與穩定hGH 177-191中Arg(183)和Glu(186)相反電荷之間成鹽相互作用的重要性一致。RefNo.9408(Lys(183)和Glu(186)之間有醯胺鍵)以及RefNo.9407(Arg(183)被相似的帶正電荷的Lys(183)置換)的活性的保持符合穩定位置183和186之間的鍵(共價鍵或是成鹽)的需要。
表118天長期治療後合成的hGH177-191肽對肥胖小鼠體重和脂肪組織量的影響。每天給動物腹膜內注射hGH177-191(200μg/kg體重)或等體積的鹽水作為對照。所有數據表示6隻動物的均值±SEM(*P＜0.1；**P＜0.05)
(a)認為最初體重和最終體重之間的差為體重增加。(b)完整的附睪或子宮旁脂肪墊是代表性的脂肪組織。
表218天長期治療後合成的hGH177-191肽對肥胖小鼠甘油三酯和總膽固醇血漿水平的影響。從麻醉動物切開的尾尖部收集血樣本。數據代表6隻動物的均值±SEM(*P＜0.05)
表3將26周齡的雌性C57BL/6J(ob/ob)小鼠隨機分為兩組(樣本數＝每組6隻)。每天給小鼠腹膜內注射Ref No.9403(500μg/kg體重)類似物或鹽水，注射18天。18天後，再給予所有動物鹽水18天。
表4在脂解過程中，肽類似物對甘油釋放的體外影響。從雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠(12-14周齡)分離脂肪組織並與不同濃度的肽或鹽水溫育。每個實驗組含6個樣本。
表5肽類似物對脂肪生成抑制的體外影響。從雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠(12-14周齡)分離的脂肪組織與肽(0.3μM)在含有外源胰島素(0.1mU/ml)的KRB緩衝液中溫育。測定[C14]-葡萄糖摻入[C14]-脂類的速率(nmol/g組織/小時)作為脂肪組織脂肪生成活性。每個實驗組包括6次測定。
表6人腹部脂肪組織中的抗脂肪生成活性
表7人皮下脂肪組織中的脂解活性
表8豬脂肪組織中的脂解活性
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序列表(1)一般信息(i)申請人NG，Frank M.
JIANG，Woel-Jia(ii)發明名稱肥胖症的治療(iii)序列數33(iv)聯繫地址(A)收件人Metabolic Pharmaceuticals Ltd.
(B)街道10 Wallace Avenue(C)城市Toorak(D)州Victoria(E)國家澳大利亞(F)郵政編碼3142(v)計算機可讀形式(A)介質類型磁碟(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(vi)當前申請信息(A)申請號(B)遞交日(vii)在先申請信息(A)申請號PO9001(B)遞交日1997年9月8日(C)申請號PP0398(D)遞交日1997年11月13日(viii)代理機構/代理人信息(A)姓名Davies Collison Cave(B)註冊號
(C)文獻/卷號2093266(ix)通訊信息(A)電話+613 9254 2777(B)傳真+613 9254 2770(2)SEQ.ID.NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性或環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性或環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述X1m Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe X2n15 10 15(2)SEQ.ID.NO.3的信息(i)序列特徵
(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性或環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述Y1Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性或環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Y21 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.5的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置182和189帶有Cys(Acm)的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys(Acm) Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys(Acm) GlyPhe1 510 15(2)SEQ.ID.NO.6的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置179為Lys的hGH177-191Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.7的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述用CONH2替代COOH的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH215 10 15(2)SEQ.ID.NO.8的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述用CH3CO-NH替代NH2的hGH177-191CH3CO-HN Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.9的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置183為Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Ala Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.10的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置183為Lys的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.11的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構雙環(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置183為Lys，在位置183和186之間為醯胺鍵的hGH177-191| |Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.12的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述用H替代NH2的hGH177-191H Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.13的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置182和189帶有Cys(SH)的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys(SH) Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys(SH) Gly Phe1 510 15(2)SEQ.ID.NO.14的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置187和190帶有D-Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.15的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置182和189帶有Pen的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.16的信息(i)序列特徵
(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置191帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.17的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置190帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.18的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置178帶有Ala的hGH177-191
Leu Ala Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.19的信息(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述Tyr-hGH177-191Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe15 10 15(2)SEQ.ID.NO.20的信息(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述Lys-hGH177-191Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe15 10 15(2)SEQ.ID.NO.21的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置178帶有Lys的hGH177-191Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.22的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置177帶有Ala的hGH177-191Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.23的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置179帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.24的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置180帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.25的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置181帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.26的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置182帶有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Ala Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.27的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置184帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.28的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置185帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.29的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置186帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Ala Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.30的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置187帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.31的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置188帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.32的信息(i)序列特徵(A)長度15個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述在位置189帶有Ala的hGH177-191Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Ala Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ.ID.NO.33的信息(i)序列特徵(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構環狀(ii)分子類型肽(xi)序列描述Lys-Lys-hGH177-191Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu G1y Ser Cys Gly Phe1 5 10 1權利要求
1.一種包含生長激素的羧基端序列類似物的肽。
2.根據權利要求1的肽，其包含人生長激素的羧基端序列類似物。
3.根據權利要求1的肽，其包含非人哺乳動物生長激素羧基端序列類似物。
4.根據權利要求1的肽，其包括含有胺基酸殘基177-191的人生長激素的羧基端序列類似物，Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe，或者非人哺乳動物生長激素的相應序列，其環狀二硫醚或其有機或無機酸加成鹽。
5.根據權利要求1的肽，其是通過在含有胺基酸殘基177-191的人生長激素天然羧基端序列內進行胺基酸延伸、插入、刪除或置換、或者對其進行化學修飾、或者在其胺基酸側鏈之間導入環狀醯胺鍵獲得的肽，或其環狀二硫醚或其無機或有機酸加成鹽。
6.根據權利要求5的肽，其中(i)在hGH位置182及189的胺基酸以鍵連接以促成環狀構象；和/或(ii)在hGH位置183和186的胺基酸以成鹽或共價鍵連接。
7.根據權利要求6的肽，其中在hGH位置182和189的胺基酸之間的鍵是二硫鍵。
8.根據權利要求6的肽，其中在hGH位置182和189的胺基酸選自L-Cys、D-Cys、L-Pen和D-Pen。
9.根據權利要求6的肽，其中在hGH位置183和186的胺基酸以成鹽連接，並且分別是(X和Y)或(Y和X)，其中X是帶正電荷胺基酸，以及Y是帶負電荷胺基酸。
10.根據權利要求9的肽，其中X選自L-或D-Arg、Lys和Orn，Y選自L-或D-Asp和Glu。
11.根據權利要求6的肽，其中hGH位置183和186的胺基酸以醯胺共價鍵連接。
12.根據權利要求11的肽，其中在hGH位置183和186的胺基酸分別是(X和Y)或者(Y和X)，其中X選自L-或D-Lys和Orn，以及Y選自L-或D-Asp和Glu。
13.根據權利要求5的肽，其是如下序列，或者其環狀二硫醚或者其有機或無機酸加成鹽X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n其中X1和X2各自選自L-或D-Arg、His、Lys和Tyr，而且m和n各自是0、1、2或3，前提條件是至少m或n是1。
14.根據權利要求5的肽，其是如下序列，或者其環狀二硫醚或者其有機或無機酸加成鹽Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe其中Y1選自脫氨形式(H)、乙醯基(CH3CO-)和其它的醯基基團。
15.根據權利要求5的肽，其是如下序列，或者其環狀二硫醚或者其有機或無機酸加成鹽Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2其中Y2選自CONH2和烷醯胺基團。
16.根據權利要求5的肽，其選自如下序列，或者其有機或無機酸加成鹽Ref No.結構9502 Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe9405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9410H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9404 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH29407 Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9604 Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9605 Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9618 Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9607 Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9606 Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9608 Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9403 Leu Arg Lvs Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9609 Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9610 Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9612 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9613 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe9615 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe9616 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe9602 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe9501 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe9601 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala其中所用的胺基酸殘基縮寫與標準的肽命名一致Gly＝甘氨酸； Ile＝異亮氨酸；Glu＝穀氨酸； Phe＝苯丙氨酸；Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；Gln＝穀氨醯胺；Leu＝亮氨酸；Ser＝絲氨酸； Val＝纈氨酸；Lys＝賴氨酸； Ala＝丙氨酸；Asp＝天冬氨酸；His＝組氨酸；Orn＝鳥氨酸； Tyr＝酪氨酸；Pen＝青黴胺(β，β′-二甲基-半胱氨酸)。其中除非作為D-純對構型指出，除甘氨酸外的所有胺基酸都是L-絕對構型，並且此肽適當地在Cys(182)和Cys(189)或Pen(182)和Pen(189)之間有環狀二硫鍵。
17.一種用於動物肥胖症治療的方法，包括給予動物有效量的含有生長激素羧基端序列類似物的肽。
18.根據權利要求17的方法，其中動物是人。
19.根據權利要求17或權利要求18的方法，其中肽含有人生長激素羧基端序列類似物。
20.根據權利要求17或權利要求18的方法，其中肽含有非人哺乳動物生長激素羧基端序列類似物。
21.根據權利要求17或權利要求18的方法，其中肽包含帶有胺基酸殘基177-191Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe，的人生長激素羧基酸類似物、或非人哺乳動物生長激素的相應序列，或者其環狀二硫醚或者其有機或無機酸加成鹽。
22.根據權利要求17或權利要求18的方法，其中類似物是通過對含有胺基酸殘基177-191的人生長激素天然羧基端序列進行胺基酸延伸、插入、刪除或置換，或者在胺基酸側鏈之間導入環醯胺鍵或者進行化學修飾而獲得的，或其環狀二硫醚或其有機或無機酸加成鹽。
23.根據權利要求22的方法，其中類似物包含這樣的肽，其中(i)hGH位置182和189的胺基酸以鍵連接以促成環狀構象；和/或(ii)hGH位置183和186的胺基酸以成鹽或共價鍵連接。
24.根據權利要求23的方法，其中在hGH位置182和189的胺基酸之間的鍵是二硫鍵。
25.根據權利要求23的方法，其中hGH位置182和189的胺基酸選自L-Cys、D-Cys、L-Pen和D-Pen。
26.根據權利要求23的方法，其中hGH位置183和186的胺基酸以成鹽連接，並且分別是(X和Y)或者(Y和X)，其中X是帶正電荷胺基酸，且Y是帶負電荷胺基酸。
27.根據權利要求26的方法，其中X選自L-或D-Arg、Lys和Orn，Y選自L-或D-Asp和Glu。
28.根據權利要求23的方法，其中hGH位置183和186的胺基酸以醯胺共價鍵連接。
29.根據權利要求28的方法，其中hGH位置183和186的胺基酸分別是(X和Y)或者(Y和X)，其中X選自L-或D-Lys和Orn，和Y選自L-或D-Asp和Glu。
30.根據權利要求22的方法，其中類似物包含如下序列的肽，或者其環狀二硫醚或者其有機和無機酸加成鹽X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n其中X1和X2各自選自L-或D-Arg、His、Lys和Tyr，m和n各自為0、1、2或3，前提條件是至少m或n是1。
31.根據權利要求22的方法，其中類似物包括如下序列的肽，或者其環狀二硫醚或者其有機或無機酸加成鹽Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe其中Y1選自脫氨形式(H)、乙醯基(CH3CO-)和其它的醯基基團。
32.根據權利要求22的方法，其中類似物包括如下序列的肽，或者其環狀二硫醚或者其有機或無機酸加成鹽Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2其中Y2選自CONH2和烷醯胺基團。
33.根據權利要求20的方法，其中類似物包括選自下面的肽，或者其有機或無機酸加成鹽Ref No. 結構9502Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe9405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9410 H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9404Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH29407Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9604Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9605Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9618Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9607Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9606Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9608Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9403Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9609Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9610Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9612Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9613Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe9615Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe9616Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe9602Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe9501Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe9601Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala其中所用的胺基酸殘基縮寫與標準的肽命名一致Gly＝甘氨酸； Ile＝異亮氨酸；Glu＝穀氨酸； Phe＝苯丙氨酸；Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；Gln＝穀氨醯胺；Leu＝亮氨酸；Ser＝絲氨酸； Val＝纈氨酸；Lys＝賴氨酸； Ala＝丙氨酸；Asp＝天冬氨酸；His＝組氨酸；Orn＝鳥氨酸； Tyr＝酪氨酸；Pen＝青黴胺(β，β′-二甲基-半胱氨酸)。其中，除非作為D-絕對構象指出，除甘氨酸之外的所有胺基酸都是L-絕對構型，並且適當地此肽在Cys(182)和Cys(189)或Pen(182)和Pen(189)之間有環狀二硫鍵。
34.根據權利要求17～33中任一項的方法，其中此肽是口服給藥。
35.根據權利要求1～16中任一項的肽在製備用於治療動物肥胖症的藥物組合物中的用途。
36.一種用於動物肥胖症治療的藥物組合物，其包含有效量的根據權利要求1-16中任一項的肽，以及一種或多種藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。
全文摘要
用於治療動物如人肥胖症的方法,包括給予動物有效量的肽,該肽包含生長激素羧基端序列類似物,特別是含有胺基酸殘基177—191的人生長激素羧基端序列類似物。還公開了用於肥胖症治療的藥物組合物。
文檔編號A61K38/00GK1275132SQ98810089
公開日2000年11月29日 申請日期1998年9月4日 優先權日1997年9月8日
發明者F·M－W·恩格, 姜偉家 申請人:新陳代謝藥物有限公司